Nghiên cứu tác dụng kháng nấm và độc tính bán trường diễn của tinh dầu lá chúc (citrus hystrix) trồng ở an giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ NGỌC TƯƠI NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG NẤM VÀ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA TINH DẦU LÁ CHÚC (Citrus hystrix) TRỒNG Ở AN GIANG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS PHẠM THÀNH SUÔL ThS CAO THỊ KIM HOÀNG Cần Thơ - 2018 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến thầy PGS.TS Phạm Thành Suôl – Phó Trưởng khoa Dược, Trưởng liên mơn Dược lý - Dược lâm sàng, khoa Dược, Trường Đại học Y dược Cần Thơ, người thầy với tri thức tâm huyết hướng dẫn tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ cho em suốt trình thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn ThS Trần Hồng Yến, ThS Cao Thị Kim Hồng bảo tận tình chu đáo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm giúp cho em hồn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô liên môn Dược lý – Dược lâm sàng Trường Đại học Y dược Cần Thơ giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi thời gian em thực luận văn Em xin cảm ơn cô ThS.Bs Trần Kim Cúc thầy ThS.Bs Nguyễn Văn Luân hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi để luận văn hồn thành tốt Em vơ biết ơn tất Thầy Cô khoa Dược – Trường Đại học Y dược Cần Thơ hết lòng dạy dỗ, tạo điều kiện học tập tốt truyền đạt cho em nhiều kiến thức kỹ suốt gần năm qua Xin cảm ơn chị Hoa Xuân chị Họa Mi Dược K38 chia sẻ kinh nghiệm để em hồn thành luận văn tốt Xin cảm ơn bạn Thiên Trí Dược K39 ủng hộ tinh thần giúp đỡ lúc thực luận văn Con cảm ơn gia đình ln dõi theo ủng hộ, tạo điều kiện để thực tốt luận văn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Cần Thơ, ngày 12 tháng năm 2018 Nguyễn Thị Ngọc Tươi i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU .iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Chúc 1.1.1 Giới thiệu chung mô tả 1.1.2 Phân bố, thu hái chế biến 1.1.3 Tính vị, tác dụng cơng dụng 1.1.4 Tổng quan tinh dầu Chúc 1.1.5 Các nghiên cứu tác dụng dược lý hoạt tính sinh học tinh dầu Chúc…… 1.2 Tổng quan mơ hình thử tác dụng kháng nấm 1.2.1 Các vi nấm gây bệnh thường gặp 1.2.2 Các phương pháp thử tác dụng kháng nấm in vitro 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng 10 1.3 Tổng quan mơ hình thử độc tính bán trường diễn 12 1.3.1 Độc tính thuốc 12 1.3.2 Mục tiêu thử nghiệm 12 1.3.3 Thời gian thử 12 1.3.4 Liều dùng 12 1.3.5 Các thơng số theo dõi độc tính bán trường diễn 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng, hóa chất thiết bị nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2 Động vật thử nghiệm 21 2.1.3 Hóa chất thử nghiệm 21 ii 2.1.4 Trang thiết bị, dụng cụ thử nghiệm 21 2.1.5 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Khảo sát tác dụng kháng nấm tinh dầu chúc 22 2.2.2 Khảo sát độc tính bán trường diễn tinh dầu Chúc 26 2.3 Phân tích kết thống kê 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng nấm tinh dầu Chúc 29 3.1.1 Kết định tính khả kháng nấm 29 3.1.2 Kết xác định MIC tinh dầu Chúc 30 3.2 Kết khảo sát độc tính bán trường diễn tinh dầu Chúc 30 3.2.1 Tổng trạng chung chuột thí nghiệm 30 3.2.2 Kết xét nghiệm huyết học 32 3.2.3 Kết xét nghiệm sinh hóa 35 3.2.4 Kết giải phẫu mô học gan, thận 37 CHƯƠNG BÀN LUẬN 44 4.1 Khảo sát tác dụng kháng nấm tinh dầu Chúc 44 4.2 Khảo sát độc tính bán trường diễn tinh dầu Chúc 46 4.2.1 Ảnh hưởng tinh dầu Chúc lên tổng trạng chung 46 4.2.2 Ảnh hưởng tinh dầu Chúc lên thông số huyết học 46 4.2.3 Ảnh hưởng tinh dầu Chúc lên chức gan, thận 47 KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt MIC Minimal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MBC Minimal bactericidal concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu ECG Electrocardiogram DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl LC IC50 Lethal concentration The half maximal inhibitory concentration AST Aspartaminotransferase ALT Alaninaminotransferase SAB Sabouraud dextrose agar MHA Mueller-Hinton agar DMSO Dimethyl sulfoxide Điện tâm đồ iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Chức