Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase từ aspergillus niger và thử nghiệm bóc vỏ tiêu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN OẠI HỌC THỦDẰUMỘT BÁO CÁO TỔNG KẾT THU DAU MOT UNIVERSITY 2009 ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG •• NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE TỪ Aspergillus niger VÀ THỬ NGHIỆM BÓC VỎ TIÊU (Pepper nigrum L.) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: ThS Trần Ngọc Hùng Bình Dương, 12 / 2018 MỤC LỤC •• Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục từ viết tắt Thông tin kết nghiên cứu Mở đầu 12 Tính cấp thiết 12 Mục tiêu đề tài 12 Đối tượng nghiên cứu 13 Phạm vi nghiên cứu 13 Chương 1: Tổng quan tài liệu 14 1.1 Khái quát nấm Aspergillus 14 1.1.1 Phân loại Aspergillus 14 1.1.2 Đặc điểm hình thái 14 1.1.3 Đặc điểm dinh dưỡng 15 1.1.4 Khả sinh enzyme ngoại bào Aspergillus 16 1.2 Giới thiệu enzyme pectinase 16 1.2.1 Phân loại enzyme pectinase 16 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc xúc tác enzyme pectinase 17 1.2.3 Nguồn thu nhận enzyme pectinase 20 1.2.4 Đặc điểm enzyme pectinase Aspergillus 20 1.2.5 Vai trò chất pectin phát triển nấm mốc sinh tổng hợp pectinase 21 1.2.6 Ứng dụng enzyme pectinase 22 1.3 Giới thiệu hồ tiêu 23 1.3.1 Đặc điểm chung tiêu 23 1.3.2 Vai trò tiêu đời sống 24 1.3.3 Giá trị kinh tế hồ tiêu 24 1.3.4 Thành phần hóa học hạt tiêu 26 1.3.5 Thành phần hóa học cấu trúc vỏ tiêu 26 1.3.6 Các phương pháp bóc vỏ tiêu 27 1.4 Những nghiên cứu gần liên quan đến đề tài 28 Chương 2: Vật liệu Phương pháp nghiên cứu 31 2.1 Vật liệu loại môi trường dùng nghiên cứu 31 2.1.1 Vật liệu 31 2.1.2 Các loại môi trường dùng nghiên cứu 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu 31 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy bán rắn thu nhận enzyme 31 2.2.2 Phương pháp bóc vỏ tiêu theo truyền thống 31 2.2.3 Xác định hoạt tính enzyme pectinase 32 2.2.4 Xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp định lượng đường khử 34 2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng piperine 35 2.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng protein chế phẩm bán tinh 35 2.2.7 Phương pháp xác định độ ẩm chế phẩm pectinase bán tinh 35 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 35 2.3 Nội dung nghiên cứu 36 2.3.1 Xác định điều kiện nuôi cấy Aspergillus niger để thu nhận chế phẩm enzyme pectinase 36 2.3.2 Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme giàu pectinase quy mơ thí nghiệm 37 2.3.3 Thử nghiệm nâng cao khả bóc vỏ tiêu xanh chế phẩm enzyme pectinase 37 Chương 3: Kết 40 3.1 Xác định điều kiện nuôi cấy Aspergillus niger để thu nhận chế phẩm enzyme pectinase 40 3.2 Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme giàu pectinase quy mơ thí nghiệm 46 3.3 Thử nghiệm nâng cao khả bóc vỏ tiêu xanh chế phẩm enzyme pectinase 48 Chương Kết luận kiến nghị 56 4.1 Kết luận 56 4.2 Kiến nghị 56 Tài liệu tham khảo 57 Phụ lục 61 ii DANH MỤC BẢNG • Bảng Thành phần pectin mức độ ester hóa số loại nguyên liệu 22 Bảng Nội dung nghiệm thức thí nghiệm .37 Bảng Hoạt độ pectinase chủng Aspergillus niger 40 Bảng Hoạt tính pectinase chủng Aspergillus B2 môi trường chứa chất cảm ứng khác 41 Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ cùi bưởi đến hoạt độ pectinase chủng Aspergillus B2 42 Bảng Ảnh hưởng lượng nước môi trường bán rắn đến hoạt độ pectinase 43 Bảng Ảnh hưởng pH dịch khoáng đến khả sinh enzyme pectinase Asp niger B2 44 Bảng Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase chủng Aspergillus B2 45 Bảng Các tiêu chất lượng chế phẩm enzyme pectinase sản xuất quy mô pilot 48 Bảng 10 Ảnh hưởng lượng nước ngâm tiêu đến khả bóc vỏ 49 Bảng 11 Ảnh hưởng thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ tiêu 50 Bảng 12 Ảnh hưởng nhiệt độ ngâm đến hiệu suất bóc vỏ tiêu 51 Bảng 13 Hàm lượng đường khử hoạt độ enzyme dịch nước ngâm tiêu .52 