Thông tin tài liệu
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG H P BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ Bước đầu xác định dấu ấn sinh học KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh ung thư đại trực tràng kỹ thuật Realtime PCR Trường Đại học Y tế công cộng U H Chủ nhiệm đề tài: TS Dương Hồng Quân Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trung tâm Xét nghiệm Mã số đề tài (nếu có): CS 21.22-04 Năm 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG H P BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ Bước đầu xác định dấu ấn sinh học KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh ung thư đại trực tràng kỹ thuật Realtime PCR Trường Đại học Y tế công cộng U H Chủ nhiệm đề tài: TS Dương Hồng Quân Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trung tâm Xét nghiệm Cấp quản lý: Trường Đại học Y tế công cộng Mã số đề tài (nếu có): CS 21.22-04 Thời gian thực hiện: từ tháng 12 năm 2021 đến tháng 08 năm 2022 Tổng kinh phí thực đề tài 50 triệu đồng Trong đó: kinh phí SNKH 50 triệu đồng Nguồn khác: triệu đồng Năm 2022 Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp sở Tên đề tài: Bước đầu xác định dấu ấn sinh học KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh ung thư đại trực tràng kỹ thuật Realtime PCR Trường Đại học Y tế công cộng Chủ nhiệm đề tài: Dương Hồng Quân Cơ quan chủ trì đề tài: Trung tâm Xét nghiệm Cơ quan quản lý đề tài: Trường Đại học Y tế công cộng Thư ký đề tài: Trần Thị Thu Phương Phó chủ nhiệm đề tài ban chủ nhiệm đề tài (nếu có): Danh sách người thực chính: H P - TS Dương Hồng Quân - TS Nguyễn Thuận Lợi - ThS Đào Thị Nguyệt - ThS Đặng Thị Nga - ThS Nguyễn Phương Thoa U - CN Ngô Thị Phương Oanh - CN Trần Thị Thu Phương - CN Nguyễn Thị Cẩm Thu H - CN Phạm Thị Thu Phương Các đề tài nhánh (đề mục) đề tài: Không Thời gian thực đề tài: Từ tháng 12 năm 2021 đến tháng 08 năm 2022 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT H.E : Hematoxyline Eosin NCCN : Mạng lưới ung thư toàn cầu (National Comprehensive Cancer Network) P.A.S : Pediodic acid Schiff TNM : Khối u, hạch vùng, di (Tumor-Node-Metastasis) UICC : Hội chống ung thư Quốc tế (Union International Against Cancer) UTĐTT : Ung thư đại trực tràng WHO : Tổ chức Y tế giới (World Health Organization) H P U H MỤC LỤC PHẦN A: BÁO CÁO TÓM TẮT NGHIÊN CỨU 10 PHẦN B: TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI 14 1.KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI 14 2.ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỄN ĐỜI SỐNG XÃ HỘI 15 3.ĐÁNH GIÁ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT 15 4.CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 16 PHẦN C: NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ 17 1.ĐẶT VẤN ĐỀ 17 H P 2.MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 18 3.