Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử its và nghiên cứu đặc điểm nông sinh học một số nguồn gen mộc nhĩ

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM HỒNG THỊ ĐÀO ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ITS VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC MỘT SỐ NGUỒN GEN MỘC NHĨ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS.Phạm Xuân Hội TS Ngô Xuân Nghiễn NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu tơi thực Số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực, xác chưa dùng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan tài liệu tham khảo sử dụng luận văn rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo quy định giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, tháng 11 năm 2020 Tác giả luận văn Hoàng Thị Đào i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận quan tâm hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn, tất chân thành cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Xuân Hội – Viện trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp TS Ngô Xuân Nghiễn - Bộ môn Công nghệ vi sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS.Nguyễn Thị Giang cô chú, anh chị cán Trung tâm Nghiên cứu phát triển Nấm, Viện Di truyền Nông nghiệp thầy cô bạn Trung tâm Đào tạo, Nghiên cứu Phát triển nấm ăn, nấm dược liệu - Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam quan tâm giúp đỡ, tận tình bảo động viên cho lời khuyên quý giá công việc sống Tiếp theo xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam bên cạnh giúp đỡ bảo cho tơi suốt q trình học tập trường Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn tới Bố, Mẹ tồn thể gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi suốt thời gian qua./ Hà Nội, tháng 11 năm 2020 Tác giả luận văn Hoàng Thị Đào ii MỤC LỤC Lời cam đoan .i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt .v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract ix Phần Mở đầu .1 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu .2 Phần Tổng quan tài liệu .3 2.1 Tổng quan chung 2.1.1 Đặc điểm hình thái phân loại 2.1.2 Đặc điểm sinh học phân bố 2.1.3 Giá trị dinh dưỡng công dụng nấm mộc nhĩ 2.1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất nấm mộc nhĩ nước quốc tế 2.2 Phương pháp phân loại nấm mộc nhĩ 2.2.1 Các phương pháp dựa đặc điểm hình thái .9 2.2.2 Các phương pháp dựa thị phân tử 10 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 18 3.1 Vật liệu địa điểm nghiên cứu 18 3.2 Phương pháp nghiên cứu 18 3.2.1 Phương pháp thu thập nguồn gen mộc nhĩ 18 3.2.2 Phương pháp phân lập giống nấm 18 3.2.3 Tách chiết ADN tổng số .19 3.2.4 Phản ứng PCR .20 3.2.5 Phương pháp điện di gel agarose 21 3.2.6 Phương pháp gel theo kit Qiagen 21 3.2.7 Giải trình tự .22 iii 3.2.8 Phương pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học giống mộc nhĩ 23 Phần Kết thảo luận .25 4.1 Thu thập, phân lập nguồn gen nấm mộc nhĩ .25 4.2 Kết đánh giá đa dạng di truyền thị phân tử ITS 26 4.