Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết Bước đầu xác định dấu ấn sinh học KIAA1199 ở mẫu khối nến người bệnh ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật Realtime PCR trình bày xác định cặp mồi đặc hiệu khuếch đại KIAA1199 ở người bệnh ung thư đại trực tràng; Xác định tỷ lệ dấu ấn KIAA1199 ở mẫu bệnh phẩm khối nến ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật Realtime PCR.
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 521 - THÁNG 12 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH DẤU ẤN SINH HỌC KIAA1199 Ở MẪU KHỐI NẾN NGƯỜI BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR Dương Hồng Quân1, Trần Thị Thu Phương1, Nguyễn Thị Cẩm Thu1, Đào Thị Nguyệt2, Phạm Thị Thu Phương3, Nguyễn Phương Thoa1, Đặng Thị Nga1, Nguyễn Thuận Lợi4 TÓM TẮT 64 Đặt vấn đề: Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) nguyên nhân gây mắc tử vong giới Đánh giá đặc điểm phân tử xác định dấu ấn sinh học giúp chẩn đốn sớm tiên lượng bệnh có ý nghĩa quan trọng từ góp phần nâng cao hiệu điều trị người bệnh UTĐTT Mục tiêu: 1) Xác định cặp mồi đặc hiệu khuếch đại KIAA1199 người bệnh UTĐTT 2) Xác định tỷ lệ dấu ấn KIAA1199 mẫu bệnh phẩm khối nến UTĐTT kỹ thuật Realtime PCR Đối tượng Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang, mẫu mô đúc khối nến 25 người bệnh UTĐTT nhuộm kỹ thuật giải phẫu bệnh (H.E P.A.S) để xác định vùng mô u mô lành, đánh giá mức độ xâm lấn RNA tách chiết từ vùng mô u mô lành mẫu mô đúc khối nến 25 Trường Đại học Y tế công cộng Bệnh viện Đa khoa Đức Giang Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế Bệnh viện Bạch Mai Chịu trách nhiệm chính: Dương Hồng Quân Email: hqd@huph.edu.vn Ngày nhận bài: 27.9.2022 Ngày phản biện khoa học: 11.11.2022 Ngày duyệt bài: 15.11.2022 người bệnh UTĐTT xác định dấu ấn KIAA1199 Realtime PCR Kết quả: RNA tách chiết từ vùng mô u mơ lành (17/25 mẫu u đúc khối nến) có đủ điều kiện chất lượng độ tinh thực phản ứng phiên mã ngược Realtime PCR, đặc biệt tỷ lệ biểu mạnh dấu ấn KIAA1199 vùng mô u so với vùng mô lành 14/17 mẫu mô đúc khối nến người bệnh UTĐTT Kết luận: Bước đầu xác định đặc điểm bệnh học tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT, đặc biệt xác định tỷ lệ biểu mạnh dấu ấn KIAA1199 vùng mô u so với vùng mô lành 14/17 mẫu mô đúc khối nến người bệnh UTĐTT Từ khóa: KIAA1199; Ung thư đại trực tràng; Vùng mơ u; Vùng mô lành; Realtime PCR SUMMARY APPLICATION OF REALTIME PCR TO IDENTIFY OF KIAA1199 LEVEL IN FORMALIN-FIXED, PARAFFINEMBEDDED (FFPE) COLORECTAL CANCER PATIENTS Background: Colorectal cancer (CRC) is a major cause of morbidity and mortality worldwide Investigation of molecular characteristics and identification of new biomarkers for early diagnosis and prognosis of CRC are very important in order to contribute to enhance the effective treatment for CRC patients 441 HỘI THẢO KHOA HỌC GIẢI PHẪU BỆNH – TẾ BÀO BỆNH HỌC VIỆT NAM LẦN THỨ 10 Objectives: 1) To identify of specific primers to amplify KIAA1199 