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 18 3.1 Một số khái niệm, qui định, tiêu chí, phương pháp đánh giá 18 3.2 Ung thư đại trực tràng 18 3.2.1 Đại cương ung thư đại trực tràng 19 3.2.2 Sự tiến triển ung thư đại trực tràng 19 3.2.3 Phân loại ung thư đại trực tràng theo TMN 20 U 3.2.4 Phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng ung thư đại trực tràng 20 3.3 Dấu ấu sinh học KIAA1199 21 3.3.1 Nghiên cứu nước 21 H 3.3.2 Nghiên cứu nước 22 3.4 Kỹ thuật Realtime PCR 23 3.4.1 Nguyên tắc kỹ thuật Realtime PCR 23 3.4.2 Kỹ thuật Realtime PCR dùng màu huỳnh quang chèn SYBR green I 24 3.4.3 Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR 25 3.5 Giới thiệu địa bàn nghiên cứu 25 3.6 Sơ đồ nghiên cứu 27 4.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 4.1 Đối tượng nghiên cứu 27 4.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu bệnh phẩm khối nến 27 4.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ mẫu bệnh phẩm khối nến 28 4.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 4.3 Thiết kế nghiên cứu 28 4.4 Phương pháp chọn mẫu 28 4.5 Phương pháp nghiên cứu 28 4.5.1 Phương pháp thiết kế mồi 28 4.5.2 Phương pháp nhuộm H.E 29 4.5.3 Phương pháp nhuộm P.A.S 30 4.5.4 Phương pháp thu nhận mẫu khối nến 31 4.5.5 Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu khối nến 31 4.5.6 Phương pháp đo nồng độ RNA tách chiết từ mẫu khối nến 33 4.5.7 Phương pháp tổng hợp cDNA 34 4.5.8 Phương pháp Realtime PCR xác định biểu biện dấu ấn KIAA1199 34 4.6 Phương pháp phân tích số liệu 35 4.7 Trang thiết bị hóa chất sinh phẩm nghiên cứu 36 4.7.1 Trang thiết bị 36 4.7.2 Hóa chất sinh phẩm nghiên cứu 36 4.8 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 36 5.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 5.1 Xác định cặp mồi đặc hiệu khuếch đại KIAA1199 GAPDH 36 H P 5.2 Đặc điểm người bệnh ung thư đại trực tràng 38 U 5.3 Xác định nồng độ độ tinh RNA tách từ người bệnh ung thư đại trực tràng 40 5.4 Xác định tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh ung H thư đại trực tràng phản ứng Realtime PCR 42 BÀN LUẬN 43 7.KẾT LUẬN 46 8.KHUYẾN NGHỊ 46 9.TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 10 PHỤ LỤC (NẾU CÓ) 50 PHẦN D: GIẢI TRÌNH CHỈNH SỬA: PHẦN NÀY ÁP DỤNG SAU KHI ĐỀ TÀI ĐÃ ĐƯỢC THÔNG QUA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU KẾT QUẢ 73 DANH MỤC BẢNG BẢNG 5.1 ĐẶC TÍNH VÀ THƠNG SỐ CỦA CẶP MỒI KIAA1199 VÀ GAPDH 37 BẢNG 5.2 NGUỒN GỐC VÀ ĐỘ TƯƠNG ĐỒNG CỦA CẶP MỒI KIAA1199 VÀ GAPDH .38 BẢNG 5.3 GIÁ TRỊ CT CỦA GEN KIAA1199 VÀ GAPDH .38 BẢNG 5.4 ĐẶC ĐIỂM NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG (N=25) 39 BẢNG 5.5 NỒNG ĐỘ VÀ ĐỘ TINH SẠCH RNA TÁCH TỪ VÙNG MÔ U VÀ H P MÔ LÀNH CỦA NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .42 U H DANH MỤC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ 5.1 TỶ LỆ BIỂU HIỆN DẤU ẤN KIAA1199 TẠI VÙNG MÔ U VÀ MÔ LÀNH Ở MẪU KHỐI NẾN CỦA NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .43 H P U H DANH MỤC HÌNH HÌNH 3.1 TĨM LƯỢC CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG KHI SỬ DỤNG CHẤT HUỲNH QUANG SYBR GREEN I TRONG REALTIME PCR 24 HÌNH 4.1: VÙNG MƠ U VÀ VÙNG MÔ LÀNH TRÊN MẪU MÔ ĐÚC NẾN CỦA NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VÙNG MÔ U: KHU VỰC/VÙNG ĐÁNH DẤU TRỊN; VÙNG MƠ LÀNH: KHU VỰC/VÙNG ĐÁNH DẤU VUÔNG .31 HÌNH 5.1 KẾT QUẢ NHUỘM H.E VÙNG MÔ LÀNH VÀ MÔ U CỦA NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 40 H P HÌNH 5.2 KẾT QUẢ NHUỘM P.A.S ĐÁNH GIÁ SỰ XÂM LẤM CỦA TẾ BÀO U TẠI VÙNG MÔ U VỚI CÁC VÙNG MÔ LÂN CẬN KẾ BÊN CỦA NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 41 U H DANH MỤC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ 3.1 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ BIỂU HIỆN DẤU ẤN KIAA1199 Ở MẪU KHỐI NẾN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 27 H P U H 5µl H2O Sau đó, hỗn hợp ủ 65oC phút, tiếp đến ủ đá phút Tiếp theo, bổ sung 5µl First-Strand buffer 5X; 1µl DTT 0.1M; 1µl RNAaseOUT; 1µl SuperScript III RT (200 U/µl) Trộn ủ 55oC 60 phút tiến hành sinh phẩm Primescript RT (Takara) theo hướng dẫn nhà sản xuất Phương pháp Realtime PCR xác định biểu biện dấu ấn KIAA1199 Ứng dụng quy trình kỹ thuật Realtime PCR xác định biểu dấu ấn KIAA1199 phần mô bệnh mô thường lấy từ mẫu bệnh phẩm khối nến người bệnh UTĐTT Đồng thời, gen nội chuẩn GAPDH sử dụng để đánh giá chất lượng mẫu phản ứng Realtime PCR Quy trình chạy phản ứng Realtime PCR thực 95°C phút, sau 45 chu kỳ 95°C 15 giây, H P 58°C 30 giây tiến hành sinh phẩm TB Green Premix Ex TaqII (Takara) theo hướng dẫn nhà sản xuất Thể tích hỗn hợp phản ứng Realtime PCR (20 µl) gồm TB Green Premix Ex Taq II (10 µl), mồi KIAA1199_F 10µM (0.8 µl), mồi KIAA1199_R 10µM (0.8 µl), cDNA (2 µl) H2O vơ trùng (6µl) Phản ứng Realtime PCR thực hệ thống Applied Biosystems 7500 Mức độ biểu U phiên mã gen KIAA1199 mẫu mô đúc khối nến người bệnh ung thư đại trực tràng tính tốn dựa vào kết Realtime PCR gen KIAA1199 gen GAPDH thông qua chu kỳ ngưỡng (Ct) Sử dụng phương pháp -ɅɅCt Livak H để định lượng tương đối mức độ phiên mã gen KIAA1199 vùng mô u mô lành theo công thức cụ thể sau Chu kỳ ngưỡng gen KIAA1199 vùng mô u: Ct KIAA1199 (mô u) Chu kỳ ngưỡng gen KIAA1199 vùng mô lành: Ct KIAA1199 (mô lành) Chu kỳ ngưỡng gen GADPH vùng mô u: Ct GADPH (mô u) Chu kỳ ngưỡng gen GADPH vùng mô lành: Ct GADPH (mô lành) ɅCt mô u= Ct KIAA1199 (mô u) - Ct GADPH (mô u) ɅCt mô lành= Ct KIAA1199 (mô lành) - Ct GADPH (mô lành) 78 ɅɅCt= ɅCt mô u - ɅCt mô lành Tỷ lệ biểu KIAA1199 vùng mô u so với vùng mô lành mẫu mô đúc nến người bệnh ung thư đại trực tràng R= 2-ɅɅCt KẾT QUẢ Xác định cặp mồi đặc hiệu khuếch đại KIAA1199 GAPDH Chương trình Oligo Analyzer 3.0 trực tuyến trang Web IDT (41) sử dụng để kiểm tra đặc tính cặp mồi KIAA1199 GAPDH Như kết thể Bảng 1, đặc tính thơng số cặp mồi KIAA1199 GAPDH chiều dài, %GC Tm (oC) thỏa mãn yêu cầu thiết kế mồi Trong đó, H P độ dài mồi nằm khoảng từ 15-30bp, %GC mồi KIAA1199 GAPDH nằm khoảng từ 40-60% Tm (oC) nằm khoảng 60oC Như vậy, hai cặp mồi dùng để khuếch đại biểu KIAA1199 GAPDH phù hợp đáp ứng yêu cầu thông số kỹ thuật độ dài, %GC Tm (oC) U Bảng Đặc tính thơng số cặp mồi KIAA1199 