Microsoft Word Nghien cuu ap dung tin sinh hoc de quan ly an toan sinh hoc doc B KH & CN V DT N B K H & C N V D T N N Bé n«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp §−êng Ph¹m V¨n §[.]
KháiniệmvềGMO
GeneticallyModifiedOrganisms)làcơthểsống(vídụnh−c â ytrồng)m à vậtchấtditruyềncủ anóđãbịbiếnđổinhờphươngt i ệ n c ủ a k ỹ t h u ậ t g e n S ự b i ế n đ ổ i d i t r u y ề n thườngb a o gồmsựchènđoạnADN,táitổhợpnhữngmảnhADNnhỏhaygenvàotronggenomecủacơthể bịbiến đổi.Quátrìnhnàyđượcgọilàchuyểnnạp.ởvikhuẩnvàthựcvậtcóđặcđiểmtươngt ự thìsựbiế nđổiditruyềncũngcóthểxảyranhờsựthayđổimãtồntạimàkhôngc h è n ADNngoạilai.
(1)đoạnpromoter(đoạnkhởiđộng),cóchứcnăngnh−mộtchiếccôngt ắ c bật/ mởđểđọcgenđãbiếnđổihoặcgenđãchèn.
(2)genđãđ−ợcchèn(hoặcgenđãbịbiếnđổi)đểmãhoáđặcđiểmđãchọnlọcriêngbi ệt.
(3)đoạnterminator (đoạnkếtthúc),cóchứcnăngnh−mộttínhiệudừngđểđọcgenđ ãc h è n (hoặcgenđãbiếnđổi).Ngoàira,mộtvàithànhtốkháccóthểcómặttr on g cấu trúccủagenchènvàchứcnăngcủachúngthườnglàđểđiềuchỉnhvàổnđịnhchứcnăn gcủagen,hoặcđểchứngminhsựcómặtcủacấutrúct r o n g GMOshoặcđểcósựkếthợ pdễdàngcủacácthànhphầnkhácnhaut r o n g cấutrúcgenchèn.Cấutrúcgenphảiđ− ợctươnghợpvớigenomecủacơth ểnhậnđểnócósựditruyềnổnđịnh.Vìthếgenomec ủachínhcơthểnhậnc ũ n g làmộtthànhtốquantrọngtrongquátrìnhchuyểnnạp[35].
Tìnhhìnhthươngmạihoásinhvậtbiếnđổigen
Tìnhhìnhnghiêncứuvàthươngmạihoácâytrồngbiếnđổigen
Vớis ự m ớ i l ạ c ủ a cácc ơ t h ể đ−ợccảit i ế n vềmặtditruyềnvàsựl i ê n quan đếnantoànsinhhọcđãbuộcc á c chínhphủphảiđềracácquiđịnhvềcâychuyểngen.Vìthếnhiều cuộcthửnghiệmứngdụngthànhtựucủacôngnghệgenđãvà đangdiễnratrêntoànthếgiới.Nhiềucâyđ−ợcchuyểngenđểtạorakhảnăngchốngc h ị u thuố cd i ệ t c ỏ ( 4 8 9 l o à i ) , t ạ o r a nhữngtínhtrạngcủagenđ á n h d ấ u ( 4 8 8 loài),khảnăngchịub ệnh(185l o à i ) , chốngchịucôntrùng(89l o à i ) , cảit i ế n chấtl−ợng(72l o à i )…[108].
Câychuyểngenđầutiênđól à câythuốcl á khángkanamycin(năm1983).Năm1994,cây càch uachuyểngenđầutiênđãđượcthươngmạihoá[134].Vàđếnnăm 1996,sựphụchưngtrongnôn gnghiệpđãxảyradosựthươngmạihoácáccâytrồngchuyểngen.Sựpháttriểncáccây chuyểng enlàrấtnhanhvàđểt−liệuhoásựphátt r i ể n củangànhmớinày,cácthốngkês a u đâyđãđ−ợct hul−ợmt ừ c á c b á o c á o thôngt i n t ừ tr−ớctớinay.N ă m 1996,G M C (GeneticallyModifi edCrop)đãđ−ợctrồngmộtcáchphổbiến,diệntíchtăngl ê n khôngngừng:2,8triệuha(1996),1
2 , 8 t r i ệ u ha(1997),27,8triệuha(1998),40t r i ệ u ha(1999),44,2t r i ệ u ha(2000),52,6 triệuha(2001),58,7t r i ệ u ha(2002)[22,23,72],81triệuhéc-ta(năm2004),và90triệuhéc- ta(n¨m2005).
Sốquốcgiatrồngcâychuyểngenđãtăngmộtcáchđángkể,từ17nướctrongnăm2004 đã tănglên21n−ớcvàonăm2005,baogồm11n−ớcđangpháttriểnvà10n−ớccôngnghiệp Đángchúýlàsovớinăm2004,năm2005đãcó4nướcmớithamgiatrồngcâychuyểnge n,3trongsốđólàcácnướcthuộcLiênm i n h Châuâu,đólàBồĐàoNha,PhápvàCộngho àSéc,n−ớcthứ4làIran.
XếptheothứtựdiệntíchtrồngtừlớntớibélàHoakỳ,Achentina,Braxin,Can ad a, Tr ungquốc,Paraguay,ấnđộ,NamPhi,Uruguay,Ôxtralia,
Mêxicô,Rumani,Philippine,TâyBanNha,Colombia,Iran,Honduras,Bồ ĐàoNha,Đức,PhápvàCộnghoàSéc.
1 HoaKỳ 49,8 Đậutương,ngô,bông,cảicanola,bí,đuđủ
2 Achentina 17,1 Đậut−ơng,ngô,bông
4 Canada 5,8 Cảicanola,ngô,đậut−ơng
8 NamPhi 0,5 Ngô,đậut−ơng,bông
Hoakỳlàquốcgiacódiệntíchcâytrồngchuyểngenlớnnhấtthếgiới( ch i ế m 55%diệntíchtrồngcâychuyểngentrêntoàncầu),trongđókhoảng2 0 % làcácsảnp hẩmgenxếpchồng(stackedgene)cóchứahaihoặcbagen,vớisảnphẩmmangbagen lầnđầutiênxuấthiệntrongcâyngôởMỹtrongn ăm qua.Cácsảnphẩmmangtừhaige ntrởlênhiệnđãđ−ợctriểnkhaiởHoak ỳ , Canada, Ôxtraylia,Mêxicô,NamPhivàđãđ−ợcchophéptriểnkhaitại
Philippine,làxuh−ớngquantrọngvàđangngàymộttăngtrongt−ơnglai,vàt h í c h hợp hơnkhixácđịnhdiệntíchtrồngtheođặctínhhơnlàdiệntíchcâych uy ể n gennóichun gđ−ợcđ−avàotrồng.Số l−ợngdiệntích trồngtheođặctín h ởMỹtrongnăm2005là59,4triệuhéc- ta,tăng19%sovớisovớidiệntíchtrồ n g câychuyểngenlà49,8triệuhéc- tacủanăm2004.Nếuxéttrêntoàncầut h ì diệntíchtrồngtheođặctínhnàylà100,1triệ uhéc-ta,tăng10%sovớiconsố90triệuhéc-tacủanăm2004.
Trongvòng10nămquat ừ năm1996tớinăm2005,t í n h trạngkhángthuốcdiệtcỏliêntụ clàtínhtrạngnổibật,tiếpđếnlàtínhtrạngkhángsâubệnh,vàcácgenxếpchồngmangcảhaiđặc tínhtrên.Năm2005,t í n h trạngkhángthuốcdiệtc ỏ đã đ−ợctriểnkhaiở câyđ ậu t−ơng,ngô,cải dầuvàbông.Diệntíchtrồngcácloạicâytrồngmangtín htrạngkhángthuốcdiệtc ỏ chiếm71%t−ơngđ−ơngv ớ i 63,7triệuhéc- tatrongtổngsố90triệuhéc- tadiệntíchtrồngc â y chuyểngentrêntoànc ầ u , trongđó16,2triệuhéc- ta(chiếm18%)làtrồngcâytrồngB t và10,1triệuhéc- ta(11%)làdiệntíchgieotrồngcácloạicâychuyểngenmangcảhaiđặctínhchịuđ−ợcthuốcdiệt c ỏ vàkhángsâubệnh.Cáccâytrồngm a n g c ả haiđặctínht r ê n làn h ó m tăngtrưởngnhanhnhấ ttrongnămvừaquavớimứctăngdiệntíchlà49%sovớinăm2004,sovớimứctăng 9%củacâytr ồngmangđặctínhkhángthuốcdiệtcỏvàmứctăng4%củacâytrồngmangriêngđặctínhkháng sâubệnh[27].
Trongtổngsố120loạiGMCsđãđ−ợctrồngđểlàmthựcphẩmvàthức ănchănnuôithìđậut−ơngchuyểngencódiệntíchgieotrồnglớnnhấtvới54,4 triệuhé c- ta(chiếm60%diệntíchtrồngcâychuyểngentrêntoàncầu),ti ếp đếnlàngô(vớidiện tíchtrồnglà21,2triệuhéc-tachiếm24%),bông(vớid i ện tích9,8triệuhéc- ta,chiếm11%)vàcảidầucanola(với4,6triệuhéc- ta,chi ếm 5%diệntíchtrồngcâychuyểngentrêntoàncầu)[27].
TheosốliệuthốngkêcủaHộiđồngNôngnghiệp(ROC)thìhàngnămĐàiLoannhậpkhoảng600 tấnngô,trongđó96%làtừMỹ.Vàkhoảng30%ngôthươngmạiở ĐàiLoanđ−ợcđánhgiálàngôbiếnđổigen[72].
Vớith ự ctế t h u đ−ợctrongthậpkỷđ ầu tiên(từnăm1996tớinăm2005)c ây t r ồ n g ch uyểngenđ−ợcđ−avàocanhtác,cóthểlạcquanchorằngcâytrồngchuyểngensẽtiếptụctăngtr
Sốl−ợngcácn−ớcđ−avàotrồng 4 loạicây trồngchuyểngenchính dựkiếnsẽt iế p tụcnhiềuhơn,vàdiệntíchtrồngcùngvớisốl−ợngng−ờitrồngloạicâynà ycũngsẽtiếptụcgiatăngdothếhệcâytrồngchuyểngenđầutiênđang đ−ợcsửdụngrộngrãi,vàthếhệthứhaivớicảcáctínhtrạngđầuravàđầuvào đangtrởnênsẵncó.Ngoàicácsảnphẩmnôngnghiệptruyềnthốngdùnglàml−ơngth ực,thựcphẩm,làmthứcănchănnuôi,hayđểlấysợi,cácsảnphẩmn ô n g nghiệpmớic óthểdùnglàmthuốc,làmthựcphẩmchứcnăng,làmhóachất,vàđặcbiệtlàtạoracácn guồnnăngl−ợngcóthểtáichếđ−ợc, đểthayt h ế chocácloạinhiênliệuhóathạch,nhữngloạinhiênliệukhôngthểtáichế được, gâyônhiễmmôitrườngvàcácloạinhiênliệukhíđốtngàycàngtrởnên đắt đỏ Trong thời gian tới,tạicác thị trường đã đượcthiếtlập ởcácnước côngn gh iệ p, sựpháttriểncủacácsảnphẩmmangcáctínhtrạngtổnghợp,đ−ợcđob ằ n g diệntíchcâytrồngchuyểngentínhtheotínhtrạng,sẽtiếptụcpháttriểnc ù n g vớiv iệcđ−aragiớithiệucácđặctínhtổnghợpđầuvàovàđầuramớiđểtạo ra giá trị vàđápứngđ−ợcnhu cầu đadạngcủa cảng−ờisảnxuấtvàng−ờitiêudùng,nhữngng−ờiđangtìmkiếmcácloạithựcphẩmgi àuchấtdinhd−ỡngvàantoànhơn,cógiárẻhơn.Câytrồngchuyểngenvớiviệcsửdụng cácphươngphápcanhtáctốt,sẽtiếptụcgiữvaitròquantrọngnhưđãđạt đượctrongmườinămqua,vàcầnphảitiếptụcthựchiệnvaitròthenchốt,đặcb i ệ t làởc ácn−ớcđangpháttriển,nhữngquốcgiatrồngcâytrồngchuyểngench ủ yếutrongthậ pniêntới. ởViệtNamcũngđãcónhiềucôngtrìnhnghiêncứuchuyểngentạoragiốngmớicócácđ ặctínhưuviệthơnsovớigiốngthôngthường.Mộttrongn h ữ n g thànhtựutronglĩnhvựcchuyển gennàylàtạoracâytrồngcókhảnăngkhángbệnhvàcôntrùng.Vídụnh−:N g h i ê n c ứ u c ủ a c á c nhàkhoahọcthuộcViệnD i truyềnNôngnghiệpđểchuyểngenCryIAckhángsâuvàomột sốgiốngcảibắp(Brassicaoleraceav a r capitata)nhờAgrobacterium.ChủngAgrobacterium
G V 2260mangvectơnhịphânpART27chứagenchọnlọcnptII(NeomycinPhosphatTransfer asa) khángkanamycinvàgenCryIAcmãhoáproteintinhthểkhángsâu Cácgennàyđã đ−ợcb i ế n n ạ p thànhcôngvàomộtsốgiốngc ả i bắpđ ị a ph−ơngvàlầnđầut i ê n kĩthuậtla i A DNSouthernB l o t t i n g đ ã đ−ợcsửdụngđểpháthiệnchínhxácgenngoạilaic ó t r o n g c â y b ắ p cảichuyểngen[25].GenBtphốihợpgiữaCryIA(b)-
Mộtphươngphápkhácđãđượcứngdụngđểchuyểng e n khánghygromycin,genGUSvàgenk hángb ệ n h bạcl áXa-21v à ol ú a đól à phươngphápbắngen.Sửdụngk i ể u bắngenCo- Bombardmentlàphươngphápđồngchuyểnhaigentrêncácplasmidkhácnhau,ADNcủac á c plasmidđ−ợcbọcvàocáchạtđạntheoprotocol(Klein& CS,1988).LấyADNcủa2 plasmidp3
21)trộnvớitỷlệ1:8,nhỏvào100lgoldsuspenssion.VớisựcómặtcủaCaCl2vàspermidin,A DNsẽđ−ợcbọcchắcvào đạn.Nhữnghạtđạnnàysẽđ−ợcdùngđểbắnthẳngvàomôlúa Kếtquảl à cácgen mongmuốnđ ã đ−ợcchuyểnv à o 2 giốnglúaJaponicaTp309vàIndicaVL901(kếtquảnàyđ−ợ ckhẳngđịnhnhờphảnứngPCRvàphảnứn ghoámô v ới h oạt tính củaGUS)
[25].Cũngvớiph−ơngphápnàycácnhàkhoah ọc thuộcViệnSinhhọcNhiệt đớiTP.HCMvàV i ệ n NghiêncứuLúaQuốct ế (IRRI)đãsửdụngthiếtbịbắngent r ê n tế bàoh u y ền phùgiốnglúaViệtNamTàiNguyênvàđãthunhậnđ−ợcmộ ts ố dòngcâychuyểngenma nggenCryIA(b)-CryIA(c)khángsâuđụcthân[26].
Phươngphápchuyểngentrựctiếpvàotếbàotrầncũngđãđượcthựchiệnthànhcôngởc âysúplơ(B.OlebaceaL.Var.Botrytis).Kỹthuậtchuyểngenvàotếbàotrầnvớiviệcsửd ụngADNplasmidmangcácgenquantâmđãđ−ợcc ả i tiếnbởinhiềutácgiả.Vớiviệcs ửdụngPEG(PolyethylenGlycol)nh−mộty ế u tốhấpthụADN,cácnhàkhoahọcthuộ cViệnDitruyềnNôngnghiệpViệtN a m vàĐứcđãchuyểngentrựctiếpvàotếbàotrần củacâysúplơ;đólàcácg e nTuMV- cPmãhoáchoproteinvỏcủaviruskhảmcủcải,genhptmãhoáchoenzymhygromyci nphosphotransferase,gengfpmãhoáchoproteinpháth u ỳ n h quangmàulục.Kếtq uảlàvớisựhỗtrợcủaPEG,cả3gentrênđều đ−ợcchuyểnđồngthờivàoprotoplast[24].
Mộth−ớngkháccủacácnhàkhoahọcViệtNamlàtạor a câytrồngc ó khảnăngkhángthuốctrừc ỏ.Thànhtựunàyđãđ−ợcứngdụngthànhcôngởcâythuốclá.Các nhàkhoahọcthuộcViệnsinhhọcnhiệtđới(Trungtâm KHTN& CNQuốcg ia) vàtrườngĐHN ôngl â m TP.HCMđãsửdụngphươngphápchuyểngenthôngquavikhuẩnAgrobacteriumtum efacienschứaplasmidITBmanggenbar(genkhángt h u ố c trừc ỏ basta),genCryIA(c),gen GUSđểchuyểnn ạ p v à o trongc â y thuốcl á Quak ế t q u ả phânt í c h PCR,bướcđầuđãkhẳng địnhg e nbar(vàcả2 gentrên)đã đ−ợcchuyểnv à o nhiễmsắcthểcủacây.Vàquanghiênc ứ u chothấyđãc ó s ự ditruyềnvàsựph ânlytheoquyluậtMendel(vớitỷlệ3:1)củagenbarởthếhệT1củacâythuốcláchuyểngenvàgenn àyởdạngtrội[26].
Genbar( m ãhoáchoenzymPhosphinothricinAcetylTransferase)cũngđãđ−ợcbiếnnạpvào câycảidầunhờchủngAgrobacteriumAGL1(cóchứaplasmidpDM805manggenGUSvàgenb ar).Vàk ế t quảbướcđầuđãthunhậnđược20c â y cải dầum a n g genGUSvàgenbartạiViệnD itruyềnNôngnghiệp[3].
ViệtNamcũngđãtạorađ−ợcg iố n g lú a tổngh ợ p đ−ợcVitaminA (goldenr ice) vàkhángsâu nhờứngdụngkỹthuậtditruyền(TrầnT.C ú c H o à & C S , 2003,2005).Tuyđãcó mộtsốcôngtr ìnhnghiêncứuchuyểng en ở thựcvật,nh−ngtất cảch ú n g v ẫ n chỉđ−ợcthửnghiệmởquymôp hòngthínghiệmvàch−ađ−ợcthửnghiệmtrongsảnxuất.Trongt−ơnglaikhôngxa,hyvọngrằn gcáccâytrồngchuyểngencủaViệtN a m sẽđ−ợccôngnhậnvàđ−ợcđ−avàoth−ơngmạihoá,s ảnxuấtrộngrãi.
Nh−vậylàtrongmộtkhoảngthờ i gianrấtngắnGMCssđãpháttriểnvớitốc độrấtnhanh,nóđãvàđangtrởthànhsảnphẩmhànghoáđượcthươngmạihoákhắpt o à n cầu.N g−ờita−ớctínhrằngsảnphẩmGMCcủaMỹcómặttronghơn2vạncácl o ạ i mặthàngthựcphẩ m.Thịtrườngtoàncầuvềcâytrồngbiếnđổigenvàsảnphẩmd ẫ n xuấtcủanóbắtđầutăngtrưởn gnhanhchóngtừnăm1995.Doanhthuvềlĩnhvựcnàycũngngàymộttăng:năm1995là75triệu USD,năm1996là235triệuUSD,n ă m 1997là670triệuUSD,năm1998là1,6tỷUSD,năm199 9khoảng2,1–
2,3tỷUSD.Trongvòng5nămmàdoanhthutănglênđếngần30lần Năm2004là6,5tỉ đô-la,vànếutínhgộptấtcảlợiíchkinhtếtừnăm1996chotớinăm2004thìsốtiềnnàylà27tỉđô- la(trongđócácnướcđangpháttriểnthuđược15tỷvàcácnướccôngnghiệpthuđược12tỉ).Dựto ánkimngạchvềlĩnh vựcnàyvàonăm2010làkhoảng25tỷUSD[27].Trongnhữngthậpkỷtới năngsuấtcâytrồngsẽtăng10–
Thựctrạngnghiêncứuđộngvậtbiếnđổigen
KhibiếtrằnggenquyếtđịnhtínhtrạngcủasinhvậtlàmộtđoạnADN.V ì vậyn ếulấygenbênngoàirồidùngphươngphápnhântạochuyểndịchnóvàotrứngđãthụti nhcủamộtloàiđộngvậtnàođóthìgennàynhờsựphânc h i a củatrứngđãthụtinhvàsự phátdụccủaphôimàphânbốkhắpcảtếbào[ 1 4 ]
H a y bằngkỹthuậtvitiêm,ng−ờitađ−a genlạ,genmớivàonhâncủat i n h trùngtronghợptử.Nuôicấyhợptửtrongốngnghiệ mchođếngiaiđoạnph ô i dâuhoặcphôibào,rồicấychuyểnvàotửcungconvậtnhận,đ
−ợcgâyc h ử a giả.Loàiđộngvậtcómanggenngoạilainàyđ−ợcgọilàđộngvậtc h u y ể n gen.
Vớikỹthuậttiêntiếncủacôngnghệsinhhọchiệnđạitrênđốit−ợngvậtn u ô i , c ụthểlàcôngnghệgenvậtnuôi, ngườitađãtạođượccácvậtnuôi,giasúccótốcđộlớnnhanh,hiệusuấtsửdụngthứcănc ao,nângcaophẩmchất,chấtl−ợng,tăngsảnl−ợngsữa…;tạoracácgiốnggiasúc,vật nuôicókhản ă n g khángbệnhcao.Nhiềuthínghiệmvềđộngvậtchuyểngenđãđ−ợcti ếnh àn h , mộtsốđộngvậtđ−ợcchuyểngenđểdùngchữabệnh(trongyhọc),mộtsốkh ácđ−ợcdùngtrongmụcđíchchănnuôinh−bò, lợn,cừu,dê,thỏ,gà,cá…
N ăm 1985,mộtsốnhàkhoahọcTrungQuốcđãchuyểngenkíchthíchsinhtrưởn gcủang−ờivàotrứngthụtinhcủacávàngvàcáchạch.Kếtquảlàc ó 10%cáchạchcótốc độlớnnhanh,gấp3–
4lầnsovớicáchạchthường[ 4 2 ] Trongvòng10nămqua,bằngkỹthuậtvitiêmđểđưa genlạvàotếbàotrứng, hàngloạtcáchuyểngenđãđ−ợctạoranh−cáhồicầuvòng,cáchép,cátrạch,cátrê… Vàđãcótrên10loàibaogồmbò,heo,dê,cừu,thỏ,gà,cá đã đ−ợcnghiêncứuchuyểngentheoh−ớngtạorađ−ợcnhữnggiốnggiasúcvàvậtnuôicós ứcđềkhángbệnhtật,cókhảnăngcảithiệnđángkểvềchấtl−ợngcủ a thịt,sữavàtrứng Ng−ờitahyvọngtrongthờigiankhông xasẽtạođ−ợcl o ạ i thịtlợncótỷlệnạcrấtcao,giốngnh−thịtbò,sữabòcótỷlệđạmcao,t r ứ n g gàcólòngđỏto,màuđỏđậmhơn,tỷlệlecithinecaovàvỏcứng[5].
Vớikỹthuậtcấyghépgen,cấyghéphợptử,nuôicấytếbào,việcchọnlọcnhângi ốnggiasúcđãđạtđượcbướctiếncóýnghĩarấtquantrọng.Từmột conbògiốngtốtđ−ợcchọnlọcchothụtinhnhântạovớimộtgiốngtốtkhácsẽtạo đ−ợch ợptửlaimangđặctínhchọnlọccầnthiết,cóthểdễdànglấyđ−ợch ợ p tửnàyravàvậnchu yểntừnướcnàysangnướckhácđểcấyvàotửcungcủa cácconbòđịaphươngbắtchúng mangthaiđểđẻranhữngbêconcónhững đặc tínhưu việt đượcchọn lọc.Người ta cũng đãthànhcông khilấybỏn h â n từtrứngđãthụtinhcủamộtconbòbìnhthườngrồicấythaythếvàođón h â n tếbàocủaconbòcónhữngđặctínhtốtđ−ợcchọnlọc,tạorađ−ợctrứngthụtinhcón hânmới.Sauđóđưatrứngnàytrởlạivàotửcungcủaconbòbìnhthườngđểchonómang thaivàđẻra bê con cóđ−ợcnhữngđặctínhnh−cácch u y ê n giatạogiốngmongmuốn[5]. ởViệtnamcũngđãcócôngtrìnhnghiêncứuvềtạocáchuyểngenhormonesin htr−ởngng−ờiở2loạicávàngvàcáchạchnhờvitiêm.Kếtquảt h u đ−ợcchothấy: cácphôitrầnđ−ợctạobằngsửdụngenzymtrypsinchotỷlệnởcao(80%),tỷlệcáconsố ngsau3ngàytuổiđạttới94%,trứngcávitiêmhormonesinhtrưởngđạttỷlệnởtừ12- 16%vàtrọngl−ợngcásau45ngàyt u ổ i lớngấp1,5–
Việcchuyểngensừngkeratinvàođộngvậtnh−dê,thỏ… cũngđãl à m chophẩmchấtlôngcủachúngđ−ợccảithiện[14].
HiệnnaycótriểnvọngnhiềuhơncảlàcôngtrìnhvitiêmgenMxvàolợn,tạo đượcgiốnglợnmiễndịchvớibệnhcúm.Ngườit a cũngđãthànhcôngkhivit i ê m g e n IgAvàol ợn,cừutạoracácgiốngvậtnuôimiễndịchđ−ợcvớinhiềubệnh.Hay đãthànhcôngkhivitiêminsulinbòvàolợn,cừu,dê,gàtạođ−ợcgiốnggiasúcchothịtkhôngdí nhmỡ.Mộth−ớngmới,đầytriểnvọnglàvitiêmmộtsốgencủavisinhv ậ t v à o c ơ thểv ậ t nuô inh−đ−agenmãhoáenzymxúct á c tổngh ợ p acidaminXysteinđểtạogiốngcừumớichonăn gsuấtlôngcaog ấ p nhiềulần.Hiệnnayđ−ag e n tổnghợptreoninvàlyzincónguồngốcvisinhvậ tvàođểlàmtănghiệuquảsửdụngthứcăncủavậtnuôi[18].
Thựctrạngnghiêncứuvisinhvậtbiếnđổigen ……………………… 14 1.3.Vấnđềantoànvàrủirocủasinhvậtbiếnđổigen
Kỹthuậtditruyềnđãmởranhữngtriểnvọng,viễncảnhmớivềlýthuyếtthìkhôngcógiớih ạn:conng−ờicóthểthiếtkếvàtạoranhữngvisinhvật,nhữngtếbàom à tr−ớcđâych−ahềcó.Nh ữngvisinhvậtnhântạ o nàycóthĨtỉnghỵprặ quy môcôngnghiệpnhữngsảnphẩmcógiátrịphụcvụđắclựcchoviệcbảovệsứckhỏevànângcaoch ấtl−ợngsốngcủaconng−ời.
Sảnphẩmthànhcôngđầutiêncủaconngườikhisửdụngkỹthuậtditruyềntácđộngvà ovisinhvậtđểsảnxuấtsảnphẩmsinhhọcthôngquachuyểngenvàovikhuẩnE.colilàInsulin vàHormonsinhtr−ởng(1982và1987).Năm1998cókhoảngd−ới1%d−ợcphẩmcóchứapr oteinđ−ợctổnghợptáitổhợpđạtgiátrịtới12tỷUSD.Visinhvậtđ−ợccoinh−làmộtnhàmáy sinhhọc,chúngđ−ợcsửdụngcóhiệuquảtrongnghiêncứutáitổhợpADN,thiếtkếgen,nhân dòngvàbiểuhiệnproteincầnquantâm….Bêncạnhnhữngưuđiểmcủavisinhvậtchonghiên cứucơbản,nócònđóngvaitròhếtsứcquantrọngtrongngànhcôngnghiệpthựcphẩm,sảnxu ấtn−ớcgiảikhát,sảnxuấtbia,chếbiếnbánhkẹo,thựcphẩmchếbiến…
Tronglĩnhvựcchếbiếnthựcphẩm,vaitròcủavisinhvậtchuyểngengópphầnđángkểvàchính nã đãtạonênbướcc h u y ể n d ị c h c ô n g n g h ệ trongmộtsốngànhchủlựcnhư:EnzymeAmylase bềnnhiệtđ−ợctổnghợpnênbởichủngvikhuẩnBacillusLicheniformismanggenmãhoáenzym ec ó nguồngốct ừBacillusStearothermophylusđ−ợcs ử dụngrộngrãitrongcôngnghiệpsản xuấtrượu,bia,nướcgiảikhátđểthuỷphântinhbột.Ngoàir a , ngườitacũngđãchuyểngenmãh oáEnzymeAcetolactateDecarboxylasetừvikhuẩnBacillusBrevisv à o B.subtilisđểsửdụngc hosảnxuấtbia,nhằmgiảmthờigianlênmenphụvàquátrìnhtổnghợpdiacetyl… Điềuquantâmnữavềvaitròhữuíchcủavisinhvậthiệnnaylàlàmsạchsựônhiễ mcủamôitrường,vídụđiểnhìnhlàchếphẩmEM.Ngoàiravisinhvậtđóngvaiđặcbiệt hữuíchkhácnh−sảnxuấtphânbónvisinh,phâng iả inguồnn−ớcônhiễm,phângiải nguồnn−ớcnhiễmdầu…Visinhvậtlà đốit−ợngdễbiếnđổigendotínhchấtđặcthùcủachúngvềcấutạophântử,ch u kỳvòn gđờingắn,khảnăngthíchứngrộng…
Dovậy,việclưutrữnguồnsinhvậtbiếnđổigenlàcầnthiếtkhôngchỉphụcvụchongh iêncứu,khaithácsửdụngmàcònquảnlýtiềmẩnrủirodovisinhvậtbiếnđổigengâyra ởViệtNam,việctạoracácvisinhvậtchuyểngennóichungvàcácloạicây trồn gchuyểngentrongnôngnghiệpnóiriêngđãvàđangmanglạinhiềul ợ i íchcơbảnvàlâ udàitrongnhiềulĩnhvựckhácnhau:Nôngnghiệp,côngnghiệpchếbiếnthực phẩm,côngnghiệpd−ợc,côngnghiệpytế,môitr−ờng, kinhtế,th−ơngmại… củathếgiớinh−ôngMichaelKenward,tácgiảcủabàib áovớitiêuđề“Côngnghệsin hhọchướngtớithờiđạilớn”(Biotechheadsforth eBigtime)đãđánhgiárằng,nếuthế kỷXXđ−ợcđánhdấubằngcuộccáchm ạ n g điệntử,thìthếkỷXXIđ−ợcđặctr−ngbởic uộccáchmạngcôngnghệsinhhọc[21].Vớitầmnhìnxahơnnữa,ViệtNamchúngtap hảicósựlựach ọn giữacơhộipháttriểnnềnkinhtếtrongxuthếhộinhậpvàtoàncầuho á đểcónhữngquyếtsáchđúngđắn, nhằmđầut−,pháttriểnvàthừah−ởngnh ữn gthànhquảcủacôngnghệsinhhọcnóich ungvàcủavisinhvậtchuyểngennóiriêng,dochínhbàntayvàtrítuệcủang−ờiViệtN amchúngtatạora.
Mộtv ấ n đềt r a n h cãil ớ n vềnhữngr ủ i r o v ề m ô i trườngnhưlàs ự p h á t triểntínhkhá ng,nhữngtácđộngxấul ê n nhữngcôntrùngcólợivàsựlaiphấnchéovớicácl o à i hoangdãcủac á c c â y trồngc a n h tác.C ũ n g tồnt ạ i mộtm ố i l o ngạiv ề c â y t r ồ n g khángt h u ố c t r ừ c ỏ l ạ i t r ở t h à n h c ỏ d ạ i khódiệtđốivớic á c c â y trồngkhác.Nhữngbằngchứnghiệncóvềlĩnhvực nàyvẫntiếptụcđ−ợcđảmbảomộtcáchchắcc h ắ n vàtrọnv ẹ n v à chỉđ ạ o mộtcáchc ẩ n t h ậ n v à chặtchẽtr−ớckhicácc â y trồngchuyểngenđ−ợct r i ển khaitrêndiệnrộng.Tuynhiên,g ắn liền với phântích lợ i h ại trongtừngtrườnghợp,chúngtatinrằngcócơsởdữliệutincậyđểmàh ỗtrợsựtriểnkhaitrêndiệnrộng.
Tuynhiên,cómộtvàivấnđềđánglongạitrongcôngchúngvềvấnđềantoànsinhhọcv à t ácđộngm ô i trườngcủacáccâytrồngchuyểngen.Cũngcósựđòihỏi ápdụngchặtchẽnhữngđiềuluậtvềantoànsinhhọckhimàđềcậpđếnvấnđềphátt r i ể n vàtriển khaicâytrồngchuyểngen.Nhuc ầ u vàquymôvềsựchứngthựcant o à n cóthểđ−ợcdựatrênsự sosánhcácl−ơngthựcmớivànguồnl−ơngthựct−ơngt ự Trongmốit−ơngquanvớimôitr−ờn gcầnphảinhìnnhậnvàđánhgiámốitươngtácgiữacácđốitượngchuyểngenvớimôitrường.Nh ữngđ i ều luậtvềa n toànsinhhọccầntậptrungvàosựantoàn,chấtl−ợng,vàhiệuquả.Nhữngđi ềuluậtvềantoànsinhhọcđòihỏicónhữngthôngtinvềcácmặtsauđây:
(i)Sựtổchứcvàconng−ờil i ê n quan;(ii)NhữngloàichovànhậnADN;
(iv)sựt−ơngtác giữacácc â y trồngchuyểngenv à môitr−ờngvà;
Sựquảnlý,giảithíchv à sửdụngthôngt i n sẽl à mộtthànht ố quantrọngv ề đánhgiácácrủirovàxácđịnhhiệuquảvàmứcsựtincậycủacôngnghệ.Trongkhiquantâmđ ế nv ấn đềtr iển khaicủacáccây trồngchuyểngen,ta c ần phảiquantâm đến:(i)–sựphóngthíchcủacáccâytrồngchuyểngenkhônglàmxuấthiệncácloạisâubọmới, (ii)nếukỹthuậtchuyểngenchứađựngnhữngrủirolớnhơnsựchọnlọctruyềnthống,vídụnh−tr− ờnghợpchuyểngenvàocácloàihọhànghoangdãsẽdẫn đếnsựmởrộngkếtcấucácloàivàkếtquảlàtăngsựkìmhãmvềđadạngtrongcáckhuvựclânc ậ n và(iii)việcđưav à o môitrườngc á c c â y trồngchuyểng e n s ẽ l à m tăngdiệntíchđấtnôngnghi ệpởnhữngnơimànôngnghiệpkhôngthểđ−ợcđ−avàothựctiễnsớmhơn,vính−đemlạinhững hệsinhtháitựnhiêncógiátrịtrongnôngnghiệp.
Rủirolớnnhấtcủacáccâytrồngchuyểngenđangđ−ợcphóngthíchvàomôitr−ờnglàti ềmnănglanrộngcủanótrên nhữngđịab àn đ−ợctrồngcấysẽtrởthànhcỏdại.Mặcdùđãcónhữn gthảoluậnnhỏvềcáccâytrồngđangtrởthànhcỏdạinh−làhệquảcủachọngiốngc â y trồng,c ó t hểc ó mộtsốngoạil ệ vídụnh−cảidầuở Châu Âu.Điềunàycũngcóthểkhôngphảidosựcạnhtranhcủacáccâytrồngcanhtácm ớ i màđãđ−ợc chọngiốngchonăngsuấtc a o trongđiềukiệnc ơ s ở t ố t Tuynhiêncảidầulạimangnhữngđặct ínhliênquanđếncỏdạimànhiềuhạtnhỏđượcpháttánvàcóưuthếcạnhtranhrấtcao.
Mộttrongnhữngnguyhiểmcủac â y trồngc h u y ể n genl à sựtruyềncácgenv à o cách ọhànghoangdạidướiáplựccủachọnl ọ c t ự nhiên(kiểmsoátsinhhọc).Nhữngsâubọđíchkhôn gđóngbấtkỳvaitrònàotrongđiềuhoàquầnt h ể v ậ t chủhoangdã,chuyểngenkhôngchắcchắnt ạ o rabấtk ỳ m ố i nguyhiểmnào.Hơnthếnữasựtăngtínhkhángtrongcáchọhànghoangdạicũn gcóthểhoạtđộngnh−mộtthànhphầncủasựkiểmsoátsâuhạinếunhữnghoạtđộngnàylàcủavậ tchủthaythế đốivớisâubọhạiđích.
Nhữnglongạivềvấnđềantoàncủalươngthựcchuyểngencũngđãtănglên.H ầ u h ết cá cđộct ốBtđặchiệuđốivớisâuh ại khichúngđượckíchhoạttrongmôitrườngkiềmtrongđườngr uộtcủasâubọ.NhữngproteinBtbịphânhuỷnhanhchóngnhờdịchdạdàycủađộngv ật cóxương sống.Khôngcónhữngsựthayđổichủyếunàođ−ợcquans á t thấytrongt h à n h p h ầ n c ủ a càch uavàkhoait â y chuyểngen.CàchuachuyểngenBtkhônghàmchứanhữngrủirophụđốivớisứck hoẻconng−ờivà độngvật.Tuynhiên,sốl−ợngcáckhíacạnhcanhệđếnđánhgiátínhantoàncủacà chuachuyểngenBtđòihỏinhữngnghiêncứus â u rộnghơn.Khôngc ó nhữngkhácnhautrongsứ csốngv àt r ọ n g l−ợngcơ thểcủag à đ−ợcnuôinhốthaylànhữngchế độă n đ−ợcđịnhsẵnvớingôchuyểngenBtkhisosánhvớinhữngconđốichứng.H à m l−ợngGos sypol,axitbéovòngcycloprpenoid,v à aflatoxintrongc á c h ạ t củacáccâychuyểngent−ơngt ựhoặcthấphơntrongcáccâybốmẹvàcácgiốngth−ơngphẩm.H ạ t c ủ a cácdòngbôngchuyể ng e nBtcũngt−ơngứngvềthànhphầndinhd−ỡngvớicáchạtcủacáccâybốmẹvàgiốngbôngt h−ơngphẩm.ProteinCryIA(b)làmộtthànhp h ầ n củac á c c â y n g ô chuyểngensauthuhoạch mấtdầnt r ê n bềmặthoặcđ−ợctrồngcấytrongđ ấ t hoặctronggiasúcủ x i l ô đ−ợcchuẩnbịt ừ c áccâytrồngchuyểngenvẫnch−ađ−ợcxácđịnh.
Mộtvàihợpchấtđ−ợctạorabởicâytrồnghoạtđộngnh−làcơchếphòngthủt ự nhiênch ốnglạicácđộngvậtăncỏ.Nhữnghợpchấtnàybaogồmcáccơchấtbậchai(nh−làterpnoids,fla vonoids,alkaloid,vv…),- amylasevàchấtứcc h ế trypsin,lectinvànhữngp r o t e i n c ó liênquanđếnphảnứngbệnh.Một vàitrongsốnàycótiềmnăngsửdụngđểtriểnkhaic á c c â y trồngchuyểng e n đểcungc ấ p nhữn gtínhkhángđốivớisâubệnhhại.Tuynhiên,mộtsốhợpchấtthứcấpcủacâytrồngcóthể độcvớiđộngvậtcóvútrongđócóconngười.Điềunàycóthểdẫnđếnsựtừbỏgiữacácloạithuốct r ừ s â u đ−ợct ạ o rabởic á c c â y trồngchuyểngenhaynhữnggiống đ−ợct ạ o rabởic á c ch−ơngtrìnhc h ọ n giốngtruyềnthống,vớithuốctrừsâutổnghợp.Hơnt h ế nữa,c ó thểđ−ađ−ợcnhữngproteinmớivàonhữngcâytrồngl−ơngthựckhôngchỉtừcâytrồng màcòntừvikhuẩn,virút,nấm;sựgâydịứngcủachúngv ẫ n ch−ađ−ợcbiếtv í nh−cácgenchom ethioninemangnhiềuproteint ừ cácquảhạchBrazilđãđượcđưavàođậutươngvớimụcđíchtăn ghàmlượngproteincủađậutương.Tuynhiên,đậutươngchuyểngenmanggennàyđãpháthiện c ó nhữngproteing â y dịứngđãb i ế t , vàv ì v ậ y v iệc pháttriểnchúngcó th ể b ị ng−ngl ại Nế unguồnproteindịứngđãbiếtcóliênquanđếnnhữnggenđ−ợcđ−av à o t ừ nhữngnguồnc h−ađ ượcconngườisửdụngl à m thứcănthìs a u đónhữnggenn à y khôngnênđượcsửdụngtrongbiế nnạpditruyềnvàocâytrồngl−ơngthực.
SựthươngmạihoáồạtcáccâytrồngbiếnđổigenđãvàđangdiễnraởMỹvàmộtsốnướck hácđều docáccôngtyCôngnghệSinhhọcxuyênquốcgia(chủyếuthuộccáct ập đoàn t−bản Mỹ)khốngchế.SựbànhtrướngtháiquánàyđãlàmdấylênlànsóngbàiMỹởcácnướckhác,nhấtl àởChâu Âu.Ngoàira,sựphảnđốisinhvậtbiếnđổigencònbắtnguồntừmộtyếutốcơbảnkhác.Đólàmốil ongạivềcác ảnhhưởngbấtlợicóthểcóởcácsinhvậtbiếnđổigenđốivớisứckhỏeconngườivàmôitrườngsi nhthái.
VìvậyyêucầuđặtrakhithươngmạihoáGMCvàsảnphẩmcủanólà:chúngtacầnphảixé tvấnđềvềmứcđộantoàncủacácsảnphẩmnàylênhàngđầu.Nỗilosợvềđộantoàncủathựcp hẩmđangngàymộtlớn,đặcbiệtlàkhiAnhvàcácnướcChâu Âukhácpháthiệnrahoáchấtrửaphimđiệnnãođồdạngxốpởtrâubòvàchất ônhiễmDioxinở cácsảnphẩmgiacầmtạiB ỉ , đãlàmchongườit i ê u dùnggiảmlòngtinđốivới ngànhcôngnghệthựcphẩm[77,101].