Bảng 14 Ảnh hưởng hoạt độ enzyme pectinase lên hiệu suất bóc vỏ tiêu .53 Bảng 15 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả hoạt động enzyme pectinase dịch ngâm tiêu .54 Bảng 16 Hiệu suất bóc vỏ tiêu quy mô pilot 55 Bảng 17 Hàm lượng piperine tiêu bóc vỏ thử nghiệm số sản phẩm loại 56 DANH MỤC HÌNH • Hình Khuẩn lạc Aspergillus môi trường PGA sau ngày 15 Hình Mơ hình hoạt động thủy phân enzyme pectinase 19 Hình Cấu trúc vách tế bào thực vật 23 Hình Hoạt độ pectinase chủng Aspergillus niger 40 Hình Ảnh hưởng chất đến khả sinh pectinase chủng Aspergillus B2 41 Hình Ảnh hưởng tỷ lệ cùi bưởi đến khả sinh tổng hợp pectinase 42 Hình Ảnh hưởng lượng nước bổ sung đến khả sinh tổng hợp pectinase 43 Hình Ảnh hưởng pH dịch khoáng lên khả sinh enzyme pectinase Asp niger B2 .44 Hình Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase canh trường 45 Hình 10 Quy trình sản xuất chế phẩm giàu enzyme pectinase bán tinh 47 Hình 11 Ảnh hưởng việc bổ sung nước lên q trình bóc vỏ tiêu 49 Hình 12 Ảnh hưởng thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ tiêu 50 Hình 13 Ảnh hưởng nhiệt độ ngâm đến trình bóc vỏ tiêu 51 Hình 14 Hàm lượng đường khử hoạt độ enzyme dịch nước ngâm tiêu .52 Hình 15 Ảnh hưởng hoạt độ pectinase bổ sung đến trình bóc vỏ tiêu 54 Hình 16 Ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân đến q trình bóc vỏ tiêu 54 Hình 17 Hiệu suất bóc vỏ tiêu quy mô pilot 55 Hình 18 Hàm lượng piperine sản phẩm tiêu sọ thử nghiệm số sản phẩm tiêu sọ phổ biến thị trường .57 Hình 19 Tiêu xanh nguyên liệu (a) sản phẩm tiêu sau bóc vỏ 57 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT PTN : Phịng thí nghiệm WA : Water Agar PE PME PG : Pectin esterase : Pectin Methyl Esterase : Polygalacturonase EC : Enzyme Code TE : Trans-elyminase PL : Pectin lyase GLS : Galacturonic acid RHA : Rhamnose UI DNS OD : Unit International : Dinitro Salicylic Acid : Optical Density TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam NT : Nghiệm thức TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Đơn vị: Khoa Khoa học Tự nhiên THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase từ Aspergillus niger thử nghiệm bóc vỏ tiêu (Piper nigrum L.) - Mã số: - Chủ nhiệm: ThS Trần Ngọc Hùng - Đơn vị chủ trì: Khoa Khoa học Tự nhiên - Thời gian thực hiện: 01/2018 - 01/2019 Mục tiêu: - Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase bán tinh sạch, dạng bột - Thử nghiệm khả bóc vỏ tiêu chế phẩm Tính sáng tạo: Enzyme pectinase ứng dụng rộng rãi nhiều lãnh vực khác sản xuất nước ép, rượu; ly trích dược chất; xử lý môi trường Trong lĩnh vực chế biến thực phẩm, enzyme pectinase giúp tăng hiệu sản xuất, chế biến sản phẩm nông sản trà, cà phê, hồ tiêu Tiêu trắng sản phẩm nhiều thị trường lớn ưa chuộng Việc sản xuất tiêu trắng chủ yếu sản xuất thủ công bán công nghiệp từ tiêu xanh tiêu đen theo phương pháp ngâm nước Quá trình thường kéo dài từ 10 - 12 ngày, làm cho tiêu sau xát vỏ thường sậm màu, mùi khó chịu phải khử màu khử, mùi hóa chất Lượng nước ngâm tiêu quy trình chế biến nguy gây ô nhiễm môi trường Đề tài nghiên cứu khả sử dụng enzyme pectinase nuôi thu nhận từ việc nuôi cấy bán rắn chủng Aspergillus niger B2 để rút ngắn thời gian bóc vỏ tiêu Theo đó, giúp nâng cao hiệu chế biến tiêu sọ giảm áp lực xử lý môi trường xí nghiệp chế biến tiêu sọ Kết nghiên cứu: Kết sàng lọc chủng Aspergillus niger cho thấy, chủng Aspergillus niger B2 có khả sinh tổng hợp enzyme pectinase tốt môi trường bán rắn chứa 12 % bột cùi bưởi, lượng dịch khoáng bổ sung chiếm 40 %, pH 5,5 Sau ngày, hoạt độ pectinase canh trường đạt 4,82 UI/g Trên quy mơ sản xuất thử 10 kg/mẻ, chế phẩm có hoạt độ pectinase đạt 91,3 % so với nuôi cấy bình tam giác Kết thí nghiệm cho thấy có giải phóng enzyme cellulase pectinase nội sinh từ vỏ tiêu ngâm tiêu với nước khoảng 24 Trong trường hợp không bổ sung enzyme pectinase, hiệu bóc vỏ tiêu đạt cao bổ sung nước với