HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG THỊ NGỌC ANH NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN SÂM CAU (CURCULIGO ORCHIOIDES GAERNT) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Khiêm PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày Luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2020 Tác giả luận văn Dương Thị Ngọc Anh i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu thực Luận văn, nhận hướng dẫn tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp này, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh, TS Nguyễn Văn Khiêm tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Trung tâm Nghiên cứu nguồn gen giống dược liệu Quốc gia - Viện Dược Liệu tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi q trình làm Luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Khoa Cơng nghệ sinh học tồn thể thầy, giáo truyền đạt cho kiến thức, kĩ quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ, làm động lực cho trình học tập, nghiên cứu khoa học sống Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2020 Tác giả luận văn Dương Thị Ngọc Anh ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích, ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Ý nghĩa khoa học 1.2.3 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Nguồn gốc phân bố sâm cau 2.2 Đặc điểm thực vật học sâm cau 2.3 Đặc điểm sinh thái sâm cau 2.4 Thành phần hóa học dược liệu sâm cau 2.5 Công dụng sâm cau 2.6 Tác dụng sinh học sâm cau 2.7 Nhân giống trồng trọt sâm cau 10 2.8 Các thị danh gia da dạng di truyền 11 2.8.1 Chỉ thị hình thái 11 2.8.2 Chỉ thị hóa sinh 12 2.8.3 Chỉ thị phân tử DNA 12 2.8.4 Đặc điểm thị phân tử RAPD ISSR 14 2.9 Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen sâm cau thị phân tử DNA 17 iii Phần Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 19 3.1 Đối tượng, hóa chất thİết bị dùng nghİên cứu 19 3.1.1 Đối tượng 19 3.1.2 Hóa chất thiết bị 20 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 3.3 Nội dung nghiên cứu 20 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1 Thu thập, mô tả đặc điểm thực vật giám định tên sâm cau 20 3.4.2 Tách chiết DNA tổng số định lượng 21 3.4.3 Phản ứng PCR với mồi RAPD 21 3.4.4 Phản ứng PCR với mồi ISSR 22 3.4.5 Phân tích sản phẩm PCR 23 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 25 4.1 Thu thập mẫu, mô tả đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học sâm cau 25 4.2 Đa dạng di truyền nguồn gen sâm cau thị phẩn tử DNA 26 4.2.1 Tách chiết DNA tổng số 26 4.2.2 Đa dạng di truyền nguồn gen sâm cau thị RAPD 28 4.2.3 Đa dạng di truyền 21 nguồn gen sâm cau thị ISSR 34 Phần Kết luận kiến nghị 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 Danh mục cơng trình cơng bố 41 Tài liệu tham khảo 42 Phụ lục 47 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt µg Micro gram µl Micro lit ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic AFLP Amplified fragment length Đa hình chiều dài đoạn polymorphism cắt nhân Bp Base pair Cặp bazơ CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Đa hình trình tự đoạn cắt Sequence khuếch đại CS CTAB Cộng Cetyl trimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic axit dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates ISSR Inter Simple Sequence Repeat Kb Kilobase Na2EDTA Ethylene diamine tetra acetate Lặp lại trình tự đơn sodium OD Optical Mật độ quang Density PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR-RFLP Polymerase chain reaction – Phản ứng chuỗi trùng hợp - đa Restriction fragment length hình độ dài đoạn cắt giới hạn polymorphism RAPD RNA Randomly Amplified Đa hình đoạn DNA nhân Polymorphic DNA ngẫu nhiên Ribonucleic acid Axit ribonucleic v SCAR Sequence Characterized Đa hình trình tự đặc biệt Amplified Region đoạn khuếch đại SDS Sodium dodecyl sulfate SNP Single-Nucleotide Polymorphism Đa hình trình tự nucleotide SSR Inter Simple Sequence Repeats TAE Tris Acetate EDTA TE Tris EDTA VNTR Variable numbers of tandem repeat vi