VậyliệunhữngnghiêncứuđểđánhgiáGMOsvềđộantoàntrongthờigiansửd ụ n g có chínhxáchaykhông? Đặcbiệtlàmốiquantâmvềđặctínhgâydịứngvàkhảnăngtácđộngđếnsựkhángkhán gsinhcủaGMOs[79]. Đểc ả i thiệnt ì n h trạngnàyt h ì cácnhàs ả n xuấtphảix e m xétm ộ t c á c h nghi êmtúcv ề t í n h a n t o à n củas ả n phẩm.Vìthếbấtkỳmộts ả n phẩmchuyểngennàotr−ớckhiđ− ợcđưarathịtrườngphảiđượcthửnghiệmtoàndiện,đượccácnhàkhoahọcvàcácgiámđịnhviên đánhgiáđộclập xemcóantoànhaykhôngvềmặtdinhd−ỡng,độctính,khảnănggâydịứngvà cáckhíacạnhkhoahọcthựcphẩmkhác.Nhữngđánhgiávềant o à n thựcphẩmn à y dựatrênnhữ ngquyđịnhcủatừngnước.Chúngbaogồm:mộthướngdẫnsửdụngsảnphẩm,mộtt h ô n g t i n c h i t i ế t v ề mụcđíchsửdụngs ả n phẩm,cácthôngt i n vềphântử,hoásinh,độctính,dinhd−ỡng,v àkhảnăngg â y dịứng….“ Mứcđộantoàncủathựcphẩmchuyểng e n ítnhấtcũngtươngđươn gvớithựcphẩmkhácbởivìquátrìnhđánhgiáantoànđốivớithựcphẩmchuyểng e n kỹl−ỡnghơ nnhiềusovớicácthựcphẩmkhác.Quátrình đánhgiáantoànthựcphẩmđảmbảorằngthựcphẩmchuyểngenmanglạitấtcảcácl ợ i í c h n h−thựcphẩmthôngth−ờngv à khôngc ó thêmmộttáchạinào”(Tổchứcl−ơngthựcthựcphẩm óc-NewZealand,2000).
CácphươngphápxácđịnhGMOs
PhươngphápxácđịnhdựatrêncơsởADN
PhươngphápxácđịnhdựatrêncơsởAD Nd ựath eo nguyêntắc bổsungcủahaimạchA DNxoắnképmàởđóchúnglaitheo mộtphươngthứcđặchiệuvềtrìnht ự ADNc ủ a G M O s c ó chứamộ t v ài t h à n h tố mà nólà m ảnhhưởngđếnhoạtđộngc ủ a ADN.C á c thànht ố nàyl à t rìnhtựpromoter,gencấutrúcvàtrìnht ự ‘ s t o p ’ đốivớigen.Mặcdùc ó mộtvàikỹthuậtkhácnh− ngchỉcókỹthuậtSouthernblotvàPCRl à đ−ợcsửdụngphổbiến[29,116].Hiệnnay,kỹthuậtMi croarraycũngđã đ−ợcpháttriển[63].
PCRkhaitháctínhđặchiệuADNpolymeraseđểkhuếchđ ạ i chọnl ọ c các đoạnADNđặchiệuở tầnsốthấptronghỗnhợpphứchợpc á c trìnht ự A D N k h á c [29].Trongx étnghiệmPCRtiêuchuẩn,haicặpmồiđãđ−ợcsửdụng.Cácc ặp mồinàyđ−ợcthiếtkếđểb ắ t cặp tr ên cácchuỗiđốing−ợccủ a trìnhtự đích,v à khuếch đạitrìnhtựgiữacácmồithànhhàngtriệulầnquamộtloạtchukỳlặplại.ViệcphântáchA D N đã khuếchđạit h e o kíchthướcc ó t h ể p h ụ thuộcv à o điệnd i gela g a r o s e , m ặ c d ù cáck ỹ thuậ tp h â n táchk h á c chẳngh ạ n nh−sắckýlỏngc a o á p ( H P L C ) và điệndimaoquản(CE)cũngđãđ−ợcứngdụng[29,47].
Hiệnnay,ngườitathấyhầuhếtGMOsđềucóchứa1trong3yếutốditruyềnsau:prom oterCaMV35Scủav i r ú t khảms ú p l ơ , terminatorN O S v à genc h ỉ thịkhángkhángsinh (nptII).Cácyếut ố nàyc ũ n g xuấthiện1 c á c h t ự n h i ê n trongc â y trồngvàvisinhvậtđất,vàvìv ậychúngcóthểđ−ợcpháthiệnnhờkỹthuậtPCRvớicáckếtquảd−ơngtínhsai.NếuphântíchPC
Rc h o k ế t quảdươngt í n h thìcáck ỹ thuậtPCRđặchiệusảnphẩmđốivớiloạithựcphẩmGMk hácnhaucóthểđ−ợctiếnhành.Cáckỹthuậtnàykhaithácbộmồimànónốiđ−ờngranhgiớicủaha iyếutốdit r u y ề n g ầ n k ề n h a u ( v í d ụ nh−cácđ o ạ n promoter,c á c g e n đích,cácđoạnte rminator),hoặccácc ặ p mồinàyđ ặ c hiệuđốiv ớ i việcpháth i ệ n trìnht ự g e n đích đãbiếnđổi.Giớihạnnhậnbiếtnằmtrongvùngtừ10–20ngADNđíchvà0,0001%
Cácphươngphápkháccó thểđượcsửdụngđểnhậnbiếtcác kếtquảPCR.Phươngphápđầutiên làsựphântáchđặchiệucủasảnphẩmkhuếchđạinhờcắtenzymgiớihạn[86].Phươngphápth ứhailà laivớ imẫu dòđặchiệuđốivớitrìnhtự đích[66].Phươngphápthứbalàgiảitrìnhtựtrựcti ếpsảnphẩmPCR[116].PhươngphápthứtưlàPCRxếplồngvàonhau(nestedPCR),màtrongđó haibộmồiliếtkếtmộtcách đặchiệuvớitrìnhtựđíchđãkhuếchđại.
Gầnđây,hãngGeneScanEuropeđãđ−arabộkitkiểmtrađểnhậnbiếtGMOstrongcács ảnphẩmthựcphẩm,sửdụngmultiplexPCRđểnhậnbiếtđặchiệuđốivớit r ì n h tựADNtừ cây trồngv à cáctín h trạngGM[54].Đầutiên làp hải táchchiếtvàtinhsạchADN.Sauđólàkhuếch đạitrìnht ự ADNđặchiệutừ cảcâytrồngvàcáctínhtrạngGMnhờ2phảnứngmultiplexPCRriê ngbiệt,cácsảnphẩmcủacả2phảnứngđ−ợctrộnvớinhau,vàchuỗiADNk é p đ−ợct á c h thàn hm ạ c h đơnnhờc ắ t bởienzymexonuclease.S a u khitrộnv ớ i đệmlai,mẫuđ−ợctrảivàokhoan hmỏng.Cáct r ì n h tựđãkhuếchđạisẽlai vớicácmẫudòcADNbaoquanhkhoanhmỏng,sa uđó đ−ợcnhuộmvớithuốcnhuộmhuỳnhquangCy5vàđ−ợcphântíchnhờđầuđọcBiochip(vídụBio detect654 TM ).Giớihạnnhậnbiếtđ ố i v ớ i KitC h i p GMOnằmtrongvùng250bảnsaocủam ỗitrìnhtựADNđíchtrongPCR.
VấnđềchínhcủaphântíchGMOstrongthựcphẩmlàđịnhl−ợng,bởivìgiớihạntốithiể uc ủ a GMOst r o n g thựcphẩmlàc ơ sởđểdánn h ã n hànghoáở nhiềuquốcgia,điểnhìnhlàLi ênminhChâu Âu[34,6 7 ] , NhậtBản,H à n QuốcvàĐàiLoan[42].Vìvậy,cácphươngp háp PCRđịnhlượng rất cần thiết.PCRđ−ợcgọilà địnhl−ợngn ế u ADNchuẩnnộisinhđ−ợcđồngkhuếchđạivớiADNđích[93].Trongcáchệthố ngnhưphươngphápPCRcạnhtranhđịnhlượng(QC-
(2)Phântáchcácsảnphẩmnhờph−ơngphápthíchhợp,chẳnghạnnh−điệnd igelag ar os e và nhuộmgelbằngethidiumbromide;(3)Phântíchđộdày củagel;
( 4 )ướclượngmộtcáchtươngđ ố i s ố lượngADNtiêuchuẩnvàADNđíchnhờphântíchhồiquy.ởđiểmcânbằng,nồngđộkhởiđộngcủaADNđíchvàADN chuẩnnộisinhlàt−ơngđ−ơngnhau.TrongQC-PCR,sựcạchtranhgiữaviệckhuếch đạiADNchuẩnnộisinhvàADNđíchdẫntớilàmmấtđộnhạycủasựnhậnbiết.
ELISAsửdụngchiếnlượccủanhómthứ2 v à c ó thểđượcđịnhlượngkhiPCRđãbịdừngtrướck hicósựgiảmt í n hiệutronghiệusuấtkhuếchđạitìmt h ấ y ELISAđãđ−ợcsửdụngđểđịnhl−ợn gmộ t cáchtươngđốisốlượngthấpcácsảnphẩmPCR[ 5 3 , 8 1 ] Mặcdùthựct ế , việcđịnhlượ ngtươngđốisửdụngPCR-
Genos,Angers,Pháp),kỹthuậtnàykhôngđ−ợcứngdụngrộngrãiđốivớimụcđíchđịnhl−ợng GMOschínhxác.
1.4.1.3.PCRđịnhl−ợngxửlýsốliệuthôngquamáytính(QuantitativeReal- t i m e PCR) Đểkhắcphụcmộtsốnh−ợcđiểmcủaPCRđiểmcuốiđịnhl−ợngt r u y ề n thống,Real- timeQ-
PCRđãđ−ợcgiớithiệu.Theol ý thuyết,sựsảnsinhc á c sảnphẩmPCRnênđạttớihàmsốmũ.Tu ynhiên,trongthựctếnóđạttớitrạngtháibìnhổnở khoảng30-
40c h u k ỳ , b ở i v ì thànhphầnphảnứngtrởnêngiớihạn[47].VớiPCRđịnhtính,cácsảnphẩmc ủaphảnứngđ−ợcđotạiđiểmđơntrongdữliệuphảnứng.Đồthịnồngđộcủacácsảnphẩmxuấthi ệntạiđiểmnàynh−l àhàmsốcủal−ợngADNb a n đầuc ó mặtở mỗiphảnứngđ ó c h o t h ấ y rằ ngt ỷ lệgiữanồngđộADN(vùngđộnglực)v à cácsảnphẩmPCRtìm th ấy v−ợtquavùngnồngđ ộADNgiớihạn,d ẫ n tớilàmmấtđộchínhxáctrongđịnhl−ợng.Tuynhiên,theokinhnghiệmch othấyrằngnồngđộADNtrongphảnứngReal- timePCRtỷlệvớisốchukỳPCRtrongsuốtgiaiđoạnluỹthừacủaphảnứngPCR[102].Vìvậy,nế usốchukỳđ ạt tớiđiểmgiốngnhautrongđườngcongsinhtrưởngtheosốmũđãđượcbiết, độchínhxácvềhàml−ợngADNbanđầucủanó(sauđólàGMOs)cóthểđ−ợcxác định.Real-timePCRcũngnhậnbiếtđ−ợcsốb ả n saoADNthấp[30].Mộts ố máyReal- timePCRt ự độnghoáth ủ t ụ c phântíchv à c h o phéptừngc h u k ỳ t ừ n g c h u k ỳ kiểmtracấutrú cvậnđộngcủaphảnứng,chophéptínhtoánnồngđộcủatrìnht ự đích.Mộtvàidạngđãđ−ợcsửdụngđểđánhgiásốl−ợngsảnphẩmPCRnh−:(1)ds-
(2)Cácmáydòl a i hoặcmáydòtruyềnnăngl−ợngcộngh−ởnghuỳnhquang(FRET);
(4)Cáccộtmốc(đènhiệu)phânt ử [30].Cáchệthốngn à y cũngthừanhậnsựkhácnhaugiữacác sảnphẩmPCRđặchiệuvàkhôngđặchiệu(vídụnh−2mạchmồi(primer- dimer))nhờlaimẫudòhoặcphântíchđ−ờngcongnóngchảycủa
A B Hình 1: Sự nhận biết sản phẩm PCR
C cácsảnphẩmPCR,bởiv ì cács ản phẩmk h ô n g đ ặc hiệucókhuynhh−ớngt an ch ảy tạinhiệtđ ộthấphơncácsảnphẩmđặchiệu[102]. trongrealtime.
(A):Đ−ờngcongtiêuchuẩnchothấyg i á trịC t đãđánhdấuđốilậpvớilogcủanồng độgen35Sban ®Çu.
(B):Sựkhuếchđạipromoter35Strongdu ngdịchADNgenomephaloãng5 l ầ n củ ađậut−ơngRuondupReady,sửdụnghệt hèngGeneAmp 5700.
NgườitađãsửdụngTaqMan đểphântích179sảnphẩmthựcphẩmchứađậutươngRound upReady(vídụnh−thựcphẩmdànhchotrẻemv à cács ả n p h ẩ m ă n kiêng,n−ớcđậu,móntrán gmiệng,đậuphụ,dầu,mìsợi…).Phươngphápnàyc ó độnhạy,tuynhiênADNđậutươngcóthể khuếchđạicóthểkhôngđ−ợcnhậnbiếttrongchấtbéo,dầuvàđồg ia vị.Sựb iến đổiditruyềncủa đ ậ u tươngRoundupReadyđãpháthiệnđượctrong34mẫu,trongđó8mẫucóchứanhiềuhơ n1%đậut−ơngRoundupReady[57].
Hệt hốngA BI Prism7700,t ậ ndụngTaqMan trongPCRđịnhlượngtương đối,đãnhậnbiếtđược2pgngôGMvàđậutươngRoundupReady/ gammẫubanđầutrong3 g i ờ saukhitáchchiết[135].Kếtquảnhậnbiếts ả n phẩmPCRtrongR eal- timesửdụnghệthốngGeneAmp 5700Sequenceđ−ợcchỉr a ở hình1.P C R đ−ợctiếnhành ở m á y Perkin-ElmerAB5700S D S (HệthốngSinhhọcứngdụng,Foster,
Trênđồt h ị đườngcongk h u ế c h đ ạ i sựtăngsốlượngt í n h i ệ u phátquang(Rn ),lựachọnRnnơimàt í n h i ệ u phátquangt ừ cả2 dungdịchchuẩnđốivới đườngcongtiêuchuẩnvàdungdịchmẫuADNkhuếchđạitheohàmluỹthừa,vàkéot h e o đườn gtuyếntínhcủangưỡngbanđầu.Sửdụngđiểmmàởđóđườngtuyếntínhcủangưỡngb an đầuv àtín hiệuphátquangcủadungdịchchuẩnđốivớiđiểmđánhdấucủađườngcongtiêuchuẩn,như làchukỳng−ỡngbanđầu(Ct).
Chúngtacóthểvẽrađườngcongtiêuchuẩn(hình1)vàtínhnồngđộADNcủacácmẫunhờCtcủa chóngtrongreal- timePCR.Hệthốngthừanhậnsựkhácnhaugiữacács ả n p h ẩ m đặchiệuv à khôngđ ặ c hiệu(víd ụ2 mạchmồi)nhờphântích đ−ờngc o n g nóngc h ả y c ủ a cácsảnphẩmPCR,bởiv ì c á c sả nphẩmkhôngđặchiệuc ó khuynhhướngnóngchảyởnhiệtđộthấphơncácsảnphẩmđặchiệu. Hình2 chothấysựkhuếchđạicủagenEPSPStrongdungdịchADNplasmidphaloãng7lầnchứa genEPSPSsửdụnghệthốngnhậnbiếtABIPrism 7700Sequence.ởhình2,sửdụngmẫu dòthuỷphân(côngnghệTaqMan )đểướct í n h lượngADN,mẫudòbổsung1 phầnvớitrì nhtựđích,genE P S P S đ−ợcđánhd ấ u bằngthuốcnhuộmFAMvàTAMRAnh−làchấtthôn gbáovàd ậ p tắt.Tínhiệuhuỳnhquang đ−ợcsinhratrongsuốtgiaiđoạnkéodàicủaquátrìnhkhuếchđạiADNnh−làhoạttínhexonucl easecủaTaqpolymerasephântáchđiệnquangtừcácphântửdậptắt.Sốl−ợnggiatăngcủasảnp hẩmkhuếchđạisinhratrongmỗichukỳ.
Hình2:SựkhuếchđạigenepspstrongdungdịchADNplasmidphaloãng7lầnmàc ó chứag enepsps,sửdụnghệthốngnhậnbiếtABIPrism 7700Sepuence
Kỹthuậtnàygồmcácbước:cốđịnhADNđãtáchchiếtvàomàngnylonhoặcnitrocellul ose,đánhdấumẫudòvớicácmẫudòacidnucleicđãđánhdấumạchkép(ds– double- strADNed)đặchiệuv ớ i GMOs,v à nhậnbiếtquátrìnhlainhờt i a X- quang,đođộdàyhuỳnhquanghoặcsựphátquangnhờphảnứnghoáhọc.Cácmẫudòbanđầuđ−ợ cđánhdấubằng 32 P.Tuynhiên,ADNđãđánhdấufluoretxeinkhôngphóngxạ[107],cácmẫudò ADNđánhdấubiotinhoặcdigoxigenin,vớiđộnhạytươngđươngvớimẫudò 3 2 Pmàgầnđâyđãs ửdụng,việcphòngn g ừ a hoạtt í n h phóngxạtrongphòngthửnghiệml à r ấ t c ầ n t h i ế t C á c m ẫ u dòkhôngcóphóngxạn à y đãgiảmsựnhậnbiếttớimứcíthơn1giờ,trongkhivới 32 Plà24gi ờ.Tuynhiên,dochỉcómộtmẫudòđ−ợcsửdụngvàsựkhuếchđạikhôngđ−ợcthựchiện,chonê nphươngphápnàycóđộnhạythấphơnPCR,màtậndụngADNcủa2mồi.
Gầnđây,m ộ t kỹthuậtSouthernblotkhácđãvàđangđ−ợcnỗl ự c nghiêncứu,thửnghiệm;kỹth uậtnàysửdụngthuốcnhuộmtiahồngngoạigần(phátraở700và800nm)đãkếthợpvớinhómphả nứnglạivớicarbodiimidevàđãgắntrựctiếpvớiADNtrongphảnứng5phút.Cáctínhiệuđốivới cả2loạithuốcnhuộmđãđ−ợcpháthiện đồngthờinhờh a i thiếtbịnhậnbiếthìnhảnhtiahồngngoại,mộtsốthứvẫnkhôngthểnhậnbiếtvới cáckỹthuậtnhậnbiếtthôngquachấtphóngxạthôngth−ờnghoặcsựphátquangnhờphảnứngho áhọc[62].
KỹthuậtnhậnbiếtGMOsdựatrêncơsởprotein
Phântíchmiễndịchlàýtưởngđểnhậnbiếtnhiềuloạiproteintrongcácmẫuphứchợpkhi mụcđíchphântíchđãđ−ợcxácđ ị n h [ 9 6 ] C ả hailoạikhángthểđơndòng(đặchiệucao)vàđad òng(thườngnhạyhơn)c ó thểđượcsửdụngp h ụ thuộcvàolượngcầndùng,hệthốngnhậnbiếtđặ chiệu,ứngdụngriêngbiệtvàphânbốthờigianđểthửnghiệmvàchiphí.Trêncơsởcácnồngđộđ ặ c tr−ngc ủ a v ậ t l i ệ u chuyểngentrongmôthựcvật(nhiềuhơn10g/ mô),giớihạnnhậnbiếtcủacácphânt í c h miễndịchproteincóthểdựđoántr−ớcsựxuấthiện củacác proteinđãbiếnđổitrongvùng1%GMOs[121].Cácphântíchmiễndịchvớicáckhán gthểgắnliềnvớiphađ ặc đãđ−ợcsửdụngtrong2 dạng.Dạngthứnhấtlàphântíchc ạc h tranhtr ongmáynhậnbiếtvàphântíchhoàntoànđểliênkếtvớicáckhángthểbắtgiữ.Dạngthứhailà ph ântích 2 v ị trí(khángthểcặpđôixenv ào giữa)trongđóthiếtbịphânt íc h đ−ợcđểvàogiữakhángthểbắtgiữvàkhángthểnhậnbiết[44].Cảhaikỹthuậtphân tíchchấthấpphụmiễndịchg ắ n kếtenzym(ELISA)v à Westernb l o t đ ã đ−ợcs ử dụngđểph ântíchcácsảnphẩmproteincủađậut−ơngRoundupReady(dòngchuyểngencủaMonsanto) [113].
CóhaidạngtrongphântíchELISAlà:đĩavigiếng(hoặcdảivigiếng)vàốngđãb ọcvỏ.Cácvigiếngđãbọckhángthểvớicácdải8–
12giếngcóthểmởđ−ợccóđộnhạycaovàđịnhl−ợngđ−ợc.Đểđịnhl−ợngđ−ợcthìp r o t e i n khôngbịbiếntính.Thờigianchạytrungbìnhđốivớiphươngphápp h â n tíchđĩal àkhoảng90phút,vàcóđầuđọcđĩathíchhợpxácđịnhnồngđột ro ng cácmẫu.Giớihạ nnhậnbiếtđốivớiproteincủađậutươngCP4-
EPSPSl à0,25%đốivớicâyvà1,4%đốivớibộtđãquachếbiến[146].Dạngthứhaithí chhợpvớithửnghiệmđồngruộng, vớithờigianchạyđặctr−ngnămgtrongvùngtừ15–
30phút.Cácốngcóthểđ−ợcđọchoặcbằngmắthoặcbàngđầu đọcốngthíchhợpvàcáckếtquảlàđịnhtính.Dokhôngcótiêuchuẩnnộisinh địnhl−ợngtrongphântích,cácthôngtinbổsungkhôngthểthunhậnđ−ợcliênq uan đế nsựxuấthiệncủaGMOsởl−ợngthànhphầncótrongthựcphẩm[31].N g u y ê n lýcủap h−ơngphápphântíchdảichảybên(dạngthứ2)đ−ỵcchỉrặh ì n h 3.
Kỹthuậtdảichảybênl à mộtdạngcủaELISA(hình3),sửdụngcácdảitốthơnlàcácgiếng vichuẩn.Cáckhángthểképđãcốđịnh,đặchiệuđốivớiproteinđãbiểuhiện,đ−ợcc ặ p đôiv ớ i c hấtphảnứngmàuvàtíchhợpvàodảinitrocellulose.Khidảiđ−ợcđặtvàoốngeppendorffcóchứa dịchchiếttừmôthựcvậtmàcóproteinchuyểngenthìkhángthểsẽxenvàogiữamộtvài khán gthểmà đãkẹp đôivớichấtphảnứngmàu.Cácdòngchảyxengiữađãnhuộmm à u nàysẽchả yđếncuốidảithôngquamàngxốpmàcóchứahaivùngbắtgiữ,mộtvùngđặchiệuvớisựkẹpgiữ ac ủ a cácproteinchuyểngen,mộtvùngđặchiệuvớicáckhángthểđãkhôngxửlýmàc ặ p đôi vớichấtphảnứngmàu.Sựxuấthiệnchỉcủamộtđườngkẻ(đốichứng)trênmàngchỉra rằngmẫ uchokếtquảâmtính.Vànếucóhaiđườngkẻthìmẫuđóchok ế t quảdươngtính.Phươngpháp dòngchảybênchokếtquảtrongvòng5–10phút. Đâylàmộtph−ơngphápkinhtế,thíchhợpvớikỹthuậtsànglọcbanđầutrongchuỗithựcphẩm. Cácdảinàyđãđ−ợcpháttriểnđểnhậnbiếtnộiđộctố đãbiểuhiệnbởiBacillusthuringensismàbả ovệcáccôntrùng,vídụnh−CryIA(b)
(th−ờngcótrongcây,hạtngô)vàproteinCP4EPSPS(cótrongđậut−ơng,cảidầu,bôngvàcủcải ®−êng)
[49,87].Cácdảichảybênđãthươngmạihoáthườngchỉnhậnbiếtgiớihạntrongv à i sảnphẩmth ựcphẩmGM,nh−ngcónhữngdảicóthểnhậnbiếtđồngthờinhiềuprotein.
Westernblotlàphươngphápnhậnbiếtđịnhtínhhàmlượngproteinđíchtrênhoặcdưới ngưỡngđãxácđịnhtrước[87].Phươngphápnàyrấtthíchhợpvớiviệcphântíchproteinkhôngho àtan[39].Nócũngthích hợpvớinhiềuứngdụngnghiêncứuhơnlàđốivớithửnghiệmthôngth− ờng.Cácmẫuđểphântíchđ−ợchoàtanvớicácchấttẩyrửavàcáctácnhânlàmsuygiảm,vàđãphâ ntáchnhờđiệndigelSDS- polyacrylamide.C á c hợpp h ầ n đ ã đ−ợcchuyểnl ê n màngnitrocellulose,sựl i ê n kếtcácvịt ríglobulinmiễndịchtrênmàngđ−ợcchặnlạinhờsữakhôngbéođãsấykhô.C á c v ị tríđ ặ c hiệ us a u đóđ−ợcdòv ớ i cáckhángt h ể S au đócá c khángt h ể đ ã liên kếtđượcnhuộmv ớ i nitơratbạc(AgNO 3 )m à u đỏtươihoặcm à u c o m a , hoặcchấtphảnứng m i ễ n dịchthứ2,chẳnghạnnh−proteinA đ ã c ặ p đôivớihorseradish- peroxidase(HRP)hoặcalkalinephosphatase[116].Giớihạnnhậnbiếtcủacácph−ơngphápph ântíchWesternblotnằmtrongkhoảng0,25%đốivớihạtvà1%đốivớibộtđãchếbiến[146].
NhậnbiếtGMOstheotỷlệnhỏ
Dosựb ắ t buộccủacácluậtđịnhvềGMOs,kểc ả gầnđâyđãc ó cácđiềukhoảnbanđầuv àluậtdánnhãnhànghoá,đòihỏiphảixácđịnhchínhxácmộtl−ợngrấtnhỏADNchuyểngentron gmẫu Cáctếbào đơnđãtách chiếtnhờthiếtbịđotếbào dòngchảyhoặcvithaotáccóthểcun gcấpđầyđủl−ợngADNđểnhậnbiếtGMOdựatrêncơ sởPCR,mặc dùsựkhuếchđạicácgenbản saođơncóthểlà khókhăn.PCRtếbàođơncókhảnăngnghiêncứuc á c biếndịtrongsựb i ể u hiệ ngengiữacáctếbàođơntrongquầnthể,trongsựbiểuhiệngengiữacáckiểutếbàokhácnhautại cácgiaiđoạnp h á t triểnkhácnhau,hoặccóthểđ−ợcs ử dụngv ớ i c á c mục đíchchẩnđoánbaogồmcảpháthiệnGMOs.
SMD)t−ơngtựnh−kỹthuậtphổhuỳnhquangcảmứngtialazevàkỹthuậtdựatrênsựcộngh−ởng từ,đểkhảosátcácđặctínhvậtlývàhoáhọccủacácphảnứnghoásinhcủacácphânt ử riêngbiệtt rongr e a l - t i m e , làkỹthuậttiếnbộnhấttrongcáckỹthuậtphânt í c h T r i ể n vọngtrongtươnglai đốivớ iS M D đểnhậnbiếtvàđịnhl−ợngt r ự c tiếpl−ợngADNnhờtínhtoáncácphântửđơntrongdun gtíchsiêuvil−ợngchứadịchlỏng,cóthểdẫnđếnsựpháttriểncủacáckỹthuậtnhậnbiếtGMOth eotỷlệnhỏ[97].
Tổngquanvềthiếtkếmồi,mẫudòđểnhậnbiếtGMOs
Ngàynay,câytrồngbiếnđổigen(GMCs)đượctrồngngàycàngrộngrãiởrấtnhiềunướct r ê n thếgiới.Nh−ngc â u hỏivềsựa n toànt r o n g v i ệ c sửdụngc á c sảnphẩmGMCscũngđồn gthờiđ−ợcđặtravàtrởthànhmộtvấnđềnóngbỏngvớihàngl o ạ t cácvấnđềliênquanxoayqua nh.Chínhvìthế,việcnhậnbiếtGMCslàcầnthiết đốivớinhiềuứngdụngn h−đểđánhgiámứcđộsạchcủahạtgiốngh a y d á n nhãnthựcphẩm Nhiềukỹthuậtphântíchđãvàđangđượcpháttriểnđểđápứngnhucầunày.Trongsốđó,phương phápdựatrêncơsởADNchủyếunhờvàosựnhânđôicủaADNđặchiệuvớikỹthuậtPCR,phươ ngpháplaiADNđangđ−ợcnhiềuquốcgiasửdụng.KỹthuậtnàygiúpxácđịnhsảnphẩmGMvới đoạnmồi,mẫudòđ−ợcthiếtkếdựatrêntrìnhtựđoạngenchuyển.Dovậy,thiếtkếmồichophản ứngPCR,thiết kếm ẫ u dòl à m ộ t b−ớcquant r ọ n g v à khôngthểt h i ế u đ−ợctrongviệcxá cđịnhg e n đ−ợcchuyểnvàocâytrồng.
Việcthiếtkếm ồ i đòih ỏ i phảit u â n t h e o m ộ t sốnguyênt ắ c chủyếu.Trướch ế t , ngư ờitaxácđịnhtrìnhtựnucleotidecủađoạngenquantâm,sauđóđitìmđoạnADNc ó trìnht ự khoả ngt õ 15-
25bpở haiđầusaocholiênkếtbêntrongcủađoạnt ì m đ−ợclàbềnvữngnhất.Mặtkhác,trìnhtực ủahaiđoạnnàykhôngcóđoạndàibổt r ợ c h o nhauv à bảnt h â n mỗiđoạnkhôngtựbổtrợđểtrá nhchochúngkhôngbịcuộnlại hoặctự bắtcặp vớinhau.Hơnnữa,nhiệtđộbắtcặpcủahai đo ạnADNtìm đượcphảitươngđốigầnnhauđểchúngcóthểhoạtđộngđồngt h ờ i Việcxácđịnh haiđoạnADNtrênnhằmmụcđíchtạoramộtcặpmồicókhảnănghoạtđộnghiệuquả.
Cácthôngsốnh−nhiệtđộnóngchảycủamồi,nhiệtđộnóngchảycủađơnvịkhuếchđạ i(th−ờngc a o hơncủamồi),chiềud à i củamồi(15-30b p ) , c h i ề u dàic ủ a đơnvịkhuếchđ ạ i (trongkhoảng50-10.000bp),l−ợngGCtrongchuỗi(khoảng40-
Việclựachọnchiềudàimồivànhiệtđộnóngchảycủachúngdựavàomộtsốlýdo.Nhiệtđ ộnóngchảycủamồiđ−ợcđịnhnghĩalànhiệtđộthấphơnnhiệtđộcủamồimàsẽbắtcặpvớiADNk huônvàcaoh ơ n n h i ệ t đ ộ l à m mồirờikhỏikhuônADN.Nhiệtđ ộ nóngc h ả y c ầ n t ă n g l ê n theođộdàic ủ a m ồ i M ồ i quángắns ẽ l à m v i ệ c bắtcặpv ớ i mộtsốvịtrít r ê n khuônADNd ài,dẫnđ ế n cácbảnsaokhôngđặchiệu.Nóic á c h khác,chiềudàicủamồibịgiớihạnbởinhiệtđộl à m nóngchảynó.Nhiệtđộnóngchảyquác a o ( t r ê n 80°C)cóthểg â y ramộtsốvấnđềdoA
Mẫudò(Probe)l à mộtsợinucleica c i d (hoặcribonucleicacid)c ó trìnht ự xácđịnhv à đ−ợcđá nhdấubằngcácphươngphápkhácnhaudùngđểnhậndiệncácđoạnnucleicacidkháccótrìnht ựbổsungvớinó.QuátrìnhnàydựatrênnguyêntắcbiếntínhvàhồitínhcủaphântửADN,đ−ợcg ọilàlaiphântửADN.
Mộtsốứngdụngvàprotocolđòihỏimẫudòcóđánhdấuphóngxạ,trongkhimộtsốkhácthìchuỗi đíchphảiđ−ợcđánhdấu.Trongcácứngdụngđốivớimẫudòthìhaithôngsốđ−ợcđ−arađểđánh giá vềhiệusuấtcủachúngđólà độnhạyvàtínhđặchiệu.
Mẫudòcóthểđ−ợcthiếtkếdựatrênnhữngtrìnhtựcósẵntuỳvàomụcđíchcủatừngthín ghiệmvàcácthôngtinđãcó,vídụnh−:Dựatrêntrìnhtựgenomecủa đốit−ợngnghiênc ứ u đểnhậndiệncácbảnsaocủagenhoặcsảnphẩmRNAcủagen;
Dựatrêntrìnhtự g en ome củacác sinhvậtcóquanhệgầngũivớiđốit−ợngnghiêncứunhằmtìm kiếmgenchứcnăngđ−ợcbảotồnquatiếnhoá;Dựat r ê n trìnht ự aminoa c i d c ủ a proteinl à s ả n phẩmcủagen.Từđótìmkiếmtrìnhtựtrọnvẹncủag e n mãhoáchoproteinđótrêngenome. Trongquátrìnhthiếtkếmẫudòcầnbảođảm:Tínhđặctr−ngcủamẫudò;Khôngcóhiệnt−ợngl ai c h é o cácmẫudòhoặct ạ o cấu trúckhônggiannộitạitrongmẫudò;Nhiệtđộbiếntính(T m )p hảiphùhợpkhithựchiệnphéplainhiềumẫudòmộtlúc.
60% , t r á n h c á c trìnht ự chứacácbazơlặplạinhiềulần(khôngquá4 nucleotidl ặ p lại,vídụ– GGGG-). Đãcórấtnhiềuphầnmềmđ−ợcứngdụngđểthiếtkếmồivàmẫudò,chẳnghạnnh−:Oligo4,Prim er3, Tháng9/2003,h ã n g Invirogenđ ã đ−araphầnm ề m VectorNTIAdvance TM9.0 Phầnmề mnàycóthể:
- Phântíchtrìnht ự đãlựachọnvàthiếtk ế mồiP C R c h o trìnht ự đó,d ự a t r ê n cácthôngs ốnh−n h i ệ tđ ộ n ó n g chảy,%GCvàchiềudàiđoạnkhuếchđại. Đồngthờinócũngthiếtkếđ−ợcmẫudòcholaiADN;
Xâydựngcơsởdữliệuvàthiếtkếphầnmềm
Phânloạicơsởdữliệu………………………………………………… 29 1.6.2 Tổngquanvềvấnđềxâydựngcơsởdữliệuvàthiếtkếphầnmềm
Việcphânloạicơsởdữliệu(CSDL)gắnliềnvớiquátrìnhnghiêncứuvàphátt r i ể n CS DLtrênthếgiớiđểtrảlờihaicâuhỏiquantrọng:làmthểnàođểtíchtrữdữl i ệ u vàtíchtrữnh−th ếnàođểđạtđ−ợchiệuquảcaonhất?.Hiệnnay,cácnhànghiêncứuvềCSDLđềucôngnhậnloạiC SDLquanhệlàcókhảnăngtốtnhấtcảvềtíchtrữvàxuấtnhậpdữliệu.
LịchsửpháttriểnCSDLđãchothấymộtloạiCSDLmớiluôncónềntảnglàmộtloạiCSDLđãcó Phươngpháptíchtrữdữliệuđầutiênđượcsửdụngtrênmáytínhlàcáct ệ p tinđơngiản(flatfile s)khôngchứađựngbấtkỳmộthìnhtháicấutrúcCSDLnào.
Hệthốngtệptinđơngiản(FileSystems) Đâylàkỹthuậtlưutrữthôngtinbằngcáctệptinvàsửdụngcấutrúccủahệđiềuhànhm á y tí nh.Kháiniệm“flatfile”l à mộtcáchđ ể d i ễ n t ả tệptindạngtextđơngiản,khônghềc ó mộtcấu trúcriêngnào.Mọitruycậpđ ề u khôngthểthựch i ệ n đ−ợcn ế u k h ô n g l ậ p trìnhm ộ t ch−ơngtrìnhkhácbiệt.Cáctệpt i n khacnhaucũngkhôngđ− ợcthiếtlậpmộtquanhệnào.
CSDLdạngcâycócấutrúchìnhcâyng−ợc.Cácbảngdữliệucóquanhệkiểugiađì nh.Mỗibảngconcómộtbảngbốmẹduynhấtvàmộtbảngbốmẹcó thểcóquanhệvớin hiềubảngcon.Bảngconchỉtồntạikhiđãcóbảngbốmẹ.Cấutrúcloạicâynàyhìnhth ànhCSDLdạngcâyvàchophépthiếtlậpq uan hệmột-đaph−ơng.
CSDLdạngl−ớil à mộtb−ớcc ả i t i ế n t ừ C S D L dạngc â y CSDLdạngnàyc h o phépb ảngdữliệuconcóquanhệvớinhiềubảngbốmẹ.Nh−vậynóchophépthiếtlậpquanhệđaph−ơ ng.
KháiniệmCSDLdạngquanhệđ−ợcthiếtlậptrênc ơ sởCSDLdạngc â y nh−ngkhôngb ắ t b uộcphảitheođúnghạnchếbảngconphảicóbảngbốmẹ.Bấtcứbảngdữliệunàocũngcóthểđ−ợct ruycậptrựctiếpmàkhôngcầnphảithôngquabảngbốm ẹ Điềunàycảithiệnđángkểtốcđộtruy cậpvìkhôngc ầ n phảithôngquatấtcảcácbảngdữliệubậccaohơn.Điểmthuậnlợinữalàcóthểt hiếtlậpquanhệgiữahaibảngdữliệubấtkỳ.
Trênthếgiớihiệnnaycórấtnhiềuhệthốngcơsởdữliệu(CSDL)vềsinhvậtbiếnđổigen( GMOs)màtrongđóquantrọngnhấtlàbaCSDLcủaMỹ,Châu ÂuvàN h ậ t bản.ĐiểnhìnhlàTrungtâmQuốcgiavềCôngnghệTinSinhhọc(theNationalC e n t e r forBiotechnologyInformation,NCBI)t r ự c thuộcViệnQuốcg i a vềY học(theNation alInstitutesofHealth,NIH),Bethesda,MarylADN.Từnăm1988v à trongnhữngnămgầnđ â y CSDLnàyđãcótốcđ ộ pháttriểnvượtquádựbáocủanhiềungười.H i ệ n nayGenBankchứađựn ghơn30triệudữliệuvềchuỗigenđ−ợcphântíchtừhơn130ngànloàisinhvật,baogồmhơn36t ỉ n ucleotit(GenBank,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/genbankstats.html).
Từnhữngnămgiữathậpkỷ80,GenBankđãhợptáccảtronglĩnhvựchoạt động,chínhsáchvàtrao đổidữliệuvớihaitổchứctích trữgenlớntrênth ếgiớilà: ViệnCôn gnghệTinSinhhọcChâu Âu(theEuropeanBioinformaticsInstitute,EBI,thànhlậpCSDLgentừnăm1988)vàTổchứcNgânhàngDữliệuGenNhậtbản(theDNADataBankofJapan,DDBJ,bắtđầunăm1986).Batổc hứcnàyđãliêntụctrao đổidữliệugentheoquyđịnhcủaTổchứcHợptácDữliệuChuỗiNucleotitQuốctế( t h e Intern ationalNucleotideSequenceDatabaseCollaboration,INSDC)vàvềcơb ả n đềubảot r ì cùng mộtCSDLchuỗigentrongkhiviệccậpnhậpdữliệugenvẫnl i ê n tụcdiễnrahàngngàytừcácnh ànghiêncứugentrêntoànthếgiới.
NgoàibaCSDLchínhđãnêutrêncòncónhiềuWebsitekháccungcấpkhảnăngtruycập dữliệugen.MộtvàiWebsitechứađựngCSDLtoàndiệnnh−củaViệnWhiteheadC a m (the WhiteheadInstitute,TIGR)ở Cambridge,Massachusetts;vàViệnC h à o mừngHiếnmáu(th eWellcomeTrustS a n g e r Institute)cũngở Cambridge,Anh.C á c websitesk h á c thìchuy êns â u vàomộtvàiloạigenhaymộtc h ủ đềnàođó.VídụWormBase.orgchuyênvềgencủaC aenorhabditiselegans,mộtloạigặmnhấmhayđ−ợcsửdụngtrongc á c thínghiệmnghiêncứu; PhòngThínghiệmJackson(theJacksonLaboratory)ở B a r Harbor,M a i n e , cungc ấ p thông t i n mạngrộnglớnvàcáccôngc ụ l i ê n quanvềgencủaloàichuột.Thêmvàođó,c ó nhiềuhệthố ngmáytínht−nhânvẫnth−ờngxuyêntảivềtấtcảcácthôngtinmớivềg e n vừađ−ợccậpnhậ pvàocácsitechính.
CácnghiêncứuvềCSDLgenởViệtNamhầunh−mớibắtđầutrongthờigiang ầ n đây,tr ongđóCSDLcủaTrườngĐạihọcKhoahọcTựnhiênTP.HồChíMinh(CaoThịNgọcPhượng,2 003)chophéptruycậpcácthôngtinnghiêncứutrongn−ớcv à n−ớcngoài.
DùsaothìcácthôngtindữliệuvềchuỗiADNsẽcórấtíttácdụngnếukhôngcómáytính vànhữngcôngc ụ phầnmềmđểphânt í c h giảim ã Cácnhàkhoahọcnghiênc ứ u v ề côngnghệ t i n sinhhọcngayt ừ khichuỗiADNđầut i ê n đ−ợcpháthiện,đãvàđangliêntụctạoravàcảitiế ncáccôngcụphântíchgiảimãchuỗiADN.Trongthờigiansơkhai,họsosánhcácchuỗiamino axitcủaproteinthuđ−ợctừcácl o à i khácnhaubằngcáchphânlậpthànhtừngđoạnngắn,rồix emxétnhữngđoạnđóbằngmắtthường.