tỷ lệ tiêu/nước 1/1, sau 48 ngâm nhiệt độ 35 oC, hiệu suất bóc vỏ tiêu đạt 92,20 % Trên quy mơ thử nghiệm với khối lượg kg, tiêu ngâm nước 24 giờ, bổ sung enzyme pectinase với hoạt độ UI/ 50 g tiêu, ủ nhiệt độ 40 oC thời gian giờ, hiệu suất bóc vỏ tiêu đạt 93,20 % Hàm lượng piperine sản phẩm tiêu sọ thử nghiệm đạt 6,58 %, cao so với số sản phẩm phổ biến thị trường Kết thử nghiệm sở bước đầu để chúng tơi xây dựng quy trình sản xuất tiêu sọ hoàn chỉnh Sản phẩm: 03 báo khoa học hướng dẫn 02 nhóm SV CNKH - Bài báo đăng tạp chí Phát triển Khoa học Kỹ thuật, số chuyên san KHTN: Trần Ngọc Hùng, Nghiên cứu nâng cao hiệu bóc vỏ tiêu đen (Piper nigrum L.), Tạp chí Phát triển Khoa học Kỹ thuật, số chuyên san KHTN, Tập 5, Số T20, 2017, tr 50-57 - Bài báo đăng tạp chí đại học Thủ Dầu Một: Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Ngọc Như, Trương Ngọc Loan, Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả bóc vỏ tiêu đen (Piper nigrum L.), Tạp chí đại học Thủ Dầu Một, Số 6(25), 2015, tr 4034 - Bài báo đăng tạp chí đại học Thủ Dầu Một: Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Ngọc Như, Nguyễn Anh Dũng, Mai T Ngọc Lan Thanh, Nghiên cứu thu nhận chế phẩm pectinase từ Aspergillus niger nuôi cấy môi trường bán rắn chứa cùi bưởi để nâng cao hiệu bóc vỏ tiêu, Tạp chí đại học Thủ Dầu Một, Số 5(30), 2016, tr 82-89 - Hướng dẫn sinh viên thực đề tài NCKH năm 2014-2015: Nghiên cứu sử dụng vi nấm Trichoderma sp Aspergillus sp để bóc vỏ tiêu xanh Sinh viên thực chính: Trần Thị Ngọc Như; Xếp loại: giỏi - Hướng dẫn sinh viên thực đề tài NCKH năm 2015-2016: Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả bóc vỏ tiêu đen (Piper nigrum L.) Sinh viên thực chính: Trần Thị Ngọc Như; Xếp loại: tốt - Quy trình sản xuất chế phẩm giàu enzyme pectinase quy mơ pilot - Sản phẩm tiêu trắng sau bóc vỏ: kg - Báo cáo tổng thuật tài liệu báo cáo tổng kết đề tài Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết nghiên cứu khả áp dụng: Kết đề tài giúp sản xuất chế phẩm giàu enzyme pectinase quy mô pilot Chế phẩm định hướng để ứng dụng chế biến tiêu sọ chế biến cà phê Ngày tháng năm Chủ nhiệm đề tài (chữ ký, họ tên) Đơn vị chủ trì hữ ký, họ tên) INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information: Project title: Studying to produce the nitrogen solution from red worm (Perionys excavatus) for add to feed chickend Code number: Coordinator: MS Tran Ngoc Hung Implementing institution: Deparment of Natural Science Duration: from January/2018 to January/2019 Objective(s): - Study on producing the semi-purified pectinase preparation, powder form - Experiment the capability of the preparation in taking off the husk of pepper Creativeness and innovativeness: Pectinase enzyme are probably applied in many fields, such as production of fruit juice, wine; extraction of pharmaceutical substrate; environmental treatment In food process, pectinase enzyme help increase effective of agro-product process such as tea, coffee, pepper The white pepper are liked by the market of developed countries Production of white pepper is mainly manual or semi-industrial from the fresh pepper or black pepper by the immersing way This way often takes 10 - 12 days, making the sheeling pepper have a dark colour, unpleasant smell This way also require a large of water that is a harzard cause environmental pollution The experimental subject used pectinase enzyme receiving from culturing the Aspergillus niger B2 on the semi-solid medium to shorten the time of shelling pepper Accordingly, the result of subject help increase the effective of white pepper process and decrease the pressure of environmental treatment at self enterprise Research results: The result of screening strains of Aspergillus niger showed B2 strain synthesis pectinase enzyme with the highest yield on the semi-solid medium containing 12 % of pomelo pulp; 40 % of mineral solution, pH 5.5 After days, the pectinase yield in cultured gets 4.82 UI/g At the 10 kg/batch of scale, pectinase activity of the preparation gets 91.3 % in comparison with the flask scale khả sinh enzyme pectinase Asp niger B2 pH dịch khoáng 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 Hoạt độ pectinase (UI/g) 3,66 ± 0,32 4,15 ± 0,10 4,08 ± 0,33 3,89 ± 0,39 3,45 ± 0,17 3,16 ± 0,24 3,28 ± 0,45 Hình Ảnh hưởng pH dịch khoáng lên khả sinh enzyme pectinase Asp niger B2 Các kí tự khác cột biểu thị mức độ sai khác độ tin cậy 95 % Khi nuôi cấy phương pháp bề mặt, mơi trường có hàm lượng ẩm thấp nên pH dịch ly trích sau lên men thường thay đổi Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu mơi trường có ảnh hưởng khơng nhỏ đến sinh trưởng tạo thành enzyme Khi pH môi trường dịch phía acid kiềm, tạo thành sinh khối khơng bị ảnh hưởng q trình sinh tổng hợp enzyme pectinase bị kìm hãm Giá trị pH tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật nằm khoảng 4,5 - 5,5 (Trần Xuân Ngạnh, 2007) Aspergillus niger phân lập từ vỏ cam tổng hợp pectinase tốt giá trị pH 5,4 (Sharma et al, 2011) Trên chất cảm ứng bột cùi bưởi, chủng Aspergillus niger B2 sinh tổng hợp enzyme pectinase cao khoảng pH 5,0 - 6,0, với hoạt độ trung bình đạt 3,89 4,15 Ul/g Các giá trị hoạt tính khoảng pH khơng có khác biệt mặt thống kê độ tin cậy 95 % Việc giảm tăng pH dịch khoáng ban đầu khơng ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng chủng lại làm giảm trình sinh tổng hợp enzyme pectinase Từ kết thí nghiệm, chúng tơi chọn giá trị pH ban đầu dịch khoáng 5,5 để tiến hành thí nghiệm Đây giá trị pH gần với giá trị tự nhiên dịch khoáng, hạn chế việc bổ sung chất điều chỉnh pH vào môi trường nuôi cấy Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Chủng Aspergillus niger B2 nuôi cấy mơi trường bán rắn có bổ sung cùi bưởi với tỷ lệ 12 % Lượng nước bổ sung vào môi trường 40 % Sau khoảng thời gian ni cấy từ đến ngày, hoạt tính pectinase canh trường xác định thể bảng hình Bảng Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase chủng Aspergillus B2 Thời gian nuôi Hoạt độ pectinase cấy (ngày) _(UI/g) _ 3,39 ± 0,33 4,05 ± 0,19 4,82 ± 0,24 3,97 ± 0,33 3,34 ± 0,28 Hình Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến hoạt độ pectinase canh trường Thời điểm thu nhận enzyme pectinase thích hợp sau ngày ni cấy, hoạt độ pectinase canh trường đạt 4,82 UI/g Thời gian nuôi cấy dài, hoạt độ enzyme pectinase giảm Sau thời gian ngày, khả sinh trưởng nấm Aspergillus niger B2 đạt cực đại nên chúng không tiết thêm pectinase vào môi trường Trong đó, lượng enzyme tiết trước dần hoạt tính nên hoạt độ pectinase canh trường giảm dần Mặt khác, hoạt động enzyme protease chủng Aspergillus tiết thủy phân phân tử pectinase So với kết nghiên cứu Huỳnh Ngọc Oanh (2008), chế phẩm chúng tơi có hoạt độ thấp Tuy nhiên, thí nghiệm sàng lọc trước cho thấy enzyme pectinase thu giúp nâng cao hiệu bóc vỏ tiêu, nên chúng tơi tiếp tục thử nghiệm hướng ứng dụng 3.2 Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme giàu pectinase quy mơ thí nghiệm Từ yếu tố thu từ thí nghiệm trước, chúng tơi xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme giàu pectinase Ni cấy chủng Aspergillus niger chọn lọc môi trường bán rắn Quy trình ni cấy thể hình 10 Thuyết minh quy trình: - Chuẩn bị giống: Bào tử chủng Aspergillus niger B2 từ ống thạch nghiêng trộn nước cất, xác định mật độ ban đầu buồng đếm hồng cầu Pha loãng dịch cho mật độ bào tử đạt x 108 bào tử/g - Chuẩn bị môi trường cấy giống: phối trộn nguyên liệu bao gồm 55 % cám gạo, 31 % trấu 12 % bột cùi bưởi (NH4)2SO4 hòa tan 40 % nước, điều chỉnh pH dịch khống mơi trường đạt 5,5 trộn với loại nguyên liệu Hấp khử trùng 121 oC, atm 20 phút Sau thời gian khử trùng, trải môi trường khay nhựa để nhiệt độ canh trường giảm xuống 40 - 45 oC Khối lượng môi trường kg khay - Cấy giống Aspergillus: Tưới dịch bào tử pha lỗng lên mơi trường