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số 26 4.2.2 Kết PCR giống mộc nhĩ 26 4.2.3 Kết giải trình tự vùng ITS-rDNA giống nấm mộc nhĩ 27 4.2.4 Kết nhận biết giống mộc nhĩ nghiên cứu .28 4.3 Kết nghiên cứu đặc điểm nông sinh học 34 4.3.1 Đánh giá sinh trưởng hệ sợi nấm môi trường PGA 34 4.3.2 Đánh giá sinh trưởng hệ sợi nấm với ngưỡng nhiệt độ khác môi trường PGA 36 4.3.3 Đánh giá sinh trưởng hệ sợi giống mộc nhĩ giá thể ni trồng 40 4.3.4 Sự hình thành phát triển thể giống mộc nhĩ chất nuôi trồng 40 4.3.5 Về đặc điểm hình thái thể giống nấm mộc nhĩ 40 4.3.6 Năng suất giống mộc nhĩ nghiên cứu 41 Phần Kết luận kiến nghị 43 5.1 Kết luận .43 5.2 Kiến nghị 43 Tài liệu tham khảo 45 Phụ lục 49 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt AFLP Amplified fragment length polymorphism CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence CTAB Cetyl trimetylammonium bromua DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ITS Internal transcribed spacer LDL Low density lipoprotein PCR Polymerase chain reaction RAPD Random Amplified Polymorphic DNA rDNA Ribosome Deoxyribonucleic acid RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms SCAR Sequence Characterised Amplified Region SNP Single-Nucleotide Polymorphism TAE Tris-acetate EDTA v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách mồi ITS 20 Bảng 4.1 Nguồn gen nấm mộc nhĩ thu thập 25 Bảng 4.2 Độ dài đoạn trình tự vùng ITS-rDNA 09 giống mộc nhĩ 27 Bảng 4.3 Tỉ lệ thành phần nucleotide vùng ITS1-5,8S-ITS2 28 Bảng 4.4 Hệ số tương đồng di truyền 09 giống mộc nhĩ 29 Bảng 4.5 Sự sinh trưởng hệ sợi nấm mộc nhĩ môi trường PGA 35 Bảng 4.6 Hệ sợi nguồn gen nấm mộc nhĩ với ngưỡng nhiệt độ khác môi trường PGA 36 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Các giai đoạn phát triển thể nấm mộc nhĩ Hình 2.2 Một số hình ảnh thể nấm mộc nhĩ Hình 2.3 Sơ đồ vùng rDNA-ITS 12 Hình 2.4 Chu trình phản ứng PCR 14 Hình 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số 09 giống mộc nhĩ 26 Hình 4.2 Kết PCR 09 giống mộc nhĩ với cặp mồi ITS4/ITS5 26 Hình 4.3 Cây quan hệ phát sinh 09 giống mộc nhĩ nghiên cứu 29 Hình 4.4 Một số vị trí nucleotide sai khác vùng gen ITS-rDNA mẫu mộc nhĩ mẫu tham chiếu 34 Hình 4.5 Sinh trưởng hệ sợi giống mộc nhĩ giá thể ni trồng 39 Hình 4.6 Thời gian thể khối lượng thể giống mộc nhĩ 40 Hình 4.7 Đặc điểm hình thái thể giống mộc nhĩ 41 Hình 4.8 Năng suất giống nấm mộc nhĩ 42 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hoàng Thị Đào Tên luận văn: Đánh giá đa dạng di truyền thị phân tử ITS nghiên cứu đặc điểm nông sinh học số nguồn gen mộc nhĩ Ngành:Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đánh giá đa dạng di truyền thị phân tử ITS để nhận dạng 09 nguồn gen nấm mộc nhĩ nghiên cứu đặc điểm nông sinh học nguồn gen nấm mộc nhĩ thu thập, từ tìm giống nấm mộc nhĩ triển vọng đưa vào sản xuất Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu gồm 02 nội dung đánh giá đa dạng di truyền nghiên cứu đặc điểm nông sinh học số nguồn gen nấm mộc nhĩ thu thập vùng miền nước Nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học phân tử bao gồm tách chiết DNA tổng số, PCR, điện di, giải trình tự, so sánh trình tự với mẫu tham chiếu từ phân loại giống nấm mộc nhĩ thu thập phần mềm tin sinh học Ứng dụng nuôi trồng để đánh giá đặc điểm nông sinh học giống nấm mộc nhĩ Kết kết luận