Lặp lại trình tự đơn DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách mẫu sâm cau 19 Bảng 3.2 Tên mồi trình tự mồi RAPD sử dụng phản ứng PCR 22 Bảng 3.3 Tên mồi trình tự mồi ISSR sử dụng phản ứng PCR 22 Bảng 3.4 Thành phần nồng độ chất cho phản ứng PCR 23 Bảng 3.5 Chu trình phản ứng PCR khuếch đại mẫu DNA 23 Bảng 4.1 Nồng độ DNA tổng số mẫu sâm cau 27 Bảng 4.2 Đa hình 21 nguồn gen sâm cau dựa thị RAPD 30 Bảng 4.3 Hệ số tương đồng 21 nguồn gen sâm cau dựa thị RAPD 32 Bảng 4.4 Đa hình 21 nguồn gen sâm cau dựa thị ISSR 36 Bảng 4.5 Hệ số tương đồng 21 nguồn gen sâm cau dựa thị ISSR 37 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Phân bố sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) giới Các điểm chấm đen thể phân bố sâm cau .3 Hình 2.2 Một số hình ảnh sâm cau (Curculigo orchioides) Hình 4.1 Hình ảnh hoa, quả, hạt sâm cau (từ trái sang phải) .25 Hình 4.2 Hình ảnh thu thập sâm cau 25 Hình 4.3 Hình ảnh điện di DNA tổng số mẫu tương ứng với giếng 1-21 26 Hình 4.4 Ảnh điện di sản phẩm RAPD - PCR với mồi khác nhiệt độ gắn mồi 370C (trên) 390C (dưới) Mẫu DNA SC1 28 Hình 4.5 Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD - PCR 29 Hình 4.6 Sơ đồ quan hệ di truyền 21 nguồn gen sâm cau (SC1-SC21) thị RAPD 33 Hình 4.7 Ảnh điện di sản phẩm ISSR – PCR .35 Hình 4.8 Sơ đồ quan hệ di truyền 21 nguồn gen sâm cau (SC1 - SC21) thị ISSR 38 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Dương Thị Ngọc Anh Tên Luận văn: Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) thị phân tử DNA Ngành: CNSH Mã số: 42 02 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn) thị phân tử RAPD ISSR Phương pháp nghiên cứu 21 nguồn gen sâm cau thu thập từ 15 tỉnh, thành nước, trồng lưu giữ nhà lưới - Viện Dược Liệu Thanh Trì, Hà Nội Các nguồn gen xác định tên khoa học (Curculigo orchioides Gaertn) DNA tổng số tách chiết, định lượng, đạt chất lượng để thực phản ứng PCR Tổng cộng 10 mồi RAPD; 10 mồi ISSR sử dụng để khuếch đại 21 mẫu sâm cau theo Li & cs 2012 Phân tích đa dạng di truyền 21 nguồn gen sâm cau thị RAPD ISSR sử dụng phần mềm NTSYS 2.1 Kết kết luận Kết nghiên cứu thu thập 21 nguồn gen sâm cau từ 15 tỉnh/thành nước ta Nguồn gen sâm cau mô tả đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học cho thấy loài (Curculigo orchioides Gaertn) Nguồn gen sâm cau đa dạng kiểu hình (như kích thước (tỷ lệ dài/rộng), mầu sắc thân rễ, bẹ lá, hoa…); kiểu gen phân tích thị phân tử RAPD ISSR Tổng cộng 21 nguồn gen sâm cau đánh giá đa dạng di truyền thị RAPD ISSR Đối với thị RAPD, nhiệt độ 390C chọn lọc để khuếch đại DNA sử dụng 10 mồi Tổng cộng 78 băng tạo từ 10 mồi khuếch đại 21 mẫu nghiên cứu Trong đó, băng lớn có kích thước 1500 bp, băng nhỏ 100 bp Tỷ lệ băng đa hình đạt 54,14 % - 90,91 %, trung bình 79,54 % Số băng trung bình tạo 7,8 băng/mồi Chỉ số PIC dao động 0,24 đến 0,41 trung bình 0,34 Chỉ số sai khác cặp mồi 4,73 Hệ số tương đồng di truyền 21 nguồn gen dao động từ 0,44 đến 0,84, trung bình 0,64 21 nguồn gen sâm cau chia làm nhóm lớn: Nhóm thứ gồm mẫu SC1, SC2, SC8, SC10, SC3, SC5, SC4, SC9, SC7, SC11, ix Nema R.K & Ramawat K.G (2010) Isolation and identification of a new molecule from Curculigo orchioides (hypoxidaceae) Journal of Chem Pharm Res 2(2): 610-617 Nie Y & Dong X (2013) Medicinal plants of genus Curculigo: Traditional uses and a phytochemical and ethnopharmacological review Journal of Ethnopharmacol 147(3): 547 - 563 Pandit P., Singh A., Bafna AR., Kadam PV & Patil MJ (2008) Evaluation of antiasthmatic activity of Curculigo orchioides Gaertn rhizomes Indian Journal of Pharmaceutical Sciences 70(4): 440-444 Prevost A & Wilkinson M (1999) A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars Journal of Theoretical and Applied Genetics 98(1):107-112 Rao K.S & Mishra S.H (1996) Effect oF rhizomes of Curculigo orchioides Gaerntn on drug induce hepatoxicity Journal of Indian Drugs 3(9): 458-461 Ricky W.K.W., Rabie B., Bendeus M & Hagg U (2007) The effects of Rhizoma Curculiginis and Rhizoma Drynariae