hấp khử trùng, mật độ giống đạt 107 bào tử/ g môi trường, đảo trộn Ủ canh trường nhiệt độ phòng (30 - 33oC) khoảng thời gian ngày Dùng vải phủ lên bề mặt canh trường để giữ ẩm Hằng ngày, phun nước lên vải phủ - Thu nhận canh trường: canh trường sau ni cấy sấy thơng gió 45 oC độ ẩm canh trường khoảng 10 % Khi sấy cần phủ vải để tránh bào tử nấm bay Canh trường khô lưu trữ túi nylon nhiệt độ phòng - Tinh sơ enzyme pectinase: canh trường sau sấy khơ hịa vào nước cất với độ pha loãng 20 lần, lắc 30 phút Ly tâm thu nhận dịch tốc độ 5.000 vòng/phút, 5oC, thời gian phút Dịch sau ly tâm kết tủa protein - ethanol tỷ lệ 60 %, 5oC, thời gian 30 phút Ly tâm thu tủa tốc độ 5.000 vòng/phút, nhiệt độ oC, thời gian 10 phút Kết tủa hòa tan dung dịch đệm phosphate 6,5 - Thu ch ế phẩm enzyme pectinase bán tinh sạ ch: trộn lượng tối thiểu chất mang vào dung dịch enzyme pectinase bán tinh Chế phẩm sấy chân không 5oC độ ẩm cịn khoảng 10 % Đóng gói chế phẩm túi nylon, hàn kín miệng bảo quản nhiệt độ lạnh tối thiểu 5oC Đánh giá hoạt độ enzyme pectinase chế phẩm phương pháp định lượng đường khử Phối trộn chất mang, sấy C o Hình 10 Quy trình sản xuất chế phẩm giàu enzyme pectinase bán tinh Đánh giá chất lượng thành phẩm: Chế phẩm enzyme pectinase bán tinh thu quy mô nuôi cấy 10 kg/mẻ xác định tiêu chất lượng hoạt độ enzyme pectinase, hàm lượng protein, độ ẩm đánh giá hiệu suất hoạt độ chế phẩm so với ni cấy bình tam giác Bảng Các tiêu chất lượng chế phẩm enzyme pectinase sản xuất quy mô pilot Chỉ tiêu Kết Hoạt độ enzyme pectinase canh trường khô (UI/g) Hoạt độ enzyme pectinase Phương pháp định lượng 4,40 ± 0,21 36,67 chế phẩm bán tinh (UI/g) Hàm lượng lượng protein Phương pháp xác định đường khử Phương pháp định lượng đường khử 105,27 Phương pháp Lowry cải chế phẩm bán tinh (mg/g) tiến TCVN 10529:2014 Độ ẩm chế phẩm pectinase bán tinh Theo TCVN 9297:2012 (%) 9,5 ± 0,6 Trên quy mô sản xuất thử nghiệm với khối lượng 10 kg/mẻ, canh trường có hoạt độ pectinase 4,40 ± 0,21 UI/g, đạt 91,3 % so với ni cấy bình tam giác Sau q trình tinh sơ bộ, chế phẩm bán tinh có hoạt độ pectinase đạt Ul/g Nhìn chung, chủng Aspergillus niger có khả sinh trưởng mạnh nhiều loại chất khác nhau, lượng bào tử hình thành nhiều, nhiên, điều lại gây nhiều bất lợi cho trình thu nhận sản phẩm Bào tử chủng Aspergillus dễ bay khơ, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người sản xuất Do đó, cần có thêm nghiên cứu để tối ưu hóa thời gian thu nhận chế phẩm pectinase Aspergillus chưa hình thành nhiều bào tử 3.3 Thử nghiệm nâng cao khả bóc vỏ tiêu xanh chế phẩm enzyme pectinase Ảnh hưởng tỷ lệ nước ngâm tiêu số lần thay nước Cân 50 g tiêu nguyên liệu cho vào bình tam giác bổ sung nước theo nghiệm thức khác nhau, giữ nhiệt độ 30 oC Sau ngày tiến hành bóc vỏ Hiệu suất thể bảng 10 hình 11 Bảng 10 Ảnh hưởng lượng nước ngâm tiêu đến khả bóc vỏ Hiệu suất bóc vỏ (%) Nội dung nghiệm thức Kí hiệu Nước : tiêu theo tỷ lệ khối lượng 1:1 NT1 97,33 ± 0,99 Nước : tiêu theo tỷ lệ khối lượng 1:2 NT2 95,20 ± 0,88 Nước : tiêu theo tỷ lệ khối lượng 1:3 NT3 96,77 ± 0,88 NT4 96,77 ± 0,88 NT5 93,87 ± 0,63 Nước : tiêu theo tỷ lệ khối lượng 1:1, thay nước lần sau 24 giờ, lượng nước bổ sung lần khối lượng tiêu Nước : tiêu theo tỷ lệ khối lượng 1:1, thay nước lần sau 24 48 giờ, lượng nước bổ sung lần khối lượng tiêu Hình 11 Ảnh hưởng việc bổ sung nước lên q trình bóc vỏ tiêu Các kí tự khác cột biểu thị mức độ sai khác độ tin cậy 95 % Lượng nước ngâm ảnh hưởng nhiều đến q trình bóc vỏ tiêu đen Khi tăng lượng nước ngâm tiêu từ tiêu : nước đến tiêu : nước, hiệu suất bóc vỏ dao động khoảng 95,20 - 97,33 % Việc thay nước nhiều lần không đem lại hiệu bóc vỏ tiêu rõ ràng Trong đó, nước ngâm tiêu có mùi khó chịu; hàm lượng vi sinh, chất rắn lơ lửng cao ngun nhân gây nhiễm mơi trường q trình sản xuất tiêu trắng Việc giảm lượng nước trình ngâm tiêu giảm thiểu lượng nước thải mơi trường Vì thế, chúng tơi