Ngàynay,toànbộchuỗig en baogồmhàngngàngenđãđ−ợctrảira,vàcần cónhữngphầ nmềmhoạtđộngtrênhệthốngmạngkếtnốicácmáytínhmạnhmẽnhấtđểcóthểphântích,sosá nhvàdiễntảdữliệugenvàtíchtrữkếtquảd−ớidạngthíchhợpchoviệctruy cậpthôngtin.Sau khisắpxếpmãcủa toànbộmộtd ã y gen,chươngtrìnhmáytínhsẽtruyxétđểxácđịnhcácmãd ấu,vídụnh−làcác dấubắt đầuvàkếtthúccủamộtđoạngenchứamãcủamộtprotein.Nh−vậymãcấutrúccủaproteinđ ó c ó thểđ−ợcdiễntảvàcókhảnănggiảimãđ−ợcc ả v ề s i n h l ý v à chức năngđiềuhòacủaproteinđókhisosánhvớicácproteinđãđượcbiết trước.Sauđócóthểtoànbộ dãygencũngsẽđượcphântíchđểtìmracơchếsinhhóavàphươngthứcđiềuhòa.
Rấtnhiềucáccôngc ụ phầnmềmvềkỹnghệphântíchgenđ−ợcl o a d sẵnt r ê n cácwebsite,thậ mchícảcáccôngcụđangtrênquátrìnhpháttriểnnh−trênwebsitecủaN C B I , EBI,DDBJ, TIGR,t h e SangerInstitutev à cáct ổ chứck h á c ( v í d ụ danhs á c h cáccôngcụ củ a NCBItrênh ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/tools/ index.html).Nh−vậyphầnlớncácdữliệuvềgenvàc á c c ô n g c ụ phântíchc ó t h ể đ−ợctảivề miễnphíchobấtcứaicómáytínhvàkếtnốiInternet.
CácC S D L t r ê n Internetvềgenđãđ−ợcx â y dựngđểt í c h t r ữ nhiềudạngdữliệugen, kểcảaminoacidcủaprotein,cấutrúc3 chiều,cácchứcnăngcủ a protein,m ã phânloạis i n h v ậ t v à t−ơngt ác giữacácloạiprotein.Tàil i ệ u thamkhảov ề g e n cũngđ−ợcsắpxếpkèmtheocảtó mtắtvàđ−ợcđặttr on g tr ạn g th áid ễ chias ẻ trênwebsitecủaTh−việnY họcQuốcgia.P h ầ n l ớ n cáccôngbốkhoahọcmớinhấtvềcôngnghệgend−ớidạngđiệnt ử cũngcóthểt r u y cậpdễd àng.Thờigiangầnđây,cácC S D L W e b đãđ−ợcdanhmụchóavàbaogồmc ả cácd ữ liệut h í ng hiệmkhoahọcmớinhất.
Nhữngthínghiệmđóthườngtạorakhốilượngdữl i ệ u lớnhơnnhiềusovớinhữnggìmà mộtphòngthínghiệmđơnđộcc ó t h ể t ự xửl ý Mộttrongnhữngmục đíchcủacácCSDLgenhiện naylànhằmgiúpcácnhànghiêncứ u kháctruycậpvàtựmìnhphân tíchkếtquả.VídụEBIđãt ạ o r a mộtWebsitechomụcđíchnày(http://www.ebi.ac.uk/ arrayexpress/),vàHiệphộiDữliệuvềbiểuhiệngennhờMicroarray(theMicroarrayGeneExp ressionDataSociety)đãđ−ợcthànhlậpn ă m 1999đểkhuyếnkhíchviệctraođổinhữngdữliệun h−v Ë y(http://www.mged.org/index.html).
TổngquanvềnghiêncứuvàsựpháttriểncủamạngWebvàCSDL …
MạngWebbaogồmvôvànmáytínhkếtnốiquamạngInternetbằngnhiềuph−ơngthứck hácnhauđểchúngcóthểtruyc ậ p nộidungl ẫ n nhau.CácCSDL(Databases)t r ê n cácm á y tínhcơbảnlàcáchệthốngt í c h t r ữ cácdãydữliệu.Th−ờngthìc á c CSDLn à y cóthểchiasẻtru yc ậ p Trongt h ậ p kỹqua,sựpháttriểnv−ợtbậccủakỹnghệt in họcInternetchophéps ử dụngc ôngnghệC SD L tr ên Web v à làmchoviệctruycậpthôngtinởcácCSDLtrênWebtrởnê ntiệnlợi.DovậyđãxuấthiệncụmtừhệthốngCSDLWebmàthựcchấtlàcáchệthốngCSDLmàc hóng chophéptruyc ập thôngtin quamạngInternet.Điềunàykhôngnhữngápdụngch o việctrìnhb ày thôngtintrênWebquaCSDLmàcònchocảcácdịchvụth−ơngmại W e b
SựkếthợpgiữaCSDLvàInternetđãđặtramộts ố vấnđềmới.Vấnđềđầutiênliênquanđế nquátrìnhtruycậpvàtìmkiếm.Đốiv ớ i cácC SD L thôngth−ờng,quátrìnhtìmkiếmđ−ợcthựch iệnnhờứngdụngngônngữtìm kiếmnh−SQL.Các CSDLtrênWebđ−ợcthiếtkếvàxâydựngt rênrấtnhiềuhệthốngkhácnhauvớicáclogickhácnhau.Hơnnữatốcđột r a o đổithôngt i n trên mạngcònhạnchế.Tấtc ả nhữngsựkhácbiệtđóđặtrachocôngnghệCSDLtrênWebnhữngthửth áchmới.
Mộtv ấ n đềkháccũngl i ê n quanđ ế n phươngphápt ì m kiếml à v ấ n đềkhaithácthôn gtin(datamining).Khaithácthôngtin có nghĩalà tìmkiếmcác thôngtinmớihayph−ơngthứ c(patterns)mớimàkỹthuậtCSDLtrướcđâykhôngcó.ĐốivớingườitruycậpWebthìvấnđềtìmr athôngtinhayph−ơngthứcmớirấtquantrọng.Dov ậ y t r o n g kỹnghệW e b xuấthiệnc ụ m từ
Tr−ớckhithiếtkếvàxâydựngmộthệthốngCSDLWebaicũngphảitrảlờicáccâuhỏisau:kếtnối giữaCSDLvàW e b rasao?Sửdụngphầnmềmc ơ sởnào?
CSDLcóthểđ−ợckếtnốivớiW e b quach−ơngtrìnhtrunggiansửdụngngônngữlậptrìnhnh− PHP,PERL,Javaapplets,VisualBasic.NEThayC++.
Vấnđềcầnchúý là hiệuquảcủahệthốngCSDLWeb,nhấtlà khisốngườitruycậpđồngt hờicókhảnăngtăngnhanh.
Nh−đãđềc ậ p ở trên,CSDLWebc ó thểb a o gồmn h i ề u k i ể u vàdạngdữl i ệ u khácnhau(dạn gsố,dạngvănbản,dạnghìnhảnh,âmthanh,video,v.v.).Đâycũnglàđặc điểmkhácbiệtcủaCSDLWebsovớiCSDLthôngthường.Vấnđềnàyyêucầuphầnm ề m cơsở choCSDLphảicókhảnăngxửlývàtraođổicácdạngdữliệukhácnhau. CũngdoCSDLsinhvật biếnđổigenbaogồmdữliệuđadạngnênvấnđềan t o à n mạngc ũngcầnđ−ợcchútrọng.CSDLvàphầnmềmquảntrịCSDLcầntuânthủcácnguyêntắcbảomật vàantoànđểhệthốngcóthểhoạtđộngtốttrongtươnglai.
Tấtcảnhữngv ấ n đềđãnêuở trêncầnđ−ợcgiảiquyếtkhithiếtk ế v à x â y d ự n g CSDLsinhvậ tbiếnđổigenvàcácsảnphẩmcủachúng.
ứngdụngtinsinhhọcđểgiảitrìnhtựgen
X174đ−ợcxácđịnhtrìnhtự (1977)chođếnnay,trìnhtựADNc ủ a rấtn h i ề u loàisinhvậtđãđ−ợ clưutrữt r o n g cácn g â n hàngcơsởdữliệugen.Nhữngdữliệunàysẽđượcphântíchđểtìmranh ữnggencấutrúc(genmãhoáchomộtproteinnàođó),cũngnh−tìmraquiluậtcủanhữngtrìnhtự tươngđồnggiữacácprotein.Việcsosánhcácgentrongcùngmộtloàihaygiữacácloàikhácnha ucót h ể chot h ấ y sựt−ơngđ ồ n g v ề c h ứ c n ă n g củaprotein,h a y mốiquanhệphátsinhch ủngloàigiữanhữngloàinày(thểhiệntrêncâyphátsinhchủngloài(phylogenetict r e e ) ) Với sựtăngtr−ởngkhổnglồcủadữliệuloạinày,việcphântíchtrìnhtựADNmộtcáchthủcôngtr ởnênkhôngthểthựchiệnnổi.
Ngàynay,cácchươngt r ì n h m á y t í n h đượcsửdụngđểgiúpt ì m cáctrìnht ự tương đồngtrongb ả n đồgen(genome)củahàngloạtsinhvật,vớisốl−ợngnucleotidetrongtrìnhtựlê nđếnhàngtỉ Nhữngchươngtrìnhn ày cóthểtìmkiếmnhữngtrìnhtựADNkhônggiốngnhauh oàntoàndocácđộtbiếnnucleotide(thaythế,mấth a y t h ê m cácgốcbase).Nhữnggiảithuậtbắt cặptrìnhtự(sequencealignment)cũng đ−ợcápdụngngaycảtrongquátrìnhxácđ ị n h trìnht ự A D N , l à kỹthuậtxácđịnhtrìnhtựđoạn nhỏ(shotgunsequencing).Kỹthuậtnàyđãđ−ợccôngtyCeleraGenomicssửdụngđểxácđịnhtr ìnhtựgenomecủavikhuẩnHaemophilusinfluenza.Kỹthuậtxácđịnhtrìnhtựhiệnnaykhôngt h ể tiếnh à n h v ớ i c ả đoạntrìnht ự A D N lớn(cỡvàichụcnghìnnucleotidetrởlên)nênng−ờitas ửdụngxácđịnhtrìnhtựnhỏ đểgiảimãhàngnghìnđoạntrìnhtựvớikíchthướckhoảng600-800nucleotide.Sau đó,nhữngđoạntrìnht ự nhỏnàysẽđ−ợcsắpxếpt h ứ t ự v à nốilạivớinhau(thôngquaviệcbắtcặp trìnhtự ởnhữngđầugốilênnhau(overlap))tạothànhmộttrìnhtựgenomehoànchỉnh.
Kỹthuậtxácđịnht r ì n h t ự đ o ạ n n h ỏ t ạ o r a chuỗidữl i ệ u m ộ t cáchnhanhchó ng,nh−ngnhiệmvụsắpxếplạicácm ả n h ADNc ó t h ể làkháphứct ạ p c h o c á c genomelớn.Tr ongtr−ờnghợpdựánb ả n đ ồ g e n ng−ời( H u m a n GenomeProject),cácnhàtinsinhhọcphải mấthàngthángđồngthờisửdụnghàngloạtsiêumáytính(cácmáy DECAlpharađờinăm2000) đểsắpxếpđúngtrìnhtựngắnlại.Xácđịnht r ì n h tựđoạnnhỏlàkỹthuậtưutiênsửdụngtrongh ầuhếtcácdựángiảimãgenomeh i ệ n nayvàgiảithuậtl ắ p rápgenome(genomeassemblyalgo rithms)l à mộttrongnhữnglĩnhvựcnóngcủatinsinhhọc.
Mộtkhíac ạ n h kháccủat in sinhhọctrongv i ệ c p h â n tíchtrìnht ự làviệct ì m kiếmtựđộ ngc á c genvànhữngtrìnht ự điềukhiểnb ê n trongm ộ t genome.Không phảilàt ấ t c ả nucleotidebêntrongm ộ t genomeđềul à gen.Phầnl ớ n c á c ADNbêntronggeno mecủacácsinhvậtbậcc a o làc á c đoạnADNkhôngphụcvụchomộtnhiệmv ụ c ụ thển à o (hoặ cdokhoahọchiệnnaych−anhậnra)đ−ợcgọilànhững đoạnADNrác(junkADN).Tinsinhhọccòngiúpk ế t nốidữl i ệ u g i ữ a cácd ự á n genomevàp roteomic,vídụviệcsửdụngtrìnhtựADNđểnhậndạngprotein.
tổngquanvềlậpbảnđồgenlúa
Tìnhhìnhnghiêncứulậpbảnđồgenkhángđạoôn
Lậpbảnđồcácgenkhángđạoônđãđ−ợctiếnhànhtừnăm 1991,đến nayđãcókhoảngvài chụcgen:gồmcácg e n c h í n h v à c á c QTLđ−ợcxácđịnhtrênnhiễmsắcthểsố:4,5,6,8,11và12 củalúa(Yu1991;Zhu&CS,1992;Wangetal,1994;Zheng& CS,1995;Chen& C S , 1999;Fu ji& C S , 2000;Zenbayashi& CS,2002;Sallaud&CS,2003).Dựatrênkếtquảlậpbảnđồ,bagen khángđạoôn:Pi-1,Pi-2vàP i -
3 đãđ−ợcquitụvàogiốnglúaCo39,mộtgiốngnhiễmnặngvớihầuh ế t cácchủngđạoônđểt ạ o radònglúacó3 genkháng.Dònglúanàyđãthểhiệntínhkhángc a o v ớ i nhiềuc h ủ n g đạoônkh ácnhau,điềun à y đãm i n h chứngchos ự c ầ n t h i ế t củaviệclậpbảnđồgentrongcôngtácchọ ntạogiốngkháng.
ViệtNamđ−ợccoilàtrungtâmcủasựđadạngthựcvậttrongđócócâylúa,sựđadạngnày cũngđồngnghĩavớisựđadạngvềnguồngenq u í Trongsốcácgiốnglúađ−ợcthut h ậ p v à kiể mđịnhở ViệtNam,rấtnhiềugiốngcókhảnăng khángbệnhđạoôncaovàchúngthựcsựlànguồngenquítrongtạogiốnglúakhángbệnhnếunh
−cácgenkhángđ−ợcphântíchvàlậpbảnđồphântử.Lập bảnđồgenkhángbệnhđạoônởcácgiố nglúađịaphươngViệtNamchỉmớiởgiaiđoạnbắtđầuv à mớichỉdừnglại ởmộtvàinghiêncứu cótínhchấtthămdò,trongkhiđóthựctếcủacôngtácchọnt ạ o giốngkhángbằngchỉthịphânt ử l ạiđangđòihỏic ó bảnđồphântửcủacácgenkhángbệnh;đặcbiệtlàcácchỉthịphântửliênkếtvớ igen.
Tìnhhìnhnghiêncứulậpbảnđồgenchịuhạn
Khảnăngchốngchịuhạnđ−ợcđánhgiábằngnhiềuchỉtiêukhácnhaunh−ápsuấtthẩmthấ ucủalá;cấutrúc,hìnhtháibộrễnh−:độdàirễ,độđâmxuyêncủarễ,sốl−ợngrễ.v.v.Vềbảnchấ t,tínhchịuhạncủacâytrồngdođagenquiđịnh;bởivậyxácđịnhcácgenquiđịnhtínhchốngchịu hạnởlúalàcôngviệchiệnrất khókhăn.H i ệ n nay,cácnhàkhoahọcchorằngcókhoảng200 genthamgiavàocơchếkhángh ạ n ởcâytrồng.
Lúalàmộttrongnhữngcâyl−ơngthựccókhảnăngchịuhạnkémvàđ−ợccoilàc â y t−ơ ngđốinhạyc ả m vớimôitrườngbênngoài.Đốiv ớ i từnggiaiđoạnphátt r i ể n khácnhaucủacâ ylúatừlúcnảymầmđếnkhichín,sựthiếunướccũnggâyảnhhưởngởmứcđộkhácnhau.Tínhtrạ ngchịuhạnlàmộttínhtrạngdođagenquiđịnhphứctạpmàsựthểhiệncủanóởcácgiaiđoạnphá ttriểnkhácnhaucủacâylúaquanhiềuyếutốnh−ápsuấtt h ẩ m thấu,h ì n h tháib ộ rễ.v.v.;bởiv ậ y sựchọnt ạ o cácgiốngcótínhchịu hạncaoquacácđặctínhhìnhtháilàvôcùngkhókhăn,t ốnkémvàkhôngcóhiệuquảcao.
Vàonhữngnămgầnđây,dosựpháttriểnkhôngngừngcủacôngnghệsinhhọccùngvớisựr ađờicủacácchỉthịphântửđặcbiệtlàởlúa,cácnhàkhoahọcđãthiếtlậpđ−ợcmộtsốbảnđồphâ ntửchocáctínhtrạngsốl−ợngnh−:chịuhạn,chịuúng,chịuphèn.v.v.Đốivớiđặct í n h chốngc hịuhạnbằngsửdụngc h ỉ thịphântửnh−SSR,AFLP,RFLP,SNP.v.v.cácQTLk h á n g h ạ n đ ã đ−ợcđ ị n h v ị ở n h i ề u loạic â y trồngkhácnhaucũngnh−câylúa(Morgan&CS,1996;Otoo le&CS,1979;Lilley&CS,1996;Champoux& CS,1995;Price& CS,1997;Yadav& CS,1998; Zhang& CS,2000,Tripathy&CS,2000,Zheng&CS,1999;Nguyễn&CS,2000,2004).Bản đồQTLmộtsốtínhtrạngliênquanđếnchịuhạnởlúađãđ−ợcthiếtlậpvàcôngbốtrongcáccô ngtrìnhnghiêncứucủacáctácgiảgiớinh−:tínhtrạngđiềukhiểnthẩmt h ấ u (osmoticadjustme nt)củaLilley&CS,1996,Zhang&CS,1999và2001,Robin
&CS,2003);Trạngtháiổnđịnhmàngtếbào(cell-membranestability)củaTripathy
&CS,2000;Hàml−ợngaxítabscisic(abscisicacidcontent)củaQuarrie&CS,1994và1997;đi ềuchỉnhkhíkhổng(stomatalregulation)củaP r i c e & C S , 1997;Tìnhtrạnglá (leafwatersta tus)vàhìnhtháirễ(rootmorphology)củaChampoux& CS,1995,Ray&CS,1996,PriceandTo mos1997,Yaday&CS,1997,Ali&CS,2000;Courtois& CS,2000,Zheng& CS,2000,Zhang
& CS,2001,Kamoshita& CS,2002,Price&CS,2002.
Cácvịtrímanggenkhánghạnđãđ−ợcđịnhvịvàrảiđềutrên12nhiễmsắcthể(NguyễnThị ThanhThuỷ& CS,2004).Mặcdùnhiềucôngtrìnhkhoahọcđ−ợccôngbốvềtínhtrạngchịuhạn; tuynhiênkhảnăngchốngc h ị u hạnở lúavẫnđang đ−ợccoilàmộtđặctínhquantrọngvàđ−ợcđầut−nghiêncứu,đặcbiệtlàviệcxác định,địnhvịvàphânlậpđ−ợccácgenchịuhạnnhằmphụcvụchocôngtácchọntạogiốngbằng chỉthịphântử.
ViệtNamlàmộttrongcácn−ớcxuấtkhẩugạohàngđầuthếgiới,tuyvậydohệthốngphânp hốicònkhókhănnênmộtbộphậnng−ờidânởcácvùngsâu,vùngxa,vùngcaocònthiếu lúag ạo.Bởivậy,việctạoracácgiốnglúacókhảnăngchịuhạncaosẽgiảiquyếtđượcvấnđềlươngth ựctạichỗchocácvùngnóitrên.Bêncạnhđó,nócòngópphầnchấmdứttệducanh- duc−,ổnđịnhcuộcsốngchođồngbàodântộcthiểusố,chấmdứtnạnphárừngđanggâyranguy cơnghiêmtrọngvềcânbằngsinhthái.
Trongnhữngnămgầnđây,dobiếnđổicủakhíhậunênnhiềunướctrênthếg i ớ i , nhiềuvùn gl ã n h thổbịhạnhánk é o dàigâyảnhh−ởngnghiêmtrọngđ ế n sảnxuấtnôngnghiệp.ViệtNam làmộtnướcởvùngnhiệtđớigiómùa,lượngmưatrungbìnhhàngnămkhálớnnhưngphânbốkh ôngđềutrongnăm,cácvùngnh−m i ề nTrung,vùngTrungduvàmiềnNúivẫnchịucảnhhạnh ánkéodàiảnhhưởngđếnsảnlượngcâylươngthựcđặcbiệtlàcâylúa.Nhànướcđãvàđangtậptru ngđầut−choviệcchọn cácgiốnglúach ịu hạnphùhợpvớitậpquánvàđiềukiệncanhtácởtừng địaphương.Nhiềucôngtrìnhnghiêncứuvềtínhchịuhạnởlúađãđượccôngbốvàmộtsốgiốnglú achịuhạn(CH133,CH1,CH2,LC93-
1.v.v.)đ ã đ−ợcchọntạ ođ em l ạ i lợiíchkinhtếxãhộicao.Tuyvậy,ph−ơngphápchọngiốngc hịuhạnchủyếuvẫnlàtruyềnthống;tốnnhiềucôngsức,thờigianvàch−ađảmbảođộtincậylâu dàivìs ự lựachọnchỉđ−ợcđánhgiábằngcácchỉtiêuhìnhthái. ởViệtNam,nghiêncứulậpbảnđồQTLkhánghạnởgiốnglúanươngsửdụngc h ỉ thịph ântửdotổchứcRockefellertàitrợđãđ−ợctiếnhànhtạiphòngCôngnghệ
Tếb à o Thựcvật,ViệnCôngnghệSinhhọc(NguyễnĐứcThành&C S , 2004).ViệnDitruyềnN ôngnghiệpđangtiếnhànhcácnghiêncứuphântíchditruyềnvàlậpbản đồgenchịuhạnởlúaquacácnghiêncứucủaViệnđãchothấynhiềugiốnglúachịuhạnđịaphươ ngthuthậpt ừ cáctỉnhmiềnnúiphíaBắc,miềnTrung,m i ề n N a m lànguồngenchịuhạntốtlàm vậtliệuđểlậpb ả n đồg e n vàkhaitháctrongchọnt ạ o giốngkhánghạn(NguyễnThịThanhTh uû&CS,2000).
Tuycónguồngenc h ị u h ạ n phongphút ừ c á c giốngl ú a địaphương,songsự đánhgiátổngt h ể , khaithácvàsửdụngnguồngennàyphụcv ụ c h o c h ọ n t ạ o cácgiốnglúach ịuhạndựatrênbảnđồgenlàv iệc cần phảitiếptụctiếnhànhmạnh mẽhơnnữa.
Ch−ơng2:vậtliệu vàph −ơngpháp nghiêncứu
Cácdòng,giốngsửdụngtrongnghiêncứu
Mẫungônghiêncứu:sửdụngcácdòngngôchuyểngen(ngô176,ngôT25,ngôMON810)vàn gôkhôngchuyểngen(giốngnếphồng).
Mẫuđậut−ơngnghiêncứu:làcácgiốngđậut−ơngkhôngchuyểng e n vàđậut−ơngchuyểng en.
Cácgensửdụngtrongthiếtkếcáccặpmồivàmẫudò
Cácgenkhángt h u ố c t r ừ cỏP A T,EPSPS,Bar genkhángsâuBt(CryIA(a),CryIA(b)
,CryIA(c)) genkhángkanamicine(NptII )đ−ợcsửdụngđểlàmnguyênliệutrongthiếtkếc áccặpmồivàmẫudòchoviệcnhậnbiếtmộtsốgenphổb i ế n đãđ−ợcchuyểnnạpvàocâytrồng.
CáccặpmồisửdụngtrongphảnứngPCRvàcácbộkitnhậnbiếtGMOs 40 2.1.4 CácphầnmềmsửdụngtrongnghiêncứuvàxâydựngWeb ………… 412.2.Hoáchất
KÝcht h −íc đoạnk hu Õ c h đại
Bảng3:TrìnhtựcáccặpmồidùngtrongphảnứngRT-PCRvàmult ip le x- PCR
- MicrosoftVisualStudio.NET2003đểlậptrìnhhệthốngbaogồmcácmodulexuấtnhậ p,tìmkiếmbiểuthị,xửlýthốngkêvàlậpbáocáo.
- DeveXpress.NET(DeveloperExpressInc.,L a s Vegas,Hoakỳ)l à phầnm ề m hỗtrợlậ ptrìnhchoVisualStudio.NETtrongviệcthiếtkếgiaodiệnthânthiệnvớing−ờisửdụngv àbiểuthịkếtquả.
- VBeXpress.NETversion3.0(DataCastSystem,Inc.,Dublin,Ireland)làphầnm ề m hỗ trợđểxâydựngc á c chươngtrìnhtrênnềnNetFramewrokđ ặ c biệtr ấ t tiệnlợikhithàn hlậpcácCSDLStoredProcedures.
Cáchoáchấtsinhhọcphânt ử cầnthiết:cáchoáchấttáchchiếtADN,hoáchấtlàmPCR,h oáchấtchạygelagarose,gelpolyacrylamide
HoáchấttáchchiếtA D N b a o gồmc á c loạinh−:T r i s HCl,EDTA,S D S , NaCl,CTAB, Chloroform,isopropanol,isoamylalcohol,EthanolcủacáchãngSigma,Merck,Prolabo,ICN, Labscan.
HClpH8,1,5mMMgCl2,5mMKCl)hoặcđệmP C R 1XcủaQuiagenhoặcInvitrogen
- dNTPs(dATP,dGTP,dCT,dTTP(hoặcdUTP))củaFermentas,Invitrogen.
- Mồi,Marker1 kb,Marker100bp,Marker/HindIIIcủahãngFermentas,Invitrogen.
- Điệndig e l a g a r o s e g ồ m c á c h o á chất:TAE(gồmTrisb a s e , EDTA,A c e t i c a cid),ChấtnhuộmBromophenolblue(hoặcXylenecyanolhoặchỗnhợpcả2chấtnày),E thidiumbromide,agarose.
- Điệndigelpolyacrylamide,baogồm:Acrylamide,Bis- acrylamide,TBE(gồmTrisb as e, EDTA,Boricacid) , APS,TEMED,STR(gồmNa OH,formamide,Bromophenolblue,Xylenecyanol),Xylenecyanol,glacialacetica c i d , formaldehyde,AgNO3,Urê,Na2S2O.5H2O,Saccarose.
Ph−ơngphápnghiêncứu……………………………………… 44Môhìnhnghiêncứu
Xâydựngcơsởdữliệuvàthiếtkếphầnmềm ……………………… 47 2.3.2 ThiếtkếmồiPCR,thiếtkếmẫudòchoviệcpháthiệnmộtsốgenphổbiếnđ−ợcchu yểnvàocâytrồng
+Hệt h ố n g c ơ sởdữliệuv ề GMOsđãđ−ợct h i ế t kếv à xâyd ự n g t r ê n c ơ s ở Microso ftSQLServer2000vàhệđiềuhànhWindowsServer2000,cònphầnmềmquảnlý trêncơ sở Mic rosoftV is u a l Studio.NET2003tr ên nềnhệđiềuhànhWindowsXP.DeveXpress.NET(Deve loperExpressInc.,LasVegas,Hoakỳ)làphầnmềmhỗtrợlậptrìnhchoVisualStudio.NETtron gviệcthiếtkếgiaodiệnthânt h i ệ n vớ i ng−ờisửdụngvàbiểuthịkếtquả.VBeXpress.NETver sion3.0(DataCastSystem,Inc.,Dublin,Ireland)làphầnmềmhỗtrợđểxâydựngcácchươngtrì nhtrênn ề n NetFramewrok.
+Sửdụngch−ơngtrìnhphântíchsosánhdựatrênnềnBLASTversion2.2.5vàClutaIWv ersion1.8.1.HệquảntrịCSDLđ−ợcsửdụngdựatrênMySQLversion,tạophầnmềmquảnl ý đặc tr−ng,phụcv ụ chov i ệ c t r a cứuvàcácmodulứngdụngcầnthiếtđikèm(Modulhệthốngphânlo ại,nhậpliệu,cậpnhật,xửl ý thốngkê,inấ n , quảntrịdữliệu).
+B i ê n t ậ p , p h â n tích,xửl ý , c h u y ể n đổidữliệub ằ n g cácphầnmềmchuyêndụng,tí chhợp,càiđặtphầnmềm,kếtnốihệcơsởdữliệuvàomạnginternetnộibộ.CSDLxâydựngđ−ợ ccũngl i ê n k ế t v ớ i c á c c ơ s ở d ữ l i ệ u hiệnđạitrênthếgiớiAGBIOS,ISAAA,phụcvục ôngtáctruynhậpthôngt i n nhậnbiếtsinhvậtbiếnđổigen.
+CSDLcũngl i ê n kếtchặtvớiCSDLkhácnh−NCBI,DDBJ,Expassy,EMBL- EBI…tiệníchkhicầnphântíchtrìnhtựADN,protein
+Sửdụngchươngtr ìn h p h ầ n mềm OLIGO.4đểthiếtkếmồit r ê n t r ì n h tự đoạngen đãbiết.Trìnhtựcủamồikhoảngt ừ 15-
+K i ể m t r a s ự hoạtđộngc ủ a c ặ p m ồ i mớiđ−ợcthiếtkếdựavàophảnứngP C R và điệndisảnphẩmphảnứng,xácđịnh ng−ợcl ại trìnhtự ADNcủasảnphẩmPCRđóxemcóđ úngđoạngenquantâmkhông.
+Thiếtkếm ẫ u dòt r ê n ch−ơngtrìnhOLIGO.4,vềc ơ bảncũngp h ả i thoảmãncác điềukiệnnh−quátrìnhthiếtkếmồi.Trìnht ự củaADNm ẫ u dòc ó thểdàihơní t nhiềusovớitrìn htựcủamộtđoạnmồi(vàichụcbp).
- Khôngdùngformamide:nhiệtđộl a i thườngkhácao,sửdụngđ ố i vớimẫudòđánhdấ ubằngphóngxạ.
- Dùngformamide(50%):nhiệtđộlaithấphơn,sửdụngđốivớimẫudòđánhd ấ u bằn ghuúnhquang.
QuytrìnhtáchchiếtADNcủacácgiốngcâytrồngchuyểngendựatheoph−ơn gphápcủaHugo&CS (1995)cócảitiến.
Quy trình táchchiết đ−ợctiến hànhnh−sau:
- Cắt1glánonvàotrongốngeppedoff1,5ml,bổsung200lđệmchiếtvànghiền.Bổsungtiế p200lđệmchiếtvànghiền.
- Cho400lphenol:chloroform:isoamylalcohol(25:24:1),lắcng−ợcốngvàlytâmtrong1 0phútở12.000vòng/phút.
- Chuyểnlớptrêncùngsangốngeppendoffmớivàbổsung1thểtích(v/ v)dungdịchphenol:chloroform:isoamylalcohol(25:24:1),lắcng−ợcốngrồilytâmở12.000 vòng/phúttrong10phút.
- Chuyểnlớptrêncùngsangốngeppendoffmớivàbổsung1thểtíchEthanol100%(v/ v),lytâm12.000vòng/phúttrongkhoảng10phút,loạibỏd ị c h v à giữl ại kếttủaADN.
- Hoàt a n tủaA D N trong50lđệmTEhoặct r o n g nướccấtkhửtrùngđãloạiion, đ−ợcADNstock.
- Nghiềnmẫutrongcốixayvàcân2 0 0 m g v ào ốngependoff2 ml,bổsung1400l đệmchiếtIvàovàlắctrộnđều.
- Chov à o m á y lắcc á c h thuỷở 60 0 Ctrongkhoảng30’ 60’,rồil ấ y ralắcnhẹở nhiệtđộph òngtrong10phút.Lytâm10.000vòng/phútkhoảng10phútở nhiệtđộphòng.
lhỗnhợpchloroform:isoamylalcohol(24:1)vào,lắcng−ợcống.Lytâm10.000vòng/ phúttrong10phútởnhiệtđộphòng.
- Lấyr a 6 5 0ldịch(phatrêncùng)chovàoốngependoff2 ml.Bổsung1400l đệmchiếtIIvàđểởnhiệtđộphòngtrong40phút.Lytâm12.000vòng/phútởnhiệt độphòngtrongkhoảng30phút,loạibỏdịchvàgiữlạikếttủaADN,hongkhô.
- ChovàotủaADNkhoảng7 5 0lđệmmuối,đ ể trong tủ lắccáchth u ỷ ở 45 0 Cch o đếnkhitủaADNtan.
- Cho750lhỗnhợpchloroform:isoamylalcohol(24:1),lắcnhẹng−ợcốngvàlytâm14.000v òng/phútởnhiệtđộphòngtrongkhoảng10phút.
- Lấyra650ldịchtrêncùngchovàoependoff1,5mlvàbổsung650lIsopropanol,đặtởnhiệ tđộphòngtrong10phút(hoặcđểquađêmở4 0 C).
- Lyt â m 10.000vòng/ phútở nhiệtđộphòngtrongkhoảng10phút,loạibỏdịchvàgiữlạikếttủaADN.
- RửatủaA D N b ằ n g Ethanol70%(400l), sụctủaADNl ê n vàlytâm10.000vòng/ phúttrong10phútởnhiệtđộphòng.LoạibỏEthanol70%,rửatiếpbằng150lEthanol100%và dùngpipetđểloạibỏEthanol,rồihongkhôtủaADN.
Saukhitáchchiếtxong,kiểmtranồngđộADNtổngsốnhờphươngphápđiệnd itrênge lagarose1%vớisosánhlàLambdaADN.
QuytrìnhtáchchiếtADNcủacácmẫuhạtngô,đậut−ơngnghiềnnhờph−ơn gphápCTAB(theoLipp&CS,1999)
CácphảnứngPCRđ−ợcthựchiệntrongthiếtbịEppendorfMastercyclerg r a d i e n t (96giếng),vớithểtíchcuốicùnglà25l/phảnứng.
- CặpmồiHS01/Cry-CR01;PA01/CM01vàPA01/CM03:
+Cácphânt í c h realtimePCRđ−ợcthựchiệntrongthiếtb ị PerkinE l m e r AB5700SDSsửdụn ghệthốngTaqMan,vớithểtíchcuốicùnglà25l/phảnứng.
Taqpolymerase 1,25U(Hot-StartQuiagenhoặcPlatintừInvitrogen) Mẫudòcóhuỳnhquang 250nM(IDT,USA)
Cácmẫudòđ−ợcđánhdấubằngchấtnhuộmthôngbáoh u ỳ n h quang6 - carboxyfluorescein(FAM)ở đầu5’vàthuốcnhuộml à m tắthuỳnhquang6- carboxytetramethylrhodamine(TAMRA)ở đ ầ u 3’.
60 0 Ctrong1phút 45chukỳlặplại Cáckếtquảđ−ợcphântíchnhờhệthốngxácđịnhtrìnhtựcủahệthốngsinhhọcứngdụngPE.
3mM(phảnứngmultiplexPCRgồmgenBtvàPat)) dNTP 0,2mM(đốivớicácphảnứngđơn)
CácsảnphẩmPCRđượcđiệnditrêngelagarose2%trong1giờởcườngđộ40mAvàđãn huémEthydiumbromide.
1 Kẹpmộtphầnmôlávàogiữachópvàthâncủaốngtáchchiếtmô;đậy nắ p;t á c h 2 m ô r i ê n g b i ệ t n h ờ đóngk í n p h ễ u Đ ặ t l á v à o c á c l ỗ , d ù n g c hày đẩychúngxuốngđáyống.
30giây,hoặcchotớikhim ô lánghiềnnát.Chúý:Vớihạt,việcnghiềnvỡhạ thoàntoàngiúpcảit h i ệ n hiệuquảtáchchiếthơnvàhiệusuấtthửnghiệm.
3 Giữố n g t h e o c h i ề u thẳngđ ứ n g , c ẩ n t h ậ n b ổ sung1 5 g i ọ t đ ệ m ch iết(350lđệmchiết)Quick St ix (dùngcholáhoặc hạt)vàomỗiốngchứ am ô lángô.
4 Lặpl ạ i c á c b−ớcn g h i ề n đ ể t r ộ n đ ề u m ô vớid ị c h c h i ế t V ứ t b ỏ c h à y (kh ông đ−ợcsửdụngchàychonhiềumẫu).Đốivớihạt,đậylắpốnglạiv à lắcnhẹ,rồiđểchấtlỏnglắngxuốngđáyống.
1 Đểcáchộpđãlàmlạnhđếnnhiệtđộphòngtrướckhimởhộp.Lấycácd ả i QuickStixra,tránhuốncongcácdải.Đậyhộplạingaylậptức.
3 Đểd ả i b ă n g khuếcht r−ơng( m ở r ộ n g ) t r o n g 5 phútv à s a u đ ó k i ể m t r a k ế t quả.
Ph−ơngphápnhậnbiếtgenCryIA(c)bằnglai phântửADNSouthernBlot:Sửdụngkỹth uËtRFLP(Restrictionfragmentlengthpolymorphism)
Trongt h í nghiệml a i phânt ử ADN(Southernb l o t ) , chúngtôiđãsửdụngenzym BglII(trình tựnhậnbiết6cặpbazơnitơ)đểxửlýADNcủacâythínghiệm.Sởdĩchúngtôichọn haienzymnàybởivìchúngkhôngcóđiểmcắttrongtrìnht ự c ủ a genngoạilai(CryIA(c)vànptI
Saukhix ử l ý enzym,ADNđ−ợcđiệnditrêng e l agarose1%ở điệnáp3 volt/ cm,thêigian14h.
ADNtr−ớckhichuyểnlênmàngđ−ợclàmmấtpurintrong0,25MHCl,vớithờigian10p hút.S a u đógelđ−ợcbiếntínhtronghỗnh ợ p 0,4MNaOHvà1,5MNaClđểchuyểnADNtừmạ chđôithànhmạchđơn.
TáchgenCryIA(c)từplasmidpART27làmmẫudò.Mẫudòđ−ợcbiếntínhởnhiệtđộ95
VớidungdịchlaiADN bằngbộkitECL,nhiệtđộphảnứngtốtnhấtlà42 0 C.Quátrình lai,cácADNcủamẫudòsẽliênkếtvớinhữngmảnhADNtrênmàngcót r ì n h t ự bazơn i t ơ t− ơngđồng.Pháthiệnkếtquảlaibằngphươngpháphiệnphimt h e o bộkitECL.
Giảitrìnhtựmộtsốgenđãđ−ợcsửdụngtrongbiếnnạpGMOs
Sảnp h ẩ m P C R c ủ a c á c g e n n à y đ−ợct i n h s ạ c h n h ờ x ử l ý r i ê n g r ẽ vớia m m on i u m a c e t a t e 4 M v à c ồ n 1 0 0 % đ ể l o ạ i b ỏ m ồ i v à c á c n u c l e o t i t d−thừa sauphảnứng.SauđókếttủathusảnphẩmPCRvàhoàtanvớiTEđểdùnglàmk h u ô n để giảitrìnhtự.XácđịnhtrìnhtựADNđ−ợctiếnhànhtheoProtocolsửdụngbộkitxác địnhtrìnhtựBigdyecủaAppliedBiosystems.
Mẫusequencing:2àl(NOS),3àl(CaMV35S),2,5àl(Bt)H2Odedio nkhửtrùng:vừađủthểthíchcuốicùngl::17ã17::l
- Bổsung65àlethanol95%,dốcốngng−ợclại,nhẹnhàngvàgiữởnhiệtđộphòn g15phót.
- Lytâm10.000vòng/ phúttrong20phút,sauđólậptứcloạibỏlớpdịchtrên,g i ữ lạitủa.Rửatủabằngetha nol70%vàđểkhôtựnhiênhoặccôchânkhông.
ứngdụngtinsinhhọcđểlậpbảnđồchỉthịphântửcácgencóliênquan đếnbệnhđạoônởlúaDựchiêmvàtínhtrạngkhánghạnởlúaLC93-1
HaigiốnglúaDựchiêmvàCR203đãđ−ợclaivớinhauđểtạocâylaiF1,câylaiF1tựthụđểt ạ o h ạtF2.150h ạ t F2đãđ−ợctrồngđểthumẫutáchchiếtADNv à giáphảnứngbệnh(kháng/ nhiễmbệnh).
Cáccâylúabố,mẹvàF2đ−ợcbốtríthínghiệmđểđánhgiáphảnứngbệnhvàovụ Đôngxuânnăm2006với3lầnnhắclại.PhảnứngbệnhcủamỗicâylúabốmẹvàF2 đượcđánhgiátheothangđ i ể m c ủ a IRRItừmứckhángđếnnhiễmbệnhtươngứ n g vớithangđi ểmtừ0đến9.
Lá4tuầntuổicủacâylúabốmẹvàF2đãđ−ợcthuđểtáchchiếtADN.ADNcủalálúađ−ợct á c h chiếtbằngph−ơngphápsửdụngCTABcủaMurrayvàThompson(1980).
NhậndạngADNcủalúađ−ợct i ế n hànht h e o ph−ơngphápPCRs ử dụngm ồ i SSRcủaMcCo uchvàcs.(2002).
Dữliệuvềkiểugen(nhậndạngADN)vàkiểuhình(phảnứngbệnh)đ−ợcsửdụngđểxâydựngbản đồliênkếtditruyềnvàpháthiệnQTL(vịtríchứagentrênnhiễmsắct h ể ) ChươngtrìnhMAPM AKER/
EXPver3.0(Lander&CS,1987)đ−ợcsửdụngđểxâydựngbảnđồliênk ế t củacácchỉthịS S R tr ênnhiễmsắcthểlúa,khoảngcáchgiữacácchỉthịSSRđ−ợctínhbằngđơnvịcentimorgan(cM). Cácnhómliênkếtchỉt h ị SSRvàvịtrícủanótrênnhiễmsắcthểlúađ−ợcxácđịnhdựavàobảnđ ồliênkếtcủ a cácchỉthịSSRởlúa(McCouch&CS,2002).