Giải trình tự vùng gen ITS1-rDNA-ITS2 09 giống mộc nhĩ thu thập; dựa vào quan hệ phát sinh chia giống mộc nhĩ thành nhóm từ kết so sánh trình tự nhận dạng giống mộc nhĩ thuộc loài A.polytricha, A.delicata A.cornea Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học cho thấy ngưỡng nhiệt độ phát triển hệ sợi tối ưu 09 giống mộc nhĩ nghiên cứu; đánh giá, tuyển chọn 03 giống mộc nhĩ có suất sinh học cao, chất lượng tốt có tiềm đưa vào khảo nghiệm nuôi trồng thời gian tới viii THESIS ABSTRACT Master candidate: Hoang Thi Dao Thesis title: Evaluate genetic diversity based on ITS (internal transcribed spacer) sequences and study agro-biological characteristics of wood ear (Auricularia spp) Major: Biotechnology Code: 42 02 01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Evaluate genetic diversity using ITS (internal transcribed spacer) sequences to identify 09 varieties of wood ear mushroom and study agro-biological characteristics of wood ear mushroom genetic resources collected, thereby finding the promising wood ear mushroom varieties the prospect for production Materials and Methods The study includes contents: evaluate genetic diversity and study agro-biological characteristics of wood ear mushroom genetic resources collected in regions across the country The study used molecular biology methods including total DNA extraction, PCR, electrophoresis, sequencing, comparison with reference samples from which to classify of wood ear mushroom genetic resources collected by bioinformatics soft Farming applications to evaluate agro-biological characteristics of wood ear mushroom varieties Main findings and conclusions Sequencing of ITS1-rDNA-ITS2 gene regions of 09 varieties wood ear mushroom collected; based on the relation tree, it is possible to divide 09 varietes of woodear mushroom into main groups and from the results of comparing the sequence, identify 09 wood ear mushroom varieties of A.polytricha, A.delicata and A.cornea Study agrobiological characteristics show optimal fiber system development temperature threshold of 09 wood ear mushroom varieties; 03 wood ear mushroom varieties with high biological yield and good quality have been evaluated and selected to be tested for cultivation in the coming time ix 4.3.4 Sự hình thành phát triển thể giống mộc nhĩ chất nuôi trồng Do giống nấm Aucg2 Aucg6 không bung sợi nên số 09 giống nấm mộc nhĩ nghiên cứu có 07 giống nấm có khả hình thành phát triển mầm thể chất nuôi trồng Thời gian hình thành mầm thể giống dao động từ 53,4 -57,7 ngày; giống có thời gian thể sớm Au9 (53,4 ngày) giống xuất mầm thể muộn Aucg1 (57,7 ngày) (hình 4.6) 16 59 13.9 11.4 12 10 58 12.8 57.7 57 10.2 56.3 9.8 9.2 56 55.5 55 54.5 54.2 54 53.5 53.4 53 T thể (ngày) Khối lượng thể (g/quả) 14 13.6 52 51 Aucg1 Aucg4 Aucg5 Aucg7 Au8 Giống nấm Mộc nhĩ Au9 Au1(đ/c) Hình 4.6 Thời gian thể khối lượng thể giống mộc nhĩ 4.3.5 Về đặc điểm hình thái thể giống nấm mộc nhĩ Các giống nấm Aucg7, Au8, Au9 Au1 có kết cấu tai nấm dai, bề mặt tai nấm có phủ dày sợi lơng ngắn, phía tai nấm có màu xám đến nâu, đặc điểm đặc trưng giống nấm mộc nhĩ thuộc loài A cornea (Trịnh Tam Kiệt & cs., 2012) (hình 4.7A) Các giống