extracts on bones, Journal of Chinese Medicine 2:13 doi:10.1186/1749-8546-2-13 Sharma M (1975) Observations on oxytocic activity of a flavones glycoside isolated from Curculigo orchioides Journal of Res Indian Med 10(3): 104-106 Singh R & Gupta A.K (2008) Antimicrobial and antitumor activity of the fractionated extracts of Kalimusli (Curculigo orchioides) International Journal of Green Pharmacy 2: 34-6 International Journal of Green Pharmacy Srivatsava S & Nidhi M (2009) Genetic Markers - A Cutting Edge Technology in Herbal Drug Research Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 1(1): 1-18 Thakur M., Chauhan N.S., Bhargava S & Dixit V.K (2009) A comparative study on aphrodisiac activity of some Ayurvedic herbs in male albino rats Journal of Arch Sex Behav 38(6): 1009-1015 Thakur M & Dixit V.K (2007) Effect of some Vajikaran herbs on pendiculation activities and in vitro sperm count in male Journal of Sex Disabil 25(4): 203-207 Tharachand C., Immanuel S.C & Mythili M.N (2012) Molecular markers in characterization of medicinal plants: An overview Journal of Research in Plant Biology 2(2): 01-12 45 The Wealth of India (1950) Raw Materials, C.S.I.R Journal of New Delhi II 400 pages Venukumar M.R & Latha M.S (2002) Hepatoprotective effect of the methanolic extract of Curculigo orchioides in CCl4-treated male rats Indian Journal Pharmacol 34(4): 269-275 Vijayanarayana K & Rodrigues R.S (2007) Evaluation of estrogenic activity of alcoholic extract of rhizomes of Curculigo orchioides Journal of Ethnopharmacology 114: 241-245 Wang Y.K., Hong Y.J., Wei M., Wu Y., Huang Z.Q., Chen R.Z & Chen H.Z (2010) Curculigoside Attenuates Human Umbilical Vein Endothelial Cell Injury Induced by H2O2 Journal of Ethnopharmacology 132(1): 233 - 239 Wu Q., Fu D.X., Hou A.J & Lei G.Q (2005) Antioxidative phenols and phenolic glycosides from Curculigo orchioide Journal of Chemical and Pharmaceutical Bulletin 53: 1065-1067 Xia L-F., Liang S-H., Wen H., Tang J & Yan Huang Y (2016) Anti-tumor effect of polysaccharides from rhizome of Curculigo orchioides Gaertn on cervical cancer Tropical Journal of Pharmaceutical Research 15 (8): 1731-1737 Xu J.P., Xu R.S (1992) Cycloartane type sapogenins and their glycosides from Curculigo orchioides Journal of Phytochem 31: 2455-2458 Yadav D., Reshi MS., Shrivastava S., Srivastava N., Narayana S.K.K & Shukla S (2016) Macro - Microscopic evaluation, Physicochemical analysis and HPTLC Finger printing of Curculigo orchioides Gaertn Rhizome Journal of Pharmacogn 8(5): 430-434 46 PHỤ LỤC Phụ lục Kết giám định mẫu sâm cau 47 48 SC 1 0 1 1 1 SC 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 SC 1 1 0 1 SC 1 1 0 1 SC 1 1 0 1 1 SC 1 1 0 1 1 SC 1 1 0 1 1 SC 1 1 0 0 0 0 SC 1 1 0 1 1 SC1 1 1 0 0 1 SC1 1 1 0 0 0 SC1 1 1 0 1 1 SC1 1 1 1 1 0 SC1 Ma trận nhị phân thị RAPD Phụ lục 1 1 0 0 1 0 SC1 1 1 1 1 0 SC1 1 1 0 1 0 0 SC1 1 1 0 0 0 0 0 SC1 1 1 0 0 0 0 0 SC1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 SC2 SC2 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 50 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 51 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 52 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 53 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 SC 1 1 1 0 1 0 1 SC 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 SC 1 1 1 1 1 1 SC 1 0 0 1 1 SC 1 0 0 1 0 0 0 SC 1 0 1 1 1 0 SC 1 0 1 1 1 1 SC 1 0 1 0 1 0 SC 1 1 1 1 1 1 SC1 1 0 1 0 1 0 SC1 54 1 0 1 0 1 0 SC1 0 1 1 0 1 0 0 SC1 1 1 0 1 0 0 SC1 Ma trận nhị phân thị ISSR Phụ lục 1 1 1 0 0 0 SC1 1 1 1 0 1 1 SC1 0 1 1 1 0 0 SC1 1 0 0 0 0 0 SC1 1 0 0 0 0 0 SC1 1 0 1 1 1 SC2 1 0 0 1 1 0 SC2 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 55 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 56 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 57 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 58 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 59 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0