ChươngtrìnhMAPMAKER/QTLver.1.1(Lincoln&CS,1993)đượcsửdụngđểxác địnhQTLquiđịnhtínhkhángđạoônởlúa.ĐểtìmQTL,nhữngQTLđãđ−ợcxác đinhởnhữngvùngcóchỉsốLOD(log-likelihood)lớnhơn2.0.
1vàKhangdân18đãđ−ợclaivớinhauđểtạocây laiF1,cây laiF1tựthụđểtạohạtF2.150hạtF2đ ãđ−ợctrồngđểkiểmtratínhchịuhạnvàthum ẫ u táchđểchiếtADN.
Cáccâylúabố,mẹvàF2đ−ợcbốtríthínghiệmđểđánhgiáchịuhạnvàovụĐôngxuânnăm200 6với3lầnnhắclại.Biểuhiệncủalákhibịtạokhôcủamỗicâylúabốm ẹ vàF2đ−ợcghinhậnv àđánhgiátheothangđiểmcủaIRRItừmức0đến9.Cây lúabố,mẹvàF2ởgiaiđoạn65ngàyt uổiđãbịtạođiềukiệnkhôhạnbằngcáchrúth ế t nuớcvàđểđấtkhô,sau1 t u ầ n ( 7 ngày)b ắ t đ ầ u ghinhậnsựbiếnđổicủal á vàtheodõisốngàylábịcuốnhoàntoàncủatừngcâyF2.
PhântíchADN và PhântíchADN vàPhântích dữliệu :giống:giốngnhnh−−lậpbảnlậpbảnđồgenkhángbệnhđạo ônởlúaDựchiêm.
Máymócthiếtbị………………………………………………… 57Ch−ơng3:kếtquảvàthảoluận ……………………………… 59 3.1 kếtquảthuthậpthôngtinvềsinhvậtbiếnđổigen… 59 3.1.1 Thôngtinvềmộtsốcâytrồngbiếnđổigen ………………………… 59 3.1.1.1.Đậutươngbiếnđổigen …………………………………………… 59 3.1.1.2.Cácdòngngôbiếnđổigen ………………………………………… 65 3.1.1.3 DòngcàchuachuyểngenFLAVRSAVR TM
MộtsốdòngBông(GossypiumhirsutumL)chuyểngen
- Tínhtrạng:Khángthuốctrừc ỏ Sulfonylurea,đặcbiệtlàtriasulfuronv à metsulfuron- methyl.
- Ph−ơngphápbiếnnạp:Chuyểng e n giántiếpv à o câythôngq u aAgrobacteriumtumefaci ens
- Mụcđíchsửdụng:sảnphẩmbôngchosợi,hạtvàbộtđểlàmthứcăngiasúc,dầut ừ hạtlàmthứ c¨nchoconng−êi.
N¨mphãngt hÝ ch rangoàimô itr−êng
51Ađãđ−ợcpháttriểnnhờkĩthuậttáitổhợpADNđểđ−agenALSchốngchịuSulfonylurea,gen n à y mãhoáenzymacetolactatesynthase(ALS).EnzymA L S đãsảnsinhtrongcácdòngbôngchuyểngennàygiúpnóc ó khản ă n g chốngc h ị u đ−ợcthuốctrừcỏSulfonylurea.GenALSđãsửdụngtrongdòngbông19-
51Alàcấut r ú c genchimericđ−ợckếthợpgiữahaigenA L S khácnhaum à c ả h a i gennàym ã h oácácvùngnhạycảmvớithuốctrừcỏcủaALS(MazurvàCS,1987).Genchimeric
HrAđ−ợcchuyểnvàotếbàocủacâybôngnhờAgrobacteriumtumefaciens.Dòngbôngđãsửdụ ngđểpháttriểndòng19-51AlàtừdòngCoker312.
RB pUC19P-ALS chimericS4HrA T-ALS pUC19 LB
Genchuyển Promoter Terminator Ph−ơngphápx á c định
Genals(acetolactatesynthase)cãn guồngốctừthểkhảmcủa2g e n AH
- Mụcđíchsửdụng:Sảnphẩmbôngchosợi,hạtvàbộtđểlàmthứcăngiasúc,dầut ừ hạtlàmthứ c¨nchoconng−êi.
236(Gossypiumhirsutum)thôngquasựbiếnđổidit r u y ề n c ủ a dòngbôngAcalaGC510(B69 0)đểkhángs âu bọthuộcbộcánhvẩy.Dòngmớin à y tạ o raproteinCry1Fcónguồngốctừchủn gBacillusthuringiensis.Aizawai.CácDelta- endotoxinproteintạor a genCry1Fhoạtđộngnhờsựl i ê n kếtc ó c h ọ n lọcvớithụquanđặchiệ uở biểumôruộtgiữacủacá c loài sâunhạycảm Khiấu trùngcủabộcán h v ẩy ă n phảiCry1Ft hìbị
101 chếtvàhoạttínhđặchiệucủanócóthểthamgiatrựctiếpvàovịtríliênkếtđặchiệuở c á c côntr ùngđích.Khôngc ó v ị t r í l i ê n k ế t đốivớicácdelta- endotoxinc ủ a B thuringensistrênbềmặttếbàoruộtcủađộngvậtcóvú,vìvậyđộngvậtnuôivà conngườikhôngnhạycảmđốivớicácproteinnày.
- Mụcđíchsửdụng:SảnphẩmtiêudùngchoconngườivàgiasúcThôngti nvềcôngty:AventisCropScience(RhonePoulencInc.)Thôngtinliênq uanđếnviệcsửdụngsảnphẩmchuyểngennày:
N¨mphãngt hÝ chrangoài môitr−ờng
Thựcphẩmvà/ hoặcThứcăngia súc Thựcphẩm Thứcăngi asóc
Cảidầu(Brassicanapus)đ−ợctrồngth−ơngphẩmở50n−ớcvớitổngsảnl−ợng đạttrên4 0 t r i ệ u t ấ n C á c nướcs ả n xuấtCảidầuchủyếuvàonăm2000làTrungQuốc,C an ad a,ấnđộ,Đức,Pháp,Úc,cvàMỹ.Cảid ầ u đ−ợct r ồ n g đểlấy hạt,cá c hạt đ−ợcdùnglàmnguyênliệuchínhtrongdầuthựcvậtvàcũngđ−ợcsửdụnglàmthức ăngiasúc.ThựcphẩmchủyếusửdụngtừcảidầuởBắcMỹvàChâu Âulàdầuăn.Dầucảidầucóthểđượcsửdụngđểtrộnxalát,đểnấunướnghaytrộnlẫnvớicácloại d ầ u thựcvậtkháctrongquátrìnhsảnxuấtbơ,dầurán,salát,nấun−ớng.Bộtxaycủacảidầu,một sảnphẩmphụcủaquátrìnhsảnxuấtdầuănđ−ợcbổsungtheonhữngtỷlệnhấtđịnhvàotrongthứ cănchănnuôi.
5)đ−ợcpháttriểnđểchophépsửdụngthuốctrừcỏoxynil,ioxynilvàbromoxynilkiểmsoátcỏdại. Bromoxynilrấthiệuquả đốivớiloạicỏcótánlárộng,mànóthườngcóởvùngtrồngCảidầuvàkhitriểnkhaidòngcảidầu chuyểngenkhángbromoxynilsẽchophépkiểm soátcỏdạimà không ảnhhưởngđếncâytrồng.Oxy-235chuyểngenc h ứ a 1 bảnsaoc ủ a genb x n được tácht ừ vikhuẩnKlebsiellapneumoniae(sub.spozaenae),gennàym ã hoáenzymnitrilazamà enzymnàycókhảnăngthuỷphânthuốctrừcỏo x y n i l thànhc á c hợpc h ấ t khôngđộc.Sựbiể uhiệnchínhcủagenbxnđ−ợcđiềukhiểnbởiCaMV35Scủaviruskhảmsúplơ(CaMV)vàhàml
−ợngcủaenzymnitrilazađãđ−ợcxácđịnhtrongm ô lá(1000ng/ mgproteintổngsố)vàmôhạt(35gal pha-1- antitripsintrong1 l í t sữa=1/5nhucầuđiềutrịcho1bệnhnhân/ năm.Tuynhiên,vàotháng6 năm2003,côngt y nàyđãphảit ừ bỏ côngtrìnhdochiphíquátốnkémchov i ệ c t i n h c h ế proteint ừ sữ acõu.
Khángthểđộngvậtc ó phảnứngquám ẫ n c ả m nh−ngkhángth ểng−ờiđ−ợctổnghợptừchuộtthìkhông.
Khángthểđơnd òng Cácloạivaccineđ−ợctạoranh−vaccineviêmganB.
Năm1998,1 báoc á o chorằng,s ữ a d ê c ó chứa1 loạiprotein giốngvớiproteincủakýsinhtrùngsốrét,vìvậysữanàyc ó thểđ−ợ cdùngnh−mộtloạivaccinechốngbệnhsốtrét.
Bò Lactoferin loạiproteinnàygiúpconvậtnonhấpthụFe 2+ ,cótácdụngchốngnhi ễmkhuẩn,chốngthiếumáu,chốngviêmkhớp.
Bảng19:Giámộtsốsảnphẩmthuốc đ−ợctạorabởicôngty Anima‘ lPharming’
TPA(tissuePlasminogenactivator,điềutrịđôngmáu) Dê 75.000U SD
Cõu,chu ột,dê 75.000USD HumanProteinC,chốngđôngmáu,điềutrịđôngmáu Lợn 1.000.000USD
−ợc Điềutrịxơnangvàkhíthũng ChấtứcchếProteazavàantithrombinIII Điềutrịbệnhdovirut 7khángthểkhácnhau Khángthểđơnclon Sảnxuấtvacxin
NhântốVIII,vànhântốIX Điềutrịbệnh−achảymáu ProteinCởng−ời Điềutrịchứnghuyếtkhối Chấtchốngđôngmáu3 Điềutrịchứnghuyếtkhối Acidglutamicdecarboxylase Điềutrịbệnhđáitháođườngtype1
Cừu Hoocmonsinhtr−ởng Sinhtr−ởngnhanh(CSIRO)
Khángbệnh Khángthểđơndòng Điềutrịđaxơcứng Antitrypin,nhântốIX,VIII,Fi
Gensảnxuấtkeratintrongnangl ông Thayđổiđặctínhlôngnh−độbóngvàđộd à i c ủalông,
Insullin(typeI) Tăngsảnl−ợnglông(SARDI)
MàngbaovirutVisna Giảmbệnhlýcủabệnhviêmnão,viêmphổi,viê mkhíp(Clement,1994) PrP
Lactoferrin Làmkhángsinhtựnhiênvàsửdụngtrongphẫut huậthìnhvành Lysostaphin Khángkhuẩnđểngănngừachứngviêmvúở bò
CollagenI,CollagenII Thaythếmô,điềutrịbệnhviêmkhớpm ã n tín ht¨ngdÇn
Lactoferrin ĐiềutrịtácđộngnhẹcủaGI,điềutrịlâynhiễmc hứngviêmkhớp Khángthểđơnclon Sảnxuấtnhữngvacxinkhác
Ch−abiết Tăngchấtl−ợngsữavàgiảmtỷlệdịứngở ng−ờ iuèngs÷a Lactoglobulin Tăngsựsảnxuẩtproteintrongsữa
Hoocmonsinhtr−ởnglợnd−ớis ựđiềukhiểncủametallathionine Sinhtr−ởngnhanh
Insulin(typeI) Sinhtr−ởngnhanh a-lactalbuminbò Sinhtr−ởngnhanh
PhytasecủaE.coli Tậndụngl−ợngPhyasecủalợnvìvậykhônglãn gphiPhospho
Ch−abiết Tăngkhảnăngkhángbệnh a(1,3)galactosyltransferase Tạokhángnguyênbềmặt
Chuét Đ−aLysostaphinvàotrongt u y ế n vú Tránhđ−ợcbệnhkhuẩntụcầu
Stearoyl-CoAdesaturase Tăngthànhphầnchấtbéotrongsữavàcân đốihàml−ợngacidbéo
GenIsocitratelyasaevàm a l a t e synthasetừE.coli Đ−achutrìnhGlyoxylatevàođộngvậtcóvúc hophéptổnghợpGlucotừacetate
Erythropoieten(EPO)ởng−ời ĐiềutrịbệnhPaget
Dismutaseperoxitngoạibào,int erleukinởng−ời Chữabệnhthiếumáu,ungth−máu
Cáchép Hoocmonsinhtr−ởng Sinhtr−ởngnhanh Cávàng Chuỗipeptidchốngđông Chốngđôngmáu
Cáhồibạ c Hoocmonsinhtr−ởngcủacáhồit rắng Sinhtr−ởngnhanh
Hoocmonsinhtr−ởngcủacáhồ itrắng,promoterAFPcủacánh eo Sinhtr−ởngnhanh
Cáhồi chÊm hồng GenkhángGnRH KhángGnRH
Plasmidchứagenmetallothione incáhồitrắng,g e n acetyltranfe rasecủavikhuẩn Khôngrõ
Cáhồng Hócmônsinhtr−ởngcủacát r ắ m cỏ Sinhtr−ởngnhanh
CárôphiH ornorum Hoocmonsinhtr−ởngcủacáhồiđ ỏ Sinhtr−ởngnhanh
Hoocmonsinhtr−ởngcủacáhồiđ ốmđen,promoter#-actin Sinhtr−ởngnhanh
Hoocmonsinhtr−ởngcủacáhồ itrắng,promoterAFPcủacá nh eo Sinhtr−ởngnhanh
Thôngtinvềcácgenđ−ợcchuyểnvàotrongmộtsốcâytrồng
Khảnăngchốngchịuthuốctrừcỏđãtrởthànhđặcđiểmquantrọngnhấtsauđól à khảnăngc hốnglạicôntrùng.Cácgiốngcâytrồngbiếnđổigenchốngchịuthuốctrừcỏphổbiếnnhấtlàchốngc hịuglyphosatevàglufosinate.H a i l o ạ i chấtthuốct r ừ c ỏ nàyrấthữuíchtrongviệckiểmsoátcỏ dạivàítảnhh−ởngtrựctiếplênvậtnuôicũngnh−khôngtổnhạilâudài,chúngcóhiệuquảcaonhấ tvàantoànnhấttrongsốnhữnghoáchấtdùngtrongnôngnghiệp.Đ ặ c tínhchốngc h ị u thuố ct r ừ c ỏ th−ờngđ−ợcchuyểnvàocáccâytrồngnh−đ ậ ut−ơng,c ả i d ầ u vàmộtsốgiốngngô. KhảnăngchốnglạicôntrùngnhờđộctốcủavikhuẩnBt(Bacillusthuringiensis)làmộtđặctính đãđ−ợcchuyểnv à o nhiềul o ạ i c â y trồngnh−ngô,bông,k h o a i t â y V í dụdòngngôchuyể ngenMON80100đ−ợcbiếnđổiditruyềnđểkhángs â u đụcthânngôChâu Âu(ECB)bằngcáchtạorathuốctrừsâucủachínhnó.Dòngngônàyđ−ợcpháttriểnnhờchuyểng e nC r y 1 A ( b ) m àđãđ−ợcphânl ậ p t ừ vikhuẩnđ ấ tBtv à odòngn g ô ( H i -
I I x FRB73)nhờph−ơngphápbiếnnạpbằnggiatốchạt(súngb ắ n gen).Haycácdòngbông31807 và31808đãđ−ợcbiếnđổiditruyềnđểkhánglạisựtấncôngcủacácloạicôntrùngmàchủy ếu l à cô ntrùngthuộcbộcánhv ảy ởbôngvàchốngch ịu thuốctrừcỏthuộchọOxynilgồmcóbromoxynilv àioxynil.Nhữngdòngbôngchuyểngennàyc h ứ a genbxn– làgenchốngchịuoxynilvàgenCryIA(c)từvikhuẩnBacillusthuringiensismãhoáchoproteinCr yIA(c)kiểmsoátcôntrùng.Nhữnggennàyđ−ợc đ−avàohệgencủabôngthôngquavikhuẩnAgrobacterium.
Bảng21:Mộtsốloạicâytrồngbiếnđổigenđang đ−ợcth−ơngm ạ i hoá
Bông Khángcôntrùng Đuđủ Khángvius Đậut−ơng Chốngchịuchấtdiệtcỏ Đậut−ơng Hàml−ợngacidoleiccao
Cácphântíchđ ể xácđ ị n h cácg e n chuyểnchủyếudựavàocácph−ơngphápdựatrêncơs ởADN.Hơn40genđãđ−ợcsửdụngđểtạoracácgiốngcâytrồngchuyểngen.Genchuyểnxuấth i ệ n nhiềunhấtl ànptIIc ónguồngốct ừ g e n nhảycủaE.coli.G e n n à y c ó khảnăngkhángvớicáck hángsinhaminoglycosideđãchọnl ọ c Trườnghợpm à genn p t I I chịus ự điềukhiểncủacácth ànhtốditruyềnc ó nguồngốct ừ vikhuẩnthìnókhôngbiểuhiệnt r o n g cây.Ng−ợcl ạ i , nếun p t I
.CácgenCrycónguồngốctừBacillusthuringiensisxuấthiệntrongcâytrồngchuyểngennhiềut hứ2 saunptII.T ấ t c ả cácg e nCryđ ề ub i ể u hiệntrongthểnhận.Ngườit a đãt ì m t h ấ y trong 20s ả n phẩmchuyểngen,trongđógenxuấthiệnnhiềunhấtl àCryIA(b)vàCry3A.TrìnhtựgenC ryIA(b)đãchuyểnvàongôBt11,ngô176,Mon809vàMon810c h o thấychúngcótrìnhtựkhác nhau.Ngoàira,genbarvàCP4-EPSPSđ−ợctìmthấytrong12và15câytrồngchuyểngen.
Bảng22:Thôngtinvềcácgenđãchuyểnvàocâytrồngbiếnđổigen đangđ−ợcth−ơngmạihoá
Gen Nguồngốc Tầnsốxuấthiệnc ủ a mỗigen aad E.coli 7
ALS Arabidopsisthaliana 1 bar Streptomyceshygroscopicus 15 barnase Bacillusamyloquefaciens 8 barstar Bacillusamyloquefaciens 6
S4-HrA Nicotianatabacum 1 nptII E.coli 29(+7part.*)
GmFAD2-1 Glycinemax 1 gox Achromobactersp.StrainLBAA 7
GUS E.coli 5 nitrilase Klebsiellaozaenae 5 mEPSPS Zeamays 1 nos Agrobacteriumt u m e f a c i e n s 1
PVYcp Virútgâybệnhởkhoaitây(chủngY) 1 sam-k E.colibacteriophageT3 1 tetR E.coli 1 dam E.coli 1 dapA Corynebacterium 1 gentR E.coli 1
ThiếtkếmồiPCR,thiếtkếmẫudòđểnhậnbiếtmộtsố genphổbiếnđ−ợcchuyểnvàocâytrồng ………………… 3.3 SửdụngkỹthuậtP C R vớicácmồiđặchiệuđểnhậnbiếtcâ ytrồngbiếnđổigen ……………………………………… 153156 3.3.1.KếtquảtáchchiếtADN ………………… ………………………… 156 3 Kếtquảnhậnbiếtcâytrồngbiếnđổigenvàsảnphẩmthứcăngia súcnhờphảnứngPCRthôngth−ờng ………………… ……………… 158 3.1 KếtquảnhậnbiếtđoạnpromoterCaMV35S
KếtquảnhậnbiếtđoạnterminatorNOS ………………………… 160 3.3.2.3 Kếtquảpháthiệnmộtsốđoạnđặctr−ngtronggenCryIA(b)
CặpmồiNOS F /NOS Rkhuếch đạiđoạntrìnhtựdài192bptrênvùngkếtthúcT-
NOS.Đâyc ũ n g l à m ộ t dấuhiệunhậnbiếtgiántiếpsực ó mặtcủag e n chuyểnvìhầuhếtc á c thực v ậ t biếnđổigenđềum a n g đoạnT-NOSnày.Chúngtôiđãsửdụngc ặ p m ồ i NOS F /
NOS Rđể xácđịnhngôvàkhoailangchuyểngennhằmtìmraquytrìnhphảnứngPCRthíchhợpđốivới c ặ p mồinày.VàkếtquảđiệndisảnphẩmPCRt h ể hiệnởhình33chothấy:
NOS R của ngô(A)vàkhoailang(B) MẫuADNcủacâychuyểngen:giếng1-5,8-12(33A),3,4,9,10(33B)
MẫuADNcủacâykhôngchuyểngen:giếng7(33A),1,2,6(33B)M ẫ u đốic hứngd−ơngtính:giếng6(33A),8(33B)
NOS Rvà cácbăngADNrõnét.Khisosánhvớimarkerchuẩn1kbthìcácbăngđềucókíchthước192 bpcũnggiốngnh−mẫud−ơngt í n h chuẩn.Điềuđ ó c h o t h ấ y c á c mẫungôtrongnghiêncứun àyđềulàcácgiốngbiếnđổigencómangđoạnT-NOS(hình33A).
Trong6 giốngkhoailangthìc ó 4 mẫuđól à IP1,IP2,IP3,I P 4 đ ề u chokếtquảdươngtínhgiố ngvớimẫudươngtínhchuẩn,cònhaimẫukhôngbiếnđổigenthuthậpngoàithịtrườngthìchokết quảâmtính.
NOS Rc h o kếtquảkiểmtrakháchínhxác,ngoài3m ẫ u chokếtquảd−ơngtínhgiốngvớikếtquảc ủ a c ặ p mồi35S1/35S2,nócònchok ế t q u ả d−ơngt í n h vớim ẫ u IP1cũngl à mẫukhoailangbiế nđổigendophòngthínghiệmSinhhọcPhântửcungcấp(hình33B).
Córấtnhiềucâytrồngđ−ợcchuyểngenkhángsâu, màthườnglàgenBt.C h o nênđãcónhữngcâytrồngchuyểngenđượcgắnliềnvớitêncủa gennày,vídụ nhưngôBt, bôngBt Người ta thấyrằnggenCryIA(b)đã được chuyểnvàorấtnh iều loạicâytrồngnh−cácgiốnglúa,ngôvàcácgiốngđậut−ơng.Vìvậy c h ú n g tôiđãứngdụngkỹthuậtPCRđểnhậnbiếtgenCryIA(b)nàytrongcácm ẫ u câyt hínghiệm.
Trongn g h i ê n cứun à y , chúngtôisửdụngr i ê n g r ẽ 2 c ặ p m ồ i đól à C D P K - cry03/CDPK- cry04k h u ế c h đạiđoạn211bpđểpháthiệngenCryIA(b)vàHS01/Cry-
CR01khuếchđạiđoạntrìnhtựdài194bptrêngenCryIA(b).GenCrynàythườngđượcchuyểnvào cácgiốngngôvàbôngbiếnđổigenđểkhángsâuđụcthân.
VớicặpmồiCDPK-cry03/CDPK-cry04:Trongtổngsố23mẫuthửphảnứng(3mẫu đốichứng( m ẫ u H2O,m ẫ u âmtínhchuẩn,mẫuADNplasmidpART27),11mẫucủa4 giốngngôch uyểngenvà9 mẫut h ứ c ă n giasúcchứaGMOs)t h ì c ó 7 m ẫ u x u ấ t hiệnbăngkíchth−ớc211bpm ongđợi(3mẫucủagiốngngôbiếnđổigenvà4mẫuthứcăng i a súc.TrongkhicácmẫuH 2 Ovàmẫu âmtínhthìkhôngcóbăngsảnphẩmPCR.
SảnphẩmPCRvớitrìnhtự211bpđãđ−ợckhuếchđạiđoạnliênhợptừvịtrí73bptrong vùngp r o m o t e r củagenCryIA(b)vàt ạ i vịt r í 138bptrêngenc ấ u trúctrongc á c s ả n phẩmbi ếnđổigen.
Từk ế t quảnàychúngta c ó thểkhẳngđịnhrằnggiốngngôCG1,CG2,CG3làcácgiốngngô chuyểngenkhángsâuvàtrongsố7 mẫuthứcă n g i a súcthuthậptrênthịtr−ờngcóchứaGMOthì4 mẫulàchứasảnphẩmcủacâytrồngchuyểngenkhángs â u Quađócũ n g chothấyc ặp mồiCD PK-cry03/CDPK- cry04cótín h nhạyvàcó khảnăngnhậnbiếtđốivớicả2vùnggen:gencấutrúcvàgenđiềuhòa,chop hÐpkiÓmtra đoạnliênhợpcủa2vùnggennàytrongngôbiếnđổigenvớichutrìnhPCRthíchhợp( h ì n h 34A).
Hình3 4 : K ế t q u ả s ả n p h ẩ m P C R v ớ i c ặ p m ồ i C D P K - c r y 0 3 / C D P K - c r y 0 4 n h ậ n biếtngôBt,thứcăngiasúccóchứaGMCmanggenBt(A)vàcặpmồiHS0 1/Cry-CR01nhậnbiếtbôngBt(B)
Mẫuâmtính:giếng2(34A);Mẫuđốichứngdươngtính:giếng3(34A)MẫuH 2 O(k hôngcóADN):giếng1(34A),8(34B)
CR01:Khichạyphảnứn gP C R k i ể m t r a v ớ i cácgiốngbôngv à ngôđểnhậnbiếtđoạn194bptrên genCryIA(b)thìchỉcómẫubôngchokếtquảd−ơngtính(hình34B).
Từđóchothấy:ngôvàbôngcùngđ−ợcchuyểngenCryIA(b)nh−ngvớicáccặpm ồ i k h á c n h a u t h ì k h u ế c h đ ạ i c á c t r ì n h t ự k h á c n h a u v à c h o kếtq u ả phảnứ n g PCR khácnhau.Nguyênnhânlàdomỗiloạivectơthiếtkếlàkhácnhaumặcdùch ú n g cùn gmangmộtloạigen.QuakếtquảnàytacóthểkếtluậnrằngcặpmồiHS01/Cry- CR01đặchiệuvớicácgiốngbôngchuyểngenvàcóthểsửdụngcặpm ồ i nàyđểnhận biếtbôngbiếnđổigen.
3.3.2.4 Kếtquảnhậnbiếtmộttrongsốcácgenkhángthuốctrừcỏ(PAT)củac â y tr ồngbiếnđổigen
GenPhosphinothricin-N- acetyltransferase(PAT)làmộttrongnhữngg e n khángthuốctrừcỏđãđ−ợcchuyểnvàomộtsốcây trồngnhưngôvàđậutương.Córấtnhiềuc ặ p mồiđãđượcthiếtkếđểnhậnbiếtcácvùngtrìnhtựkh ácnhaucủagennàyvàtrongnghiêncứunày,chúngtôisửdụngcặpmồiPA01/
CM01khuếchđạitrìnhtự437bpt r ê n vùnggencấutrúccủag enPAT (ởmẫungômanggenPAT
CM03đểkhuếchđạiđoạntrìnhtựdài231bpt r ê n genPATởcácmẫungôthínghiệm. Đểkhuếchđại2đoạntrìnhtựtrêncủagenPAT,chúngtôiđãsửdụngcácmẫuADNngôtác hchiếttừlácóphảnứngd−ơngtínhvớicặpmồi35S1/35S2.
CM01:c ó sựxuấthiệncủa4 băngsảnphẩmPCR(hình35A).Khisosánhv ớ i t h a n g markerA D
N 1 kbt h ấ y có2 băngmongđợikíchthước437bp(giếng4và22-hình35A)- haibăngnàyxuấthiệnrõvàsắcnéthơnsovới2băngsảnphẩmPCRcònlại(1băngcủamẫulángô GMvà1băngcủamẫuthứcăngias ú c chứaGMOs).H a i b ă n g s ả n phẩmP C R c ò n l ạ i rấtm ờ :
1 băngkíchth−ớckhoảng506bpvà1băngkíchth−ớckhoảngtrên800bp. ĐểkhẳngđịnhkếtquảnhậnbiếtgenPATmộtcáchchínhxác,chúngtôi đãtiếnhànhPCRnhậnbiếtgenPATvớimẫuADNtáchchiếttừhạtngôGMmang genP
AT,lácủacácgiốngngôchuyểngenởtrênvàcácmẫuthứcăngiasúcGM.Kếtquảchothấ y2mẫuADNtáchchiếttừhạtngôGMmanggenPATc ósựxuấthiệncủa2băngkíchth−ớ c437bpnh−mongđợi(giếng1,2– hình3 5 B ) TrongkhitấtcảcácmẫuthínghiệmkháckhôngthấybăngsảnphẩmPCRnà y
Từ2kếtquảtrênchothấy:cóthểcónhữngkếtquảd−ơngtínhsai– nguyênn h ân cóthểdotrongquátrìnhtáchchiếtADNbịgẫy.Ngoàira,doPCRlàmộtk i ể u phảnứngenzymnêncómộtsốnhântốảnhhưởng,tácđộngđếnphảnứngen zy m n àythìcũngcóthểgâynênkếtquảPCRsai.Cácnhântốnàybaogồm chuẩnbịmẫuADN,mồi,cácthànhphầnkháccủaphảnứngPCR…khôngđ−ợc đồngđều(dokỹthuậtthaotác)vàsựtồntạicủanhântốứcchếtrongmẫuADNt ổ n g số.K ếtquảâmtínhsaicũngcóthểlàdocácnhântốtrên.
CácphảnứngPCRsainàycóthểđ−ợcgiảmtớimứcthấpnhấtnếutasửd ụ n g các GMOschuẩnnh−làmộttiêuchuẩnsosánhd−ơngtính.VàmẫuhạtngôGMmanggen
PATtrongthínghiệmnàycóthểđ−ợcxemnh−làmẫuG M O s chuẩn,đểđảmbảokỹth uậtPCRởtrênlàphảnứngPCRchínhxác,cót h ể xácđịnhđ−ợcgenPATvớitrìnhtự43 7bpsửdụngcặpmồiPA01/CM01.
CM03(C)pháthiệngenPATcủacácmẫungô,thứcăngiasúc Ngôchuyểngen:giếng1-13(35A);3-5(35B);1-8(35C)
MarkerchuÈn1kb:giÕng14(35A);12(35B);10(35C)M É u © mtÝnh:giÕng16(35A);11(35B);9(35C)
CM03:c ó sựxuấthiệnc ủ a 3 băngk í c h thước2 3 1 b p v à 3 mẫuthínghiệmnàyđềulàgiốngngôCG3(h×nh35C). ĐiềuđóchứngtỏgiốngngôCG3làgiốngngômangcảgenBtkhángsâuvàgenPAT khángthuốctrừcỏ.Nh− vậy,chúngtôiđã:
- Pháthiệnđ−ợcmộtsốloạithứcăngiasúcth u thập trênthịtr−ờngcóchứasảnphẩmcủac âytrồngbiếnđổigen,cụthểlàsảnphẩmcủacâytrồngcóchứagenCryIA(b),genPAT,Ca
Kếtquảnhậnbiếtcâytrồngbiếnđổigennhờphảnứngmultiplex-PCR vàRealtime-PCR ………………… ……………………………………… 165 1.PháthiệnGMCsnhờphảnứngmultiplex-PCR
CặpmồiđểkhuếchđạivùnggenCryIA(b)tổnghợpcótrongngô176,BT11vàMon810đã đ−ợcthiếtkế(bảng3,cặpmồi1Fvà1R).Trìnhtựt−ơngứngvớigenBtcótrongdòng176vàBT11đ ượcsửdụngđểthiếtkế.Hình36Achothấyđoạnkhuếchđạic ó kíchthước204bp,đoạnnàykhông chỉcótrongADNđíchc ủ a c á c dòng176v à BT11,m à c ò n c ó trongc ả dòngMon810.Từđótr ìnhtựsaucùngkhôngpháthiện được,đơnvịsaochéptươngứngđượcgiảitrìnhtự(Hình37).TrìnhtựđơnvịsaochépADNdịchmã thành68aminoaxitđầutiêncủapolypeptideCryIA(b)tựnhiên.
TrìnhtựgenPATtổnghợpcótrongdòngT25,làdòngngôkhángthuốctrừcỏammoniumglufosina te,đ−ợcpháthiệnnhờcặpmồi2F/R.C ặ p mồin à y khuếchđại đoạn262bptươngứngvớigenchuyểnđangquantâm(hình36B).Bốnmồiđãmiêutảở trênđượcd ùngđểpháthiệnđồngthờigenCryIA(b)vàPATtrongphảnứngmu lti p lex PCR(hình36C),với 1%ADNcủaMon810và1%ADNcủaT25.ởnồngđộ0,1%ADNchuyểngencũngđãchophả nứngd−ơngtínhmộtcáchrõràng(hình36Avà36B).
Phảnứngmultiplex PCRnàyđượctốiưuhoákếthợpvới4 mồiở cácnồngđộkhácnhau( 1F/Rởnồngđộ0,25M,2Fởnồngđộ0,067Mvà2Rởnồngđộ
0,125M),bổsungthêm3mMMgCl2vàủởnhiệtđộ58 0 C.Độnhạycủaphảnứnglà0,5%.Nh−vậy chỉmộtphảnứnglàđủđểxácđịnhbấtkìdòngnàotrong4dòngngôchuyểngen(176,BT11,Mon810vàT25)màcóthểthấytrongcáchạtth−ơngmại.
1,0.5và1%làtỷlệmẫuADNchuyểngentrong50ngADNtổngsốcủacácdòngchuyểngenMon810,176 ,Bt11vàT25
Tr−ớcđâycá c mồin h ậ n b i ế t n g ôBtđ ãđ−ợcc ô n g b ố, sửd ụ n g PCRđ ơ n [ 6 9 ,
88,123].Trongnghiên cứucủachú ng tôi,khicácđiềukiệnPCRđ−ợccảitiến t h ì m ộ t t ro n g n h ữ n g cặpm ồ i m à ủvớivùn gm ã h oá genCryIA(b)
20bpm ong m u ố n T r o n g n g h i ê n c ứ u n à y , c h ú n g t ô i sửd ụ n g c ặ p m ồ i m ớ i p h á t h i ệ n vùngm ã h o á g e nC r y I A ( b ) đ ãđ−ợcn ó i ở trênc ó mặtt r o n g d ò n g n g ô c h u y ể n gen.Bêncạnhđócũngcóthểsửdụngmộtcặpmồikháctrongphảnứngmu lt ipl ex đểphá thiệnsựcómặtcủagenPATtrongcácdòngchuyểngenkhác.G ầ n đâyviệcsửdụng multiplex-
PCRđểpháthiệnvànhậnbiếtcácdòngchuyểng e n t r o n g c á c m ẫ u n g ô đ−ợcđ ề n g h ị b ở i M a t s u o k a v à C s [ 8 9 ] H ọ đ ã s ử d ụ n g multiplexđểxácđ ị n h 5dòngngôch u yể ngenkhácn hau vớiđộnhạy0,5%đ ối vớ i mỗiGMOs.
Chúngtôicũngđãthựch i ệ n phảnứngmultiplexPCRkhácđểpháthiệnchínhx á c v à đồn gthờic á c đoạngenEPSPSvàT-T-
NOS,c ả h a i tươngứngv ớ i đơnv ị dịchm ã củagenđưavàotrongđậutươngchuyểngenRoundu pReadynhờsửdụngcácmồi3F/Rvà4F/
R.Phảnứngkhuếchđạiriêngcácđoạn447bpvà192bp(hình38A).Băngthứbacủađoạn252bpxuấ thiệnthíchhợptrongphảnứngnày.
Hình37:Trìnhtựvàsựchuyểndịchpeptidcủađơnvịsaochépđ−ợckhuếchđạitừcặpmồi1F/ 1Rt−ơngứngvớiđoạngenBtcótrongdòngngôMon810.Trìnhtựcógạch chânt −ơngứngvớicác mồiđãsửdụngđểkhuếchđại Đơnvịsaochépnàyđ−ợcpháthiệnbởimồixuôiT-
NOSvàmồingượcE P S P S (hình38B).Giảitrìnhtựđoạnkhuếchđạicókíchthước252b ptừphứch ợ p (hình38B,băng1)vàtừbăng2(hình38B)đãchocáckếtquảgiốngnhau,c h ú n g tươngứngvới1phầnbảnsaothứ2đãcắtngắncủagenchuyểnởđầu3’c ủ a đơnvịsao chépđầutiên, giốngnhưWindels&CSđãmiêutảtrướcđây[ 14 2] Độnhạycủaphảnứngmultiplexn àylà0,1%.
NOS,đoạnnốigiữagenEPSPSvàC a M V 35Schocáckếtquảchínhxáchơn,bởivìcácđ oạncủađơnvịsaochépgiốngnhaunàyđ−ợckhuếchđạiđồngthời.
Dữ liệu huỳnh quang (Rn) so với các chu kỳ Đ−ờng cong tiêu chuẩn
Các bản sao của đoạn NOS
NOScómặttrongđậut−ơngRoundupReady (A):PhảnứngmultiplexPCR c ủa các đoạnEPSPS vàT-
NOS,tạorac ác băngc ókíchth−ớc447bpvà192bp
(B):Băng 1( 3FR / 4FR) t−ơngứngvớihì nhA; bă ng 2 (3F/4F) sửdụngmồi x uôit ừT-
N OSv à m ồ i ng−ợctừEPSPS nt:MẫuADNkhôngchuyểngen;M:Thangmarker50bp(-):Mẫ uđốichứngkhôngcókhuônADN(mẫunước)
Hình39:RealtimePCRcủađoạnT- NOStừđậutươngRoundupReady,sửdụngĐồthịkhuếchđại(A)vàđườngcongtiêuchuẩn(B)đ ãtạora3000;1000,300và30bảnsaocủađoạnT- NOScótrongđậut−ơngchuyểngenkhisửdụnghệthốngpháthiệnTaqMancho thấy giá trị
NOScótrongADNđậut−ơngRoundupReady,ngôGA21v à cácc â y trồngchuyểng e n k h á c đãđượcthiếtkếđểđịnhlượngrealtimePCR(mồi5Fvà4R,mẫudòP1).Đường congtiêuchuẩnvới100%đậutươngRoundupReadyđãđượcthiếtl ậ p vớih à n g l o ạ t dịchphaloã ngđểthểhiệntừ30-
3000bảnsaocủagenchuyểnvới34ngADNtổngsố(vídụ:30.000bản sao).CảADNcủamẫu đậut ươngchuyểngenvàkhôngchuyểngenđềucónồngđộlà34ng.Đườngcongnàychothấysựtương quan(R 2 )là-0,997vàgiátrịdừnglà -
3,63(hình39).Sốl−ợngAD N c ủ a g e n chuyểnth ấp nhất(30bảns a o, t−ơngứngvới0,1%ADNt ổngsố)đãđ−ợcquansátsau33chukỳ(hình39B).
Vaitilingom& C S [135]thiếtkếcáccặpmồivàmẫudòhuỳnhquangchorealtimeP C R (T aqMan)đốivớig e nEPSPScótrongđậutươngRoundupReadyvàgenCryIA(b)cótrongdòngng ô176.SauđóTrapamann[131]đãđ−aramộtc ặ p mồiv à mộtmẫudòđểxácđịnhsốl−ợngCaMV
35Scótrongđó.Gầnđâycó3báocáomiêut ả việcđịnhlượngđậutươngchuyểngenbằngRealT imePCR,đềxuấtviệckhuếchđạivùngnốicủagenchuyểnv à A D N c ủ a c â y trồng.Phươngpháp c ủ a chúngtôidựavàoviệcđịnhl−ợngđoạnk ết thúcT -
NOS bằngRealTimePCRcóthểđ−ợcsửdụngt h e o cáchchungvàđángt i n c ậ y đểđịnhl−ợngs ự c ó m ặ t củađậuR o u n d u p R e a d y , n g ô GA21vàcáccâytrồngchuyểngenkhácxuấthiện trênthịtr−ờng.
Tuynhiênviệcđịnhl−ợngcácgenchuyểnđ−ợcđ−avàogenomecủangôc ó th ểkhôngđángtincậy.Cácnhànghiêncứucảnhbáorằng:trongmộtprotocolRea lT im e PCR thìsốbản saocủ age nc h u y ể n đ−ợcxác địnhvàđ−ợcphânchiathànhcácbảns aoADNtổngsố,theotỷlệphầntrăm.Việcđịnhl−ợngg e n chuyểncótrongmẫuhạtng ôcóthểkhôngtincậyđ−ợc,dotrongthựctếsốl−ợngb ả n s a o c ủ a genchuyểnphụt h u ộ c v à o c á c t r−ờngh ợ p xuấthiệnt r o n g chúng Vídụ,mộtbảnsaocủaCaMV35
5bảnsaolàtrongdòng176.Hơnnữa,nếucách ạt laith−ơngmạilànửatiếphợp(chỉ mộtdòngthuộcbốmẹchuyểngen)nh−trongd ò n g M o n 8 1 0 [ 1 3 2 ] , c á c h ạ t đ ã t h u h o ạ c h l à h ỗ n h ợ p c ủ a c á c genđ ồ n g hợpt ử ( 2 b ả n saoc ủ a g e n c h u y ể n / g e n o m e l−ỡngb ộ i ) , n ử a t i ế p h ợ p (mộtbảns ao c ủ a g e n c h u y ể n / g e n o m e l−ỡngbội)vàc á c h ạ t k h ô n g c h u y ể n g e n C ũ n g phảichúýđếnnguồn gốccủaADNchuyểngenđốiv ớ i cácđườngcongchuẩn.Vi ệc sửdụngplasmid[128]hoặcADNtừdòngMon810[132]làchínhxáchơnmẫu đốichứngđãchuẩnbịvới dòng176(BộtngôIRMM411,Fluka).Điềucuốicù ng làlợiíchcủaviệcđịnhl−ợngcá cmẫuchỉchứadòng176từđócósựđánh giákhôngđúngvềsốbảnsaogenchuyểncóthểxảyranếucáchạttừcácdòngkhácc ómặttrongmẫu. ĐểđánhgiáchấtlượngcủaADNtrongphảnứngPCRthôngthườnghoặct r o n g đị nhl−ợngRT-
PCR,việckhuếchđạigennộibàonh−lectintrongđậuhoặczei ntrongngôđãđ−ợcđềxuấ t[69,70,80,94,123,142].Ph−ơngphápcóthểk h ô n g thuậnlợinếupháthiệnthấysựcóm ặtcủacácchấtứcchếtrongmẫuADNbởivìgennộibàocóthểđ−ợcpháthiệnngaycảkhis ựkhuếchđạiđãbịứcc h ế mộtphần,trongkhiđóhàml−ợnggenchuyểncóthểgiảm.Nóit heocáchkhác,với100ngADNngôtrongốngPCR,thìgầnnh−37.000bảnsaocủabảns a o đơngennộibàocómặtnh−kếtquảkhuếchđại,trongkhiđó37.000bảnsaocủagenchu yểnsẽđ−ợcpháthiệnnếuhàml−ợngđểpháthiệnyêucầulà0,1%.Mộtlựachọnkhácnữal àđểgiảmbớtnồngđộcácmồicủagennộibào.Chẳngh ạn nh−,đãthựchiệnthànhcôngp hảnứngmultiplexđểpháthiệnzeinvàCaMV35S,mồizeinđ−ợcthêmvàoởnồngđộ0,08
M,trongkhiđócácmồichoC a M V 35Sgiữở0,35M(hình40A).Nồngđộcácmồithấ pđểzeinhạnchếsựk h u ếc h đạicủachúng,nếucóchấtứcchế,thìnócóthểbịpháthiện.T heonghiênc ứ u củaMatsuokavàCs[89]đãnghiêncứuđ−ợcmứcđộtăngchậmcủagiớih ạnpháthiệntronggenchuyển.Điềunàycóthểgiảithíchnhờgiảmsựcạnht r a n h giữacá cnhântốgiớihạn.