nhận thấy bổ sung nước trình ngâm tiêu với tỷ lệ tiêu : nước phù hợp, đem lại lợi ích kinh tế giảm nguy gây nhiễm môi trường Ảnh hưởng thời gian ngâm tiêu Mỗi bình tam giác chứa 50 g tiêu 50 g nước, giữ nhiệt độ phòng (30 oC) Sau khoảng thời gian 24, 48, 72 96 tiến hành bóc vỏ Hiệu suất bóc vỏ thể bảng 11 hình 12 Bảng 11 Ảnh hưởng thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ tiêu Thời gian ngâm Hiệu suất bóc vỏ (giờ) 24 (%) 75,71 ± 3,18 48 86,23 ± 2,90 72 95,29 ± 1,02 96 96,00 ± 0,80 Hình 12 Ảnh hưởng thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ tiêu Các kí tự khác cột biểu thị mức độ sai khác độ tin cậy 95% Kết thí nghiệm cho thấy hiệu suất bóc vỏ tiêu đen tăng dần theo thời gian ngâm nước Khi ngâm nước, enzyme nội sinh trái tiêu thủy phân phân tử có lớp vỏ, làm cho cấu trúc lớp vỏ trở nên lỏng lẻo tách khỏi phần sọ tiêu Khi đó, tác động học chà xát giúp q trình bóc vỏ diễn dễ dàng Đối với tiêu đen có độ ẩm 10 %, lớp vỏ thường bền gắn chặt vào sọ tiêu nên q trình bóc tách tiêu tốn tương đối nhiều thời gian Tiêu ngâm nước từ 24 72 giờ, hiệu suất bóc vỏ tăng từ 75,71 - 95,29 % Khi ngâm tiêu thời gian lâu hơn, q trình bóc vỏ tăng khơng đáng kể, hạt tiêu khơng bóc vỏ hồn tồn, nhiều mảnh vỏ gắn chặt vào phần sọ Để nâng cao hiệu bóc vỏ tiêu thời gian ngắn, khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian ngâm 48 Ảnh hưởng nhiệt độ trình ngâm tiêu Tiêu cho vào bình tam giác, bổ sung nước với tỷ lệ 1:1, giữ nhiệt độ khác nhau: 30, 35, 40, 45 50 oC Sau 48 tiến hành bóc vỏ Hiệu suất bóc vỏ thể bảng 12 hình 13 Bảng 12 Ảnh hưởng nhiệt độ ngâm đến hiệu suất bóc vỏ tiêu Nhiệt độ ngâm tiêu (oC) Hiệu suất bóc vỏ (%) 30 83,28 ± 2,45 35 92,20 ± 1,18 40 93,41 ± 1,32 45 92,19 ± 1,20 50 92,21 ± 2,03 100 30 35 Nhiệt độ ngâm (°C) 40 45 50 Hình 13 Ảnh hưởng nhiệt độ ngâm đến q trình bóc vỏ tiêu Các kí tự khác cột biểu thị mức độ sai khác độ tin cậy 95% Nhiệt độ ngâm có ảnh hưởng đáng kể đến q trình bóc vỏ tiêu đen Nhiệt độ tác động đến trình trương nước vỏ tiêu, làm liên kết vỏ sọ tiêu lỏng lẻo Ngoài ra, nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt động hệ enzyme cellulose enzyme pectinase nội sinh, có vai trị việc làm mềm vỏ tiêu Khi ngâm tiêu nhiệt độ 35 oC, hiệu xuất bóc vỏ đạt 92,2 % Việc gia tăng nhiệt độ từ 35 - 50 oC khơng làm thay đổi hiệu suất bóc vỏ Nhiệt độ cao gây ức chế hoạt tính hệ enzyme cellulase, pectinase không làm mềm cấu trúc lớp vỏ Do đó, chúng tơi nhận thấy, nhiệt độ 35 oC phù hợp cho q trình bóc vỏ tiêu đen Thử nghiệm bổ sung pectinase để nâng cao q trình bóc vỏ tiêu Trong q trình ngâm, hạt tiêu giải phóng enzyme cellulase, pectinase để thủy phân phân tử cellulose, pectin lớp vỏ Tuy nhiên, hoạt độ enzyme không cao thời gian tự phân lớp vỏ thường kết thúc sớm Trong thí nghiệm này, chúng tơi đánh giá hoạt độ thời điểm hạt tiêu ngừng sản sinh enzyme cellulase pectinase, làm sở cho việc bổ sung pectinase, hỗ trợ q trình bóc vỏ Bảng 13 Hàm lượng đường khử hoạt độ enzyme dịch nước ngâm tiêu Thời gian ngâm tiêu (giờ) Hàm lượng đường khử (mg/mL) Hoạt độ cellulase (UI/mL) Hoạt độ pectinase (UI/mL) 0,26a ± 0,02 0,01a ± 0,01 0,04a ± 0,02 24 0,75b ± 0,08 0,26b ± 0,07 0,34b ± 0,05 48 0,79b ± 0,06 0,21b ± 0,02 0,28b ± 0,04 trị Hình 14 Hàm lượng đường khử hoạt độ enzyme dịch nước ngâm tiêu Các kí tự khác cột biểu thị mức độ sai khác độ tin cậy 95% Kết đánh giá hoạt độ enzyme cho thấy trái tiêu sản sinh enzyme cellulase, enzyme pectinase hòa tan vào dịch ngâm Sau thời gian ngâm giờ, hoạt độ loại enzyme thấp Tuy nhiên, sau ngâm 24 giờ, hoạt độ enzyme cellulase pectinase tăng lên nhanh, đạt 0,26 0,34 UI/mL nước ngâm tiêu Sau 24 tiếp theo, hoạt độ enzyme cellulase pectinase không thay đổi Nguyên nhân ngắt khỏi cuống, vỏ tiêu sản sinh ethylene, chất đóng vai trị hormone thực vật, kích hoạt loạt trình dẫn tới việc tạo enzyme cellulase pectinase Các enzyme thủy phân thành phần vỏ tiêu cellulose