GAPDH Gen đích Mồi Trình tự mồi (bp) H ’ ’ KIAA1199 KIAA1199_F -CCAGGAATGTTGAATGTCT-3 GADPH Độ dài %GC (bp) Tm (oC) 19 42.1 60 KIAA1199_R 5’-ATTGGCTCTTGGTGAATG-3’ 18 44.4 60 5’-AACAGCCTCAAGATCATC-3’ 18 44.4 60 5’-CACGATACCAAAGTTGTC-3’ 18 44.4 60 GADPH_F GADPH_R Để khẳng định cặp mồi KIAA1199 thiết kế sử dụng để xác định tỷ lệ KIAA1199 người bệnh UTĐTT, RNA tách chiết từ dòng tế bào UTĐTT (HT-29), dòng tế bào UTĐTT thương mại hóa có tỷ lệ biểu cao với dấu ấn KIAA1199 Như kết mô tả Bảng 2, giá trị Ct gen KIAA1199 (Ct=27.56) gen GAPDH (Ct=15.48) nhỏ 32 Như vậy, cặp 79 mồi KIAA1199 hoàn toàn đáp ứng để xác định tỷ lệ biểu KIAA1199 mẫu bệnh phẩm UTĐTT Bảng Giá trị Ct gen KIAA1199 GADPH Gen đích Giá trị Ct KIAA1199 27.56 GADPH 15.48 Đặc điểm người bệnh ung thư đại trực tràng Như kết mô tả đặc điểm người bệnh UTĐTT giới tính, độ tuổi, H P mơ bệnh học giai đoạn bệnh thể Bảng Trong đó, với đặc điểm giới tính 25 người bệnh UTĐTT tiến hành nghiên cứu có 14 nam giới, chiếm 56% 11 nữ, chiếm 44%; độ tuổi nhóm tuổi > 70 tuổi có tỷ lệ mắc cao 12 người bệnh, chiếm 48% nhóm tuổi độ tuổi từ 41-50 tuổi bị mắc 0, chiếm 0%, đặc biệt người bệnh có độ tuổi thấp ≤ 40 tuổi người U bệnh, chiếm 4% số trường hợp mắc UTĐTT; mơ bệnh học ung thư biểu mơ tuyến chiếm chiếm 100% khơng có người bệnh bị ung thư biểu mô vảy; giai đoạn bệnh chủ yếu tập trung giai đoạn III với 14 người bệnh, chiếm 56%, H tiếp đến ung thư giai đoạn II với người bệnh, chiếm 32% Như tỷ lệ UTĐTT nam giới cao nữ giới, chủ yếu nằm độ tuổi >70 tuổi, dạng ung thư biểu mô tuyến người bệnh chủ yếu giai đoạn III Bảng Đặc điểm người bệnh ung thư đại trực tràng (n=25) Đặc điểm Số người (n=25) Tỷ lệ (%) Nam 14 56 Nữ 11 44 Giới tính Độ tuổi 80 ≤ 40 41-50 0 51-60 20 61-70 28 > 70 12 48 Ung thư biểu mô tuyến 25 100 Ung thư biểu mô vảy 0 Mô bệnh học H P Giai đoạn bệnh Giai đoạn I Giai đoạn II Giai đoạn III U Giai đoạn IV Tổng 32 14 56 25 100 Xác định nồng độ độ tinh RNA tách từ người bệnh ung thư đại trực tràng H RNA tách chiết từ vùng mô u vùng mô lành tách từ 25 mẫu khối nến 25 người bệnh UTĐTT kiểm tra xác định nồng độ đánh giá độ tinh phương pháp đo mật độ quang Hầu hết mẫu RNA đạt chất lượng độ tinh với tỷ số A260/A280 nằm khoảng từ 1.8-2.1 đo máy quang phổ bước sóng 260nm 280 nm (Bảng 4) Hơn nữa, có 17/25 mẫu RNA tách từ vùng mơ u mô lành người bệnh UTĐTT đảm bảo đủ lượng cần thiết (500 ng) để thực phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA (Bảng 4) Như vậy, hầu hết mẫu RNA sau tách chiết (17/25) từ vùng mô u vùng mô thường đạt chất lượng, đủ điều kiện độ tinh để đánh giá tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT 81 Bảng Nồng độ độ tinh RNA tách từ vùng mô u mô lành mẫu khối nến người bệnh ung thư đại trực tràng Mã số mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Nồng độ RNA (ng/µL) Vùng mơ Vùng mô u lành 244.33 111.92 189.1 56.82 185.73 143.41 67.53 96.58 146.83 43.66 55.76 52.56 241.56 29.85 198.94 79.91 148.21 42.83 152.44 43.28 217.96 39.23 90.18 59.32 310.26 122.11 