(B):C á c sảnphẩmkhuếchđạicủag e n E P S P S , m ẫ u chứa0,5%A D N củađậutươngchuyểnge n M:Thangmarker100bp;(-):MẫuđốichứngkhôngcókhuônADN(mẫunước) nt:mẫuADNcủangôkhôngchuyểngen(40A),củađậut−ơngkhôngchuyểngen(40B)
Mộtcáchkhácđểkhẳngđịnhrằngcáckếtquảâ m tínhkhôngphảil à âmtínhsai,mànguyên nhânlàdocácchấtứcchếc ó trongh ỗ n h ợ p m ẫ u A D N c h u y ể n gen(t−ơngứngvớihàml−ợng pháth iện đ−ợc).Nếukhôngpháthiệnđ−ợcgenchuyểnthìc ó thểd o mẫ u AD N ch−atinhsạch. Vídụ3 mẫ u ADNđậutươngkhácnhaumàchokếtquảPCRâmtínhđốivớigenEPSPSđượcphântí chnhờtiếnhànhởhàml−ợnghỗnhợpphảnứngPCRl à 0,5%ADNđ ậ u RoundupReady/ mẫu.Kếtquảhình40BchỉrarằngADNcóthểđ−ợckhuếchđạivàcácmẫucóchứachấtứcchếchok ếtquảâmtính.
Cuốicùngcáchthứbađểđánhgiásựcómặtcủachấtứcchếđ−ợcbổs u n g vàonh−l àđối chứng nộisinhđốivớihỗnhợpphảnứngtươngđương,sốlượngADNchuyểngentừcâytrồngkh ácnhau(vídụthêmADNtừmẫuđậut−ơngchuyển genvào mẫuADN ngô)tươngđươngvới mứcđộ nhạyđãyêucầu. ĐiềunàycũngcósứchútvớiRealTimePCR.TrongmộtthínghiệmADNđậut−ơngchu yểngenvớihàml−ợng0,5%đ−ợcthêmvàohỗn hợpphản ứngvà mẫun g ô chứa1%và0,1%ADNchuyểngenMon810,đ−ợcphântíchđốivớigenE P S P
S bằngRealTimePCR[135].CảhaimẫuchothấygiátrịCt(Chukỳn g−ỡngbanđầu)giố ngnhauởbấtkìng−ỡngđiềukhiểnnàokhikhuếchđạiđốic h ứ n g nộisinh.Hơnnữakhôn gcósựkhácbiệtvềgiátrịCtgiữamẫunghiêncứuvàmẫun−ớc,điềunàychothấyrằngkhô ngcóchấtứcchếtrongphảnứng.Sau đómẫuđ−ợcphântíchđểxácđịnhsốl−ợngCaMV35Snhờsửdụnghệthốngn h ận biếtTa qMan.Cáckếtquảchothấycácgiátrị0,90,04và0,120,02% đốivớimẫungôchứa1%và0,1%GMO,trongkhiđósốlượngướctínhcủaA D N chuyển gentrongđậutươngđãsửdụngnhưđốichứngnộisinhlà0,530,05%(bảng21). ĐồngnhấtmẫutrướckhitáchADNlàmộtđiểmđánglưuý.Đồngnhấtb ộ t làmộtq uátrìnhkhó,đặcbiệtkhimẫulớnkhoảng1kghoặchơnthế.Cómộtcáchđểgiảiquyếtvấ nđềnàylàtáchADNtừmẫunguyênvẹn.Biệnphápnàycóh i ệ u quảnh−ngch−athựctếb ởivìcầnmộtthểtíchđệmchiếtlớn.TrapmannvàC s[131]đãsửdụngmộtprotocolbaogồ mmộtdịchhuyềnphùlỏng,tiếptheol à m đônglạnh,nghiềnvàlặplạinhiềulần,đểchuẩ nbịcácvậtliệuthínghiệm.
(4 0 C)cóthểgiảiquyếtmột phầnvấnđềnày.Sauđóchấtl−ợngADNđ−ợccải thiệnhơn,hỗnhợpbộtkhôđ−ợclấyđ ểchuẩnbịcácvậtliệuthínghiệmchot h ế hệthứba[132]. Đồngnhấtmẫutronghexanelàmộtlựachọnthiếtthựcđốivớihỗnhợpmẫuthôngthường.H ơnnữaviệcthêmmộtdungmôihữucơvàob ộ t c ó mộtthuậnl ợ i đốiv ớ i dầuchiết,làmchoviệcchi ếtADNđ−ợcdễdànghơn.
Trongthínghiệmnày,chúngtôiđãđemphântíchhaimẫungô(1kg)chứa0,5%và0,1%(w/ w)hạtngôMon810.Sauđókíchthíchchúngtrong30phútởbình5lítvới2,5líthexane,dungmôiđ
−ợcloạibỏvàbộtđ−ợclàmkhôquađêmở40 0 C.Mỗimẫu đ−ợctiếnhànhtáchchiếtADN10lần.ADNtổngsốđ−ợcxácđịnhsốl−ợngbằngánhsánghuỳnhq uangvàtrìnhtựCaMV35Sđ−ợcxácđịnhsốl−ợngbằngRealTimePCR[131].Cáckếtquảchot h ấ y nghiêntấtcảcácmẫuđạidiệnđãphântíchđ ề u đ ạ t tớing−ỡngbanđầuởchutrìnhgầnnh−giống nhau.Biếnthiênvềtỷlệ
%thuđ−ợclà24và13,2t−ơngứngvới0,1và0,5%GMOs.Nhữnggiátrịnàylàởgiữanhữnggiátrị đãthuđượcbởiTrapmann[131]khikiểmtracáctiêuchuẩncủađậutươngIRCC.
Ct=chukỳmàánhsánghuỳnhquangđãphátrađạttớing−ỡngbanđầuđãxácđịnhtrongthínghiệ m;SD=độlệchtiêuchuẩn;35S=cácbảnsaocủađoạnđãpháthiệnt h e o đườngcongtiêuchuẩn;
%GMO=Sựđịnhl−ợngGMOtrongmẫu.Đểtínhtoán%nàythìlấy37000genome/
100ngADNngôvà42ngADNđậutươngđãđượcđánhg i á (Genomeđậutươnglà đồnghợptử đố ivớigenchuyển-2x,trongkh i ngôMon810 lànửatiếphợp-
1x).Mẫungôđãđ−ợcchuẩnbịbằngcáchtrộnngôMon810vàbộtngôkhôngchuyểng e n theot ỷ l ệ thíchhợp.ADNt ừ đậut−ơngđ−ợcsửdụngnh−là c h ấ t thêmcũngđ−ợcphântíchnh−cácốngc h−abiếtkhikhuếchđạiđểpháthiện35S.
Cácản h hưởngtiếp theođãđượclàmđểc ả i tiếnphươngphápnhằmpháthiệnvàxácđịnh GMOstrongcáchạtngũcốcvàthựcphẩm,khixétđếncácyêucầuđốivớiv i ệ c thươngm ạ i hoáq uốct ế vàcácquyđịnhvềa n toàn.ở đ â ychúngtôiđãđềxuấtc á c mồimớichophảnứngPCRthô ngth−ờngvàchoRealTimePCRvàthảoluậncácph−ơngphápđ ể điều khiểnchấtl−ợngcủaAD Nvàđồngnhấtcácmẫu bộtmàcó thểc ó lợi.
Quathựct ế t h í nghiệmv à c á c nghiênc ứ u củanhiềut á c giảk h á c , chúngtôithấy:p hươngphápPCRcóđộchínhxáckhácao,cóthểđịnhtínhvàđịnhlượngđượcGMOs.Tuynhiên,đ âylàphươngphápkhôngkinht ế , yêuc ầ u t h i ế t bịhiệnđại,kỹthuậtviêncótaynghềcao.
3.4 Nhậnbiếtcâytrồngchuyểng e n nhờkỹthuậtlaiADN(South ernblot) ĐểnhậnbiếtchínhxácgenngoạilaiCryIA(c)cótrongcáccâyngôchuyểngen,c h ú n g tô itiếnhànhthínghiệmlaiphântửADN.NguyênlýchunglàsửdụngmộtđoạnA D N tươngđồng(m ẫudò)đểlaivớiđoạntươngđồngvớinótheonguyêntắcbổsung.Trongthínghiệmchúngtôiđãtác hgenC r yI A( c) từplasmidpART27đểl à m mẫudò.M ẫ u dòđ−ợcbiếntínhở nhiệtđộ95 0 C,tron g5 phútnhằmphávỡmốiliên kếthydrogiữahaisợiphântửADNđểtạothànhsợiđơn,đánhdấumẫ udòbằngbộkitECL.
Theonhữngnghiêncứutr−ớcđây,cóhaigiảthuyếtchínhvềviệcbổsungmẫudòvàophảnứ nglai,mộtl à : tínhtoánnồngđộADNmẫudòtheod i ệ n tíchmànglaiA D N ,hailà:l−ợngADN mẫudòbổsungvàophảnứngdựavàothểtíchdungdịchlai.Quaquátrìnhthínghiệm,chúngtôinhậ nthấy:nếubổsungnồngđộmẫudòvàodungd ị c h laiquáthấpphéplaicóthểxảyra,nh−ngkhihiệ nphimđểnhậnbiếtbănglaithìkhôngthấyxuấthiện.Mặtkhác,nếunồngđộmẫudòquácaoviệcla iADNtrongdungdịchkhóxảyra.Khiápdụnggiảthuyết1,phảnứngchỉđạtkếtquảnếucho1- 3màngl a i , vàhiệuquảgiảmdầnnếusửdụngtừ3mànglaitrởlên.Ng−ợclại,giảthuyết2đã đượcchúngtôiápdụngvàc ó hiệuquảv ớ i mọitrườngh ợ p Dov ậ y , chúngt ô i đãsửdụnggiảthu yết1đểtínhtoánADNmẫudòchothínghiệmlaiADNcủamình.
ADNcủacâychuyểngenvàcâyđốichứngđ−ợcxửlývớienzymegiớihạnBglII,vịtrícắt củaenzymnàynhậnbiết6cặpbazơnitơ.Sởdĩchúngtôichọncácenzyme
B nàybởivìchúngkhôngcóđ i ể m c ắ t trongt r ì n h t ự c ủ a genngoạil a i (CryIA(c).Khốil−ợngA DNđemxửlýlà5g,vớithểtíchphảnứnglà100l,vớithờigian1,5-2h.
Saukhixửlýenzyme,ADNđ−ợcđiệnditrêngelagarose1%.DoADN củanhânrấtlớnnênsốđoạnbịcắtbởienzymegiớihạnrấtnhiều,khoảngcáchvềkhốil− ợngphântửgiữachúngrấtnhỏ.Dovậysaukhiđiệnditrêngelchúngs ẽ tạothànhmộtdải gồmnhiềumảnhADNliêntục(smear)(hình41A).
SaukhiADNđãđ−ợcloạibỏpurinvàgelđ−ợcbiếntínhinsitu,mụcđíchl à đểmởx oắnADNtạothànhmạchđơn.Màngđ−ợcđemhongkhôtrongkhôngk h í4giờđểcốđịn hADNsợiđơntrênmàng.SauđóADNđ−ợcchuyểnlênmàng nitrocellulosevàchúngđ
−ợclaivớimẫudòđãđánhdấu,nhiệtđộphảnứ n g xảyratốtnhấtở42 0 C.Mẫudònàocócác gốckiềmbổsungchínhxácvớiphântửADNtrênmàngthìsẽghépđôiđểtạothànhsợixo ắnkép(gồm2sợi đơncónguồngốckhácnhau).
Hình41:Kếtquảxửlýenzym(A)vàlaiphântửADNnhậnbiếtgenCryIA(c)trongcâyngôchuyể ngen(B) Giếng1:Mẫuđốichứngdương(đoạngenCryIA(c)táchchiếttừplasmidpART27)
3 –8:Mẫu lai ADN của câyngôchuyển gen
KếtquảlaiADNđ−ợcpháthiệnnhờhiệnphimXquang,hình41Bchoth ấy sựxuất hiệnbănglaicủagenCryIA(c)
(1băngcủamẫuđốichứngdương(plasm id pART27)và6băngcủamẫungôchuyểnge n),cácbănglainàycó
AB kíchthướctươngứnglà1,845kb,trongkhiđóởđối chứngâmthìkhôngcósựx u ấ t hiệncủabănglaiADNnày(giếng2–hình41).
PhươngphápSouthernBlotcóđộchínhxáccaohơnPCR.Nhưngthờigianphânt í c h dài,q uátrìnhthựchiệnphứctạp,chiphícao,chỉkiểmtrađ−ợcđịnhtínhcácthànhphầnG M O s 3.5 Kếtquảnhậnbiếtcâytrồngbiếnđổig e n nhờsửdụngqueth ử nhanh(QuickStix)
EnviroLogixl à côngt y đ ã đưaraphươngphápthôngdụngđển h ậ n biếtcácgiốngcâytr ồngchuyểngen- đâychínhlàph−ơngphápsửdụngquethửnhanhQ u i c k S t i x Vớiph−ơngphápnày,ng−ờiứng dụngchỉcầntáchchiếtmẫuvớinướchoặcdungdịchđệm,rồinhúngquethửvàoốngđựngmẫuđóv àđợiđọckếtquả.Tuynhiên,phươngphápnàychỉđạthiệuquảkhisửdụngvớiquytrìnhvàbộkítcủa hãngvàcácbộkítđóđ−ợcthiếtkếchỉđểphântíchởmứcđịnhtính.
Trongthửnghiệmnàychúngtôiđãsửdụngphươngphápnàyvà2 bộk í t củahãngEnviroL ogixđểtiếnhànhnhậnbiếtgenCryIA(c)cótrongngôchuyểngen(nhờsửdụngbộk i t QuickStix TM
CryI A ( c ))v à genEPSPSc ótrongđậut−ơngchuyểngen(nhờsửdụngbộkitQuickStix TMRoundup Ready ). Đốiv ớ i m ẫ u hạtngôsaukhiđ−ợcnghiềnnhỏ,bổsungdịchchiếtvàoốngđựngbộtnghiềnv à đặtq uet h ử v à o trongốngc h ứ a dịcht á c h chiết,khoảng5 phútt h ì kiểmtrakếtquả.
Kếtquảthuđ−ợcởhình42chothấy:ởốngchứadịchtáchchiếtcủahạtngôk h ô n g chuy ểngenthìchỉthấyxuấthiệnmộtvạchmàutrêndảibăng(chokếtquảâmtính),trongk hiởốngchứahạtngôBtlạicó2vạchmàu(chokếtquảd−ơngtính).
Kếtquảd−ơngtínhtrongmẫungôBtchothấysựbiểuhiệncủaProteinCryIA(b) vàCryIA(c)cótronggiốngngôchuyểngenđãthínghiệm(Hình42).
Vớim ẫ u l á đ ậ u tươngchuyểngen,chúngtôicũngđãthuđượck ế t quảdươngtínhởốngc óchứadịchchiếtmôláđậut−ơngRoundupReadyvớisựxuấthiệncủa2vạchbăngtrêndải.Kết quảnàyđãchothấysựbiểuhiệncủaproteinEPSPStrongđậutươngRoundupReady.Trongk himẫuđốichứng(mẫuđậutươngkhôngchuyểngen)thìchỉcó1vạchbăngxuấthiện.Kếtquảâmt ínhnàychothấykhôngcósựbiểuhiệnc ủ a proteinEPSPStrongmẫuđốichứng.
Hình43:Kếtquảbiểuhiệncủa proteinEPSPStrongđậut−ơngRoundupReadyn h ờ s ửdụngquethửnhanh
Quacácthửnghiệmđãtiến hành,chúngtôi thấyphươngphápsửdụngquethửmiễnd ịch ELISAnàylà ph−ơngphápnhanh,kinhtế,thíchhợpvớiviệcsànglọcban đầu.Tuynhiênnólạichỉđặchiệuvớimộtsốítđốit−ợng,chẳnghạnnh−chỉđặchiệukhinhậnbiếtn ộiđộct ố biểuhiệnbởiBacillusthuringensis( CryIA(b),C r y IA(c)c ótrongngôchuyểngen)vàpr oteinCP4-EPSPS( c ótrongmộts ố dòngchuyểng e n nh− đậut−ơng,cảidầu,…).
Ngoàira,hãngEnviroLogixcònc ó mộtsốbộk í t khácdùngđển h ậ n b i ế t c â y t r ồ n g chuyểng ennhờsửdụngquethửQuickStix.S a u đ â y l à danhsáchcácbộkítcủaEnviroLogixứngdụngđể nhậnbiếtmộtsốcâytrồngchuyểngen:
MÉuThÝ nghiệm SốhiệubộK i t Tênth−ơngmại Genphânt Ých Thêigian đọckếtquả Giớihạnnhậnbiết
Lúa Hạtthóc 013 AS RB LibertyLink PAT/bar
Bông Hạt AS 016 AP Cry1F 10phút 1%
Bông Hạt AS 005 AP BollgardI I Cry2A 10phút 0,25%
Bông Hạt AS 011 AP RoundupReady CP4EPSPS 10phút 0,25%
Bông Hạt AS 013 AP LibertyLink PAT/bar 10phút 0,25%
Bông Hạt AS 003 AP Bollgard Cry1Ac 10phút 0,5%
Ngô Hạt,môlá AS 037 LT;
037 BG AgrisureR W Cry3Ađãcải biến 5phút 5–10.10 -7 %( m ô lá),
Bông Môcây,hạt AS 003 CT
LS Bollgard Cry1Ac 10phót 5-10.10 -7 % Đậut−ơ ng Hạt
5phót 0,1% Đậut−ơ ng Môlá AS 010 LS RoundupReady CP4EPSPS 5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCP4EPSPS Ngô Hạt AS 036TC
RoundupReady,Y i e l d Ga rd C B , Yi eldGardC R W ,
Ngô Hạt,bột AS 003 BG
Ngô Môcây,hạt AS 003 CR
;Naturegard,Kno ckout- Bt176 Cry1Ab
Ngô Môlá,hạt AS 016 BG, A
AS005 BollgardII Cry2Aa,Cr y2Ab
5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry2Aa,Cry2Ab
YieldGard,Yiel dGardPlus,Yiel dGardVT Cry3Bb
,bét AS008 StarLink Cry9C 5-10phót 0,125%
Ngô Môlá,hạt AS 054 BG, A
AS013LS LibertyLink PAT/bar 10phút Cósựxuấthiệncủaprotei nP A T / b a r
AS014 LibertyLink PAT/pat 5phót 1%
Ngô Hạt AS 010 BG RoundupR e a d y CP4EPSPS 5phút 0,5%
AS010LS RoundupR e a d y CP4EPSPS 5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCP4EPSPS
AS011LS RoundupR e a d y CP4EPSPS 5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCP4EPSPS
017 LS RoundupR e a d y CP4EPS PS 5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCP4EPSPS
Củcải đ−ờng Hạt AS 010SB RoundupR e a d y CP4EPS PS 5phút 0,1%
Môlá, hạt,cỏ khô AS 045 RoundupR e a d y CP4EPS PS
AS012LS BollgardII Cry1Ac,Cr y2A
5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry1Ac,Cry2A
Bông Hạt AS034ST Bollgard,Rou ndupR e a d y Cry1Ac,CP
10phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry1Ac,CP4
Bông Hạt AS 046ST BollgardI I, Ro undupR e a d y
Cry1Ac,Cry 2A,CP4EPS PS
10phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry1Ac,Cry2A,CP4
Bông Hạt AS 047ST LibertyLink
10phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry1Ac,Cry2A,P A
Ngô Môlá AS 038 LS YieldGardPlus Cry1Ab,Cry
5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry1Ab,Cry3 B b
V3 5 S(smallsubunitsofcauliflowermosuicv i r u s ) c ủ a virusk h ả m súpl ơ v à đ o ạ n k ế t t h ú c T-NOS(Nopalinsynthase)c ủ a Ti- plasmidt ừ v i k h u ẩ n A g r o b a c t e r i u m , v à t r ì n h t ự m ã h o á c ủ a c h í n h g e n đ−ợcc h u y ể n Đ o ạ n C a M V35Sv à T -
N O S l à n h ữ n g trìnht ự q u a n trọngđ ố i v ớ i s ự b i ể u h i ệ n c ủ a c á c g e n n go ạ i laitr ongthùcvËt.
– l à t i n h thểđ ộ c t ố c ủ a v i kh u ẩ n B aci ll usthuringensis.Ti n h t h ể đ ộ c t ốn à y cónhiề unhómkhácnhaunh−Cry I, CryII,CryIII…
Tuynhiênkhiứngdụngc á c nhómđộctốnàyđểtạokhảnăngkhángsâuchocâytrồngthì mớichỉcócácv e c t ơ mangtrìnhtựmãhóachotiềnđộctốCryIA(a),CryIA(b),Cry
IA(c).Vàv e c t ơ c ó v ù n g genc ấ u t r ú c C r yI A ( b )đãđ−ợcc h u y ể n v à o r ấ t n h i ề u l o ạ i c â y trồng, đặcbiệtlàcácgiốngngô.
Trongnghiêncứunày,chúngtôiđãtiếnhànhđọctrìnhtựcủa3đoạngen đól à genBt,đ o ạ n C a M V35S,T -
N O S S ả n p h ẩ m PCRc ủ a c á c genn à y đ−ợctinhsạchnhờxửlýriêngrẽvớiamm oniumacetate4Mvàcồn100%đểloạibỏmồivàcácnucleotitd−thừasauphảnứn g.SauđókếttủathusảnphẩmPCRvàho àtanvớiTEđểdùnglàmkhuônđểgiảitrìnht ự.XácđịnhtrìnhtựADNđ−ợct i ế n h à n h t h e o P r o t o c o l s ử d ụ n g b ộ k i t x á c đ ị n h trìnht ự B i g d y e c ủ a AppliedBiosystems(8àlBigdye(đãphaloãngtừstockvới tỷlệ1:3);4àlBuffer2,5X;5 àlmồi(0,8pmol/àl;sảnphẩmPCR:2àl(T-NOS),3àl(CaMV35S),
2,5àl(Bt);H 2 Odeionkhửtrùngvừađủvớithểthíchphảnứngl::17ã17::l).Chạyvớichutrì nh nhiệt:95 0 Ctrong1phút;2 5 chukỳ:95 0 Ctrong30giây;50 0 Ctrong20giâyvà6 0
0 Ctrong4 p h ú t Sauđ ó b i ế n tínhv ớ i H i D i F o r m a m i d e ( 1 0àl)ở 9 0 0 Ctr on g 3phú tvàchovàomáysequecing.
-ĐoạnpromoterCaMV35Scónguồngốctừviruskhảmsúplơ.TrìnhtựCaMV35S dài195bp(hình45). ggcactacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacag tggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaacca cgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaat ccc actatc
NOS( n o p a l i n esynthaseterminator)cónguồngốct ừ vikhuẩnAgrobacteriumtumefaciens.Đ oạnterminatornàyđ ã đ−ợcchuyểnvàongôchuyểngenvàđãđ−ợcphântáchrađểgiảitrìnhtự.Đoạ ntrìnhtựnàydài192bp(hình46).ctttcgggagcgattcatccttcccgaacgcagcataca actccccgttgtactgcgctcttcaagtgtgcttcttcccccttctcccccttaccac ggcaagtccttgggaaataactccgatgggcagaaaaaagaaggggtttagagaccct cctggcccaaccctacggc aacaggattcaatcttaa
GenBtc ónguồngốctừBacillusthuringiensis.Gennàyđãđ−ợcchuyểnvàodòngngô176vàđ ượcphântáchđểđọctrìnhtựkíchthước420bp. cggccccgagttcacctt ccccctgtacggcaccatgggcaacgctgcacctc agcagcgcatcgtgccacagctgggccagggagtgtaccgcaccctgagcagc accctgtaccgtcgacctttcaacatcggcatcaacaaccagcagctgagcgt gctggacggcaccgagttcgcctacggcaccagcagcaacctccccagcgccg tgtaccgcaagagcggcaccgtggacagcctggacgagatcccccctcagaac aacaacgtgccacctcgacagggcttcatccaccgtctgagccacgtgagcat gttccgcagtggcttcagcaacagcagcgtgagcatcatccgtgcacctatgt tcagctggattcaccgcagtgccgagtt caacaacatcatccccagcag
Tài liệu Tham khảo Đối tượng Dữ liệu Sinh học Dữ liệu Gen
Giới Các Dòng Đặc tính (Chịu bệnh, v.v.) Bài báo Động vật
TT chung Vector Tài liệu khác
Hệthốngc ơ sởdữl i ệ u GMOsv à p h ầ n mềmquảnl ý đ ã đ−alênmạnginternetbaogồmha ithànhphầnchính:
Hệthốngcơ sởdữliệu vềGMOsnhằmt íc h trữdữliệu cáccây trồngbiến đổigen
(GMCs),đặcbiệtcungc ấ p c á c thôngt i n cấut r ú c genc ủ a G M C s v à cácd ữ l i ệ u liênquankể c ả tàil i ệ u thamkhảonh−c á cbàib á o , sáchđiệnt ử , v.v.C ơ sởdữliệuv ề GMOst í c h hợptro ngWebsitecùngv ớ i phầnm ề m c ơ s ở củaCSDL(MicrosoftSQLServer2000EnterpriseEditio n).MicrosoftSQLServer2000c h o phépkiểmsoátv à quảnlýsốl−ợngmáytínhtrongViệnDitru yềnNôngnghiệpcóthểtruycập,cậpnhậpvàchỉnhsữadữliệuGMOs.
Phầnmềmquảnlýnàybaogồmcácmodulegiaodiệnvớing−ờiquảntrịnh−nhập xuất,t ì m kiếm,bảotrì,xửl ý thốngkêv à h i ể n t h ị dữliệu.Phầnmềmquảnl ý C S D L đ−ợccàiđặtởcảmáychủvàcácmáytínhtrongmạngquảnlýCSDL.
HệthốngCơsởdữliệuvềGMOsđãđ−ợcthiếtkếvàxâydựngt r ê n c ơ sởMicrosoftSQLServer200 0vàhệđiềuhànhWindowsServer2000,cònphầnm ề m quảnl ý trêncơsởMicrosoftVisualStudio NET2003trênnềnhệđiềuhànhWindowsXP.
PhầnmềmquảnlýGMOscó3côngcụ,chứcnăngchínhđólà:nhậpdữliệu,tìmkiếmvàdanhmụ c.
Phầnm ề m baogồmhệthốngcơsởd ữ l i ệ u v ề sinhv ậ t biếnđổig e n trênthếgiớivàViệtNam,với tổngsốgần300đốit−ợngđ−ợcthốngkê.
Chứcnăngnhậpdữliệubaogồm4 tr−ờng:Thôngt i n chung,Đặcđiểmcủadòng,Nhữngphêch uẩnvàPhươngphápxácđịnhGMOs(hình49,50)
Chứcnăngtìmkiếmbaogồm:tìmkiếmcơbảnvàtímkiếmnângcao(hình51).Tacót h ể t ì m kiế mtheo:loài,têndòngthôngdụng,tínhtrạng,gen,nơiphêchuẩn,Kiểuphêchuẩn,nơiđềnghịphêch uÈn.
Danhmụcbaogồm9giaodiệnđólà: giaodiệnchỉnhsửadữliệuvềgiới,loài,tínhtrạng,phươ ngphápb i ế n nạp,nơiphêchuẩn,k i ể u phêchuẩn,phươngphápxácđịnhGMO,phươngpháptác hchiếtADN,vàgiaodiệnchỉnhsửadữliệuvềcặpmồi(hình52,53).
Websiteđ−ợcđăngkýchínhthứcvớitênmiềnlàhttp:// www.gmo.gov.vn tại TrungtâmInternetViệtNam(VNIC).Tínhđếnngày16/8/2007đãcó11.111l−ợtng−ờitruycậpvàowebsite.
Các phương pháp biến nạp gen
Các nghiên cứu về GMOs tại Việt Nam Thành tựu và công nghệ
Các phương pháp xác định GMOs
Cây trồng Động vật Đánh giá ATSH
Cơsởdữliệu(CSDL)gồmc::27ỷ36::ốit−ợngđóđ−ợcchuyểngentrênthếgiớivàmViệtNambaog ồm:
ThùcvËt §éngvËt VisinhvËt Đậut−ơng Dê E.coliDH5α §ËuAdzuki Chuét E.coliJM109
Lanh Cáhồi E.coliNBRP Đuđủ Cátrắmcỏ E.coliDS2,DS2-2
Củcảiđ−ờng Cáhồichấmhồng Pseudomonaspaueimobilis ớtngọt Cátrê PseudomonasppY101LA
H−ớngd−ơng CárôphisôngNin PseudomonasfluorescensF113pcb
Adenovirustuýp5nhãmC Virutlàmmsuyg iả m bệnhđậumùadòng Ankara
Guidelinesforgeneratingp r e - c l i n i c a l andclinicaldataforr D N A vaccines,diagnostics andotherbiologicals,1999
Rulesforthemanufacture,use,import,exportand storageo fhazardousmicroorganisms,geneticallyengineeredorgani smsorcells
Malaixia Guideline for the Release of GMOs into theEnvironment
GuidelinesforApplicationofRecombinantDNAOrganism si n Agriculture,Forestry,Fisheries,TheFoodIndustryand OtherRelatedIndustries-
Philippinebiosafetyguidelines Rulesandregulationsfort h e importationandreleaseintoth eenvironmento f plantsa n d plantp r o d u c t s derivedfrom theuseofmodernbiotechnology
Singapore SingaporeOccupationalHealtha n d SafetyGuidelinesforL aboratoriesandProductionfacilitiesintheBiomedicalScien ces
SingaporeBiologicalAgents andToxinsAct SingaporeBiosafetyGuidelinesforresearchonGMOs SingaporeGuidelineso n t h e C a r e Useo f AnimalsforScie ntificPurposes
Srilanka TheGazetteoft h e DemocraticSocialistRepublico f SriLa nka
ThailandB i o s a f e t y Guidelinesi n GeneticE n g i n e e r i n g an d BiotechnologyforFieldWorkandPlannedRelease
ThailandB i o s a f e t y Guidelinesi n GeneticE n g i n e e r i n g andBiotechnologyforLaboratoryWork ThailandDraftGuidelinesonContainedUsesofGMOs
ViệtNam Regulationonf i e l d trials,riskmanagementandissueofbio safetylicenseofgeneticallymodifiedcrops
Bangladesh NationalBiosafetyFrameworkoftheGovernmentoft h e Pe ople’sRepublicofBangladesh
Ghanabiosafetybill Draftofabillentitledbiosafetyact,2004 NationalbiosafetyframeworkforGhana GuidelinesonPublicParticipation,InformationSharinga n d Acces s t o JusticewithRespectto GeneticallyModifiedOr ganisms
Criticalanalysisofsouthafrica’sl a b e l l i n g regulationsfor geneticallymodifiedfood,feedandproductsderivedfromg m-fedanimals
Coordinatedbi otechnology framework for regulation of
Issuesi n theregulationofgeneticallyengineeredplantsana nimals c Ác hentina Analysiso f a nationalbiosafetys y s t e m regulatorypolicie sandprocedureinArgentina
TheDirective2001/18/CE Theregulation1829/2003/CE TheEUDirective90/219/CE TheDirective2002/81/EC TheEUDirective90/220/EEC TheRegulation1642/2003
6 Kếtquảnhậnbiếtđoạnmộttrongsốc á c g e n k h á n g t h u ố c t r ừ c ỏ (PAT)củac â y trồngbi ếnđổigen.
2.E.coligeneexpressionprotocols Edi tedby:PeterE.VaillancourtPubli sher:HumanPress
Editedby:DavidL.Nelson;MichealM.Cox
Editedby:Lodish;Berk;Matsudaira;Kaiser;Krieger;Scott;Zipursky;Darnell
Editedby:Peter.J.Quesenberry;GaryS.Stein;BernardG.Forget;Sherman
Editedby:WilliamD.Stansfield;JaimeS.Colomé;RaulJ.CanoPublisher:Mc GRAW-HILL
Editedby:AlanR.ClarkePublish er:HumanaPress
Truycậptrangwebhttp://gmo.gov.vn để biếtthêmthôngtinchitiết.
3.8 Cácg i ả i p h á p quảnl ý mộts ố sinhvậtbiếnđổigencótriểnvọngvàcảnhbáonhữngrủiroti ÒmÈn
Ngàynaysinhvậtbiếnđổigenvàcácsảnphẩmcôngnghệsinhhọccómặtrộngrãitrongcác sảnphẩmchămsócsứckhoẻconng−ờinh−insulin,vacxinviêmganB,thuốcchữabệnhtimmạch
… hoặcchomụcđíchcôngnghiệp.Tuynhiên,mộtsốkhủnghoảngcóliênquanđếnthựcphẩmtrongn hữngnămgầnđâyđãlàmchongườitiêudùngquantâmđặcbiệtđếnvấnđềantoànthựcphẩm.Nỗil osợvềđộantoàncủathựcphẩmđangngàymộtlớn,đặcbiệtlàkhiAnhvàmộtsốnướcChâu ÂukhácpháthiệnrahoáchấtrửaphimđiệnnãođồdạngxốpởtrâubòvàchấtônhiễmDioxinởcácsả nphẩmgiacầm tạiBỉđãlàmchongườitiêudùnggiảmlòngtinđốivớingànhcôngnghệthựcphẩ m.Đểcảithiệntìnhtrạngnàythìcácnhàsảnxuấtcầnphảixemxétmộtcáchnghiêmtúcvềtínhan toàncủasảnphẩm.Mứcđộantoàncủathựcphẩmchuyểngenítnhấtcũngtươngđươngvớithực phẩmkhácbởivìquátrìnhđánhgiáantoànđốivớithựcphẩmchuyểngenkỹl−ỡnghơnnhiều sov ớicácthựcphẩmkhác.“Quátrình đánhgiáantoànthựcphẩmđảmbảorằngthựcp h ẩ m chuyểngenm a n g lạitấtc ả c á c lợiíchnh−th ựcphẩmthôngth−ờngvàkhôngcóthêmmộttáchạinào”(Tổchứcl−ơngthựcthựcphẩmúc- NewZealand,2000).
Vàotháng9/2000,m ộ t b à i báocủaMỹđãthôngbáor ằ n g ngôStarLink TMđ ã đ−ợctìmthấytrongTacoShellsởcáccửahàngthựcphẩmMỹ.Loạisảnphẩmcủangôchuyểng e n nàyđ−ợcth−ơngmạibởiAventisvàđ−ợcphêchuẩnbởicơquanbảovệ môitrườngcủaMỹ(EPA)đểlàmthứcăngiasúcnhưngkhôngsửdụnglàmthựcphẩmchongười.V iệc phêchuẩnlàm thứcăn gias ú cđ ã đ−ợccôngnhậnv à chắcchắn rằngloạingônàychỉđ−ợctrồ ngchomụcđíchl à m thứcă n gias ú c Việcphêchuẩnđểsửdụnglàmthựcphẩmkhôngđ−ợccông nhậnbởivìch−agiảiquyếtđ−ợcnhữnglolắngr ằ n g proteinCry9Ccóthểgâydịứng.
Cácsảnphẩmchuyểngenđãvàđangpháttriểnmộtcáchnhanhchóngtrêntoàncầu.Mặcd ùngàycàngcónhiềunhàkhoahọcnhìnnhậnlợiíchcủaGMOsnh−ngxétv ề mặtan toàns in hhọ cthìvẫncònnhiềuýkiến khácnhauvềcácsảnphẩmbiếnđổigen.Ngườitathấyrằngcâytrồngch uyểngencóthểcónhữngnguycơtiềmẩnsau:
- Sâubệnhcónguycơtăn g cườngtínhkhángvớicácch ất độctiết ratừ cây chuyểng e n ;
- Nguycơnhữngchấtđộcnàytácđộngtớisinhvậtkhôngphảisinhvậtcầndiệt. Đểg i ả m thiểut ớ i mứct h ấ p n h ấ t n h ữ n g n g u y c ơ t i ề m ẩ n c ủ a sinhvậtbiếnđổigent ạiViệtNam,chúngtôiđ−arahaigiảiphápsau:
Việcđánhgiáantoànthựcphẩmc ó nguồngốct ừ c â y t r ồ n g , độngv ậ t c h u y ể n genvàđ ộngvậtnhândòngđ ề u đượcquảnlýn hưnhauvàđánhgiádựavàophươngphápsosánh.Phươngp hápsosánhđãđ−ợcpháttriểnnh−làmộtcôngcụđểnhậnbiếtrõràngnhữngđiểmgiốngnhauvàkh ácnhaugiữathựcphẩmm ớ i (thựcphẩmc ó nguồngốctừGMOs)vàthựcphẩmtruyềnthống(làth ựcphẩmcónguồngốcantoàn).V ấ n đềa n toàn thựcphẩmđ−ợcquantâm nhấtchínhlà liệucács ả n phẩmthựcp h ẩ m cónguồngốct ừ GMOscóđ ặ c t í n h gâydịứnghaykhông?
Vìv ậ y trướckhicácsảnp h ẩ m GMOstrở thànhsảnp h ẩm thựcphẩmthìchúngcầnđượcđánhgi ávềkhảnănggâydịứng.
VÝ dụ tr − ờnghợp protein Cry9C :
GenCry9Cđãđ−ợcchuyểnvàoplasmidpGI9CK,pRVA9909vàs a u đóđ−ợcbiếnnạpvà otrongngôStarLink(dòngn g ô CBH-
351).Proteinnàyđ−ợctạor a1 cách t ự nhiênt ừ vikhuẩnBacillusthuringiensissp.tolworthi,l à biếnthểcủanhómđộctốB t,kểcảCry1Ađãđượcsửdụngđểthươngmại.CácđộctốBthoạtđộn gnhờliênkếtv ớ i cácthụquanđặchiệutrêncáctếbàoruộtgiữacủacôntrùng,gâyrasựtiêuhuỷvà cuốicùnglàmthốirữabộmáytiêuhoácủacôntrùng.ProteinBtlàvậtchủđặchiệuvàk h ô n g liê nkếtvớicáctếbàocủađộngvậtcóxươngsống.
TheoTrungtâm kiểmsoátbệnh(CDC),proteinCry9Ccóchung1 vàiđặctínhp h â n tửvới cácproteinmàđã đượcbiếtlàcácchấtgâydịứngởthựcphẩm,v ì thếcơ quanbảov ệ m ô i trườngM ỹ(EPA)khôngc ấ p giấyphépchongôStarLinkdùngl à m s ả n phẩmthựcphẩmcủaconng−ời.
PAGE,Westernblots,giảitrìnhtựN- terminalaminoacid,cácthửnghiệmglycozilhoá(glycosylationtests),… đ ã xácđịnhđượcrằng:Cry9Cc ó6 2 5 aminoa c i d vàc ó k í c h thước1878bp.
Quađ á n h g i á c h o thấy:phạmv i ảnhhưởngtácđộngđếnkhảnănggâydịứngc ủ a cácsản phẩmcóchứaproteinCry9Cđốivớiconngườilàthấp,xấpxỉ1%đốivớingườitrưởngt h à n h v à 5
% đốivớitrẻe m dưới7 tuổi.Ngườit aướctínhrằngkhoảng7,5%dânsốcóbiểuhiệndịứnghoặcm ẫncảmvớimộtsốthựcphẩm.
- Thửnghiệmliênkếthuyếtthanh:Cácmẫuhuyếtthanhđãmãhoáđượcphântíchtừ28ngườicóp hảnứngdịứngvớingôStarLinkthìcũngnhạycảmcaođốivớicácchấtdịứngkhácnhau.Cácnghi êncứucủahọcóthểkhôngxácđịnhđ−ợcmốiliênhệgiữaCry9Cvàviệcsảnxuấtl−ợngIgEđặchi ệuvớiCry9Ccóthểxácđịnh.
* Đánhgiárủirođếnmôi tr − ờng và hiện t − ợngtrôi gen sangcácloàikhác
Nhữngcuộctranhluậnxungquanhảnhhưởngcủacâychuyển genđốivớimôitrườngn gàyc à n g phứctạp,căngthẳngvàrấtnhạycảm.Vấnđềnàyngàycàngphứctạphơnkhicó cácnghiê ncứumớiđ−ợccôngbố.Vậycây chuyểng en có an toànvớim ô i tr−ờnghaykhông?
Nhữnghậuquảgìcót h ể xảyrakhiđ−acácgenmớiv à o trongmôitr−ờngl à m ộ t câu hỏiđ ầutiênv à quantrọng nhấtkhinghiêncứuứngdụngcácvisinhvậtbiến dổigen(GMMs).Cầnphảix e m xétđểtrảlờic â u hỏirằng:liệucácgenđãđ−ợcchuyểnvàoGM Mscógâyhạigìchoconngười,câytrồng,vậtnuôihayđộngthựcvậthoangdãhaykhông?