pectin tạo thành phân tử đường đơn Bằng chứng việc hàm lượng đường khử dịch ngâm tiêu tăng nhanh sau 24 giờ, đạt 0,75 mg/mL, ổn định sau 24 ngâm Tuy nhiên, hàm lượng đường khử hoạt độ enzyme nghiên cứu không tăng sau 48 ngâm Điều cho thấy trái tiêu ngừng sản sinh enzyme sau khoảng 24 hoạt độ giảm dần theo thời gian Thực tế, để đạt hiệu bóc vỏ tiêu cao, phương pháp truyền thống thường ngâm tiêu khoảng - 10 ngày Trong trình này, vỏ tiêu làm mềm bóc tách khỏi phần lõi hoạt động vi sinh vật có sẵn bề mặt vỏ Từ kết trên, nhận thấy việc bổ sung pectinase vào thời điểm enzyme nội sinh trái tiêu ngừng tạo ra, cắt đứt mối liên kết vi sợi cellulose lớp vỏ, từ giúp gia tăng hiệu rút ngắn thời gian bóc vỏ tiêu Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung pectinase với hoạt độ 2; 4; 6; 10 UI/50 g tiêu vào dịch ngâm tiêu sau 24 Sau ủ, kết thí nghiệm thể bảng 14 hình 15 Bảng 14 Ảnh hưởng hoạt độ enzyme pectinase lên hiệu suất bóc vỏ tiêu Hoạt độ pectinase bổ sung (UI/50g tiêu) Hiệu suất bóc vỏ (%) 74,90 ± 3,80 81,76 ± 2,14 85,96 ± 1,68 88,54 ± 1,73 10 87,42 ± 2,00 86,54 ± 1,65 Nhìn chung, bổ sung enzyme pectinase sau 24 ngâm nâng cao hiệu bóc vỏ tiêu Các nghiệm thức bổ sung pectinase với hoạt độ 6; 10 UI không đem lại sai khác đáng kể so với xử lý hoạt độ UI/50 g tiêu Hình 15 Ảnh hưởng hoạt độ pectinase bổ sung đến q trình bóc vỏ tiêu Các kí tự khác cột biểu thị mức độ sai khác độ tin cậy 95 % Bên cạnh ảnh hưởng hoạt độ, thời gian thủy phân ảnh hưởng đến độ bền enzyme pectinase, đặc biệt môi trường phản ứng có chứa nhiều chất khác Kết tác động thời gian thủy phân lên hiệu bóc vỏ thể bảng 15 hình 16 Bảng 15 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả hoạt động enzyme pectinase dịch ngâm tiêu Nhiệt độ thủy Hiệu suất bóc 55 phân (oC) vỏ tiêu (%) 30 81,38 ± 2,08 35 84,12 ± 1,08 40 89,39 ± 2,14 45 87,30 ± 1,89 50 87,39 ± 0,76 86,40 ± 1,21 Hình 16 Ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân đến trình bóc vỏ tiêu Các kí tự khác cột biểu thị mức độ sai khác độ tin cậy 95 % Ở hoạt độ bổ sung UI/ 50 g tiêu, xử lý nhiệt độ 40 oC đem lại hiệu bóc vỏ cao Gia tăng nhiệt độ thủy phân ức chế hoạt tính enzyme pectinase Điều cho thấy, rút ngắn thời gian ngâm bổ sung enzyme pectinase với hoạt độ UI/ 50 g tiêu, giữ nhiệt độ 40 oC Sau 28 giờ, hiệu suất bóc vỏ tiêu đạt 89,39 % Trong trường hợp khơng bổ sung enzyme pectinase, điều chỉnh nhiệt độ trình ngâm 35 oC, sau 48 giờ, hiệu suất bóc vỏ đạt 92,20 % (hình 13) Đây hai giải pháp để người sản xuất áp dụng tùy theo điều kiện cụ thể sở chế tiêu sọ Đánh giá hiệu suất bóc vỏ hàm lượng piperine quy trình bóc vỏ tiêu thử nghiệm Với kết thu từ thí nghiệm trước, chúng tơi tiến hành thử nghiệm nâng cấp quy mơ bóc vỏ tiêu Ngâm kg tiêu xanh lít nước, giữ nhiệt độ phịng (30 o C) Sau 24 giờ, bổ sung enzyme pectinase với tổng hoạt độ 400 UI, ngâm nhiệt độ 40 oC Nghiệm thức đối chứng tiến hành điều kiện tương tự với enzyme pectinase bị bất hoạt Tiêu sau bóc vỏ sấy khô nhiệt độ 45 - 50 oC, xác định hiệu suất bóc vỏ so sánh hàm lượng piperine với vài sản phẩm lưu hành thị trường Kết thí nghiệm thể bảng 16 hình 17 Bảng 16 Hiệu suất bóc vỏ tiêu quy mơ pilot Chỉ tiêu Bổ sung enzyme pectinase (%) Nghiệm thức đối chứng (%) Kết 93,2 ± 1,2 75,5 ± 2,5 Hình 17 Hiệu suất bóc vỏ tiêu quy mơ pilot Các kí tự khác cột biểu thị mức độ sai khác độ tin cậy 95 % Khi tăng khối lượng tiêu lần ngâm từ 50 g lên kg, chúng tơi nhận thấy hiệu suất q trình bóc vỏ khơng khác biệt nhiều so với quy mơ thí nghiệm độ tin cậy 95 % Sau 28 giờ, hiệu suất bóc vỏ đạt 93,20 ± 1,23 % Kết nghiên cứu thấp so với kết Bùi Văn Miên công bố vào năm 2004, với tỷ lệ bóc vỏ đạt 95 % Tuy nhiên, nghiên cứu Bùi Văn Miên cộng sử dụng lượng nước ngâm tiêu nhiều thời gian bóc vỏ kéo dài từ - ngày (Bùi Văn Miên, 2004) Hiệu suất bóc vỏ thí nghiệm tương tự với nghiên cứu Bùi Thanh Hịa Võ thị Ngọc Thanh (2010), nhóm tác giả sử dụng chế phẩm có