Aucg1, Aucg2, Aucg4 Aucg5 thuộc lồi A delicata (hình 4.7B) loài nấm hoang dã thu thập vùng nhiệt đới gió mùa tỉnh Lâm Đồng Kết cấu tai nấm nhăn có gân (lưới), tai nấm mềm nhiều so với loài A polytricha giịn so với A auricular-judae, lồi nấm phát vườn Quốc gia Cát Tiên năm 2012 Duy giống Aucg6 thuộc loài Auricularia polytricha, loài nấm thu thập thân gỗ vườn quốc gia Bidoup tai nấm có màu hồng xám (hình 4.7 C) 40 Hình 4.7 Đặc điểm hình thái thể giống mộc nhĩ 4.3.6 Năng suất giống mộc nhĩ nghiên cứu Năng suất nấm mộc nhĩ phụ thuộc chặt chẽ vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng chất nuôi trồng (Krishnan & cs., 2011) Trong nghiên cứu này, giống nấm mộc nhĩ nuôi trồng điều kiện Khối lượng thể nấm tiêu quan trọng định đến suất giống mộc nhĩ Kết giống nấm mộc nhĩ có khối lượng có sai khác có ý nghĩa mức độ tin cậy 95%; 04 giống ) Aucg4, Aucg5, Aucg7 Au8 có khối thể đạt từ 11,4-13,9 g/quả cao giống đối chứng Au1(giống công nhận giống sản xuất); 02 giống cịn lại Aucg1 Au9 có khối lượng thể thấp từ 9,2-9,8 g/quả 41 Năng suất giống nấm mộc nhĩ có khác rõ rệt Hai giống nấm Aucg7 Au8 thuộc loài Auricularia cornea giống Aucg5 thuộc lồi Auricularia delicata có suất nấm tươi cao khác biệt có ý nghĩa α=0,05 so với giống lại so với giống đối chứng Năng suất nấm tươi thu 03 giống 720,6kg; 715,6 kg 680,3 kg nấm tươi/tấn nguyên liệu, cao giống đối chứng Au1 Các giống giống nấm cịn lại có suất thấp tương đương khơng có khác biệt có ý nghĩa so với giống đối chứng Au1 (hình 4.8) 800 720.6 607.3 Năng suất nấm tươi(g/kg NL) 715.6 680.3 700 634.4 613.7 610.5 Au9 Au1(đ/c) 600 500 400 300 200 100 AuCG1 AuCG4 AuCG5 AuCG7 Au8 Giống nấm Mộc nhĩ Hình 4.8 Năng suất giống nấm mộc nhĩ 42 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 09 giống mộc nhĩ nghiên cứu đa dạng, hệ số tương đồng di truyền giống Mộc nhĩ dao động khoảng 54,40% (giữa hai giống Aucg5 Aucg6) đến 99,76% (giữa giống Au1 Au9) Dựa vào quan hệ phát sinh 09 giống mộc nhĩ thu thập mẫu tham chiếu xác định chia thành nhóm Kết so sánh trình tự nucleotide vùng ITS1-rDNA-ITS2 với marker ITS4/ITS5 nhận dạng giống Aucg6 thuộc loài A polytricha; hai giống Aucg1 Aucg4 thuộc loài A delicata; bốn giống Aucg7, Au8, Au9 Au1 thuộc loài A cornea Kết đánh giá đặc điểm nông sinh học cho thấy: - giống nấm mộc nhĩ Aucg5, Aucg7 Au8 có hệ sợi sinh trưởng khỏe, mật độ hệ sợi dày môi trường PGA chất nuôi trồng - Nhiệt độ tối ưu cho phát triển hệ sợi giống nấm mộc nhĩ nghiên cứu 30±2oC - Ở giai đoạn nuôi trồng giống nấm nghiên cứu, có 02 giống giống Aucg2 Aucg6 khơng hình thành phát triển thể chất nuôi trồng 03 giống giống Aucg5, Aucg7 Au8 có thời gian hình thành thể sớm tương đương cho suất sinh học cao giống đối chứng Au1 từ 11,518,1%; chất lượng tốt đưa vào để khảo nghiệm ni trồng hướng tới phục vụ sản xuất - Kết phân tích đa dạng di truyền có liên quan chặt chẽ với kết phân tích đặc điểm hình thái thể giống mộc nhĩ nghiên cứu 5.2 KIẾN NGHỊ - Cần xây dựng mơ hình khảo nghiệm cho giống Aucg5, Aucg7 Au8 tiềm để từ nhân rộng sản xuất giống đại trà cho tỉnh, nâng cao suất - Cần tiếp tục đánh giá sử dụng thị khác với mẫu Aucg2 Aucg5, hệ số tương đồng chúng với mẫu tham chiếu cịn chưa cao(