biomarker in CRC patient’s sample; and 2) To determine of KIAA1199 level in CRC patient’s FFPE samples by Realtime PCR Materials and Methods: Cross-sectional description study, tumor specimens from 25 CRC patients were stained with H.E and P.A.S to identify of a tumor and normal tissue, and evaluate of tumor invasion A tumor and normal tissue in 25 CRC patient’s FFPE samples were extracted RNA and determined the KIAA1199 level by Realtime PCR Results: RNAs extracted from tumor and normal tissues (17/25 CRC patient’s FFPE samples) that are qualified for quality and purity were performed for reverse transcription and Realtime PCR, high expression level of KIAA1199 in tumor tissue of CRC patient’s FFPE samples comparing to normal tissue in 14/17 CRC patient’s FFPE samples Conclusion: This study is initially identified the histopathological characteristics and KIAA1199 expression level in CRC patient’s FFPE samples, especially determination of high expression level of KIAA1199 in tumor tissue comparing to normal tissue in 14/17 CRC patient’s FFPE samples Keywords: KIAA1199; Colorectal cancer; Normal tissue; Tumor tissue; Realtime PCR I ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) loại ung thư phổ biến đứng hàng thứ nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ với ước tính khoảng 1,800,000 trường hợp mắc 881,000 ca tử vong xảy năm 2018 (1) Tỉ lệ mắc UTĐTT cao thuộc Châu Âu, Úc, New Zealand số quốc gia thuộc khu vực Đông Á Nhật Bản, Hàn Quốc (1) Theo cơng bố 442 tổ chức ung thư tồn cầu (GLOBOCAN) tình hình ung thư Việt Nam năm 2020, UTĐTT nguyên nhân đứng thứ tư gây tử vong với 16,426 trường hợp mắc 8,203 ca tử vong (7) Những khác biệt vị trí địa lý dẫn đến khác biệt chế độ ăn uống điều kiện môi trường sống, với tảng di truyền định nguyên nhân gây hiệu điều trị UTĐTT Chính vậy, UTĐTT mối quan tâm toàn xã hội từ tập trung nghiên cứu đưa chiến lược chẩn đoán sớm phác đồ điều trị hiệu điều trị UTĐTT Chẩn đoán sớm, tiên lượng bệnh xác đưa phác đồ điều trị phù hợp định thành công điều trị UTĐTT Tuy nhiên, số lớn người bệnh UTĐTT đặc biệt UTĐTT giai đoạn muộn/di mẫn cảm với liệu pháp hóa trị, liệu pháp xạ trị liệu pháp điều trị đích ảnh hưởng đến thành công điều trị ca bệnh Do đó, với nghiên cứu đánh giá chế phân tử kháng thuốc nghiên cứu phát thuốc điều trị đích mới, nghiên cứu phát dấu ấn sinh học giúp chẩn đoán sớm tiên lượng bệnh có ý nghĩa lâm sàng từ góp phần nâng cao hiệu điều trị người bệnh UTĐTT Chính vậy, chẩn đốn UTĐTT dấu ấn sinh học KIAA1199 mẫu bệnh phẩm khối nến người bệnh UTĐTT góp phần nâng cao hiệu điều trị người bệnh UTĐTT thời gian tới Với ý nghĩa khoa học thực tiễn nêu trên, nghiên cứu thực với hai mục tiêu gồm 1) Xác định cặp mồi đặc hiệu khuếch đại KIAA1199 người bệnh UTĐTT 2) Xác định tỷ lệ dấu ấn KIAA1199 mẫu bệnh phẩm khối nến UTĐTT kỹ thuật Realtime PCR TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 521 - THÁNG 12 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 25 mẫu bệnh phẩm khối nến người bệnh UTĐTT nhận từ khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Đa khoa Đức Giang, Hà Nội Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu bệnh phẩm khối nến Được chẩn đoán xác định UTĐTT giai đoạn từ I-IV kết giải phẫu bệnh (H.E P.A.S) mẫu mơ đúc nến có vùng mơ u mơ lành Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12 năm 2021 tới tháng năm 2022 Địa điểm nghiên cứu: Trường Đại học Y tế công cộng Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu nhận mẫu khối nến Vùng mô u mô lành mẫu mô đúc khối nến người bệnh UTĐTT phân biệt cạo vào ống ly tâm 1.5ml lưỡi dao phẫu thuật riêng biệt Phương pháp thiết kế mồi Ứng dụng phần mềm NCBI primer blast để thiết kế mồi cho phản ứng Realtime PCR vùng gen KIAA1199 gen nội chuẩn GADPH với độ dài đoạn đặc hiệu cần khuếch đại nhỏ 200 bp kiểm tra công cụ BLAST (NCBI, Hoa Kỳ) Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu khối nến Tách chiết RNA từ vùng mô u vùng mô lành mẫu khối nến bệnh nhân UTĐTT tiến hành NucleoSpin Total RNA FFPE (Takara) theo hướng dẫn nhà sản xuất Phương pháp đo nồng độ RNA Nồng độ RNA tách từ vùng mô u mô lành mẫu khối nến người bệnh UTĐTT xác định phương pháp đo mật độ quang máy Nanodrop cách đo hấp thụ bước sóng 260nm (OD260) 280nm (OD280) Nồng độ RNA (CRNA) tính theo cơng thức CRNA = OD260 x 40 x d, d: Độ pha loãng mẫu đo; Nếu 1.8 70 12 48 Mô bệnh học Ung thư biểu mô tuyến 25 100 Ung thư biểu mô vảy 0 Giai đoạn bệnh Giai đoạn I Giai đoạn II 32 Giai đoạn III 14 56 Giai đoạn IV Tổng 25 100 Xác định nồng độ độ tinh RNA 1.8-2.1 đo máy quang phổ bước RNA tách chiết từ vùng mơ u vùng sóng 260nm 280 nm (Bảng 4) Hơn mô lành tách mẫu mô đúc khối nến nữa, có 17/25 mẫu RNA tách từ vùng mô u 25 người bệnh UTĐTT kiểm tra xác mô lành người bệnh UTĐTT đảm bảo định nồng độ đánh giá độ tinh đủ lượng cần thiết (500 ng) để thực phương pháp đo mật độ quang Hầu hết phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA (Bảng mẫu RNA đạt chất lượng độ tinh 4) với tỷ số A260/A280 nằm khoảng từ Bảng Nồng độ độ tinh RNA tách từ vùng mô u mô lành mẫu khối nến người bệnh UTĐTT Nồng độ RNA (ng/µL) Độ tinh (A260/A280) 500 ng (µL) Mã số Vùng mơ Vùng mơ Vùng mơ Vùng mô Vùng mô Vùng mô lành mẫu u lành u u lành 244.33 111.92 2.11 2.06 2.04 4.47 189.1 56.82 2.13 2.04 2.64 8.79 445 HỘI THẢO KHOA HỌC GIẢI PHẪU BỆNH – TẾ BÀO BỆNH HỌC VIỆT NAM LẦN THỨ 10 185.73 143.41 2.14 67.53 96.58 2.13 146.83 43.66 2.12 55.76 52.56 2.06 241.56 29.85 2.12 198.94 79.91 2.11 148.21 42.83 2.09 10 152.44 43.28 2.11 11 217.96 39.23 2.12 12 90.18 59.32 2.10 13 310.26 122.11 2.15 14 112.95 66.37 2.20 15 75.22 72.05 2.1 16 89.55 104.15 2.08 17 541.18 77.21 2.13 18 146.87 62.53 2.11 19 272.62 91.48 2.11 20 265.46 59.74 2.11 21 83.17 62.57 2.06 22 201.22 25.82 2.16 23 84.09 102.64 2.12 24 53.27 18.02 2.09 25 43.02 48.67 2.04 Xác định tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến phản ứng Realtime PCR Để xác định tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT, RNA tách chiết từ vùng mô u mô lành (17/25 mẫu khối nến) đủ điều kiện chất lượng độ tinh thực phản ứng phiên mã ngược phản ứng Realtime PCR Tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 tăng mạnh vùng mô u so với mô 446 2.10 2.69 3.49 2.10 7.4 5.12 3.4 11.5 2.08 8.97 9.51 2.01 2.06 16.75 2.14 2.51 6.25 2.05 3.37 11.67 1.95 3.27 11.55 2.07 2.29 12.74 2.13 5.54 8.42 2.15 1.61 4.09 2.29 4.42 7.53 1.9 6.64 6.94 2.06 5.58 4.8 2.08 0.92 6.48 2.11 3.4 7.99 2.02 1.83 5.47 2.06 1.88 8.36 2.11 6.01 7.99 2.05 2.49 19.36 2.18 5.94 4.87 2.1 9.38 27.7 2.15 11.62 10.27 thường 14/17 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT (#2, 3, 4, 6, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21 23); mẫu khối nến người bệnh số 6, 12 19 có tỷ lệ biểu mạnh mẫu khối nến người bệnh số 15 có tỷ lệ biểu yếu Tuy nhiên, có 3/17 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT có tỷ lệ biểu KIAA1199 vùng mơ u thấp so với vùng mô lành (#1, 8, 16) (Biểu đồ 1) TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 521 - THÁNG 12 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2022 Biểu đồ Tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 vùng mô u mô lành mẫu khối nến người bệnh UTĐTT IV BÀN LUẬN Kỹ thuật sinh học phân tử ngày hoàn thiện giúp chẩn đoán nhiều bệnh lý ung thư di truyền liên quan đến dấu ấn sinh học có ý nghĩa sàng lọc chẩn đốn sớm bệnh Trong đó, tách chiết tinh DNA/RNA từ mẫu mô đúc nến công đoạn bước quan trọng để có nguồn DNA/RNA đảm bảo chất lượng, sử dụng cho việc thực kỹ thuật sinh học phân tử để xác định dấu ấn sinh học giúp chẩn đoán sớm bệnh Các phân tử DNA/RNA phải tách chiết tốt, không bị đứt gãy; phải tinh tốt không bị tạp nhiễm nhằm đảm bảo cho phản ứng có độ xác cao Do vậy, để xác định tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 người bệnh UTĐTT, RNA từ mẫu mô u mô lành mẫu khối nến 25 người bệnh UTĐTT tách chiết sinh phẩm NucleoSpin Total RNA FFPE Đầu tiên, nghiên cứu thực bước lựa chọn vùng mô lành mô u (vùng tập trung tế bào ung thư có mật độ cao) sau nhuộm hóa mơ thường quy (H.E P.A.S) Hơn nữa, để tách chiết RNA đạt chất lượng tốt, sử dụng phương pháp tách cột tiến hành với sinh phẩm hãng Takara đánh giá độ tinh RNA số hấp thụ quang phổ, dựa vào tỷ lệ A260/A280 Trong nghiên cứu này, tồn RNA tách chiết từ vùng mơ u mô lành mẫu khối nến 25 người bệnh UTĐTT đạt chất lượng độ tinh có tỷ lệ A260/A280 nằm khoảng từ 1.8 đến 2.1 RNA tách chiết từ vùng mô u mô lành mẫu khối nến bị đứt gẫy độ tinh không cao Do vậy, trước tiến hành kỹ thuật Realtime PCR để xác định dấn ấn KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT, chất lượng RNA kiểm tra cách sử dụng gen nội chuẩn GADPH Sự khuếch đại gen GADPH rõ ràng, xác, khơng có tín hiệu nhiễm vậy, khẳng định quy trình tách chiết tinh RNA từ vùng mô lành mô u mẫu 447 HỘI THẢO KHOA HỌC GIẢI PHẪU BỆNH – TẾ BÀO BỆNH HỌC VIỆT NAM LẦN THỨ 10 khối nến người bệnh UTĐTT tối ưu quy trình chất lượng RNA Để xác định tăng biểu KIAA1199 vùng mô u so với vùng mô thường mẫu khối nến người bệnh UTĐTT Realtime PCR cần xác định xác số lượng đích ban đầu có mẫu thử với RNA tách từ vùng mô u mô lành Sự tăng biểu KIAA1199 xác định vùng mô u so với vùng u lành mẫu khối nến người bệnh ung thư dày, vú, đại trực tràng, gan, tuyến tiền liệt thông qua đánh giá mức độ gen Realtime PCR mức độ protein hóa mơ miễn dịch (2,3,4,5,6) Trong nghiên cứu này, bước đầu xác định tỷ lệ biểu KIAA1199 vùng mô u so với vùng mô lành mẫu khối nến người bệnh UTĐTT, đặc biệt xác định mức độ biểu mạnh KIAA1199 vùng mô u so với vùng mô lành 14/17 mẫu mô đúc khối nến người bệnh UTĐTT Mặc dù vậy, số mô đúc khối nến có phân bố khơng đồng vùng mơ u mơ lành Điều giải thích mẫu khối u cố định dung dịch formol vùi paraffin không đảm bảo chất lượng làm ảnh hưởng tới trình chất lượng RNA dẫn tới ảnh hưởng kết phản ứng Realtime PCR đánh giá mức độ biểu KIAA1199 người bệnh UTĐTT V KẾT LUẬN Nghiên cứu bước đầu xác định đặc điểm bệnh học tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT, đặc biệt xác định tỷ lệ biểu mạnh dấu ấn KIAA1199 vùng mô u 448 so với vùng mô lành 14/17 mẫu mô đúc khối nến người bệnh UTĐTT TÀI LIỆU THAM KHẢO Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al (2018) Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries CA: A Cancer Journal for Clinicians 68(6): 394-424 Evensen NA, Kuscu C, Nguyen HL, et al (2013) Unraveling the role of KIAA1199, a novel endoplasmic reticulum protein, in cancer cell migration Journal of the National Cancer Institute 105(18): 1402-1416 Jiang Z, Zhai X, Shi B, et al (2018) KIAA1199 overexpression is associated with abnormal expression of EMT markers and is a novel independent prognostic biomarker for hepatocellular carcinoma OncoTargets and Therapy 11: 8341-8348 Matsuzaki S, Tanaka F, Mimori K, et al (2009) Clinicopathologic significance of KIAA1199 overexpression in human gastric cancer Annals of Surgical Oncology 16(7): 2042-2051 Michishita E, Garcés G, Barrett JC, et al (2006) Upregulation of the KIAA1199 gene is associated with cellular mortality Cancer Letters 239(1): 71-77 Tiwari A, Schneider M, Fiorino A, et al (2015) Early insights into the function of KIAA1199, a markedly overexpressed protein in human colorectal tumors PLoS One 8: e69473 https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/ populations/704-viet-nam-fact-sheets.pdf ... 2.04 Xác định tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến phản ứng Realtime PCR Để xác định tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT, RNA tách chiết từ vùng mô u mô lành (17/25 mẫu khối. .. KIAA1199 người bệnh UTĐTT V KẾT LUẬN Nghiên cứu bước đầu xác định đặc điểm bệnh học tỷ lệ biểu dấu ấn KIAA1199 mẫu khối nến người bệnh UTĐTT, đặc biệt xác định tỷ lệ biểu mạnh dấu ấn KIAA1199 vùng... THỨ 10 khối nến người bệnh UTĐTT tối ưu quy trình chất lượng RNA Để xác định tăng biểu KIAA1199 vùng mô u so với vùng mô thư? ??ng mẫu khối nến người bệnh UTĐTT Realtime PCR cần xác định xác số