112.95 66.37 75.22 72.05 89.55 104.15 541.18 77.21 146.87 62.53 272.62 91.48 265.46 59.74 83.17 62.57 201.22 25.82 84.09 102.64 53.27 18.02 43.02 48.67 Độ tinh (A260/A280) Vùng mô Vùng mô u lành 2.11 2.06 2.13 2.04 2.14 2.10 2.13 2.10 2.12 2.06 2.08 2.12 2.01 2.11 2.14 2.09 2.05 2.11 1.95 2.12 2.07 2.10 2.13 2.15 2.15 2.20 2.29 2.1 1.9 2.08 2.06 2.13 2.08 2.11 2.11 2.11 2.02 2.11 2.06 2.06 2.11 2.16 2.05 2.12 2.18 2.09 2.1 2.04 2.15 Vùng mô u 2.04 2.64 2.69 7.4 3.4 8.97 2.06 2.51 3.37 3.27 2.29 5.54 1.61 4.42 6.64 5.58 0.92 3.4 1.83 1.88 6.01 2.49 5.94 9.38 11.62 H P U H 500 ng (µL) Vùng mô lành 4.47 8.79 3.49 5.12 11.5 9.51 16.75 6.25 11.67 11.55 12.74 8.42 4.09 7.53 6.94 4.8 6.48 7.99 5.47 8.36 7.99 19.36 4.87 27.7 10.27 Xác định tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh ung thư đại trực tràng phản ứng Realtime PCR Để xác định tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT, RNA sau tách chiết từ vùng mô u mô lành (17/25 mẫu khối nến) đủ điều kiện chất lượng độ tinh thực phản ứng phiên mã ngược phản ứng Realtime PCR Như kết mô tả Biểu đồ 1, tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 tăng mạnh vùng mô u so với mô thường 14/17 mẫu khối nến 82 người bệnh UTĐTT (#2, 3, 4, 6, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21 23); mẫu khối nến người bệnh số 6, 12 19 có tỷ lệ biểu mạnh mẫu khối nến người bệnh số 15 có tỷ lệ biểu yếu Tuy nhiên, có 3/17 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT có tỷ lệ biểu KIAA1199 vùng mô u thấp so với vùng mô lành (#1, 8, 16) Kết bước đầu đánh giá xác định tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 vùng mô u so với vùng mô lành mẫu khối nến người bệnh UTĐTT H P U H Biểu đồ Tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 vùng mô u mô lành mẫu khối nến người bệnh ung thư đại trực tràng THẢO LUẬN Trong lĩnh vực y học, kỹ thuật sinh học phân tử ngày hồn thiện giúp chẩn đốn nhiều bệnh lý ung thư di truyền liên quan đến dấu ấn sinh học có ý nghĩa sàng lọc chẩn đốn sớm bệnh Trong đó, tách chiết tinh DNA/RNA từ mẫu mô đúc nến công đoạn bước quan trọng để có nguồn DNA/RNA đảm bảo chất lượng, sử dụng cho việc thực kỹ thuật sinh học phân tử để xác định biểu dấu ấn sinh học giúp chẩn đoán sớm bệnh Các phân tử DNA/RNA phải tách chiết tốt, không bị đứt gãy; phải tinh tốt không bị tạp nhiễm nhằm đảm bảo cho phản ứng tiếp 83 theo có độ xác cao Chính vậy, cần có phương pháp tách chiết DNA/RNA phù hợp với kỹ thao tác tốt nhằm đảm bảo chất lượng số lượng DNA/RNA mẫu xét nghiệm Do vậy, để xác định tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 người bệnh UTĐTT, RNA từ mẫu mô u mô lành mẫu khối nến 25 người bệnh UTĐTT tách chiết sinh phẩm NucleoSpin Total RNA FFPE Đầu tiên, nghiên cứu thực bước lựa chọn vùng mô lành mô u (vùng tập trung tế bào ung thư có mật độ cao) sau nhuộm hóa mơ thường quy H.E Đây khâu quan trọng định nồng độ RNA tế bào ung thư tổng số RNA tách chiết từ mẫu mơ đạt hiệu cao Mẫu mơ ung thư có
Ngày đăng: 27/07/2023, 00:37
Xem thêm:
