Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và phân tích gen phân loại cây thông đỏ (táu chinensis pilg ) tại thanh hóa

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết đồng tác giả với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, đặc biệt trình tự gen rpoC1 gen ITS lồi thơng đỏ (Taxus chinensis) Thanh Hóa kết đƣợc cơng bố Việt Nam, phần đƣợc công bố tạp chí Khoa học Tự nhiên trƣờng Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chƣa đƣợc công bố công trình nghiên cứu khác Thanh Hóa, tháng 11 năm 2019 Tác giả HV Quách Thị Hà Nhung ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành tới TS Lê Đình Chắc - Trƣởng Bộ mơn Sinh học, ngƣời thầy tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ chia sẻ khó khăn với tơi suốt thời gian thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Bộ môn Sinh học, Ban chủ nhiệm Khoa KHTN Trƣờng Đại học Hồng Đức Thanh Hóa Tơi xin cảm ơn giúp đỡ Phòng Quản lý Sau đại học Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian học tập làm nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ quý báu tất anh, chị em bạn lớp K10 cao học Thực vật học Cuối cùng, tơi muốn tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến tất ngƣời thân gia đình ln sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn này! Thanh Hóa, tháng 11 năm 2019 HV Quách Thị Hà Nhung iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU Đặt vấn đề ………1 Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu .2 Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn CHƢƠNG I TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .3 1.1 Khái quát thông đỏ (Taxus chinensis (Pilg.)Rehd.) .3 1.2 Phân bố sinh thái 1.3 Vai trò thông đỏ (Taxus chinensis (Pilg.)Rehd.) 1.4 Mã vạch DNA (DNA Barcode) 1.4.1 Giới thiệu DNA barcode 1.4.2 Các đặc điểm trình tự barcode 10 1.4.3 Một số trình tự đƣợc sử dụng DNA barcode thực vật 12 1.4.3.1 Vùng gen nhân mã hóa ribosome 12 1.4.3.2 Gen lục lạp 13 1.4.4 Ứng dụng mã vạch DNA nhận biết dƣợc liệu 16 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .19 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 19 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.2 Hóa chất, thiết bị máy móc 19 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phƣơng pháp thu mẫu 19 2.2.2 Phƣơng pháp lập tiêu giải phẫu lá, thân, rễ 20 iv 2.2.3 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 20 2.2.4 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide đoạn gen rpoCl, ITS1-4 23 3.1 Kết phân tích đặc điểm hình thái, giải phẫu thông đỏ 25 3.1.1 Đặc điểm hình thái thân, lá, rễ thơng đỏ 25 3.1.2 Đặc điểm giải phẫu, rễ, thân thông đỏ 27 3.2 Kết phân tích đoạn gen rpoc1 ITS thông đỏ 30 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ thông đỏ 30 3.2.2 Kết nhân bản, xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 30 3.2.3 Kết nhân bản, xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn gen ITS1-4 36 3.3 Kết so sánh trình tự ITS1-4 thu đƣợc từ mẫu thông đỏ (Taxus chinensis.Pilg.)Rehd.) Thanh Hóa với số trình tự ITS1-4 công bố gen banks 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 Kết luận 46 1.1 Về đặc điểm hình thái thơng đỏ (Taxus chinensis Pilg.)Rehd.) 46 1.2 Về đặc điểm phân loại học phân tử 46 1.3 Về hình thái, giải phẫu gen phân loại 46 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC P1 PHỤ LỤC P2 PHỤ LỤC P3 PHỤ LỤC P4 v PHỤ LỤC P5 PHỤ LỤC P6 PHỤ LỤC P7 PHỤ LỤC P8 vi DANH MỤC BẢNG Bảng Trang Bảng Trình tự nucleotide hai cặp mồi PCR khuyếch đại đoạn gen rpoC1 ITS-4 21 Bảng 2 Thành phần phản ứng PCR .22 Bảng 3.1: Nồng độ độ tinh mẫu .30 Bảng 3.2 Trình tự rpoC1 thông đỏ thu đƣợc Pù Luông Thanh Hóa 31 Bảng 3.3 Sự sai khác trình tự gen rpoC1 thu đƣợc trình gen rpoC1 công bố ngân hàng gen quốc tế mã số KU940092 34 Bảng 3.4 So sánh với trình tự rpoC1 thu đƣợc với trình tự rpoC1 gen banks mã số KU940092 .34 Bảng 3.5 Kết Blast trình tự gen rpoC1 thu đƣợc trình tự gen rpoC1 ngân hàng Genbank mã số KU940092 37 Bảng 3.6 Kết đọc trình tự gen ITS1-4 mẫu thu Pù Luông .37 Bảng 3.7 Kết so sánh sai khác cặp nucleotide gen ITS1-4 thu đƣợc với trình tự ITS1-4 công bố gen banks mã số MG730723 40 công bố gen banks 40 Bảng 3.8 So sánh với lồi Taxus mairei voucher cơng bố gen banks……………………………………………………………………….41 Bảng 3.9 Kết Blast trình tự gen ITS1-4 thu đƣợc trình tự gen ITS ngân hàng Genbank mã số MG730723……………………………… 42 Bảng 3.10 Kết so sánh trình tự vùng ITS1-4 phân lập đƣợc với trình tự vùng ITS1-4 cơng bố ngân hàng gen mã số MG730723, MG730407, MH117822, MK116529, JN600627, KX981188 .44 vii DANH MỤC HÌNH Hình Trang Hình Cây thơng đỏ nhỏ 25 Hình 3.2 Cây thơng đỏ trƣởng thành 26 Hình 3.3 Ảnh chụp thơng đỏ (Taxus chinensis) ……………… 26 Hình 3.4 Ảnh chụp rễ thông đỏ (Taxus chinensis) …… …………27 Hình Ảnh hiển vi cấu tạo giải phẫu rễ thơng đỏ .28 Hình 3.6 Ảnh hiển vi cấu tạo giải phẫu thân thơng đỏ 28 Hình 3.7 Ảnh hiển vi cấu tạo giải phẫu thông đỏ 29 Hình 3.8 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen rpoC1 từ hai mẫu thông đỏ với cặp mồi rpoC1-F/rpoC1-R 31 Hình 3.9 Kết so sánh trình tự gen rpoC1 thu đƣợc với trình tự rpoC1 đƣợc cơng bố ngân hàng gen quốc tế, mã số KU940092 .34 Hình 3.10 Sơ đồ dựa trình tự nucleotide gen rpoC1 mẫu thu đƣợc với trình tự gen rpoC1 mã số KU940092 35 Hình 3.11 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen ITS1-4 từ mẫu thông đỏ với cặp mồi ITS-F/ITS-R 37 Hình 3.12 Kết so sánh trình tự genITS1-4 thu đƣợc với trình tự ITS1-4 đƣợc công bố ngân hàng gen quốc tế, mã số MG730723 38 Hình 13 Sơ đồ dựa trình tự nucleotide gen ITS1-4 mẫu thu đƣợc với trình tự gen ITS loài 40 Hình 3.14 Kết so sánh trình tự genITS1-4 thu đƣợc với số trình tự ITS1-4 đƣợc công bố ngân hàng gen quốc tế, mã số MG730723, MG730407, MH117822, MK116529, JN600627, KX981188 .43 Hình 3.15 Sơ đồ dựa trình tự nucleotide vùng ITS1-4 thu đƣợc với trình tự vùng ITS1-4 công bố ngân hàng gen mã số MG730723, MG730407, MH117822, MK116529, JN600627, KX981188 ………….44 viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BioEdit DNAstar : Phần mềm Tin sinh học phân tích liệu DNA Blast : Basic Local Alignment Search Tool CTAB : Cetyl trimethyllammonium Bromide rpoC1 : RNA polymerase C gen PCR : Polymerase chain reaction ITS : Internal transcribed spacers TDTH : Thông đỏ Thanh Hóa DNA : Deoxyribonucleic acid MỞ ĐẦU Đ t vấn ề Việt Nam với 3/4 diện tích tự nhiên vùng đồi núi, chịu ảnh hƣởng khí hậu nhiệt đới gió mùa; điều kiện khí hậu địa hình nhƣ tạo nên hệ thực vật rừng phong phú đa dạng, có nhiều loại gỗ lâm sản có giá trị cao, đặc biệt loài dƣợc liệu Nằm vùng phân bố lồi, Việt Nam (trong có Thanh Hóa) đƣợc ghi nhận có phân bố lồi thơng đỏ, nhiên nghiên cứu dƣợc học đặc điểm thực vật học lồi Việt Nam cịn hạn chế Các hƣớng nghiên cứu chủ yếu đa dạng thành phần loài, đặc điểm sinh thái học thông đỏ số nghiên cứu đông y lồi Với lợi ích thơng đỏ, việc nghiên cứu giá trị dƣợc học thông đỏ năm gần đƣợc quan tâm Trong số cơng trình nghiên cứu gần nhà khoa học cho thấy, thông đỏ dƣợc liệu q, có nhiều cơng dụng y học, thơng đỏ đƣợc khai thác nhiều để phục vụ công tác chữa bệnh