loại bạch cầu 15 Bảng 1.2 Một số số huyết học bình thường chuột 17 Bảng 1.3 Một số số sinh hóa bình thường chuột 20 Bảng 3.1 Định tính khả kháng nấm (đường kính vịng kháng nấm, mm) 29 Bảng 3.2 Giá trị MIC tinh dầu Chúc 30 Bảng 3.3 Thành phần bạch cầu lô thử nghiệm sau 30 ngày 34 Bảng 3.4 Thành phần bạch cầu lô thử nghiệm sau 60 ngày 34 v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây Chúc (Citrus hystrix) Hình 2.1 Đĩa thạch định tính khả kháng nấm 24 Hình 2.2 Đĩa thạch xác định MIC 26 Hình 3.1 Kết định tính khả kháng nấm 29 Hình 3.2 Kết MIC tinh dầu Chúc 30 Hình 3.3 Sự thay đổi trọng lượng lô chuột thử nghiệm 31 Hình 3.4 Các số hồng cầu lô thử nghiệm sau 30 ngày 60 ngày 32 Hình 3.5 Chỉ số tiểu cầu lô thử nghiệm sau 30 ngày 60 ngày 33 Hình 3.6 Số lượng bạch cầu lơ thử nghiệm sau 30 ngày 60 ngày 33 Hình 3.7 Các số AST ALT lô thử nghiệm sau 60 ngày 35 Hình 3.8 Chỉ số ure creatinin huyết lơ thử nghiệm sau 60 ngày 36 Hình 3.9 Đại thể lô uống tinh dầu Chúc liều 200mg/Kg sau 30 ngày 37 Hình 3.10 Đại thể lô uống tinh dầu Chúc liều 400mg/Kg sau 30 ngày 37 Hình 3.11 Đại thể lô uống tinh dầu Chúc liều 600mg/Kg sau 30 ngày 37 Hình 3.12 Đại thể lơ Dầu sau 30 ngày 37 Hình 3.13 Đại thể lơ Nước sau 30 ngày 38 Hình 3.14 Đại thể lơ uống tinh dầu Chúc liều 200mg/Kg sau 60 ngày 38 Hình 3.15 Đại thể lô uống tinh dầu Chúc liều 400mg/Kg sau 60 ngày 38 Hình 3.16 Đại thể lô uống tinh dầu Chúc liều 600mg/Kg sau 60 ngày 39 Hình 3.17 Đại thể lơ Dầu sau 60 ngày 39 Hình 3.18 Đại thể lơ Nước sau 60 ngày 39 Hình 3.19 Vi thể gan lơ thử nghiệm sau 30 ngày 40 Hình 3.20 Vi thể thận lơ thử nghiệm sau 30 ngày 41 Hình 3.21 Vi thể gan lô thử nghiệm sau 60 ngày 42 Hình 3.22 Vi thể thận lô thử nghiệm sau 60 ngày 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Người Việt Nam từ bao đời biết sử dụng loài cỏ tự nhiên để làm thức ăn, làm gia vị, mỹ phẩm, tạo mùi thơm đặc biệt vị thuốc thuốc dân gian để chữa bệnh Cho đến ngày nay, nhiều loài thực vật cho thấy giá trị chúng chữa bệnh kinh tế Các sản phẩm tinh dầu, hương liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày ưa chuộng, công nghiệp đại trọng đầu tư khai thác Cây Chúc (Citrus hystrix), lồi chứa tinh dầu có giá trị phát bước nghiên cứu phát triển Ở Việt Nam, Chúc loài thực vật đặc hữu tỉnh An Giang Dân gian dùng Chúc loại gia vị, dùng để gội đầu, trồng Chúc quanh nhà để đuổi rắn Toàn có tinh dầu thơm nên ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực từ ẩm thực, dược phẩm đến mỹ phẩm Hiện nay, chưa có đề tài nghiên cứu tinh dầu Chúc nước cơng bố Trong đó, tinh dầu Chúc nghiên cứu khoa học giới chứng minh có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tốt, đặc biệt với dòng vi khuẩn thường gặp viêm nhiễm đường hô hấp [31] Đồng thời, tinh dầu Chúc biết có mùi thơm dễ chịu, có thời gian bền mùi dài [30] Citrus hystrix có tiềm nghiên cứu thương mại hóa lĩnh vực hương liệu , giải pháp chống côn trùng, làm dầu gội, hợp chất chống oxy hóa sản phẩm làm đẹp [23] Cây Chúc cho thấy lồi có nhiều cơng dụng mang lại hiệu kinh tế cao, nguồn dược liệu quý cần đẩy mạnh phát triển Do vậy, sản phẩm từ tinh dầu Chúc có nhiều hội tiếp nhận sử dụng rộng rãi Theo định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 Thủ tướng Chính phủ: “Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 định hướng đến năm 2030” [12] với mục tiêu phát triển dược liệu thành ngành sản xuất hàng hóa sở ứng dụng khoa học cơng nghệ đại nhằm tạo sản phẩm có chất lượng cao, đồng thời quản lý khai thác, sử dụng bền vững nguồn dược liệu Do đó, việc nghiên cứu phát triển Chúc tỉnh An Giang góp phần bảo tồn phát triển vốn quý y dược học cổ truyền nước nhà, đồng thời làm tăng tỷ trọng sử dụng nguồn nguyên liệu thiên nhiên Việt Nam Xuất phát từ thực tế trên, nhằm làm rõ hoạt tính sinh học độ an toàn tinh dầu Chúc, giúp cho việc nghiên cứu tinh dầu Chúc ngày rõ ràng, từ góp phần nâng cao giá trị sử dụng Chúc, tiến hành “Nghiên cứu tác dụng kháng nấm độc tính bán trường diễn tinh dầu chúc (Citrus hystrix) trồng An Giang” với hai mục tiêu sau: 1) Khảo sát tác dụng kháng nấm tinh dầu Chúc 2) Khảo sát độc tính bán trường diễn tinh dầu Chúc