chứa nấm Aspergillus sp để thúc đẩy q trình bóc vỏ tiêu, hiệu suất bóc vỏ đạt 93 % Tuy nhiên, nghiên cứu rút ngắn đáng kể mặt thời gian Q trình bóc vỏ tiêu tốn 28 so với ngày nhóm tác giả Bùi Thanh Hịa cơng bố Nguyễn Thị Hồi Trâm cơng bố kết bóc vỏ đạt hiệu suất 97 % sau 48 ngâm với chế phẩm nấm Trichoderma hahatum Tuy nhiên, lượng chế phẩm sử dụng thí nghiệm lên đến 15 % (Nguyễn Thị Hoài Trâm, 2013) Kết thí nghiệm sở để chúng tơi nâng cấp quy mơ bóc vỏ tiêu tương lai tiến tới áp dụng vào thực tiễn sản xuất Tiêu sọ thu từ thí nghiệm trước sấy khô nhiệt độ khoảng 45 oC đến độ ẩm khoảng 10 % Đánh giá hàm lượng piperine tiêu sọ theo tiêu chuẩn TCVN 9683:2013 Song song đó, chúng tơi đánh giá hàm lượng piperine số sản phẩm tiêu sọ phổ biến thị trường (sản phẩm Tiêu sọ mộc Pepper công ty Phương Linh; sản phẩm Tiêu sọ Phú Quốc công ty Minh Hà) Kết đánh giá thể bảng 17 hình 18 Bảng 17 Hàm lượng piperine tiêu bóc vỏ thử nghiệm số sản phẩm loại Hàm lượng piperine (%) Tiêu bóc vỏ thử nghiệm 6,58 ± 0,10 Độ ẩm (%) 11,0 ± 0,7 Tiêu sọ mộc 6,51 ± 0,07 10,0 ± 0,3 Tiêu sọ phú quốc 4,64 ± 0,07 Sản phẩm 8,0 ± 0,3 Hình 18 Hàm lượng piperine sản phẩm tiêu sọ thử nghiệm số sản phẩm tiêu sọ phổ biến thị trường Các kí tự khác cột biểu thị mức độ sai khác độ tin cậy 95 % Kết nghiên cứu cho thấy, tiêu bóc vỏ theo quy trình thử nghiệm có hàm lượng chất cay piperine tương đương cao sản phẩm thị trường, đạt 6,58 % trọng lượng khô Kết thu tốt so với công bố số nhóm tác giả gần Bùi Thanh Hịa (2010) Nguyễn Thị Mỹ Hiền (2010), với hàm lượng piperine sản phẩm tiêu sọ đạt từ 5,0 - 5,7 % Có thể việc giảm thời gian lượng nước ngâm tiêu hạn chế q trình thất piperine Hình 19 Tiêu xanh nguyên liệu (a) sản phẩm tiêu sau bóc vỏ (b) CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong số chủng Aspergillus niger nghiên cứu, chủng B2 có khả sinh tổng hợp enzyme pectinase tốt môi trường bán rắn chứa 12 % bột cùi bưởi, lượng dịch khoáng bổ sung chiếm 40 %, pH 5,5 Sau ngày, hoạt độ pectinase canh trường đạt 4,82 UI/g Trên quy mô sản xuất thử 10 kg/mẻ, chế phẩm có hoạt độ pectinase đạt 91,3 % so với ni cấy bình tam giác Nghiên cứu cho thấy có giải phóng enzyme cellulase pectinase nội sinh từ vỏ tiêu ngâm tiêu với nước khoảng 24 Trong trường hợp không bổ sung enzyme pectinase, hiệu bóc vỏ tiêu đạt cao bổ sung nước với tỷ lệ tiêu/nước 1/1, sau 48 ngâm nhiệt độ 35 oC, hiệu suất bóc vỏ tiêu đạt 92,20 % Trên quy mơ thử nghiệm với khối lượg kg, tiêu ngâm nước 24 giờ, bổ sung enzyme pectinase với hoạt độ UI/ 50 g tiêu, ủ nhiệt độ 40 oC thời gian giờ, hiệu suất bóc vỏ tiêu đạt 93,20 % Hàm lượng piperine sản phẩm tiêu sọ thử nghiệm đạt 6,58 %, cao so với số sản phẩm phổ biến thị trường Kết thử nghiệm sở bước đầu để chúng tơi xây dựng quy trình sản xuất tiêu sọ hoàn chỉnh 4.2 Kiến nghị Qua trình nghiên cứu, chúng tơi đề xuất số kiến nghị để khắc phục phát triển thêm đề tài: - Trong q trình ni cấy bán rắn, chủng Aspergillus niger tạo nhiều bào tử, cần có phương án để thu nhận chế phẩm hiệu quả, tránh lây nhiễm cho môi trường sản xuất ảnh hưởng tới sức khỏe người sản xuất - Nghiên cứu điều kiện để thu nhận chế phẩm enzyme pectinase bán tinh quy mô kg nguyên liệu/ mẻ - Thử nghiệm hiệu chế phẩm pectinase bán tinh quy trình chế biến cà phê theo phương pháp ướt ... Aspergillus niger phân lập địa phương, chất giàu pectin, đề xuất đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase từ Aspergillus niger thử nghiệm bóc vỏ tiêu (Pepper nigrum L.) 2 Mục tiêu đề tài - Nghiên. .. cứu: - Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme pectinase từ Aspergillus niger quy mơ thí nghiệm - Nghiên cứu điều kiện để nâng cao khả bóc vỏ tiêu chế phẩm enzyme pectinase CHƯƠNG... tiêu đề tài - Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase bán tinh sạch, dạng bột - Thử nghiệm khả bóc vỏ tiêu chế phẩm Đối tượng nghiên cứu: - Hồ tiêu (Pepper nigrum L.) : Tiêu già thu hái, loại