Đây lý để thơng đỏ ngày bị đe dọa nghiêm trọng tự nhiên sinh cảnh sống khai thác mức Do việc cung cấp tƣ liệu khoa học lồi có ý nghĩa lớn việc bảo tồn, phát triển khai thác có hiệu lồi địa phƣơng nói riêng, nƣớc nói chung Cây Thơng đỏ (Taxus chinensis Pilg.)Rehd.) thuộc họ Thủy tùng (Taxaceae.) Trong y học cổ truyền Trung Quốc, vỏ Thông đỏ dùng thuốc dân gian Hiện nay, vỏ thông đỏ đƣợc nghiên cứu với mục đích sử dụng y học để chữa bệnh ung thƣ Xuất phát từ giá trị dƣợc học thông đỏ, đồng thời với mục đích cung cấp tƣ liệu hóa lồi dƣợc liệu này, phục vụ khai thác phát triển nguồn gen dƣợc liệu quý thuộc danh lục thuốc q Việt Nam Thanh Hóa, chúng tơi chọn “Nghiên cứu c iểm hình thái, giải phẫu phân tích gen phân loại Thơng ỏ (Taxus chinensis Pilg.) Rehd.) Thanh Hóa” làm đề tài nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Phân tích đƣợc đặc điểm hình thái, giải phẫu, trình tự gen rpoC1 vùng ITS lồi thơng đỏ Thanh Hóa, góp phần xây dựng mã vạch DNA việc tƣ liệu hóa phục vụ bảo tồn, lƣu giữ nguồn gen lồi thơng đỏ Việt Nam Nội dung nghiên cứu i) Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu lá, thân, rễ thơng đỏ thu Thanh Hóa; ii) Phân tích đặc điểm trình tự nucleotide gen rpoC1 vùng ITS mẫu nghiên cứu so sánh với số trình tự nucleotide gen rpoC1 ITS thông đỏ công bố Ngân hàng gen quốc tế Phạm vi nghiên cứu Trong phạm vi nghiên cứu, đề tài tập trung phân tích đặc điểm hình thái cấu tạo hiển vi thân, rễ, lồi thơng đỏ địa phƣơng Thanh Hóa Bƣớc đầu tạo liệu phân loại học phân tử dựa sở phân tích đặc điểm đoạn gen rpoC1 vùng ITS phân lập đƣợc phục vụ nhận diện lồi thơng đỏ Thanh Hóa Ý nghĩa khoa học thực tiễn Kết phân tích so sánh đặc điểm hình thái giải phẫu thân, rễ, lá, phân bố đặc điểm sinh học khác lồi thơng đỏ liệu đƣợc tƣ liệu khoa học cho lồi thơng đỏ Thanh Hóa Đặc biệt đặc điểm trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 vùng ITS phân lập từ thơng đỏ Thanh Hóa liệu khoa học quý giúp nhận diện thông đỏ cơng nghệ gen Kết nghiên cứu vừa có ý nghĩa khoa học vừa có nhiều ứng dụng thực tiễn 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Về đặc điểm hình thái thơng đỏ (Taxus chinensis).Pilg.Rehd) i) Thơng đỏ lồi trung sinh ƣa sáng, mọc núi đá vôi độ cao khoảng 800 - 1.200m, rải rác rừng rậm Thân gỗ có kích thƣớc tƣơng đối lớn, có cá thể cao tới 20m, lớp vỏ dày, dễ bong tróc, nứt dọc, màu nâu sẫm, đƣờng kính đạt tới 80cm; non thân có màu nâu nhạt Rễ có màu nâu sẫm, kích thƣớc khơng đều, rễ phát triển có khả phân nhành tốt có khả xuyên sâu đất Đối với trƣởng thành, kích thƣớc rễ lớn Hạt hình tròn trứng, dẹt; nằm vỏ hạt giả chín mọng nƣớc màu đỏ tƣơi, dài khoảng 5mm, đầu có hai gờ, rốn hạt trịn ii) Thơng đỏ loài dƣợc liệu quý, đƣợc sử dụng chữa số bệnh nhƣ bệnh tim ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ phổi, tăng cƣờng sức đề kháng, chống oxy hóa, chống hạ đƣờng huyết giảm đau 1.2 Về đặc điểm phân loại học phân tử i) Đoạn gen lục lạp rpoC1 đƣợc phân lập từ mẫu thông đỏ (Taxus chinensis Pilg.) Rehd.) thu Pù Lng, Thanh Hóa có kích thƣớc 582 nucleotide đoạn gen ITS1-4 có kích thƣớc 228 nucleotide ii) Dựa trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 ITS1-4 thu đƣợc từ mẫu thông đỏ (Taxus chinensis) Pù Lng (Thanh Hóa) cơng bố Việt Nam, góp phần cung cấp liệu di truyền xây dựng mã vạch DNA cho loài dƣợc liệu quý 1.3 Về hình thái, giải phẫu gen phân loại Các đặc điểm hình thái, giải phẫu trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 ITS1-4 phân lập từ hệ gen lục lạp gen nhân thơng đỏ thu Pù Lng (Thanh Hóa) liệu sở cho nhận diện thông đỏ (Taxus chinensis Pilg.)Rehd.) Việt Nam 47 Đề nghị Cần tiếp tục nghiên cứu đặc điểm sinh học khác phân tích thêm trình tự gen phân loại khác phục vụ thiết lập mã vạch DNA cho thơng đỏ (Taxus chinensis Pilg.)Rehd.) Việt Nam nói chung Thanh Hóa nói riêng 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ KH & CN, Viện KH &CNVN, 2007: Sách Đỏ Việt Nam (Phần Thực vật), NXB KHTN & CN, Tr 528- 529 Chính phủ nƣớc CHXHCN Việt Nam, 2006: Nghị định số 32/2006/NĐCP Chính phủ ngày 30 tháng năm 2006 quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý Chu Hồng Mậu (2008), Phƣơng pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng NxB Đại học Thái Nguyên Nguyễn Tiến Hiệp, Phan Kế Lộc, Nguyễn Đức Tố Lƣu, Philip Lan Thomas, Aljos Farjon, Leonid Averyanov, Jacinto Regalado Jr., 2004: Thông Việt Nam: Nghiên cứu trạng bảo tồn, NXB Lao động Xã hội, Hà Nội, 110-113 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, III, tr.502-503 Nguyen Quynh Nga, Pham Thanh Huyen, Phan Van Truong, Hoang Van Toan (2016), Taxonomy of the genus Paris L (Melanthiaceae) in Vietnam tap chi sinh học 38(3), pp 333-339 Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), Các phương pháp nghiên cứu thực vật (Methods of plant research) Nxb Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr 23-27 Tiếng Anh Agrawal V S.(1997), Drugs Plants of India, Kalyani Publisher, New Delhi 306 Bai XY, Lü JM, Zhou YY, Zhu ZR, Jiang RW, Zhang W (2015), “Chemical constituents of Taxus chinensis var mairei cell cultures.” Yao Xue Xue Bao 50(1):70-4 Chinese 10 Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 49 11 Cao DP, Zheng YN, Qin LP, Han T, Zhang H, Rahman K, Zhang QY Maturitas (2008) “Curculigo orchioides, a traditional Chinese medicinal plant, prevents bone loss in ovariectomized rats” Apr 20;59(4):373-80 12 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 1889-1895 13 German Serino and Pal Maliga (1998), “RNA Polymerase SubunrpoB2 Encoded by the Plastid rpo Genes Are Not Shared with the NucleusEncoded Plastid Enzyme” PlantPhysiol Aug, 117(4): 1165-1170 14 Hollingsworth Pm, G.S., Little Dp (2011), “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PLoS ONE, (5) 15 Jiang YQ, Xu XP, Guo QM, Xu XC, Liu QY, An SH, Xu JL, Su F, Tai JB (2016), “Reversal of cisplatin resistance in non-small cell lung cancer stem cells by Taxus chinensis var.” Genet Mol Res Sep 2;15(3) 16 Kim S, Kim J, Liu J (2009) Genetic discrimination of Catharanthus roseus cultivars by pyrolysis mass spectrometry J Plant Biol 52: 462465 doi:10.1007/s12374-009-9059-1 17 Kool A, de Boer HJ, Kruger Ả, Rydberg A, Abbad A, Bjõrk L, et al (2012) Molecular Identification of Commercialized Medicinal Plants in Southern Morocco PLoS ONE 7(6): e39459 doi: 10.1371/journal.pone.0039459 18 Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 19 Li N, Pan Z, Zhang D, Wang HX, Yu B, Zhao SP, Guo JJ, Wang JW, Yao L, Cao WG (2017), “Chemical Components, Biological Activities, and Toxicological Evaluation of the Fruit (Aril) of Two Precious Plant Species from Genus Taxus.”Chem Biodivers Dec;14(12) 50 20 Liu HS, Gao YH, Liu LH, Liu W, Shi QW, Dong M, Suzuki T, Kiyota H (2016), “Inhibitory effect of 13 taxane diterpenoids from Chinese yew (Taxus chinensis var mairei) on the proliferation of HeLa cervical cancer cells.” Biosci Biotechnol Biochem 1883-6 21 Mulliken Teresa, Petra Crofton, 2008: Review of the Status, Harvest, Trade and Management of Seven Asian CITES-listed Medicinal and Aromatic Plant Species 113-135 22 Ole S and Gitte P (2009), “How many loci does it take to DNA barcode a crocus?”, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 23 Paul D N Hebert*, Alina Cywinska, Shelley L Ball and Jeremy R deWaard (2003) Biological identifications through DNA barcodes Proc R Soc Lond B (2003) 270, 313-321 313 Ó 2003 The Royal Society DOI 10.1098/rspb.2002.2218 24 Parveen,I., Singh,H.K., Raghuvanshi,S and Babbar,S.B (2013), “Catharanthus roseus voucher SBB-1090 RNA polymerase beta' subunit (rpoC1) gene”, partial cds; chloroplast GenBank: JN115007.1 25 Qiao W, Ling F, Yu L, Huang Y, Wang T (2017), “Enhancing taxol production in a novel endophytic fungus, Aspergillus aculeatinus Tax-6, isolated from Taxus chinensis var mairei.” Fungal Biol 2017 Dec;121(12):1037-1044 26 Sandelius, Anna Stina (2009) The Chloroplast Interactions with the Environment Springer p 18 ISBN 978-3-540-68696-5 27 Tran Van Sung et al., 2007: Proceedings the first VAST-KOCI Workshop on Science and Technology R&D cooperation, Hanoi, September 14, 2007, 240-245 pp 28 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for 51 phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 29 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 30 Tang SY, Whiteman M, Peng ZF, Jenner A, Yong EL, Halliwell B , (2004) “Characterization of antioxidant and antiglycation properties and isolation of active ingredients from traditional chinese medicines” Radic Biol Med 2004 Jun 15;36(12):1575-87 31 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 32 Trinh Thi Thuy et al., 2005: Journal of Chemistry, 43(4): 503-507 33 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Arenas M A., Culham A., Chase M W (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (RPOB2) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114 34 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 35 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 52 36 Weng HB, Han WK, Xiong YW, Jin ZH, Lan Z, Liu C, Zhang XM, Peng W (2018) “Taxus chinensis ameliorates diabetic nephropathy through down-regulating TGF-β1/Smad pathway.” Chin J Nat Med 2018 Feb;16(2):90-96 37 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), pp 1407-1420 38 Wouter G van Doorn (2009), Role of chloroplasts and other plastids in ageing and death of plants and animals: a tale of Vishnu and Shiva Ageing research reviews, (2) :117-30 39 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of RPOB22 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 40 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 Tài liệu Internet 42 http://www.barcoding.si.eu) 43 http://www.kew.org/barcoding/protocols.html 44 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KC561139 45 https://vi.wikipedia.org/wiki/Taxus 46 http://tracuuduoclieu.vn/thong-do.html P1 PHỤ LỤC Kết Blast gen rpoC1 mẫu thông ỏ thu Thanh Hóa P2 PHỤ LỤC Kết Blast gen ITS1-4 mẫu thơng ỏ thu Thanh Hóa P3 PHỤ LỤC Kết so sánh trình tự ITS1-4 thơng ỏ (Taxus chinensis) Pù Lng, Thanh Hóa gen banks mã số MG730723 P4 PHỤ LỤC Kết so sánh trình tự ITS1-4 thơng ỏ (Taxus chinensis) Pù Lng, Thanh Hóa gen banks mã số MG730407 P5 PHỤ LỤC Kết so sánh trình tự ITS1-4 thơng ỏ (Taxus chinensis) Pù Lng, Thanh Hóa gen banks mã số MH117822 P6 PHỤ LỤC Kết so sánh trình tự ITS1-4 thơng ỏ (Taxus chinensis) Pù Lng, Thanh Hóa gen banks mã số MH116529 P7 PHỤ LỤC Kết so sánh trình tự ITS1-4 thơng ỏ (Taxus chinensis) Pù Lng, Thanh Hóa gen banks mã số JN600627 P8 PHỤ LỤC Kết so sánh trình tự ITS1-4 thơng ỏ (Taxus chinensis) Pù Lng, Thanh Hóa gen banks mã số KX981188