Trướctiên,đánglongạilàbấtkỳGMMsnàođưavàomôitrường đềucóthểđộtbiếnthànhmầmbệnhchođộngvậth ay thựcvật.Tuynhiên,rủironày đãđ−ợcchứngminhlàkhócóthểxảyratrongthựctếvìkhảnănggâybệnhphụthuộcvàoloạigen,th ểnhậnvàphápluậttạinhữngnơiđangxemxétứngdụngGMMs.Trongsốtấtcảcácloạig e n sửdụng trongcôngnghệGMMs,longạilớnnhấtlàgenkhángkhángsinh.Lýdocủasựl o ngạinàylàsựxuất hiệntínhkhángkhángsinhở c á c chủngphânlậptừcácbệnhphẩm. Đốivớicâytrồngbiếnđổigent h ì l o ngạic h í n h v ề ảnhhưởngc ủ a c â y c h u y ể n genđốiv ớimôitr−ờnglàkhảnăngtạoraloàicỏmớithôngqualaichéoxavớicáccâyhọhànghoangdạihoặ cđơngiảnhơnlàtồntạilâutrongtựnhiên.Khảnăngnàycóthểxảyra,đượcđánhgiátrướcquátrìn hchuyểngenvàđ−ợckiểmsoátsaukhicâyđ−ợc đ−aratrồng.Khảnăngxẩyralaichéoxagiữagenđ−ợcchuyểnvàovớicáccâycỏhọhàng,cũngnh
Sựtrôigentrongthựcvậtxảyrakhicóhiệnt−ợngthụphấntừcâynàysangcâykhác,nếuphấnt ừ c â y c h u y ể n genđ−ợcdic h u y ể n bởigióhoặccôntrùngthìđềuliênquan đếncáccâykhôngchuyểngen,cácgenchuyểncóthểbịtíchhợpvàogenomecủathếhệconcháu, dođólàmthayđổitínhtrạngcủathếhệconcháu.Trướcđâyvấnđềtrôigentừcâychuyểngenđãnh ấnmạnhvềsựdichuyểncủagenchuyểntớicácmốiquanhệvớicâytrồnghoangdại,trongkhiđóả nhh−ởngcủatínhkhángcôntrùnglạibịbỏqua.
Giảiphápvềhiệnt − ợng trôigenở một số cây trồng:
Ngôl à loàic â y t h ụ phấnc h ủ yếunhờgió,khoảng97%giaophốicùngg i ố n g giữacácc âyvớinhauvàsựthụphấnxảyratrongkhoảng200m.ĐểkiểmtragiảthuyếtvềsựtrôigentừngôBtsa ngcácgiốngngôbìnhthườngđểtạorađộctínhBttrongngôkhôngchuyểngen,ngườit a đãkiểmtra cácmẫuhạtcủangôkhôngchuyểngenmà đ−ợctrồnggầnvớingôchuyểngen KếtquảkiểmtrachothấyrằngnồngđộđộctínhBt-
% c ủ a hạtc ó độct ốCry1A(b)giảmsovớingôchuyểngen.Nhữngkếtquảnàychothấyhiệnt−ợn gtrôigengiántiếpthôngquathụphấnt ừ ngôchuyểngenlànguyênnhângâyrasựt ạ o thànhđộctính Bttronghạtcủanhữngcâykhôngchuyểngen.
+HiƯnt−ỵngtrôigent ừ ngôBtchuyĨngentớingôBtkhôngchuyĨng e n xảyrặ khoảngcách31m +CácthửnghiệmELISAvềngôkhôngchuyểngenchothấyrằngnồngđộđộctínhBtCry1A(b)v àtỷlệ
%Cry1A(b)trongcáchạtgiảmtheokhoảngcáchtrồngsovớingôBtchuyểngen.Cónghĩalànồng độCry1A(b)trongcáchạtlaiBtlà260±19ng/g.Nồng độđộctínhBttrongngôkhôngchuyểngencaonhấttrongkhoảngcách2msovớingôchuyểngenv àgiảmnhanhtheokhoảngcách.ởkhoảngcách31mthìnồngđộCry1A(b)trongcác hạtcủa ngôkhôngchuyểngen là4,4±1,2ng/ gtươngđươngvới1,7%sovớinồngđộtronghạtcủanhữngcâytrồngsátvớicâychuyểngen[41].
Nh−vậygiảiphápđểquảnlý hiệnt−ợngtrôigenở ngôchuyểngenlàtrồngởkhoảngcách3 1m.
Hiện t − ợng trôi gen ở lúa
Hạtphấnlúamấttácdụngsau5phútsaukhirơiranếunókhôngđ−ợcthụphấn.Trongm ộ t vàitr−ờ nghợpđặcbiệtthìhạtphấncóthểtồntạiđộclậpđược15phútngoàimôitrường.Sựdichuyểnth eophươngngangcủahạtphấnrấthạnchế.10mlàkhoảngcáchc ầ n thiếtđểt ạ o rac â y l a i vàc ó th ểtránhđ−ợcsựnhiễmbệnhvớinhữngh ạ t phấntừcáccánhđồnggầnkề[80].
Tuynhiên,sựthơphấnchéocịngchỉxảyrặ mộtvàiphạmvi,tỷ lƯ thơp h ấn chéophơthuộ cvàoyếutốkhíhậuvànhữngyếutốvềsựđadạngkhác.Tỷlệgiaophốicùnggiốngth−ờngxảyranhi ềuhơnởcácgiốnglúaIndicavàmộtsốloàilúadạihơnlàở giốnglúaJaponica[104].Lord(1935)đ ãt ì m rarằngvớiđiềukiệnkhíh ậ u khácnhauởhaiquậncủaSriLankathìtỷlệgiaophốitựnhiênth
0.67%,trongkhiđótheoBrown(1957)thìtỷ lệthụphấnchéotự nhiênởMalaysialà 0.41%.C ò n t h e o SrinivasanvàSubramanian(1961)thìt ỷ l ệ t h ụ phấnc h é o t ự nhiênởấnđộchỉlàtừ0.04
Cácthínghiệmchothấyrằngtrôigengiántiếpthôngquathụphấntừlúachuyểngenk h á n g t h u ố c t r ừ cỏ tớic â y l ú a b ê n cạn h k h ô n g c h u y ể n g en l à 0 , 0 1 -
Trôigentừcâytrồngtớicâyhoang dại:genchuyểnđ−ợcđ−avàolúathìcũng sẽ v ào qu ần th ể l ú a hoangdại, mặc d ù tỷlệ thụ p h ấn ch éo là rấtthấp[ 53 ] Vídụtr ô i gent ừ k h o ả n h đ ấ t t h í n g h i ệ m n h ỏ c ủ a l ú a c h u y ể n g e n k h á n g t h u ố c t r ừ c ỏ tớil ú a h o an g dạilàtừ0-
0,06%ởTrungQuốcvàChâuâu[43,95].Tươngtựnhưvậy,Gealyv à Cs(2003)trướcđó cũngcónhữngthínghiệmvềtrôigentừlúađ−ợcgieotrồngtớilúahoangdạivàchúýrằngtỷl ệlaigiữacâytrồngvàloàihoangdạicủachúngxấpxỉ0 , 0 1 -
1 % Họ cũ n g chú ý r ằn g tr ô i g en có thểx ảy ra th eo định hướngtừ cây trồ ng tớ i l o à i ho angdạihoặctừloàihoangdạitớicâytrồng.
Tuyv ậ y , t ỷ l ệ t ự t h ụ phấnc ủ a lúavàhầuhếtcácloàihoangd ạ i c ủ a chúngl à cao,nênc â y trồngn à y đ−ợcđánhgiál à l o à i rủir o thấptrongmốil i ê n quanđếncácc â y trồngchuyểnge nkhácnhau[123].Tuynhiên,nếugenchuyểnđủmạnhtrongđiềuk i ệ n thuậnlợithìnócóthểnha nhchóngđ−ợcchuyểnvàocácquầnthểhoangdạicủachúng,mặcdùt ỷ lệthụphấnchéolà rấtth ấp[49].Bêncạnhđósựtr ô i gentrongcác loàitựthụphấnnhưlúamì,đậutươngcũngrấtítkhixảyr avàhiệnt−ợngtrôigengiữacácloàinàyvớiquầnthểhoangdạilàbằngkhông[114].
Giảiphápđểquảnl ý sựtrôig e n t ừ c â y trồngchuyểngen(GMCs)làtrồngchúngở khoả ngcáchantoànvàsaukhitrồngt a sẽđánhgiákhảnăngtrôig e n củaG M C s bằngcácphươngphá pnh−ELISA,PCR,laiADN,
Proteintồntạitươngđốibềntrongđấtvàđượcphânloạinhưlàdạngbấtđộngvìchúngkhôn gcókhảnăngdichuyểnhoặcthấmquan−ớcngầm.Cácproteinkhôngbềnvữngtrongđ i ề u kiệnđ ấtaxit.Khiphơidướiánhnắngmặttrờichúngbịphânhuỷnhanhchóngdướitácđộngcủatiacựctí m.
Cácchuyêng i a đãtiếnhànhnhữngnghiêncứuđộclậpnhằmđiềutracácảnhhưởngcủacây trồngBtđốivớisinhvậtđấtvàcácloàicôntrùngkhácđ−ợcxemlàcóíchtrongnôngnghiệp.Kếtqu ảchothấy,chúngkhônggâyraảnhhưởngbấtlợiđốivớic á c sinhvậtđấtkhôngphảilàđíchtấncô ngcủachúng,thậmchíngaycảkhicácsinhvậtnàyđ−ợcxửlý Btvớil i ề u l−ợngcaohơnnhiềusov ớithựctếcó thểxảyr a tr on g điềukiệntrồngtr ọt Nghiêncứ u củaC ơquanBảo vệ Môi tr−ờngMỹ(EPA)cũngchothấykhôn gcósựthayđổinàotrongquầnthểvisinhvậtđấtgiữa cáccánhđồngtrồngc â y chuyểng e nBt vàcánhđồngtrồngcácgiốngcâytruyềnthống[47],cũngnh−khôngquansátthấysựkhácbiệtgiữac áccánhđồngtrồngc â y chuyểngenBtvàcâykhôngchuyểngenBt[48].
Mộtv ấ n đềnảysinhtrongnghiêncứuliênquanđếna n toàncủavisinhvậtchuyểngen(G MM)trongmôitr−ờngl à s ố p h ậ n c ủ a c á c ADNngoạibàotrongmôitr−ờngbịảnhh−ởngbởic ácđiềukiệnsinhhọcvàphisinhhọccủamôitrường.Nhiềuv i khuẩns ả n sinhc á c chấtđểphânhu ỷc á c A D N ngoạilai.Tuynhiên,ng−ờitavẫnpháthiệnđ−ợcsựtồnt ạ i củacácADNcó trọngl−ợn gphântửcaotrongđấtvànướckhôngbịphânhuỷ.
Ngoàinhữngmốil o ngạivềcâytrồngchuyểngen,ngườit a c ũ n g c ó m ố i quant â m đếnv isinhvậtchuyểngen(GMMs).Rằngliệuviệcđ−aGMMsvàomôitr−ờngtựnhiêncógâyrasựmất cânbằngsinhtháidosựt−ơngtáclẫnnhaugiữacácloàitronghệsinhtháihaykhông?
Haivídụđiểnhìnhkhôngliênquanđếnvikhuẩnl à virusmyxomac ủ a t h ỏ v à b ệ n h n ấ m củac â y đ u đ ủ HàLan.Khôngchỉmầmbệnhn à y g i ế t k ý c h ủ m à cònd ẫ n đếnthayđổicấutrúcquầnxãsaukhitiêudiệtđộngvật ăn cỏ haymộtcấu phầnquantrọngcủavùng rừngrụngl á sớmở Châu Âu.N ế u l o ngạil i ê n quanđếnviệcđưac á c GMMsgâybệnhvàomôitrườngt h ì r õ ràngl à c ầ n p hảixemxétđếncảvaitròquantrọngcủakýchủtronghệsinhthái.
MặcdùgiảiphóngGMMstrongphạmvihẹpkhônggâyratácđộngc ó hại.Nghiêncứuchủyếuhướ ngv à o giảiquyếtcácvấnđềliệucótácđộngnàodocạnhtranhkhốcliệt giữaGMMsvàvisinhvậ tbảnđịahaytươngtácgiữavikhuẩnvàthựckhuẩnthể? ĐóchínhlànhữngvấnđềcóthểnảysinhkhiđưaGMMsvàomôitrường.
- Cầnphảisửdụngcôngnghệhiệnđạiđểhiểusâuhơnbiếnđộngquầnthểvisinhvậttrongmôitr− ờngtựnhiên.Chẳnghạnnh−,mộtcâuhỏiđ−ợcđặtravớicácsinhvậtbậccaolàliệuchứcnăngh ệsinhtháibịpháh u ỷ khiđadạngsinhhọcquầnxãgiảmhaykhông? liệumấtđimộtphầnnhỏquầnxãcógâypháhuỷchứcnăngcủanóhaykhông…
- Rủir o khisửdụngG M M s phụthuộcv à o đặcđiểmcủavisinhv ậ t vàvịtríứ n g dụng.RủiroquantrọngnhấtvớiGMMslàchuyểncácgentáitổhợpsangcácsinh vậtkhácvàpháhủcân bằngsinhthái.Trongcảhaitr−ờnghỵpnàyrđirocó th Ĩ xảyrặ mứcth ấpnhấtnếusửdụngc á c GMMsmangcácđoạng e n chuyểnb ề n v ữ n g vàkhôngcócác v ật liệu tái tổ hợpkhôngcần thiếtcóthểmangưuthếchọnlọchơncácsinhvậtkhácđãcómặttron gmôitr−ờng.
- Hiểuvềhậuquảcủaviệcđ−acácgenmớivàovikhuẩncầnxemxétđếnditruyềnquầnthểvikh uẩnvàsinhtháihọcquầnthểcũngnh−cáccơchếđiềuhoàbiểuhiệngenvàhoạtđộngchứcnăn gcủacácproteinmàgenđómãhoácho.Rõràngnhânt ố quantrọnglàbảnchấtvàsựbềnvững củacấutrúcgencầnđ−ợcđánhgiábằngcáckỹthuậtphânt ử v à t ế bàot r o n g phòngt h í ngh iệm.Ngoàiram ộ t v ấ n đềquantrọngc ầ n xemxétđếnđól à xácsuấtcácgenchuyểncóthểl a n t ruyềnt r o n g môitrườngthôngquacáccơchếtraođổitựnhiênvớicácvisinhvậtkhác.Quantr ọngnhấtlàcầnpháttriểncôngnghệchophéptiênđoánbiếnđộngsinhtháiquầnxãvisinhvậtkh icómặtcácGMMs.
Cácthửnghiệmtiếnhànhtrênchó,chuộtlang,thỏ,cá,ếchvàchimc h o thấyproteinBtkhôn ggâyranhữngả n h hưởngcóhại.Cũngc ầ n nhấnmạnhrằng,độctốhoàntoànkhônggâyảnhhưởn gđếncácloàicôntrùngcóíchhoặcđộngvậtănthịtnh−ongmậtvàbọcánhcứng.Năm1996,mộtbá ocáovềảnhhưởngcóhạicủahạt phấnt ừ câ y ngôBtđếnấutrùngcủaloàibướmMonarch.Báoc á o nàyđãgâyramốiquantâmvàlongạivềnhữngrủiromàthựcvậtBtcóthểgâyrađốivớisinhvậtkh ôngcầndiệt.Tuynhiên,nhữngnghiêncứug ầ n đ â y chot h ấ y ngôBtgâyraảnhh−ởngkhông đángkểđốivớiquầnthểbướmMonarchtrêncánhđồng.Cácnghiêncứuđiđếnkếtluậnrằng,hầuhết cácgiốnglaithươngmại,proteinBtđượcbiểuhiệnvớinồngđộrấtthấptronghạtphấnvànghiên cứutrongphòngthínghiệmcũngn h−trêncánhđồngchothấymọimậtđộhạtphấnđềukhônggâyả nhhưởngcóhạitrênđồngruộng.
* Đánhgiánhữngrủirocủa gen khángkháng sinh trong các câytrồngchuyển gen
Genkhángkhángsinhlàmộtcôngcụquantrọngtrongkỹthuậtditruyềnnóic h u n g vàtron gcôngnghệsinhhọcthựcvậtnóiriêng.Nólàchìakhoátrongkỹthuậtditruyềnđểnhậnbiếtvàchọn lọccáctếbàochứagenmới.Genkhángkhángsinhcóthể đ−ợcsửdụngnh−m ộ tgenđíchm a n g t í n h t r ạ n g hoặcđ ặ c điểmquantâm.Việcxác địnhcáctếbàochuyểngensẽrấtkhóvàthậmchíkhôngthể,vìchỉcómộtphầnnhỏtếbàochứagenđ− ợcchuyển(mộttronghàngngàntếbào).Quátrìnhchọnlọclàrấtcầnthiếttrongkỹthuậtditruyền vàđâylàlýdotạisaocácgenkhángkhángsinhđ−ợcsửdụngrộngrãitrongnhiềulĩnhvựccôngnghệ sinhhọckhácnhau.
Việcđánhgiáan toàncâytrồngchuyểngenchứacácmarkerkhángkhángsinh đãđ−ợccácchuyêngiaxemxétcẩnthận,cácchuyêngiađãđánhgiátínhantoàncủac â y trồngch uyểng e n chứagennptIIkhángkanamycinvàneomycin,g e naadk h á n gstreptomycinvàspect inomycinvàgenblakhángampicilin.Cácchuyêngiađãkếtluậnrằngm ứ c độrủirocủac â y trồn gchứanhữngg e n nàyđốiv ớ i quầnt h ể visinhv ậ t l à khôngđángkể.
Cácgenkhángkhángsinhsửdụngtrongcôngnghệsinhhọcthực v ật đ−ợcthunhậntừvik huẩntựnhiên.GennptIIđ−ợcphânlậptừvikhuẩnE.colitransposonTn5,c ó 264aavàkíchth−ớc 2010bp.Cácsảnphẩmcủamarkernàyđãđ−ợcphêchuẩnvà đ−ợcsửdụngrộngrãi.Cơchếchuyểncácgentừcáctếbàothựcvậttớivikhuẩnch−a đ−ợcbiếtrõ.Việcchuyểngentớicácvikhuẩnđấtc ó thểxảyr a tronglý thuyết,trên đồngruộngnơic â y trồngchuyểng e n đãđ−ợctrồng.Tuynhiên,điềunàyvẫnch−a đ−ợcxácđịnh.Cácgenkhángkhángsinhchỉkhánglạicácchấtkhángsinhđặchiệu.Cácmarkerkh ángkhángsinhkhôngc ó trongquátrìnhs ả n xuấtc á c chấtkhángsinh.Vìvậychúngkhôngcómặt trongthựcphẩmtạoratừcáccâychuyểngen.
Cácnhàkhoahọcđồngýrằngnguyênnhânchínhcủaviệckhángkhángsinhlàdolạmdụng cácchấtkhángsinhởng−ờivàthuốcthúy.Côngchúnglolắngvềviệcsửdụngcâytrồngmanggen khángkhángsinh,t u y n h i ê n rủiroc ủ a c á c chấtkhángsinh đ−ợcxemnh−làkhôngcó,thậmchíkhôngcóđủchứngcứđểnóirằngcácgenkhángkhángsinhh oặcnhữngmarkerkháclàcónhữngảnhh−ởngcóhại.
Hơnnữa,chođếnnaykhôngcóbằngchứngthínghiệmnàochothấysựchuyểngenngang( HGT)các v ật liệu dit r u y ề n từ thựcvậtsangvikhuẩncóthểxảyra[101].Trongvàinămgầnđâyk hủnghoảngkhángsinhngàycàngnhiều,liênquanđếnvấnđềvikhuẩnkhángkhángsinh,thậmch íđôikhikhángvớimọikhángsinh.Liệunhậnthứcy tếcộngđồngthayđổihaycódữliệumớivềsực huyểngenngangtừthựcvậtsangvikhuẩnđãlàmbùngnổsựtranhcãigiữacácnhàkhoahọcvàtrong cộngđồng?
Thựctếchorằngcácgenkhángkhángsinhthườngđượcđịnhvịtrêncácyếutốditruyềnđộ ng,đ−ợcpháttriểnrộngởcácquầnthểvikhuẩnvàviệcchuyểngenngangt ừ câychuyểngensangv ikhuẩnxuấthiệnvớitầnsuấtcựcthấpvàvẫnch−apháthiện đượcdướiđiềukiệnthựctế,dườngnhưkhôngphảilàcácgenkhángkhángsinhđóngv a i trònh
3.8.2.Đánh giánguycơtiềmẩncủacâychuyểngendựavàođặcđiểmhìnhthái Đặcđiểmkiểuhìnhc h o phépxácđịnhsực ó m ặ t hoặckhôngc ó mặtcủamộttínhtrạngđặc biệt,n h−thửnghiệmtínhkhángthuốctrừcỏ.Nh−vậynhữngthửn g h i ệ m c ó t h ể đ−ợcsửdụn gđểkiểmtrasựcómặthoặckhôngcómặtcủacácdòngGMOkhángthuốctrừcỏđ−ợcgọilàcácphâ ntíchsinhhọcvềtínhkhángthuốctrừcỏ.Chúngbaogồmcácthửnghiệmvềkhảnăngnẩym ầ m t r ê n môitrườngcóbổsungthuốctrừcỏđặcbiệt,quađóthấyđượcsựkhácbiệtgiữahạtchuyểngenvà hạtkhôngc h u y ể n gen.Mứcđộpháthiệndựavàokhảnăngnẩymầmcủahạtvàcácphươngpháp làmchohạtnẩymầmđểchắcchắnrằngt ấ t c ả c á c hạtn ẩ y m ầ m c ó t h ể s ố n g đ−ợc.Nhữnghạ tđãđ−ợckhẳngđịnhtrongquátrìnhkiểmtraphảiđ−ợcsửdụngđểgiúpchoc á c thửnghiệmtiếpth eođ−ợcxácthựchơn.
Cácthửnghiệmsinhhọcvềthuốctrừc ỏ phảichínhxác,khôngđắtvàcóthể đ−ợcdùngchomụcđíchthửnghiệmbanđầuvềphòngbệnhcủacáccôngtyhạtgiống.C á c côngt yđangs ử dụngcá c phântíchs in h họcv ề thuốctrừc ỏ đ ể kiểmtracácmặth à n g đặcbiệt.Hiệnna y,cácphântíchsinhhọcvềthuốctrừcỏcóthểđượcápdụngđốivớiđậutươngRoundupReady,ngô LibertyLink,bôngvàcảidầu.Trongtươnglai,cácp h â n tíchsinhhọcđượcdùngđểkiểmtrakhản ăngkhángs â u vànhiềugiốngGMOkhácnữa.
3.8.3.Vídụvềviệcđánhgiámốinguycơtiềmẩnkhiứngdụngchủng E.coli chuyÓngen Đasốsinhvậtchuyểngen(GMMs)đ−ợct ạ o r a làd o kếtquảcủacácnghiênc ứ u nhândò ngphânt ử Điềun à y c ó thểđ−ợcđịnhnghĩagiốngnh−làquát r ì n h b i ến n ạ p củacácvisinhv ậ t nhận(th−ờngsửdụngchủngE c o l i)v ớ i cácc ấ u t r ú c e p i s o m (chẳnghạnnh−plasmid)man gcáctrìnhtựmongmuốn.Cácsinhvậtbiếnđổigennàysauđóđ−ợcnuôicấyđểtáchchiếtvàti nhsạchcáccấutrúcplasmidđểsửdụngtrong chuyểngenthựcvậthoặccácứngdụngkhác.
CácthủtụcđánhgiárủirođốivớiE.colibiếnđổigencũnggiốngnhưcácbước đánhg i á củaGMMskhác.Cácnguyênlýc ơ b ả n trongviệcxácđịnhmốiđedoạvànhữngt á c độn gc ó hạiđếnsứckhoẻconngườivàmôitrườnglànhữngyêuc ầ u bắtbuộcphảic ó trongđánhgiáG MMs.Tuynhiênkểt ừ k h i cácnghiêncứucloningsửdụngcácchủngE.colilàmthểchothìđasốc ácGMMsnàycórủirothấphơn.Vìvậy,cácvisinhv ậ t biếnđổig e n nàysẽđ−ợcyêucầuđánhgiáở mứcthấpnhấtv à cácvi
224 sinhvậtnàynênđượcđánhgiátheocáchtươngxứngv ớ i nhữngmốinguyh i ể m trênthựctếmànó gâyhại.Ngườisửdụngnênthôngquacáccáchtiếpcậnthựctếvàtránhnhữngđánhgiáquáphứctạ pvànhữngtiêuchíđánhgiákhôngcócơsở.
12vàE c o l i Bđãđượcchứngminhlàkhôngmangmầmbệnhvàcónhữngthươngtổnditruyềnổ nđịnhtrongnhiễmsắct h ể củav i khuẩn.Nhữngthươngtổnnàythườngcótrongvisinhvậtdịdư ỡngvàphụthuộcthànhphầndinhd−ỡngmàđ−ợcbổsungvàomôitr−ờngnuôicấy.Hơnnữa,cácc hủngnàykhôngthểtồntạitrongđộngvậtcóvú,donhữngđộngvậtnàycónhữnggiớihạnsinhhọch oặccótínhnhạyvớicácyếutốphổbiến.
ChủngE.coliđãđ−ợcphânloạivàonhómrủiro2và3nênchúngđ−ợcquảnlýtheom ứ c độ2và3 ChủngE.coliK-
12vàBcólịchsửantoàntừlâuvàcóthểđ−ợcquảnl ý a n t o à n theochínhsáchở mứcđộ1.Chủng
E coliK-12c ó thểsốngsótđ−ợcvàingàytrongruộtng−ờivàtồntạilâutrongmôitr−ờng.
Chủngvikhuẩnnhậnthườngđượclàmyếuđivàkhôngmangmầmbệnhđốivớic o n ngườ i,đasốcácmốiđedoạđốivớisứckhoẻconngườisẽphátsinhdot ự nhiênc ủ a vậtliệud i truyềnđ ã c huyểnv à o Vìvậy,việcđánhgiárủironênđ−ợcc â n nhắc đếnnhữngảnhhưởngtiềm tàngcủacácsảnphẩmđãbiểuhiện.TheoluậtGMOsq u y địnhđốivớicácđánhgiárủirovàbấtkỳtácđộngcóhạinàoliênquanđếnvậtliệuditruyềnngoạisinh đãchuyểnvàovisinhvậthoặchệthốngvectơGMthìnênđ−ợcđ−avàobảnbáocáo.Phảixemxétc â n nhắcxemcáctrìnht ự đãchènc ó manghoạttínhsinhhọccó hạinh−độctố , cácyếutố kíchth íc h sinhtrưởnghay không,xemxétcáctrìnhtựliênquanđếnsựbiểuhiệncủagenchèn(chẳnghạnn h−promotervàcácvùngk i ể m soát)v à cácsảnphẩmkhácphảikhôngcó cáchoạttính cóhạis ẵncónh−nglại c ó cáctácđộngbấtlợikhác(nh−cácchấtgâydịứngvàcácproteinsinhkhángthể ). Điềuquantrọngnữalàphảixemxétđếncáchoạttínhsinhhọctiềmẩncủasảnphẩmđãmã hoábởigenc h è n vàbấtk ỳ ả n h h−ởngb ấ t lợinàogâyrabởiviệcgiảiphónghoặcbiểuhiệncủasả nphẩmđó,vídụnhưcácgencóthểbiếnđổitìnhtrạngbấtthườngcủatếbào(nhưc á cgenđộtbiếngâ yungth−,cácyếut ố kíchthíchsinhtr−ởng).CácthànhtốkiểmsoátsựbiểuhiệncủagentrongGMMsnênđ−ợchiểumộtc á c h rõnéttr−ớckhiGMMsđ−ợcphóngthích.
225 Đốivớicácnghiêncứucloning,hầuhếtcáctrìnhtựsẽđ−ợcthựchiệntrêncác c ấ u t r ú c e pisom,chẳnghạnnh−plasmid.Trạngtháiđ−aplasmidv à o n ê n đ−ợcc â n nhắc,vàgiốngnh−q uyđịnhchung,cácplasmidkhônglinhđộngnênđ−ợcsửdụngbấtc ứ đâucóthể.Nênchúýquantâ mđếncácgenchènmàmãhoácácsảnphẩmtiềmẩnhoạttínhsinhhọccóhại,vídụnh−độctố,cy tikinin,cácyếu tốsinhtr−ởng,cácchấtgâydịứng,cáchoócmônhoặccácchấtgâyungth−.Trong nhiềutr−ờnghợp,s ả n phẩmsẽkhôngđ−ợcbiểuhiện,giốngn h−khôngc ó c á c trìnht ự promot erxuấthiệntrongquátrìnhsaochéptrựctiếp.Vìvậy,sựbiểuhiệncácgencóhạitiềmẩnsẽkhôngc ó trongE colinếuchúngc h ị u s ự đ i ề u khiểncủacácpromoterc ủ a sinhv ậ t nhânchuẩn.Tr
Kếtquảnhậnbiếtcâytrồngbiếnđổig e n nhờs ử dụngquet hửnhanh(QuickStix)
EnviroLogixl à côngt y đ ã đưaraphươngphápthôngdụngđển h ậ n biếtcácgiốngcâytr ồngchuyểngen- đâychínhlàph−ơngphápsửdụngquethửnhanhQ u i c k S t i x Vớiph−ơngphápnày,ng−ờiứng dụngchỉcầntáchchiếtmẫuvớinướchoặcdungdịchđệm,rồinhúngquethửvàoốngđựngmẫuđóv àđợiđọckếtquả.Tuynhiên,phươngphápnàychỉđạthiệuquảkhisửdụngvớiquytrìnhvàbộkítcủa hãngvàcácbộkítđóđ−ợcthiếtkếchỉđểphântíchởmứcđịnhtính.
Trongthửnghiệmnàychúngtôiđãsửdụngphươngphápnàyvà2 bộk í t củahãngEnviroL ogixđểtiếnhànhnhậnbiếtgenCryIA(c)cótrongngôchuyểngen(nhờsửdụngbộk i t QuickStix TM
CryI A ( c ))v à genEPSPSc ótrongđậut−ơngchuyểngen(nhờsửdụngbộkitQuickStix TMRoundup Ready ). Đốiv ớ i m ẫ u hạtngôsaukhiđ−ợcnghiềnnhỏ,bổsungdịchchiếtvàoốngđựngbộtnghiềnv à đặtq uet h ử v à o trongốngc h ứ a dịcht á c h chiết,khoảng5 phútt h ì kiểmtrakếtquả.
Kếtquảthuđ−ợcởhình42chothấy:ởốngchứadịchtáchchiếtcủahạtngôk h ô n g chuy ểngenthìchỉthấyxuấthiệnmộtvạchmàutrêndảibăng(chokếtquảâmtính),trongk hiởốngchứahạtngôBtlạicó2vạchmàu(chokếtquảd−ơngtính).
Kếtquảd−ơngtínhtrongmẫungôBtchothấysựbiểuhiệncủaProteinCryIA(b) vàCryIA(c)cótronggiốngngôchuyểngenđãthínghiệm(Hình42).
Vớim ẫ u l á đ ậ u tươngchuyểngen,chúngtôicũngđãthuđượck ế t quảdươngtínhởốngc óchứadịchchiếtmôláđậut−ơngRoundupReadyvớisựxuấthiệncủa2vạchbăngtrêndải.Kết quảnàyđãchothấysựbiểuhiệncủaproteinEPSPStrongđậutươngRoundupReady.Trongk himẫuđốichứng(mẫuđậutươngkhôngchuyểngen)thìchỉcó1vạchbăngxuấthiện.Kếtquảâmt ínhnàychothấykhôngcósựbiểuhiệnc ủ a proteinEPSPStrongmẫuđốichứng.
Hình43:Kếtquảbiểuhiệncủa proteinEPSPStrongđậut−ơngRoundupReadyn h ờ s ửdụngquethửnhanh
Quacácthửnghiệmđãtiến hành,chúngtôi thấyphươngphápsửdụngquethửmiễnd ịch ELISAnàylà ph−ơngphápnhanh,kinhtế,thíchhợpvớiviệcsànglọcban đầu.Tuynhiênnólạichỉđặchiệuvớimộtsốítđốit−ợng,chẳnghạnnh−chỉđặchiệukhinhậnbiếtn ộiđộct ố biểuhiệnbởiBacillusthuringensis( CryIA(b),C r y IA(c)c ótrongngôchuyểngen)vàpr oteinCP4-EPSPS( c ótrongmộts ố dòngchuyểng e n nh− đậut−ơng,cảidầu,…).
Ngoàira,hãngEnviroLogixcònc ó mộtsốbộk í t khácdùngđển h ậ n b i ế t c â y t r ồ n g chuyểng ennhờsửdụngquethửQuickStix.S a u đ â y l à danhsáchcácbộkítcủaEnviroLogixứngdụngđể nhậnbiếtmộtsốcâytrồngchuyểngen:
MÉuThÝ nghiệm SốhiệubộK i t Tênth−ơngmại Genphânt Ých Thêigian đọckếtquả Giớihạnnhậnbiết
Lúa Hạtthóc 013 AS RB LibertyLink PAT/bar
Bông Hạt AS 016 AP Cry1F 10phút 1%
Bông Hạt AS 005 AP BollgardI I Cry2A 10phút 0,25%
Bông Hạt AS 011 AP RoundupReady CP4EPSPS 10phút 0,25%
Bông Hạt AS 013 AP LibertyLink PAT/bar 10phút 0,25%
Bông Hạt AS 003 AP Bollgard Cry1Ac 10phút 0,5%
Ngô Hạt,môlá AS 037 LT;
037 BG AgrisureR W Cry3Ađãcải biến 5phút 5–10.10 -7 %( m ô lá),
Bông Môcây,hạt AS 003 CT
LS Bollgard Cry1Ac 10phót 5-10.10 -7 % Đậut−ơ ng Hạt
5phót 0,1% Đậut−ơ ng Môlá AS 010 LS RoundupReady CP4EPSPS 5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCP4EPSPS Ngô Hạt AS 036TC
RoundupReady,Y i e l d Ga rd C B , Yi eldGardC R W ,
Ngô Hạt,bột AS 003 BG
Ngô Môcây,hạt AS 003 CR
;Naturegard,Kno ckout- Bt176 Cry1Ab
Ngô Môlá,hạt AS 016 BG, A
AS005 BollgardII Cry2Aa,Cr y2Ab
5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry2Aa,Cry2Ab
YieldGard,Yiel dGardPlus,Yiel dGardVT Cry3Bb
,bét AS008 StarLink Cry9C 5-10phót 0,125%
Ngô Môlá,hạt AS 054 BG, A
AS013LS LibertyLink PAT/bar 10phút Cósựxuấthiệncủaprotei nP A T / b a r
AS014 LibertyLink PAT/pat 5phót 1%
Ngô Hạt AS 010 BG RoundupR e a d y CP4EPSPS 5phút 0,5%
AS010LS RoundupR e a d y CP4EPSPS 5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCP4EPSPS
AS011LS RoundupR e a d y CP4EPSPS 5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCP4EPSPS
017 LS RoundupR e a d y CP4EPS PS 5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCP4EPSPS
Củcải đ−ờng Hạt AS 010SB RoundupR e a d y CP4EPS PS 5phút 0,1%
Môlá, hạt,cỏ khô AS 045 RoundupR e a d y CP4EPS PS
AS012LS BollgardII Cry1Ac,Cr y2A
5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry1Ac,Cry2A
Bông Hạt AS034ST Bollgard,Rou ndupR e a d y Cry1Ac,CP
10phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry1Ac,CP4
Bông Hạt AS 046ST BollgardI I, Ro undupR e a d y
Cry1Ac,Cry 2A,CP4EPS PS
10phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry1Ac,Cry2A,CP4
Bông Hạt AS 047ST LibertyLink
10phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry1Ac,Cry2A,P A
Ngô Môlá AS 038 LS YieldGardPlus Cry1Ab,Cry
5phút Cósựxuấthiệncủaprotei nCry1Ab,Cry3 B b
Kếtquảđọctrìnhtựmộtsốgenđ∙đ−ợcbiếnnạpvàoGMO
Đánhgiánguycơtiềmẩncủacâychuyểngendựavàocấutrúcphântử 192 3.8.2.Đánh giánguyc ơ t i ề m ẩ n c ủ a c â y chuyểngendựavàođặcđiểmhình thái
Việcđánhgiáantoànthựcphẩmc ó nguồngốct ừ c â y t r ồ n g , độngv ậ t c h u y ể n genvàđ ộngvậtnhândòngđ ề u đượcquảnlýn hưnhauvàđánhgiádựavàophươngphápsosánh.Phươngp hápsosánhđãđ−ợcpháttriểnnh−làmộtcôngcụđểnhậnbiếtrõràngnhữngđiểmgiốngnhauvàkh ácnhaugiữathựcphẩmm ớ i (thựcphẩmc ó nguồngốctừGMOs)vàthựcphẩmtruyềnthống(làth ựcphẩmcónguồngốcantoàn).V ấ n đềa n toàn thựcphẩmđ−ợcquantâm nhấtchínhlà liệucács ả n phẩmthựcp h ẩ m cónguồngốct ừ GMOscóđ ặ c t í n h gâydịứnghaykhông?
Vìv ậ y trướckhicácsảnp h ẩ m GMOstrở thànhsảnp h ẩm thựcphẩmthìchúngcầnđượcđánhgi ávềkhảnănggâydịứng.
VÝ dụ tr − ờnghợp protein Cry9C :
GenCry9Cđãđ−ợcchuyểnvàoplasmidpGI9CK,pRVA9909vàs a u đóđ−ợcbiếnnạpvà otrongngôStarLink(dòngn g ô CBH-
351).Proteinnàyđ−ợctạor a1 cách t ự nhiênt ừ vikhuẩnBacillusthuringiensissp.tolworthi,l à biếnthểcủanhómđộctốB t,kểcảCry1Ađãđượcsửdụngđểthươngmại.CácđộctốBthoạtđộn gnhờliênkếtv ớ i cácthụquanđặchiệutrêncáctếbàoruộtgiữacủacôntrùng,gâyrasựtiêuhuỷvà cuốicùnglàmthốirữabộmáytiêuhoácủacôntrùng.ProteinBtlàvậtchủđặchiệuvàk h ô n g liê nkếtvớicáctếbàocủađộngvậtcóxươngsống.
TheoTrungtâm kiểmsoátbệnh(CDC),proteinCry9Ccóchung1 vàiđặctínhp h â n tửvới cácproteinmàđã đượcbiếtlàcácchấtgâydịứngởthựcphẩm,v ì thếcơ quanbảov ệ m ô i trườngM ỹ(EPA)khôngc ấ p giấyphépchongôStarLinkdùngl à m s ả n phẩmthựcphẩmcủaconng−ời.
PAGE,Westernblots,giảitrìnhtựN- terminalaminoacid,cácthửnghiệmglycozilhoá(glycosylationtests),… đ ã xácđịnhđượcrằng:Cry9Cc ó6 2 5 aminoa c i d vàc ó k í c h thước1878bp.
Quađ á n h g i á c h o thấy:phạmv i ảnhhưởngtácđộngđếnkhảnănggâydịứngc ủ a cácsản phẩmcóchứaproteinCry9Cđốivớiconngườilàthấp,xấpxỉ1%đốivớingườitrưởngt h à n h v à 5
% đốivớitrẻe m dưới7 tuổi.Ngườit aướctínhrằngkhoảng7,5%dânsốcóbiểuhiệndịứnghoặcm ẫncảmvớimộtsốthựcphẩm.
- Thửnghiệmliênkếthuyếtthanh:Cácmẫuhuyếtthanhđãmãhoáđượcphântíchtừ28ngườicóp hảnứngdịứngvớingôStarLinkthìcũngnhạycảmcaođốivớicácchấtdịứngkhácnhau.Cácnghi êncứucủahọcóthểkhôngxácđịnhđ−ợcmốiliênhệgiữaCry9Cvàviệcsảnxuấtl−ợngIgEđặchi ệuvớiCry9Ccóthểxácđịnh.
* Đánhgiárủirođếnmôi tr − ờng và hiện t − ợngtrôi gen sangcácloàikhác
Nhữngcuộctranhluậnxungquanhảnhhưởngcủacâychuyển genđốivớimôitrườngn gàyc à n g phứctạp,căngthẳngvàrấtnhạycảm.Vấnđềnàyngàycàngphứctạphơnkhicó cácnghiê ncứumớiđ−ợccôngbố.Vậycây chuyểng en có an toànvớim ô i tr−ờnghaykhông?
Nhữnghậuquảgìcót h ể xảyrakhiđ−acácgenmớiv à o trongmôitr−ờngl à m ộ t câu hỏiđ ầutiênv à quantrọng nhấtkhinghiêncứuứngdụngcácvisinhvậtbiến dổigen(GMMs).Cầnphảix e m xétđểtrảlờic â u hỏirằng:liệucácgenđãđ−ợcchuyểnvàoGM Mscógâyhạigìchoconngười,câytrồng,vậtnuôihayđộngthựcvậthoangdãhaykhông?
Trướctiên,đánglongạilàbấtkỳGMMsnàođưavàomôitrường đềucóthểđộtbiếnthànhmầmbệnhchođộngvậth ay thựcvật.Tuynhiên,rủironày đãđ−ợcchứngminhlàkhócóthểxảyratrongthựctếvìkhảnănggâybệnhphụthuộcvàoloạigen,th ểnhậnvàphápluậttạinhữngnơiđangxemxétứngdụngGMMs.Trongsốtấtcảcácloạig e n sửdụng trongcôngnghệGMMs,longạilớnnhấtlàgenkhángkhángsinh.Lýdocủasựl o ngạinàylàsựxuất hiệntínhkhángkhángsinhở c á c chủngphânlậptừcácbệnhphẩm. Đốivớicâytrồngbiếnđổigent h ì l o ngạic h í n h v ề ảnhhưởngc ủ a c â y c h u y ể n genđốiv ớimôitr−ờnglàkhảnăngtạoraloàicỏmớithôngqualaichéoxavớicáccâyhọhànghoangdạihoặ cđơngiảnhơnlàtồntạilâutrongtựnhiên.Khảnăngnàycóthểxảyra,đượcđánhgiátrướcquátrìn hchuyểngenvàđ−ợckiểmsoátsaukhicâyđ−ợc đ−aratrồng.Khảnăngxẩyralaichéoxagiữagenđ−ợcchuyểnvàovớicáccâycỏhọhàng,cũngnh
Sựtrôigentrongthựcvậtxảyrakhicóhiệnt−ợngthụphấntừcâynàysangcâykhác,nếuphấnt ừ c â y c h u y ể n genđ−ợcdic h u y ể n bởigióhoặccôntrùngthìđềuliênquan đếncáccâykhôngchuyểngen,cácgenchuyểncóthểbịtíchhợpvàogenomecủathếhệconcháu, dođólàmthayđổitínhtrạngcủathếhệconcháu.Trướcđâyvấnđềtrôigentừcâychuyểngenđãnh ấnmạnhvềsựdichuyểncủagenchuyểntớicácmốiquanhệvớicâytrồnghoangdại,trongkhiđóả nhh−ởngcủatínhkhángcôntrùnglạibịbỏqua.
Giảiphápvềhiệnt − ợng trôigenở một số cây trồng:
Ngôl à loàic â y t h ụ phấnc h ủ yếunhờgió,khoảng97%giaophốicùngg i ố n g giữacácc âyvớinhauvàsựthụphấnxảyratrongkhoảng200m.ĐểkiểmtragiảthuyếtvềsựtrôigentừngôBtsa ngcácgiốngngôbìnhthườngđểtạorađộctínhBttrongngôkhôngchuyểngen,ngườit a đãkiểmtra cácmẫuhạtcủangôkhôngchuyểngenmà đ−ợctrồnggầnvớingôchuyểngen KếtquảkiểmtrachothấyrằngnồngđộđộctínhBt-
% c ủ a hạtc ó độct ốCry1A(b)giảmsovớingôchuyểngen.Nhữngkếtquảnàychothấyhiệnt−ợn gtrôigengiántiếpthôngquathụphấnt ừ ngôchuyểngenlànguyênnhângâyrasựt ạ o thànhđộctính Bttronghạtcủanhữngcâykhôngchuyểngen.
+HiƯnt−ỵngtrôigent ừ ngôBtchuyĨngentớingôBtkhôngchuyĨng e n xảyrặ khoảngcách31m +CácthửnghiệmELISAvềngôkhôngchuyểngenchothấyrằngnồngđộđộctínhBtCry1A(b)v àtỷlệ
%Cry1A(b)trongcáchạtgiảmtheokhoảngcáchtrồngsovớingôBtchuyểngen.Cónghĩalànồng độCry1A(b)trongcáchạtlaiBtlà260±19ng/g.Nồng độđộctínhBttrongngôkhôngchuyểngencaonhấttrongkhoảngcách2msovớingôchuyểngenv àgiảmnhanhtheokhoảngcách.ởkhoảngcách31mthìnồngđộCry1A(b)trongcác hạtcủa ngôkhôngchuyểngen là4,4±1,2ng/ gtươngđươngvới1,7%sovớinồngđộtronghạtcủanhữngcâytrồngsátvớicâychuyểngen[41].
Nh−vậygiảiphápđểquảnlý hiệnt−ợngtrôigenở ngôchuyểngenlàtrồngởkhoảngcách3 1m.
Hiện t − ợng trôi gen ở lúa
Hạtphấnlúamấttácdụngsau5phútsaukhirơiranếunókhôngđ−ợcthụphấn.Trongm ộ t vàitr−ờ nghợpđặcbiệtthìhạtphấncóthểtồntạiđộclậpđược15phútngoàimôitrường.Sựdichuyểnth eophươngngangcủahạtphấnrấthạnchế.10mlàkhoảngcáchc ầ n thiếtđểt ạ o rac â y l a i vàc ó th ểtránhđ−ợcsựnhiễmbệnhvớinhữngh ạ t phấntừcáccánhđồnggầnkề[80].
Tuynhiên,sựthơphấnchéocịngchỉxảyrặ mộtvàiphạmvi,tỷ lƯ thơp h ấn chéophơthuộ cvàoyếutốkhíhậuvànhữngyếutốvềsựđadạngkhác.Tỷlệgiaophốicùnggiốngth−ờngxảyranhi ềuhơnởcácgiốnglúaIndicavàmộtsốloàilúadạihơnlàở giốnglúaJaponica[104].Lord(1935)đ ãt ì m rarằngvớiđiềukiệnkhíh ậ u khácnhauởhaiquậncủaSriLankathìtỷlệgiaophốitựnhiênth
0.67%,trongkhiđótheoBrown(1957)thìtỷ lệthụphấnchéotự nhiênởMalaysialà 0.41%.C ò n t h e o SrinivasanvàSubramanian(1961)thìt ỷ l ệ t h ụ phấnc h é o t ự nhiênởấnđộchỉlàtừ0.04
Cácthínghiệmchothấyrằngtrôigengiántiếpthôngquathụphấntừlúachuyểngenk h á n g t h u ố c t r ừ cỏ tớic â y l ú a b ê n cạn h k h ô n g c h u y ể n g en l à 0 , 0 1 -
Trôigentừcâytrồngtớicâyhoang dại:genchuyểnđ−ợcđ−avàolúathìcũng sẽ v ào qu ần th ể l ú a hoangdại, mặc d ù tỷlệ thụ p h ấn ch éo là rấtthấp[ 53 ] Vídụtr ô i gent ừ k h o ả n h đ ấ t t h í n g h i ệ m n h ỏ c ủ a l ú a c h u y ể n g e n k h á n g t h u ố c t r ừ c ỏ tớil ú a h o an g dạilàtừ0-
0,06%ởTrungQuốcvàChâuâu[43,95].Tươngtựnhưvậy,Gealyv à Cs(2003)trướcđó cũngcónhữngthínghiệmvềtrôigentừlúađ−ợcgieotrồngtớilúahoangdạivàchúýrằngtỷl ệlaigiữacâytrồngvàloàihoangdạicủachúngxấpxỉ0 , 0 1 -
1 % Họ cũ n g chú ý r ằn g tr ô i g en có thểx ảy ra th eo định hướngtừ cây trồ ng tớ i l o à i ho angdạihoặctừloàihoangdạitớicâytrồng.
Tuyv ậ y , t ỷ l ệ t ự t h ụ phấnc ủ a lúavàhầuhếtcácloàihoangd ạ i c ủ a chúngl à cao,nênc â y trồngn à y đ−ợcđánhgiál à l o à i rủir o thấptrongmốil i ê n quanđếncácc â y trồngchuyểnge nkhácnhau[123].Tuynhiên,nếugenchuyểnđủmạnhtrongđiềuk i ệ n thuậnlợithìnócóthểnha nhchóngđ−ợcchuyểnvàocácquầnthểhoangdạicủachúng,mặcdùt ỷ lệthụphấnchéolà rấtth ấp[49].Bêncạnhđósựtr ô i gentrongcác loàitựthụphấnnhưlúamì,đậutươngcũngrấtítkhixảyr avàhiệnt−ợngtrôigengiữacácloàinàyvớiquầnthểhoangdạilàbằngkhông[114].
Giảiphápđểquảnl ý sựtrôig e n t ừ c â y trồngchuyểngen(GMCs)làtrồngchúngở khoả ngcáchantoànvàsaukhitrồngt a sẽđánhgiákhảnăngtrôig e n củaG M C s bằngcácphươngphá pnh−ELISA,PCR,laiADN,
Proteintồntạitươngđốibềntrongđấtvàđượcphânloạinhưlàdạngbấtđộngvìchúngkhôn gcókhảnăngdichuyểnhoặcthấmquan−ớcngầm.Cácproteinkhôngbềnvữngtrongđ i ề u kiệnđ ấtaxit.Khiphơidướiánhnắngmặttrờichúngbịphânhuỷnhanhchóngdướitácđộngcủatiacựctí m.
Cácchuyêng i a đãtiếnhànhnhữngnghiêncứuđộclậpnhằmđiềutracácảnhhưởngcủacây trồngBtđốivớisinhvậtđấtvàcácloàicôntrùngkhácđ−ợcxemlàcóíchtrongnôngnghiệp.Kếtqu ảchothấy,chúngkhônggâyraảnhhưởngbấtlợiđốivớic á c sinhvậtđấtkhôngphảilàđíchtấncô ngcủachúng,thậmchíngaycảkhicácsinhvậtnàyđ−ợcxửlý Btvớil i ề u l−ợngcaohơnnhiềusov ớithựctếcó thểxảyr a tr on g điềukiệntrồngtr ọt Nghiêncứ u củaC ơquanBảo vệ Môi tr−ờngMỹ(EPA)cũngchothấykhôn gcósựthayđổinàotrongquầnthểvisinhvậtđấtgiữa cáccánhđồngtrồngc â y chuyểng e nBt vàcánhđồngtrồngcácgiốngcâytruyềnthống[47],cũngnh−khôngquansátthấysựkhácbiệtgiữac áccánhđồngtrồngc â y chuyểngenBtvàcâykhôngchuyểngenBt[48].
Mộtv ấ n đềnảysinhtrongnghiêncứuliênquanđếna n toàncủavisinhvậtchuyểngen(G MM)trongmôitr−ờngl à s ố p h ậ n c ủ a c á c ADNngoạibàotrongmôitr−ờngbịảnhh−ởngbởic ácđiềukiệnsinhhọcvàphisinhhọccủamôitrường.Nhiềuv i khuẩns ả n sinhc á c chấtđểphânhu ỷc á c A D N ngoạilai.Tuynhiên,ng−ờitavẫnpháthiệnđ−ợcsựtồnt ạ i củacácADNcó trọngl−ợn gphântửcaotrongđấtvànướckhôngbịphânhuỷ.
Ngoàinhữngmốil o ngạivềcâytrồngchuyểngen,ngườit a c ũ n g c ó m ố i quant â m đếnv isinhvậtchuyểngen(GMMs).Rằngliệuviệcđ−aGMMsvàomôitr−ờngtựnhiêncógâyrasựmất cânbằngsinhtháidosựt−ơngtáclẫnnhaugiữacácloàitronghệsinhtháihaykhông?
Haivídụđiểnhìnhkhôngliênquanđếnvikhuẩnl à virusmyxomac ủ a t h ỏ v à b ệ n h n ấ m củac â y đ u đ ủ HàLan.Khôngchỉmầmbệnhn à y g i ế t k ý c h ủ m à cònd ẫ n đếnthayđổicấutrúcquầnxãsaukhitiêudiệtđộngvật ăn cỏ haymộtcấu phầnquantrọngcủavùng rừngrụngl á sớmở Châu Âu.N ế u l o ngạil i ê n quanđếnviệcđưac á c GMMsgâybệnhvàomôitrườngt h ì r õ ràngl à c ầ n p hảixemxétđếncảvaitròquantrọngcủakýchủtronghệsinhthái.
MặcdùgiảiphóngGMMstrongphạmvihẹpkhônggâyratácđộngc ó hại.Nghiêncứuchủyếuhướ ngv à o giảiquyếtcácvấnđềliệucótácđộngnàodocạnhtranhkhốcliệt giữaGMMsvàvisinhvậ tbảnđịahaytươngtácgiữavikhuẩnvàthựckhuẩnthể? ĐóchínhlànhữngvấnđềcóthểnảysinhkhiđưaGMMsvàomôitrường.
- Cầnphảisửdụngcôngnghệhiệnđạiđểhiểusâuhơnbiếnđộngquầnthểvisinhvậttrongmôitr− ờngtựnhiên.Chẳnghạnnh−,mộtcâuhỏiđ−ợcđặtravớicácsinhvậtbậccaolàliệuchứcnăngh ệsinhtháibịpháh u ỷ khiđadạngsinhhọcquầnxãgiảmhaykhông? liệumấtđimộtphầnnhỏquầnxãcógâypháhuỷchứcnăngcủanóhaykhông…
- Rủir o khisửdụngG M M s phụthuộcv à o đặcđiểmcủavisinhv ậ t vàvịtríứ n g dụng.RủiroquantrọngnhấtvớiGMMslàchuyểncácgentáitổhợpsangcácsinh vậtkhácvàpháhủcân bằngsinhthái.Trongcảhaitr−ờnghỵpnàyrđirocó th Ĩ xảyrặ mứcth ấpnhấtnếusửdụngc á c GMMsmangcácđoạng e n chuyểnb ề n v ữ n g vàkhôngcócác v ật liệu tái tổ hợpkhôngcần thiếtcóthểmangưuthếchọnlọchơncácsinhvậtkhácđãcómặttron gmôitr−ờng.
- Hiểuvềhậuquảcủaviệcđ−acácgenmớivàovikhuẩncầnxemxétđếnditruyềnquầnthểvikh uẩnvàsinhtháihọcquầnthểcũngnh−cáccơchếđiềuhoàbiểuhiệngenvàhoạtđộngchứcnăn gcủacácproteinmàgenđómãhoácho.Rõràngnhânt ố quantrọnglàbảnchấtvàsựbềnvững củacấutrúcgencầnđ−ợcđánhgiábằngcáckỹthuậtphânt ử v à t ế bàot r o n g phòngt h í ngh iệm.Ngoàiram ộ t v ấ n đềquantrọngc ầ n xemxétđếnđól à xácsuấtcácgenchuyểncóthểl a n t ruyềnt r o n g môitrườngthôngquacáccơchếtraođổitựnhiênvớicácvisinhvậtkhác.Quantr ọngnhấtlàcầnpháttriểncôngnghệchophéptiênđoánbiếnđộngsinhtháiquầnxãvisinhvậtkh icómặtcácGMMs.
Cácthửnghiệmtiếnhànhtrênchó,chuộtlang,thỏ,cá,ếchvàchimc h o thấyproteinBtkhôn ggâyranhữngả n h hưởngcóhại.Cũngc ầ n nhấnmạnhrằng,độctốhoàntoànkhônggâyảnhhưởn gđếncácloàicôntrùngcóíchhoặcđộngvậtănthịtnh−ongmậtvàbọcánhcứng.Năm1996,mộtbá ocáovềảnhhưởngcóhạicủahạt phấnt ừ câ y ngôBtđếnấutrùngcủaloàibướmMonarch.Báoc á o nàyđãgâyramốiquantâmvàlongạivềnhữngrủiromàthựcvậtBtcóthểgâyrađốivớisinhvậtkh ôngcầndiệt.Tuynhiên,nhữngnghiêncứug ầ n đ â y chot h ấ y ngôBtgâyraảnhh−ởngkhông đángkểđốivớiquầnthểbướmMonarchtrêncánhđồng.Cácnghiêncứuđiđếnkếtluậnrằng,hầuhết cácgiốnglaithươngmại,proteinBtđượcbiểuhiệnvớinồngđộrấtthấptronghạtphấnvànghiên cứutrongphòngthínghiệmcũngn h−trêncánhđồngchothấymọimậtđộhạtphấnđềukhônggâyả nhhưởngcóhạitrênđồngruộng.
* Đánhgiánhữngrủirocủa gen khángkháng sinh trong các câytrồngchuyển gen
Genkhángkhángsinhlàmộtcôngcụquantrọngtrongkỹthuậtditruyềnnóic h u n g vàtron gcôngnghệsinhhọcthựcvậtnóiriêng.Nólàchìakhoátrongkỹthuậtditruyềnđểnhậnbiếtvàchọn lọccáctếbàochứagenmới.Genkhángkhángsinhcóthể đ−ợcsửdụngnh−m ộ tgenđíchm a n g t í n h t r ạ n g hoặcđ ặ c điểmquantâm.Việcxác địnhcáctếbàochuyểngensẽrấtkhóvàthậmchíkhôngthể,vìchỉcómộtphầnnhỏtếbàochứagenđ− ợcchuyển(mộttronghàngngàntếbào).Quátrìnhchọnlọclàrấtcầnthiếttrongkỹthuậtditruyền vàđâylàlýdotạisaocácgenkhángkhángsinhđ−ợcsửdụngrộngrãitrongnhiềulĩnhvựccôngnghệ sinhhọckhácnhau.
Việcđánhgiáan toàncâytrồngchuyểngenchứacácmarkerkhángkhángsinh đãđ−ợccácchuyêngiaxemxétcẩnthận,cácchuyêngiađãđánhgiátínhantoàncủac â y trồngch uyểng e n chứagennptIIkhángkanamycinvàneomycin,g e naadk h á n gstreptomycinvàspect inomycinvàgenblakhángampicilin.Cácchuyêngiađãkếtluậnrằngm ứ c độrủirocủac â y trồn gchứanhữngg e n nàyđốiv ớ i quầnt h ể visinhv ậ t l à khôngđángkể.
Cácgenkhángkhángsinhsửdụngtrongcôngnghệsinhhọcthực v ật đ−ợcthunhậntừvik huẩntựnhiên.GennptIIđ−ợcphânlậptừvikhuẩnE.colitransposonTn5,c ó 264aavàkíchth−ớc 2010bp.Cácsảnphẩmcủamarkernàyđãđ−ợcphêchuẩnvà đ−ợcsửdụngrộngrãi.Cơchếchuyểncácgentừcáctếbàothựcvậttớivikhuẩnch−a đ−ợcbiếtrõ.Việcchuyểngentớicácvikhuẩnđấtc ó thểxảyr a tronglý thuyết,trên đồngruộngnơic â y trồngchuyểng e n đãđ−ợctrồng.Tuynhiên,điềunàyvẫnch−a đ−ợcxácđịnh.Cácgenkhángkhángsinhchỉkhánglạicácchấtkhángsinhđặchiệu.Cácmarkerkh ángkhángsinhkhôngc ó trongquátrìnhs ả n xuấtc á c chấtkhángsinh.Vìvậychúngkhôngcómặt trongthựcphẩmtạoratừcáccâychuyểngen.
Cácnhàkhoahọcđồngýrằngnguyênnhânchínhcủaviệckhángkhángsinhlàdolạmdụng cácchấtkhángsinhởng−ờivàthuốcthúy.Côngchúnglolắngvềviệcsửdụngcâytrồngmanggen khángkhángsinh,t u y n h i ê n rủiroc ủ a c á c chấtkhángsinh đ−ợcxemnh−làkhôngcó,thậmchíkhôngcóđủchứngcứđểnóirằngcácgenkhángkhángsinhh oặcnhữngmarkerkháclàcónhữngảnhh−ởngcóhại.
Hơnnữa,chođếnnaykhôngcóbằngchứngthínghiệmnàochothấysựchuyểngenngang( HGT)các v ật liệu dit r u y ề n từ thựcvậtsangvikhuẩncóthểxảyra[101].Trongvàinămgầnđâyk hủnghoảngkhángsinhngàycàngnhiều,liênquanđếnvấnđềvikhuẩnkhángkhángsinh,thậmch íđôikhikhángvớimọikhángsinh.Liệunhậnthứcy tếcộngđồngthayđổihaycódữliệumớivềsực huyểngenngangtừthựcvậtsangvikhuẩnđãlàmbùngnổsựtranhcãigiữacácnhàkhoahọcvàtrong cộngđồng?
Thựctếchorằngcácgenkhángkhángsinhthườngđượcđịnhvịtrêncácyếutốditruyềnđộ ng,đ−ợcpháttriểnrộngởcácquầnthểvikhuẩnvàviệcchuyểngenngangt ừ câychuyểngensangv ikhuẩnxuấthiệnvớitầnsuấtcựcthấpvàvẫnch−apháthiện đượcdướiđiềukiệnthựctế,dườngnhưkhôngphảilàcácgenkhángkhángsinhđóngv a i trònh
3.8.2.Đánh giánguycơtiềmẩncủacâychuyểngendựavàođặcđiểmhìnhthái Đặcđiểmkiểuhìnhc h o phépxácđịnhsực ó m ặ t hoặckhôngc ó mặtcủamộttínhtrạngđặc biệt,n h−thửnghiệmtínhkhángthuốctrừcỏ.Nh−vậynhữngthửn g h i ệ m c ó t h ể đ−ợcsửdụn gđểkiểmtrasựcómặthoặckhôngcómặtcủacácdòngGMOkhángthuốctrừcỏđ−ợcgọilàcácphâ ntíchsinhhọcvềtínhkhángthuốctrừcỏ.Chúngbaogồmcácthửnghiệmvềkhảnăngnẩym ầ m t r ê n môitrườngcóbổsungthuốctrừcỏđặcbiệt,quađóthấyđượcsựkhácbiệtgiữahạtchuyểngenvà hạtkhôngc h u y ể n gen.Mứcđộpháthiệndựavàokhảnăngnẩymầmcủahạtvàcácphươngpháp làmchohạtnẩymầmđểchắcchắnrằngt ấ t c ả c á c hạtn ẩ y m ầ m c ó t h ể s ố n g đ−ợc.Nhữnghạ tđãđ−ợckhẳngđịnhtrongquátrìnhkiểmtraphảiđ−ợcsửdụngđểgiúpchoc á c thửnghiệmtiếpth eođ−ợcxácthựchơn.
Cácthửnghiệmsinhhọcvềthuốctrừc ỏ phảichínhxác,khôngđắtvàcóthể đ−ợcdùngchomụcđíchthửnghiệmbanđầuvềphòngbệnhcủacáccôngtyhạtgiống.C á c côngt yđangs ử dụngcá c phântíchs in h họcv ề thuốctrừc ỏ đ ể kiểmtracácmặth à n g đặcbiệt.Hiệnna y,cácphântíchsinhhọcvềthuốctrừcỏcóthểđượcápdụngđốivớiđậutươngRoundupReady,ngô LibertyLink,bôngvàcảidầu.Trongtươnglai,cácp h â n tíchsinhhọcđượcdùngđểkiểmtrakhản ăngkhángs â u vànhiềugiốngGMOkhácnữa.
VídụvềviệcđánhgiámốinguycơtiềmẩnkhiứngdụngchủngE.coli chuyÓngen …………………………………………….…………………… 202 3.9 Kếtquảứngdụngtinsinhhọcđểlậpbảnđồchỉthịphântửc ủagenliênquanđếnbệnhđạoônvàgenchịuhạnở lúa ……………………………………………………………… 205 3.9.1 KếtquảnghiêncứulậpbảnđồgenkhángđạoônởLúaDựchiêm 205 3.9.1.1.Đánhgiáphảnứngbệnh
chuyÓngen Đasốsinhvậtchuyểngen(GMMs)đ−ợct ạ o r a làd o kếtquảcủacácnghiênc ứ u nhândò ngphânt ử Điềun à y c ó thểđ−ợcđịnhnghĩagiốngnh−làquát r ì n h b i ến n ạ p củacácvisinhv ậ t nhận(th−ờngsửdụngchủngE c o l i)v ớ i cácc ấ u t r ú c e p i s o m (chẳnghạnnh−plasmid)man gcáctrìnhtựmongmuốn.Cácsinhvậtbiếnđổigennàysauđóđ−ợcnuôicấyđểtáchchiếtvàti nhsạchcáccấutrúcplasmidđểsửdụngtrong chuyểngenthựcvậthoặccácứngdụngkhác.
CácthủtụcđánhgiárủirođốivớiE.colibiếnđổigencũnggiốngnhưcácbước đánhg i á củaGMMskhác.Cácnguyênlýc ơ b ả n trongviệcxácđịnhmốiđedoạvànhữngt á c độn gc ó hạiđếnsứckhoẻconngườivàmôitrườnglànhữngyêuc ầ u bắtbuộcphảic ó trongđánhgiáG MMs.Tuynhiênkểt ừ k h i cácnghiêncứucloningsửdụngcácchủngE.colilàmthểchothìđasốc ácGMMsnàycórủirothấphơn.Vìvậy,cácvisinhv ậ t biếnđổig e n nàysẽđ−ợcyêucầuđánhgiáở mứcthấpnhấtv à cácvi
224 sinhvậtnàynênđượcđánhgiátheocáchtươngxứngv ớ i nhữngmốinguyh i ể m trênthựctếmànó gâyhại.Ngườisửdụngnênthôngquacáccáchtiếpcậnthựctếvàtránhnhữngđánhgiáquáphứctạ pvànhữngtiêuchíđánhgiákhôngcócơsở.
12vàE c o l i Bđãđượcchứngminhlàkhôngmangmầmbệnhvàcónhữngthươngtổnditruyềnổ nđịnhtrongnhiễmsắct h ể củav i khuẩn.Nhữngthươngtổnnàythườngcótrongvisinhvậtdịdư ỡngvàphụthuộcthànhphầndinhd−ỡngmàđ−ợcbổsungvàomôitr−ờngnuôicấy.Hơnnữa,cácc hủngnàykhôngthểtồntạitrongđộngvậtcóvú,donhữngđộngvậtnàycónhữnggiớihạnsinhhọch oặccótínhnhạyvớicácyếutốphổbiến.
ChủngE.coliđãđ−ợcphânloạivàonhómrủiro2và3nênchúngđ−ợcquảnlýtheom ứ c độ2và3 ChủngE.coliK-
12vàBcólịchsửantoàntừlâuvàcóthểđ−ợcquảnl ý a n t o à n theochínhsáchở mứcđộ1.Chủng
E coliK-12c ó thểsốngsótđ−ợcvàingàytrongruộtng−ờivàtồntạilâutrongmôitr−ờng.
Chủngvikhuẩnnhậnthườngđượclàmyếuđivàkhôngmangmầmbệnhđốivớic o n ngườ i,đasốcácmốiđedoạđốivớisứckhoẻconngườisẽphátsinhdot ự nhiênc ủ a vậtliệud i truyềnđ ã c huyểnv à o Vìvậy,việcđánhgiárủironênđ−ợcc â n nhắc đếnnhữngảnhhưởngtiềm tàngcủacácsảnphẩmđãbiểuhiện.TheoluậtGMOsq u y địnhđốivớicácđánhgiárủirovàbấtkỳtácđộngcóhạinàoliênquanđếnvậtliệuditruyềnngoạisinh đãchuyểnvàovisinhvậthoặchệthốngvectơGMthìnênđ−ợcđ−avàobảnbáocáo.Phảixemxétc â n nhắcxemcáctrìnht ự đãchènc ó manghoạttínhsinhhọccó hạinh−độctố , cácyếutố kíchth íc h sinhtrưởnghay không,xemxétcáctrìnhtựliênquanđếnsựbiểuhiệncủagenchèn(chẳnghạnn h−promotervàcácvùngk i ể m soát)v à cácsảnphẩmkhácphảikhôngcó cáchoạttính cóhạis ẵncónh−nglại c ó cáctácđộngbấtlợikhác(nh−cácchấtgâydịứngvàcácproteinsinhkhángthể ). Điềuquantrọngnữalàphảixemxétđếncáchoạttínhsinhhọctiềmẩncủasảnphẩmđãmã hoábởigenc h è n vàbấtk ỳ ả n h h−ởngb ấ t lợinàogâyrabởiviệcgiảiphónghoặcbiểuhiệncủasả nphẩmđó,vídụnhưcácgencóthểbiếnđổitìnhtrạngbấtthườngcủatếbào(nhưc á cgenđộtbiếngâ yungth−,cácyếut ố kíchthíchsinhtr−ởng).CácthànhtốkiểmsoátsựbiểuhiệncủagentrongGMMsnênđ−ợchiểumộtc á c h rõnéttr−ớckhiGMMsđ−ợcphóngthích.
225 Đốivớicácnghiêncứucloning,hầuhếtcáctrìnhtựsẽđ−ợcthựchiệntrêncác c ấ u t r ú c e pisom,chẳnghạnnh−plasmid.Trạngtháiđ−aplasmidv à o n ê n đ−ợcc â n nhắc,vàgiốngnh−q uyđịnhchung,cácplasmidkhônglinhđộngnênđ−ợcsửdụngbấtc ứ đâucóthể.Nênchúýquantâ mđếncácgenchènmàmãhoácácsảnphẩmtiềmẩnhoạttínhsinhhọccóhại,vídụnh−độctố,cy tikinin,cácyếu tốsinhtr−ởng,cácchấtgâydịứng,cáchoócmônhoặccácchấtgâyungth−.Trong nhiềutr−ờnghợp,s ả n phẩmsẽkhôngđ−ợcbiểuhiện,giốngn h−khôngc ó c á c trìnht ự promot erxuấthiệntrongquátrìnhsaochéptrựctiếp.Vìvậy,sựbiểuhiệncácgencóhạitiềmẩnsẽkhôngc ó trongE colinếuchúngc h ị u s ự đ i ề u khiểncủacácpromoterc ủ a sinhv ậ t nhânchuẩn.Tr
−ờnghợpsảnphẩmgencókhảnăngtăngtínhđộchạiởnơimàkhôngcósựb i ể u hiệnnàođ−ợcđo ántrước,hoặcnơimàsảnphẩmđãbiểuhiệnđượcsinhraởdạngkhônghoạttínhthìđól à điềukhôn gm a y m ắ n C á c sảnphẩmg e n c ủ a sinhv ậ t nhânc h u ẩ n thườngkhônghoạtđộngbởihệthốn gthểnhậnthuộcsinhvậtnhânchuẩnthiếuc á c conđ−ờngth−ờngbiếnsauchuyểndịch.Hơnnữac ácproteinđãbiểuhiệnthườngt í c h tụ tr on g tế bàogiốngnhưcácthểhìnhtrònkhônghoàtan,hoặ ckhôngthểtiếtra được,vàsẽkhôngđưaramứcđộrủirotươngtựnếuđãbiểuhiệntronghệthốngsinhvậtnhânchuẩn. Vídụtr−ờnghợpnhiềucytokininkhôngglycozylhoácócảhoạttínhsinhhọcvàhàotanđ−ợckhibiể uhiệntrongE.coli.Trìnhtựnênđ−ợcnghiêncứumộtc á c h cẩnthận đểđảmbảorằngcác promo tercủasinhvậtnhânchuẩnđãđượcsinhratrongsuốtcácbướcthựchiệncloninghoặcdosựt h í c h h ợtrìnht ự củac á c v ù n g đ i ề u khiển.Nếusựbiểuhiệnx ả y ra,sauđóhoạttínhsinhhọcvàkhảnăng sinhmiễndịch/khảnănggâydịứngcủasảnphẩmphảiđ−ợcxemxétvàcânnhắc.
Ph−ơngpháptiếpcận đ−ợcđ−ar a khic á c gencủasinhvậtnhânchuẩnc ó hại đ−ợcnhândòngvàcóthểđ−ợcbiểuhiệntrongE.coli,đặcbiệtnếunómãhoáyếutốditruyềncókhả nănggâybệnh.Vídụnh−genđộctốcủavikhuẩnmàvẫncócáctrìnht ự điềukhiểnt ự nhiênc ủ a n ó c ó thểđ−ợcbiểuhiện,xửl ý vàtiếtr a trongE.colivà điềunàycóthểlàmxuấthiệncácchấtgâyđộc.Cácchấtnàycóthểtạorarủironhiềuhơnđốivớisứ ckhoẻconng−ờihơnlàchủngnhận.T−ơngtự,sựbiểuhiệntrongE.colic ủ acácyếutốditruyềnx âmnhậpcủavikhuẩn(vídụnh−cácgenYersiniainv)cóthểl à kếtquảc ủ a sựxâmnhậpv à l i ê n q uanđếnsựg i a tăngkhảnăngsinhbệnhsovớichủngnhận.
Đánh giá rủirocủa chủng E coliđốivớimôi tr − ờng :
DùchủngE.coliđãbiếnnạpcókhảnăngsốngsóttrongmôitrườnghaykhôngthìđâyl à m ộ t m ố i quant â m lớn.Hầuhếtcácchủngđãđ−ợclàmy ế u điđềusốngdịd−ỡngv à sẽhiếmthấyngo ạitrừtrongmôitrườngđặchiệu.Tuynhiên,cácchủngE coliđãbịthươngtổnthườngtồntạitrong môitr−ờngđ−ợcvàingày.
Tầnsốgenngangchuyểnthànhcôngvàotrongmôitrườngthườngrấtthấp,đặcbiệtl à nơi m à cácc ấ u trúckhôngl i n h độngđ−ợcsửdụng.Tuynhiên,c á c genđiềukhiểnplasmidđòihỏip hảixemxétchitiết,việcbiếnnạpthụđộngnênđ−ợccânnhắcv ề nhữngrủirocókhảnăngxảyra. Hạnchếkhảnăngmàbấtkỳgennàocóthểđ−ợcchuyểncầnphảicóđiểmc−trútrongtựnhiênc ủachínhgenđó.Ngườitacóthểthấyr ằ n g trìnht ự “ có hại đốiv ớ i mô i trường”(vídụnhưmar kerkhángthuốc)c ó thểxuấthiệntrongtự nhiênvàvìv ậy sựtácđộngcủ a hiệuứngchuyểns ẽ đ−ợc làmgiảmbớt.Tuynhiên,hậuquảcủav iệc chuyểncácgenđãchènnênđ−ợcđánhgiá,đặcbiệtnếug e n chèncólợiđốivớicácmầmbệnhxảyratrongtựnhiênhoặccólợiđốivớicácsinhvậtkhác.
TrongmộtvàitrườnghợpcácGMMscóthểítgâyrarủirođốivớisứckhoẻconngườinhưng cókhảnănggâyramốinguyhiểmđốivớicácloàikhác.Vìvậycầnxemx é t cácảnhhưởngbấtlợ itiềmẩncủacácsảnphẩmđãmãhoáđốivớicácsinhvậtnày.
E.colibiếnđổiditruyềnđểđịnhcưhoặccóảnhhưởngbấtlợiđến cácloàiđộngvật.Phươngph áptiếpcậnnêncẩnthậnkhicácgenđãnhândòngmàmãhoácácsảnphẩmc ó thểc ó hạiđ ố i vớiđộn gv ậ t c ó thểđượcbiểuhiệntrongE.coli.Trongtrườngh ợ p nàyngoàiviệcđưaracáctiêuchuẩnđán hgiácònphảingănchặnsựphóngthíchrangoàimôitr−ờng.
HầuhếtcácGMMsnàyrơivàoloạihoạttínhthấpnhất,chínhsáchngănchặnởmứcđộ1,b ổsungcácnguyênlýhoạtđộngcủavisinhvậtcógiátrịthìsẽbảovệđ−ợc đốivớicảsứckhoẻconngườivàmôitrường.
227 ĐạoônlàmộtloạibƯnhhạinghiêmtrọngvàth−ờngxuyênxảyrặlĩalàmảnhh−ởnglớnđ ếnnghềtrồnglúatrênthếgiớicũngnh−ởV i ệ t N a m Trongcôngt á c phòngtrừbệnh,biệnphá psửdụngnguồng e n đểtạoragiốngmớikhángbệnhđ−ợcxemlàcó hiệuquảnhất,tuynhiênmu ốnpháthuycaohiệuquảbiệnphápnàythìcácgenkhángbệnhcầnphảiđ−ợcphântíchvàxáclậpbả nđồcủachúng.
ViệtNamđ−ợccoilàtrungtâmcủasựđadạngthựcvậttrongđócócâylúa,sự đadạngnàycũngđồngnghĩavớisựđadạngvềnguồngenquí.Trongsốcácgiốnglúa đ−ợcthuthậpvàkiểmđịnhở ViệtNam,rấtnhiềugiốngcókhảnăngkhángbệnhđạo ôncaovàchúngthựcsựlànguồngenquítrongtạogiốnglúakhángbệnhnếunh−cácgenkhángđ− ợcphântíchvàlậpbảnđồphântử.Lậpbảnđồgenkhángbệnhđạoônởc á c giốnglúađịaphương ViệtNamchỉmớiởgiaiđoạnbắtđầuvàmớichỉdừnglạiởmộtvàinghiêncứucótínhchấtt h ă m d ò , trongk h i đ ó thựctếcủacôngtácchọnt ạ o giốngkhángbằngchỉthịphântửlạiđangđòihỏicóbả nđồphântửcủacácgenkhángb ệ n h ; đ ặ c b i ệ t l à cácc h ỉ t h ị phânt ử l i ê n kếtvớigen.Chínhvì vậy,trongnghiêncứunàyđãtiếnhànhphântíchxáclậpbảnđồgenkhángđạoônquaphântíchquần thểF2giữatổhợplaigồm:giốnglúaDựchiêmvàgiốnglúaCR203phụcvụchocôngtácchọntạogi ốnglúakhángbệnhđạoôn. Đểtiếnhànhlậpbảnđồgenquiđịnhmộtđặctínhnàođótrongc â y trồng,chúngtaphảitạoq uầnthểlậpbảnđồ.Quầnthểlậpbảnđồcóthểlà:F2,RIL(F6),BC(backcross).v.v.Mỗiloạiquầ nthểcónhữngưuđiểmriêngcủanónhưquầnthểF2dễt ạ o lập,quẩnthểF 6 l à nguồncungc ấ p giàuv ậ t l i ệ u chonhậndạngA D N v v TrongnghiêncứunàychúngtôichọnquầnthểF2nhằmn hanhchóngxácđịnhcácgenkhángtrênnhiễmsắcthểtronghệgencủalúa.
Lựachọnc h ỉ thịphânt ử tronglậpbảnđồgenlàviệclàmrấtquantrọng,bởim ỗ i loạichỉc ó nhữngthuậnlợivàhạnchếcủan ó C h ỉ t h ị RFLP(RestrictionLengthPolymorphism)là chỉthịđ ồngtr ộ i, c ó tínhổnđ ị n h v à chínhxácc a o tuynhiênlạ i rấttốnkémvàkhóthựchiện;sửdụngchỉth ịRADP(RandomAmplifedPolymorphicDNA)đơngiản,dễthựchiện,khôngtốnk é m nh−ngkế tquảkhôngổnđịnhvàđộchínhxáckhôngcao.v.v.SửdụngchỉthịSSRđểnghiêncứuhệg e n lúanóic hungvàl ậ p bảnđồnóiriênglàsựlựachọnhợplývàtốtnhất;bởivìchỉthịSSRdễthaotác,kếtquảchí nhxácvàđốivớilúađãcó hàngnghìnchỉth ịs ẵn sàngch os ử dụng.Ch ín hv ì vậy,trongnghiêncứ unàychúngtôiđãsửdụngc h ỉ t h ị S S R đểnhậndạngA D N phụcvụcholậpbảnđồgenởlúa.
Quitrìnhcủanghiêncứunàygồmcácb−ớcnh−sau:tạoquầnthểF2từtổhợpl a i giữagiố nglúabốmẹlà:CR203(giốnglúanhiễmbệnhđạoônđiểnhình)v àgiốngDựchiêm,bêncạnhđóti ếnhànhl â y nhiễmđánhg i á tínhkháng,nhiễmbệnhcủanhữngcâylúaF2.Sửdụngchỉthịphânt ửSSR đểnhậndạngADNgiữahaigiốnglúabốmẹđểxácđịnhchỉthịSSRchođahình.Sửdụngchỉt hịchođahìnhgiữahaigiốnglúabốmẹđểnhậndạngADNởcáccâylúaF2.DữliệunhậndạngA DNvàphảnứngb ệ n h củacáccâyF2đ−ợckếthợpđểphântíchliênkếtxácđịnhgen/
Kếtquảđánhgiáphảnứngbệnhtrênlálúađãchothấy,giốngDựchiêmcókhảnăngkhán gc a o , mứcđộphảnứngbệnhtrungbìnhl à 1,63(bảng27).TrongkhiđógiốnglúaCR203,biểuhiệ nlàmộtgiốngnhiễmbệnh,m ứ c đ ộ phảnứngbệnht r u n g bìnhlà7,45.ĐốivớinhữngcâylúaF2m ứcđộkhángtừ0,33đến8,67.Tầnsốkhángc ủ a F2đ−ợcchỉraởhình56.Khoảng2/3sốcâylúacó giátrịđánhgiánhỏhơnđiểm4 , cáccâylúacóđiểmnh−vậyđ−ợcxemnh−làđiểmkháng(R),1/3 câylúacònlạicógiátrịcaohơnđiểm4,nhữngcâylúanàyđ−ợcxemlànhữngcâynhiễmbệnh(S).T ỷlệgiữacâykhángvànhiễmbệnhx ấ p xỉ3:1,t ỷ lệnàyphùhợpvớiphânl y l ý t h u y ế t ( h ì n h 56). Theok ết quảphântích nàyít nhấtcó mộtgenkhángchínhtronggiốnglúaDựchiêm.
Hình56:Phảnứ n g bệnhđ ạ o ôncủacácg iốnglúaDựchiêm,CR203vàc á c c â y F 2 đ−ợcđánhgiát h e o t h a n g điểmcủaIRRI
*1:P0 6- 6, 2: CBN9219-25,3: IK81-3,4:V86010.R:k há ng, S:nhiễm,M : k h án g trungbình,
Bảng27:ĐánhgiáphảnứngbệnhcủacácgiốnglúaDựchiêm,CR203vàcáccây lúaF2vớinấmbệnhđạoôn
195chỉthịphântửSSRphânbốtrên12nhiễmsắcthểcủalúađãđ−ợcsửdụng đểphântíchđahìnhgiữa2giốnglúaDựchiêmvàCR203(hình57).116chỉthịđãcho đahìnhgiữa2giốnglúanóitrên(bảng28),chiếmtỷlệkhoảng60%.
116chỉthịphântửchođahìnhgiữahaigiốnglúađãđ−ợcsửdụngđểnhậndạngADNở F2(hình58).KiểunhậndạngA D N củagiốngD ự c h i ê m đ−ợcm ã là:A,củagiốngCR203mãlà:B,nhữngcâyF2c ó nhậndạnggiốngnhậnd ạ n g A D N c ủ a g i ố n g Dựchiêmđ−ợcmãlàA,giốngnhậndạngADNcủagiốngCR203đ−ợcmãlà:Bvànhữngc â y dịhợptử(cónhậndạngADNgiữagiốngDực hiêmvàCR203)đ−ợcmãlà:H.Dữ liệuADNcủacâybố,mẹvàcâyF2đ−ợcsửdụngđểxâydựngbảnđồliênkếtcủacácc h ỉ thịphântử,s ửdụngch−ơngtrìnhMAPMAKER/EXP.
Trênbảnđồliên kếtcác chỉthịphântử SSRphânbốtrên12nhiễmsắcthểvớitổngkhoản gcáchlà749,1cM,khoảngcáchtrungbìnhg i ữ a c á c chỉt h ị l à 6,46cM,khoảngcáchxanhấtgi ữahaichỉthịlà23,5cMvàgầnnhấtlà0,7cM(hình59).Trậttựs ắ p xếpcủac á c chỉthịphânt ử S S
R t r ê n mỗinhiễms ắ c thểở nghiêncứunàyc ũ n g t−ơngxứngvớitrậttự s ắ p xếpcủacácchỉthịSS Rtrênbảnđồliênkếtở lúađãđượcMcCouchvàcs.(2002)vàChươngtrìnhgenomelúacôngbố.
Bảng28:ChỉthịSSRchođahìnhgiữagiốngDựchiêmvàCR203đượcsửdụng đểnhậndạngADNởcáccâyF2vàxácđịnhgen/QTLkhángđạoôn
Cácnhiễmsắcthể:số1cósốl−ợngchỉthịlà16,vớikhoảngcáchlà134,4cM;số2cósốl−ợngc h ỉ t h ị l à 8,v ớ i khoảngcáchlà35,6cM;s ố 3 c ó s ố l−ợngchỉt h ị l à 14,v ớ i khoảngcáchlà97,6cM;s ố4cósốl−ợngchỉthịlà7,vớikhoảngcáchlà48,3cM;số5c ó sốl−ợngchỉthịlà6,vớikhoảngcá chlà39,9cM;số6cósốl−ợngchỉthịlà11,vớikhoảngcáchlà38,1cM;số7cósốl−ợngchỉthịlà9 ,vớikhoảngcáchlà64,1cM;số8c ó sốl−ợngchỉthịlà7,vớikhoảngcách là 37cM;số 9 có số l−ợn gch ỉ th ị là 10,vớikhoảngcáchlà57,7cM;số10cósốl−ợngchỉthịlà11,vớikhoảngcáchlà64,1c M;số11cósốl−ợngchỉthịlà9,vớikhoảngcáchlà73,5cMvàsố12cósốl−ợngchỉthịlà8,vớikhoản gcáchlà58,8cM.Liênkếtvàt r ậ t t ự sắpxếpcủacácc h ỉ t h ị p h â n t ử S S R đ−ợcthểhiệnchitiếttrongbảnđồliênkết(hình59).
Dữliệukiểugen(nhậndạngADN)vàphảnứngbệnh(hình59)đãđ−ợcsửdụng đểphântíchxácđịnhvịtrígensửdụngchươngtrìnhMAPMAKER/QTLver.1.1.
(%) b qBLASTp-1-DT RM0579-RM8133 1 -0.096 2,943 9,2 qBLASTp-3-DT RM5955-RM6929 3 -0.151 3,185 10 qBLASTp-9-DT RM5799-RM5526 9 -0.116 3,478 13,5 qBLASTp-10-DT RM6150-RM5841 10 -0.007 3,135 9,5 a Hiệuqủaditruyềntăngthêmdosựt−ơngtácgiữa2 allencủagiốngDựchiêmv à CR203.
DTcónghĩalàQTLliênquanđếnbệnhđạoônlá,nằmtrênnhiễmsắcthểsố3;q:làQTL,BLAST: làđạoôn,l:làlá,3:là nhiễmsắcthểsố3vàDTlàviếttắtcủacụmtừ d“ itruyền”.
Kếtquảphânt í c h đãxácđịnhđ−ợc4 QTLc ó chỉsốLOD(log- likelihood)lớnhơn2;nh−vậyđãcó4vịtríchứagenquiđịnhtínhkhángđạoôntrongquầnthểF2tạol ậ p giữagiốngDựchiêmvàCR203.Cácthôngsố:giátrịLOD,phầntrămtácđộng,vịtrínhiễmsắ cthểvàchỉthịSSRbiên(liênkếtgần)củacácvịtrímanggenQTLđ−ợcthểhiệntrongbảng26.C ác vịtrím a n g genđ−ợcđặtt ên : qBLAST-1-DT,qBLAST-3-
DT,qBLAST-9-DTvàqBLAST-10-DT.Cả4 QTLpháthiệnđ−ợcđ ề u c ó g i á t r ị A E âm,thểhiệngiốngCR203đãđónggópallenlàmtăngtínhkhángđạoôn,nh−vậymặcdùlàgiốnglú anhiễmbệnhnh−ngkhicósựt−ơngtácallenvớigiốngkhángDựchiêmnógópphầnlàmtăngtính khángbệnhtrongquầnthể.TrongsốcácQTLđãđ−ợcpháthiện,qBLAST-9-
DTcóchỉsốLODl à 3,478vàc ó phầntrămđóngtớikiểuhìnhl à chiếm13,2%,chỉsốn à y lớnhơnc ácQTLkhác,điềun à y chứngtỏnóđóngvaitròchínhquiđịnhtínhkhángđạoônvàcũngphùhợpvớ ikếtquảphântíchphảnứngbệnhchothấycóítnhấtmộtgenkhángchínhquiđịnhtínhkhángđạoôn ởgiốngDựchiêm.
Hình57:NhậndạngADNđểxácđịnhsựđahìnhgiữahaigiốnglúaDựchiêmvàCR203b ă n g cáccặp mồiSSRkhácnhau.Cáccột1,3,5,7,9,11làgiốngDựchiêm;cáccột2,4,6,8,10và12làgiốngCR203
Hình58:NhậndạngADNcủanhữngcâylúabố,mẹvàcáccâyF2vớimồiSSRchođahìnhgiữahaig iốnglúabốmẹ.Cột14làgiốnglúaDựchiêm,cột15làgiốnglúaCR203,cáccộtcònlạitừ1đến13là nh÷ngc©ylóaF2
Quatiếnhànhphântíchphảnứngb ệ n h đạoôn,phântíchkiểug e n củac á c giốnglúaDự chiêm,CR203vàthếhệF2 củ a chúng,k ết hợ pvớiphântíchliênkếtsửd ụ n g ch−ơngtrình MA PMAKER/EXPver3.0vàMAPMAKER/QTL1 1 đãx â y dựng đ−ợcb ả n đồliênkếtcácchỉt h ị SSRv à xácđịnhđ−ợccácQTLquiđịnhtínhkháng đạoôncụthểnh−sau:
1 Đãxácđịnhđ−ợc116chỉthịphântửSSRphânbốtrên12nhiễmsắcthểlúacho đahìnhgiữagiốngDựchiêmvàCR203vàxâydungđ−ợcbảnđồl iê n kếtcủa116c h ỉ thịv ớ i tổngc h i ề u d à i l à 749,1cMv à khoảngc á c h t r u n g bìnhgiữac á c c h ỉ thịlà6,46cM.
2 Đãxácđịnhđ−ợc4 QTLkhángđ ạ o ônvàb ả n đồcủachúnggồmcácQTL:qBLASTp-1- DT;qBLASTp-3-DT;qBLASTp-9-DT;qBLASTp-10-
DT.ChỉthịliênkếtgầnởhaiđầuQTLt−ơngứnglàRM0579-RM8133;RM5955-
RM6929;RM5799-RM5526vàRM6150-RM5841.
DTc ó chỉsốLODv à phầnt r ă m đónggóptớikiểuhìnhcaonhấttrongsốcácQTLđ−ợcxá cđịnh,đâylàQTLchínhtácđộnglêntínhkháng đạoônởlúa.
RM4180 RM3807 RM6038 RM3441 RM5896 RM5955 RM6929 RM6676 RM3513
Hình59:BảnđồliênkếtchỉthịphântửSSRvàcácQTLkhángđạoônđ−ợcxácđịnhquaphântích quầnthểF2củatổhợplaigiữagiốnglúaDựchiêmvàCR203
KếtquảnghiêncứulậpbảnđồgenchịuhạnởlúaLC93-1
Chịuh ạ n làmộtđặctínhnônghọcquýcủabấtc ứ loàicâytrồngnào,nhờc ó khảnăngchịuh ạntốtmàcâytrồngcóthểchốngchịuđ−ợcvớiđiềukiệnkhôhạnkéod à i củathờitiết.Đặctínhchịu hạncủalúađangđ−ợccácnhàchọntạogiốngtậptrungkhaithácnhằmtạo r a các giốnglúacó khả năngchịuhạntốttrongcác điềukiệnkhôhạncũngnh−vùngđồi,núicaonh−ngmuốnkhaitháctốt đ−ợctínhtrạngnàythìcầnphảiphântíchlậpbảnđồgencủachúng. ởn−ớct a c ó r ấ t n h i ề u g i ố n g lúac ó k h ả n ă n g c h ị u h ạ n tốtnh−cácgiống:Tẻm è o , LộcNghệAn,N ế p n−ơng,LC93-
1,CH5,CH133,CH3.v.v.cácgiốnglúanàylàv ậ t l i ệ u q u í d ể k h a i thácnguồngenc h ị u hạnt r o n g chọnt ạ o giống.Tuyvậy,nhữngnghiêncứuphântích phântử ở mứ c độADNđốivớinguồ ng en chịuhạnc ủ a lúa cònr ấ t khiêmtốnvàvẫnch−acócôngbốnàovềlậpbảnđồgen/
QTLcủacácgiốnglúanóitrên.TrongsốcácgiốnglúacónguồngenchịuhạnthìgiốngLC93- 1đangđ−ợctriểnkhairộngtrongsảnxuất,giốnglúanàyvừacókhảnăngchịuhạntốtvừacónăngs uấtcao.ChínhvìvậyđểkhaithácmộtcáchhiệuquảnhấtkhảnăngchốngchịucủagiốngLC93- 1,trongnghiêncứunàyc h ú n g t ô i t i ế n h à n h l ậ p b ả n đồgen/
QTLquiđịnhtínhchịuhạncủanó.ChúngtôiđãtạoquầnthểF2nhằmnhanhchóngxácđịnhcácgen/ QTLchịuhạn trênbảnđồnhiễm s ắc thểcủalú a Vàchúngtôiđãsửdụngch ỉ thịSSRđểnhậndạ ngADNphụcvụcholậpbảnđồgenởlúa. Đểphântíchx á c địnhcácgen/
QTLc h ị u h ạ n ở lúa,tuỳtheomỗiđiềukiệnnghiêncứukhácnhaumàng−ờitasẽquantâmtớicá cchỉtiêutrongsố21chỉtiêuliênquanđếnđiềukiệnbịkhôhạn.Trongnghiêncứunày,chúngt ô i qu ant âm tớih a i chỉt i ê u đól à : m ứ c độkhôcủal á lúahayđộcuốnlálúa(LDS,leaf- dryingscore)v à t h ờ i gian(ngày)lálúacuốnhoàntoàn(DLR,No.ofdaystoleafrolling)trongđi ềukiệnbịkhôhạn.
Quitrìnhcủanghiêncứunàygồmcácb−ớcnh−sau:tạoquầnthểF2từtổhợpl a i giữagiố nglúabốm ẹ là:Khangdân18(giốngl ú a c ó khảnăngc h ị u hạnkém)vàgiốngLC93-
1(giốnglúacókhảnăngchịuhạntốt).Sauđóthiếtkếthínghiệmđánhg i á k h ả n ă n g c h ị u h ạ n c ủ a cácc â y F2,b ê n c ạ n h đósửdụngchỉthịphânt ử S S R đ ể nhậndạngA D N giữahaigiốnglúa b ố m ẹ đ ể xácđịnhc h ỉ t h ị S S R c h o đ a h ì n h v à s ử dụngchỉthịchođahìnhgiữahaigiốnglúabố mẹđểnhậndạngADNởcáccâylúaF2.DữliệunhậndạngADNvàđánhgiáchịuhạncủacácc â y F 2 đ−ợckếthợpđểphânt í c h liênkếtxácđịnhgen/QTLchịuhạn.
Hình60:ThếhệF2saukhibịgâykhôhạn A:sau14ngàygâykhôhạn,B:sau21ngàygâykhôhạn
1 biểuhiệntínhchịuhạnkhátốt,chỉsốLDSsau7ngàytạokhôhạnlà1,33vàchỉsốD L R l à 1 8 n gày;trongkhiđógiốngKhangdân18chothấychịuh ạ n k é m vớic h ỉ s ố LDSlà6,33vàDLRlà10n gày(bảng30,31).ĐốivớinhữngcâylúaF2cókhảnăngchịuhạnởcáccấpđộkhácnhau(hình60)v àchỉsốLDStừ0,33đến7vàchỉsốDLRlà8,33đến21,67.TầnsốcáccâyF2vớikhảnăngchịuhạ nđ−ỵcchỉrặhình61.
Saukhitạohạn7ngày,sốcây F2cóđộcuốnlánh−sau:7câycómứcđộcuốnlátừ0 , 3 3 đến1;18 câyởmứcđộtừ1đến2;27câyởmứcđộtừ2đến3;35câyởmứcđộ từ3đến4;30câyởmứcđộtừ4đến5;17câyởmứcđộcuốnlátừ5đến6và14câyởmứcđộcuốnlátừ6đế n7(hình61A).SốcâyF2cuốnláhoàntoànsaukhitạohạnnh−sau:9câycuốnláhoàntoànsau8,33 đến10ngày;14câysau10đến12ngày;7 cây sau12đến14ngày;38câysau14đến16ngày;28câysau16đến18ngày;19câysau18đến20ngàyv à13câysau20đến21,67ngày(hình61B).Nhưvậyvớitầnsốcủac á c câ y F 2 ở c ả haitrườnghợp độcuốnl á (hình61A)v à thờigianlácuốnhoànt o à n (hình61B)saukhitạokhôhạn,cảhaiđồthịtrê nđ ề u c ó dạngphânbốhìnhchuông.
Hình61:KhảnăngchịuhạnvềchỉsốđộcuốnlácủacáccâylúaF2A : độcuốnc ủalásau7ngàytạokhôhạn,
Bảng30:KếtquảđánhgiátínhchịuhạnthôngquachỉsốLDSsau7ngàytạohạnđốivớicâ ylúabốmẹ(Khangdân18,LC93-3)vàF2
Bảng31:KếtquảđánhgiátínhchịuhạnthôngquachỉsốDLRsaukhitạohạn đốivớicâylúabốmẹ(Khangdân18,LC93-3)vàF2
183chỉthịphântửSSRphânbốtrên12nhiễmsắcthểcủalúađãđ−ợcsửdụng đểphântíchđahìnhgiữa2giốnglúaLC93-
1vàKhangdân18(hình62).97chỉthịđãchođahìnhgiữa2giốnglúanóitrên,chiếmtỷlệkhoảng53
1đ−ợcm ã l à : A,củagiốngKhangdân18mãlà:B,nhữngcâyF2cónhậndạnggiốngnhậndạngA DNcủagiốngLC93-
1đ−ợcmãlà A,giốngnhậndạngADNcủagiốngKhangdân18đ−ợcmã là:Bvànhữngcâydịhợp tử(cónhậndạngADNgiữacácgiốngLC93-1vàKhangdân18) đ−ợcmãlà:H.DữliệuADNcủacâybố,mẹvàcâyF2haiđ−ợcsửdụngđểxâydựngb ả n đ ồ liên k ế t củac á c chỉthịphântử,s ử dụngch−ơngtrìnhMAPMAKER/EXPver3.0.
Trênbảnđồliên kếtcác chỉthịphântử SSRphânbốtrên12nhiễmsắcthểvớitổngkhoản gcáchlà993,2cM,khoảngcáchtrungbìnhgiữacácchỉthịlà10,24cM,khoảngc ác h xanhấtgiữah aic h ỉ t h ị là 29cMvàgầnnhấtlà2,4cM(hình63).Trậttựs ắ p xếpcủac á c chỉthịphânt ử S S R t r ê n mỗinhiễms ắ c thểở nghiêncứunàyc ũ n g t−ơngxứngvớitrậttự s ắ p xếpcủacácchỉthịSSRtrên bảnđồliênkếtở lúađãđượcMcCouchvàcs.(2002)vàChươngtrìnhgenomlúacôngbố.
Hình62:NhậndạngADNđểxácđịnhsựđahìnhgiữahaigiốnglúaDựchiêmvàCR203bằngcáccặpmồ iSSRkhácnhau.Cáccột1,3,5,7,9,11làgiốngKhangdân18;cáccột2,4 , 6,8,10và12làgiốngLC93-
Hình63:NhậndạngADNcủanhữngcâylúabốmẹvàF2vớimồiSSRchođahìnhgiữahaigiốnglú abốmẹ.Cột1làgiốnglúaCL93- 1,cột2làgiốnglúaKhangdân18,cáccộtcònlạitừ1đến13lànhữngcâylúaF2
Cácnhiễmsắcthể:số1cósốl−ợngchỉthịlà12,vớikhoảngcáchlà100cM;số2 có sốl−ợng chỉ th ị là 7 , với khoảngcáchlà58,3cM;s ố 3có sốl−ợngch ỉ thị là 10,vớikhoảngcáchlà127,4c M;số4cósốl−ợngchỉthịlà9,vớikhoảngcáchlà109,4cM;số5 có sốl−ợngc h ỉ thịl à 7,v ớ i khoản gc á c h là 90,3cM;số6 c ó sốl−ợngc h ỉ t h ị l à 1 0 , v ớ i khoảngc á c h l à 111,1cM;số7 c ó sốl−ợ ngc h ỉ thịl à 7 , v ớ i khoảngc á c h là 80,3cM;số8 có sốl−ợngchỉthịlà6,vớikhoảngcáchlà68,4c M;số9 cósốl−ợngchỉthịlà9,vớikhoảngcáchlà67,7cM;số10c ó sốl−ợngchỉt h ị l à 8,vớikhoản gcáchlà65,9cM;số11cósốl−ợngchỉthịlà7,vớikhoảngcáchlà76,5cMvàsố12cósốl−ợngchỉthịl à5,vớikhoảngcáchlà37,9cM.Liênkếtvàtrậttựsắpxếpc ủ a cácchỉthịphântửSSRđ−ợcthểhiện chitiếttrongbảnđồliênkết(hình64).
Dữl i ệ u kiểugen(nhậndạngADN)vàkhảnăngc h ị u hạnđãđ−ợcsửdụngđểp h â n tíchx ácđịnhv ị tríQTLsửdụngchươngt r ì n h MAPMAKER/
QTLver.1.1.K ế t quảphântíchđãxácđịnhđ−ợc12QTLliênquanđếnđộcuốnlávàthờigianlác uốnhoàntoàn(bảng33,34vàhình64).
5QTLcóchỉsốLODlớnhơn3liênquanđếnđộcuốncủalá(bảng32).Cácthôngsố:g i á trịLOD,p hầntrămtácđộnglênkiểuhình,vịtrínhiễmsắcthểvàchỉthịSSRbiên( l i ê n kếtgần)củacác QTLđ−ợcthểhiệntrongbảng1.CácQTLđ−ợcđặttên:qDroughtLDS-1-DT,qDroughtLDS-3- DT,qDroughtLDS-8-DT,qDroughtLDS-9-DT,qDroughtLDS-10-
DT.CácQTLcóchỉsốLODtừ3,36đến4,35vàđónggópcủaQTL lênkhảnăngchịuhạn(kiểuhình)t ừ 10,1%đ ế n 12,7%.TrongsốcácQTLđãđ−ợcpháthiện,qDro ughtLDS-9-
DTc ó c h ỉ s ố L O D là4,14v à cóphầnt r ă m đónggópt ớ i k i ể u hìnhchiếm12,9%,cácchỉsố nàylớnhơncácQTLkhác,nh−vậynócóthểđ−ợcxemlàQTLchínhquiđịnhtínhchịuhạn.Trong số5 QTL:qDroughtLDS-1-DTvàqDroughtLDS-8-
7QTLđãđ−ợcpháthiệnl i ê n quanđếnsốngàyc â y lúaF 2 cuốnl á hoànt o à n saukhibịt ạ o khôh ạ n (bảng33).CácQTLđ−ợcđặttênlà:qDroughtDLR-1-DT,qDroughtDLR-1-
DT,qDroughtDLR-3-DT,qDroughtDLR-6-DT,qDrought-DLR-8-DT,qDroughtDLR-9-
DTcùngv ớ i c h ỉ sốl i ê n quanđ−ợcchỉr a ở bảng33.Trongsố7 QTL,có2QTLnằmtrênnhiễmsắ cth ể số 1,các QTLcònlạinằmtrênnhiễmsăcthểsố3,6,8,9và10.ChỉcóqDroughtDLR-8-
DTcógiátrịAEl à d−ơng,nh−vậyallent ă n g thêmkhảnăngchịuhạnđ ế n t ừ giốngLC93-
1,cácQTLc ò n l ạ i đềucó giátrịâ n vàallenđ ế n t ừ giốnglúaKhangdân18;nh−vậym ặ c dùc ó k hảnăngchịuhạnkémhơngiốngLC93-
3nhưngtrongquầnthểF2c ó sựtươngt á c a l l e n thìcácallenđếntừgiốngKhangdân18đãlàmtăn gkhảnăngchịuhạn.qDroughtDLR-10-
DTđ−ợcpháthiệntrênnhiễms ắ c thểs ố 9 c ó c á c c h ỉ s ố gồm:A E , LODv à Var.exp.lớnnhấtt−ơ ngứnglà:-0,058;6,13và17,4;đâyl à QTLchínhl iê n quanđếnthờigianchịuhạn(DLR).
QTL ChỉthịSSRbiên Nhiễms ắ c thể AE a LOD Var.exp.
(%) b qDroughtLDS-1-DT RM01201-RM08148 1 0,008 3,36 10,1 qDroughtLDS-3-DT RM03441-RM05140 3 -0,017 3,41 11,9 qDroughtLDS-8-DT RM04955-RM07013 8 0,030 3,59 11,0 qDroughtLDS-9-DT RM01896-RM05657 9 -0,154 4,14 12,9 qDroughtLDS-10-DT RM05352-RM03123 10 -0,087 4,35 12,7 a Hiệuqủaditruyềntăngthêmdosựt−ơngtácgiữa2allencủaLC93-1vàKhangdân
18.A E c ó g i á trịd−ơngvàgiátrịâmc ó nghĩal à allenlàmtăngkhảnăngc h ị u hạn đếntừgiốngCL93-1vàgiốngKhangdân18. b §ãng gópcủaQTLlênkhảnăngchịuhạn
Phânt í c h x á c địnhQTLvớic á c c h ỉ số:Đ ộ cuốnlávàthờig i a n lácuốnhoànt o à n đãxá cđịnhđ−ợc12Q T L t r ê n cácnhiễms ắ c t h ể số:1,3,6,8,9 và10.Chỉcónhiễmsắcthểsố6cómột QTLvềthờigianlácuốnhoàntoàn,cácnhiễmsắcthể:3,8,9 và10,mỗinhiễmsắcthểcóhaiQTL: mộtliênquanđếnđộcuốnlávàmộtliênquan đếnngàylácuốnhoàntoàn.Nhiễmsắcthểsố1có3QTL,CáccặpQTLvềđộcuốnlávàthờigianl á c uốnhoàntoàn:qDroughtLDS-1-DTvàqDroughtDLR-1-DT;qDroughtLDS-3-
D T c ó cùngcácc h ỉ thịbiênl à : RM01201- RM08148;RM03441- RM05140;RM05352- RM03123,nh−vậycácc ặ p QTLnàyc ó thểcùngv ị t r í tácđ ộ n g l ê n k h ả năngchịuhạnvềthời giancuốnláhoàntoànvàđộcuốnlá.HaiQTLnằmtrênnhiễmsắcthểsố9là:qDroughtLDS-9-
DT(thờigiancuốnlá ) có cácchỉs ố LODv à V a r exp.lớ n nh ất v àl àh ai Q T L chính;nh ưvậytrongnhữngbướct i ế p t h e o , đặcbiệtl à bướcl à mfinemapping”cầnt ập trungv ào nhiễ msắcthểs ố 9đ ể phântíchh aiQ TL nóitr ên vàtìm ch ỉ thịliên kếtchặtvớicácQTLsửdụngtrong chọntạogiốnglúachịuhạn.
L QTL ChỉthịSSRbiên Nhiễm s ắ c thể AE a LOD Var.exp
(%) b qDroughtDLR-1-DT RM01201-RM08148 1 -0,005 3,53 10,7 qDroughtDLR-1-DT RM03642-RM03304 1 -0,004 3,41 10,3 qDroughtDLR-3-DT RM03441-RM05140 3 -0,015 4,25 15,5 qDroughtDLR-6-DT RM06782-RM06926 6 -0,045 4,01 12,5 qDroughtDLR-8-DT RM01789-RM04955 8 0,009 3,45 10,4 qDroughtDLR-9-DT RM04692-RM06460 9 -0,058 6,13 17,4 qDroughtDLR-10-DT RM05352-RM03123 10 -0,032 5,08 15,7 a Hiệu qủaditruyềntăngthêmdosựt−ơngtácgiữa2allencủaLC93-1vàKhangdân
18.AEcógiátrịdươngvàgiátrịâmcónghĩalàallenlàmtăngkhảnăngchịuhạnđếnt ừ giốngCL 93-1vàgiốngKhangdân18. b §ãng gópcủaQTLlênkhảnăngchịuhạn qDroughtLDS-1-
DTcónghĩal à QTLliênquanđếnchịuhạn,nằmtrênnhiễmsắcthểsố1;q:làQTL,Droughtlàhạn,LDS:làđộcuốnlá,1:lànhiễmsắcthểsố1vàDTlàviếttắtcủaditruyền ”
Quaphântíchk h ả năngc h ị u hạnvớihaichỉsốđộcuốnl á vàthờigianl á cuốnhoànt o à n , ph ânt í c h kiểug e n củac á c giốnglúaLC93-
1,Khangdân18vàthếhệF 2 c ủ a chúng,kếthợpvớiphântíchliênkếtsửdụngch−ơngtrìnhMAP MAKER/EXPver
3.0vàMAPMAKER/QTL1.1xâydựngđ−ợcb ả n đ ồ liênkếtcácchỉthịS S R v à xác địnhđ−ợccácQTLliênquanđếnkhảnăngchịuhạnnh−sau:
1 Xâydựngđ−ợcb ả n đồliênkếtgồm97chỉthịphânt ử S S R phânb ố t r ê n 12n h i ễ m sắct hểlú a vớitổngchiều dàilà993,2cMvàkhoảngcáchtrungbìnhgiữacácchỉthịlà10,24cM
-5QTLliênquanđếnđộcuốnl á s a u khitạokhôhạngồm:qDroughtLDS-1-DT,qDroughtLDS- 3-DT,qDroughtLDS-8-DT,qDroughtLDS-9-DT,qDroughtLDS-10-
DT.CácQTLnàynằmtrênnhiễmsắcthểsố:1,3,8,9,10vàcóchỉthịphântửSSRbiên(chỉt hịliênk ế t gầnnhất)làRM01201- RM08148,RM03441- RM05140,RM04955-
RM07013,RM01896-RM05657,RM05352- RM03123.
-7 QTLliênquanđ ế n thờigiancuốnlàhoànt o à n saukhibịkhôhạngồm:qDroughtDLR-1- DT,qDroughtDLR-1-DT,qDroughtDLR-3-DT,qDroughtDLR-6-DT,qDroughtDLR- 8-DT,qDroughtDLR-9-DTvàqDroughtDLR-10-
DT.CácQTLnàynằmtrênnhiễmsắcthểsố1,3,6,8,9 , 10.Và có cácchỉt h ị SSR biên(chỉth ịgầnnhất)làRM01201- RM08148,RM03642- RM03304,RM03441-
RM05140,RM06782-RM06926,RM01789-RM04955,RM04692-
DTcócùngc á c chỉt h ị biênlà:RM01201- RM08148;RM03441-
RM03123,nh−v ậ ycáccặpQTLnàycóthểcùngvịtrítácđộnglênkhảnăngchịuhạnvềđộc uốnlá,thờigiancuốnláhoàntoànvàcóthểlàcácQTLđaallen.
4 2QTL:qDroughtLDS-9-DT(vềđ ộ cuốnlá)và qDroughtDLR-9-
DT(thờig ian lácuốnhoàntoàn)đềunằmtrênnhiễmsắct h ể s ố 9 c ó chỉs ố LODv à phầntr ¨m đónggóptớikiểuhìnhc a o n h ấ t trongsốc á c QTLđ−ợcxácđịnh,chúnglàcácQTLchínhtá cđộnglênkhảnăngchịuhạncủalúa.
RM2770 RM6077 RM3703 RM5862 RM6853 RM6844 RM2634
RM66782 RM6926 RM1150 RM3876 RM6781
RM1880 RM6288 RM7119 RM2529 RM5195
Hình64:BảnđồliênkếtgiữacácchỉthịSSRvà12QTLđãđ−ợcpháthiệnliên quanđếnkhảnăngchịuhạn
1 Đềtàiđãsửdụngcác phươngphápnghiêncứutruyềnthốngvàhiệnđạinhư:p hư ơngphápl a i t r u y ề n t h ố n g , đ á n h g i á k i ể u h ì n h , c á c p h−ơngp h á p sinhh ọ c p h â nt ử vàk ỹ t h u ậ t g e n ; s ử d ụ n g c ô n g n g h ệ t h ô n g t i n đ ể xâyd ự n g , thiếtk ế ph ần mềmvàcậpnhậtthôngtin,quảntrịcơsởdữliệu.Tấtcảcácph−ơngphápn g h i ê n cứ unàyđãđượcápdụngrộngrãitrongvàngoàinước,chúngtôiđãcóm ộ t sốcảitiếnvàt ấtcảnhữngcảitiếnđềuđemlạinhữngkếtquảtincậyvàcó độchínhxáccao.
2 Đềtàiđãđạtđ−ợccáckếtquảvềcôngnghệthôngtinvàkếtquảvềnghiêncứuứ n g dụng Đãđ−arađ−ợcphầnmềmcơsởdữliệusinhhọcvàWebsitevềsinhv ậ t biếnđổigen.Đ âylàcơsởdữliệutổngquátnhấtvàcóđầyđủthôngtinliênq u a n đếnsinhvậtbiếnđổige n,cậpnhậtnhiềuthôngtincủanhiềuWebsitenh−i s a a a , agbios,agbiotech,aphis,… v à c ủ a cácv i ệ n n g h i ê n c ứ u , c á c t r−ờngđ ạ i họctrongn−ớc vàquốctế.
3 Kếtquảvềđàotạo:Đãđàotạ ovàhướngdẫnđược1cửnhâncôngnghệsinhh ọ c , đ ãbảovệxuấtsắcvàonăm2005.Thôngquađềtài,chúngtôiđãđàotạo đ−ợcđộingũcánbộnghiêncứuthànhthạovềtruycậphệthốngWebsite,nângcaotrì nhđộngoạingữvàcókỹnăngtrongnghiêncứuứngdụngkỹthuậtsinhh ọ c phântử, küthuËtditruyÒn.
4 Đềtàiđãthuđ−ợctoànbộcáckếtquảcầnthiếttheoThuyếtminhbanđầu,vớik ế t quả chínhxácvàcóđộtincậy.Đólà:Đãcóđ−ợcphầnmềmquảnlýcơsởdữ liệumởđểcập nhậtthôngtin,tìmkiếmvàtruycậpvềGMOs;Đãxâydựng đ−ợcW e b s i t e c h ứ a đ ự n g d ữ liệus i n h h ọ c v ề c â y t r ồ n g , vậtn u ô i , visinhv ậ t biếnđổigen;Ngoàira,chúngtôiđãtìmđược3phươngphápxácđịnhGMOsch u ẩ n xác,n h a n h n h ạ y vàc ó đ ộ c h í n h xácc a o ; Đãl ậ p đ−ợc2 b ả n đ ồ ch ỉ t h ị phânt ử c ủ a g e n k h á n g bệnhđ ạ o ô n ở l ú a D ự chiêmv à g e n c h ị u h ạ n ở l ú a
5 ĐểtrangWebhoànthiệnhơnnữa,đềtàicầncậpnhậtthôngtinvànghiêncứunhiề uhơnvềvấnđềđánhgiárủirođốivớisinhvậtbiếnđổigenvàsảnphẩmc ủ a c h ú n g T ừ đ ó n â n g c a o v ấ n đ ề q u ả n l ý a n t o à n s i n h h ọ c đ ố i v ớ i c á c s ả n phẩmkho ahọcnày.
I KÕtluËn ĐềtàiKC.04.34đãhoànthànhđúngtiếnđộđềranh−trongThuyếtminhb an đầu,cụthểlàđãđạtđ−ợcnhữngkếtquảsau:
1 Xâydựngđ−ợcphầnmềmquảnlýcơsởdữliệumởđểcập nhậtthô ng tinliên quan đếnsinhvậtbiếnđổigen.Thiếtkế,xâydựngWebsitechứađựngcáccơsởdữliệuvềcâytrồng,v ậtnuôi,visinhvậtbiếnđổigenvàsảnphẩmdẫnxuấtcủachúng(http://www.gmo.gov.vn).
NOS,g e nB t,PAT.Pháthiệnram ộ t sốm ẫu thứcă n g ia s ú c đangti êu t h ụ trênthịtr−ờngViệt
N a m có chứasảnphẩmb iế n đ ổ i g e n SửdụngReal- timeP C R đểđịnhl−ợngGMOsc ó tronghỗnhợph ạ t ngôchuyểng e n vàkhôngchuyểngen(0 ,1%,1%hạtngôchuyểngen)vàhỗnhợpđậut−ơngchuyểngenvàkhôngchuyểngen(0,5%và10 0%h ạ t đ ậ u tươngRoundupReady).PhươngphápPCRc ó độchínhxáckhácao,cóthể địnhtínhvàđịnhlượngđượcGMOs.Tuynhiên,đâylàphươngphápkhôngkinhtế,yêucầuthiếtb ịhiệnđại,kỹthuậtviêncótaynghềcao.
SửdụngquethửELISAnhậnbiếtgenCryIA(c)cótrongngôBtvàgenEPSPSc ótro ngđậut−ơngRoundupReady.Đâylàph−ơngphápnhanh,nhạy,rẻ,thíchh ợ p v ớ i việ cs à n g l ọ c b a n đ ầ u T u y nhiênnóchỉđặchiệuv ớ i m ộ t sốí t đốit−ợngnh−CryIA( b)/CryIA(c),CP4-EPSPS.
T ì mrađ−ợcquytrìnhđểxácđịnhđ−ợcgenCryIA(c)cótronggiốngngôchuyểngenn h ờ kỹth uậtl a i phânt ử ADN.Đâyl à ph−ơngphápc ó đ ộ chínhxácc a o hơn2 ph−ơngpháptrên.N h−ngthờigianphân tích dài,phứctạp,chiphí cao,chỉkiểmtra đ−ợcđịnhtínhcácthànhphầnGMOs.
X á cđ ị n h đ−ợcc á c cặpm ồ i , m ẫ u d ò vàb ộ k í t đ ể pháthiệnc á c g e n đ−ợcc h u y ể n vàocâytrồngnh−genkhángthuốctrừcỏPAT,EPSPS,genkhángsâuCry
3.Đềxuất2giảiphápđểquảnlý,đánhgiámộtsốcây trồngbiếnđổigen(ngô, lúa,b ô n g , đ ậ u t−ơng)c ó t r i ể n v ọ n g v à cács ả n p h ẩ m t h ứ c ă n c h ă n n u ô i đ−ợc
250 chếbiếntừngô,đậutươngbiếnđổigen.Đólàgiảiphápđánhgiádựavàocấut r ú c p h â n t ử v à d ự a v à o đ ặ c đ i ể m h ì n h thái.C ũ n g n h−c ản hb á o m ộ t s ố g e n chu y ểncótiềmẩnrủirochomôitr−ờng,conng−ờivà cânbằngsinhthái.
4.Đãxâydựngđ−ợcbảnđồchỉthịphântửcủacácgenkhángbệnhđạoônvàgenchịuhạnởlúasửdụng phầnmềmMAPMAKER/EXPver3.0vàMAPMAKER/QTLver.1.1:
GenkhángbệnhđạoônởlúaDựChiêm:xâydựngđ−ợcbảnđồliênkếtgồm116chỉthịphântử SS Rphânbốtrên12 nhiễmsắcthểlúavớ i tổngchiềudàilà749,1cMvàkhoảngcáchtrungbìnhgi ữacácchỉthịlà6,46cM.
1:xâydựngđ−ợcb ả n đ ồ l i ê n kếtgồm97chỉt h ị phânt ử S S R phânbốtrên12nhiễmsắcthểlúa vớitổngchiềudàilà993,2cMvàkhoảngcáchtrungbìnhgiữacácchỉthịlà10,24cM.
II Kiếnnghị ĐểgiúpchotrangWebvàphầnm ề m quảnl ý đ−ợcđầyđủvàhoànthiệnhơnnữa,chúngtôi xintrântrọngđềnghịBộKhoahọcvàCôngnghệ,B a n ChủnhiệmChươngtrìnhKC.04xemxét,tạ ođiềukiệnchoViệnDitruyềnNôngnghiệpcũngnh−Chủnhiệmđềtàivànhómcánbộnghiêncứuc ủađềtàiKC.04-34đ−ợcti ếp t ụ c t h ự c h i ệ n tiếpĐềtài/
Dựán:“Nghiêncứuhoànthiệnphầnmềmvàcơsởdữliệuđểquảnlýantoànsinhhọcsinhvậtbiếnđ ổigentạiViệtNam”,giúphoànthiệnphầnquảnlýant o à n vàđánhgiárủirođốivớisinhvậtbiến đổigenvàsảnphẩmcủachúng.Baogồm:
- Bổsungnộidungcủatrangwebsitevề:vấnđềdánnhãnvàcácluậtđịnhvềGMOsở cácquốcgia khácnhau;B ổ sungthêmthôngt i n vềGMOshiệnc ó t ạ i ViệtN a m ,
1 NguyễnVẨnCưởng,VỳVẨnDiễn,NguyễnKimườ,NguyễnThịDiệuThuý,Quyềnư ìnhThi,TrầnQuốcDung(1999),“Tạocáchuyểngenhormonesinhtr−ởngng−ời ,”Bá o cáoKH, Hội nghịCNSHtoànquốc, HN1999-tr1347.
3 NguyễnĐứcDoanh,NguyễnVănMùi,ĐặngTrọngL−ơng(2001),“Nhữngkếtquảbanđ ầuvềchuyểngenvàocâycảidầu”,Tạpchíthôngtincôngnghệsinhhọcứngdụng,số1/200
4 LêTấnĐức,NguyễnHữuHổ,NguyễnVănUyển(2003),“TạocâyHông(Paulowniafort une)chuyểngenkhángsâuthôngquavikhuẩnAgrobacteriumTumefaciens”,BáocáoHội nghịCôngnghệSinhhọctoànquốc,HàNội,tr1088–1090.
5 NguyễnThiếtGiáp(2006),“Côngnghệsinhhọcphụcvụnôngnghiệp", http://www.nacentech.ac.vn/NACENTECH/Display_news.asp?id46
7 TrầnThịCúcHoà,LêTrầnBình,BùiBáBổng(2003),“Tiêuchuẩnhoáhệthốngchọnlọcm annosev à ứngdụnghệthốngnàytrongchuyểnnạpgenhữudụngbằngAgrobacteriumở lú a”,Báocá o HộinghịCôngnghệSinhhọctoànquốc,HàNội,tr761–765.
8 NguyễnHữuHổ,LêTấnĐức,NguyễnHữuTâm,NguyễnVănUyển(2003),“Mộtsốnghiê ncứuchuyểngenvàocâythuốclá(NicotianatabacumL.)vàcâyngô(ZeamaysL.)bằngv ikhuẩnAgrobacteriumtumefaciens”,BáocáoHộinghịCôngnghệSinhhọctoàn quốc,HàNội,tr1096–1101.
(1998),"Kếtquảb−ớcđầusửdụngAgrobacteriumtumefacienstrongnghiên cứuchuyểng e n v à o lúa"Hộin g h ị Toànq u ô c l ầ n thứnhấtvềCôngnghệSinhhọccâyl óa,HuÕ,tr85-86.
10 NguyễnThịLang,BùiChíBửu(2003),“Bảnđồditruyềnvàbảnđồvậtlýcủagenkhángrầy nâuBph-10”,TạpchíLúaOmon,số11/2003,tr35-41.
11 ĐặngTrọngL−ơng,R.Offringa,VũĐứcQuang,NguyễnHữuĐống,TrầnDuyQuý,W.D olf,vàPauJ.J.Hooykaas(1999),“Thiếtk ế lạic ấ u tr ú c genBt(Bacillusthuringiensis)để chuyểnvàocâyhail á mầm”.B á o cáoKhoah ọ c Proceedings.HộinghịCôngn g h ệ S i n h họct o à n quốc,H à Nội1999,Nhàxuấtb ả n KHKT,Hànội,tr.1371-1376.
12 ĐặngTrọngL−ơng,NguyễnĐứcDoanh,VũĐứcQuang,NguyễnHữuĐốngvàTrầnDuy
(2001),“NghiêncứuchuyểngenCryIAckhángsâuvàomộtsốgiốngcảibắp(Brassicaoler aceavarC a p i t a t a ) quaAgrobacterium”.Kếtquảnghiêncứukhoahọc1999-
2000,ViệnDit r u y ề n Nôngnghiệp,Nhàxuấtb ả n Nôngnghiệp,Hànội,tr.120-128
13 NghiêmNgọcMinh,NguyễnĐứcThành,LêThịMuội(2000),“Sựduytrìvàbiểuhiệnổnđ ịnhcủagenlụclạpngoạilaitrongcâythuốcláNicotianaPlumbaginifoliabiếnnạpquac ácthếhệR1,R2”,Tạpchísinhhọc,số4/T12/200,tr26.
(1998), Công“ nghệsinhhọc”,NXBĐHQuốcGia,HàNội,238tr.
15 LãTuấnNghĩa(1999),“Nghiêncứusựđadạngditruyềncủaquầnthểnấmđạo ônvàmộtsốgiốnglúaphụcvụchocôngtácchọntạogiốnglúakhángbệnhđạo ôn”.LuậnánTiếnsĩNôngnghiệp,ViệnKhoahọcKỹthuậtNôngnghiệpViệtNam.
16 LãTuấnNghĩa,NguyễnBáNgọc,TrầnDuyD−ơng,VũĐứcQuang(2002),“Đánhgiátín hkhángQTLbệnhđạoônở lúa”,KếtquảnghiêncứukhoahọcViệnDitruyềnNôngnghiệp
17 NguyễnThịMinhNguyệt,NguyễnTrịnhToàn,NguyễnThịKimDung,Vũ ĐứcQuang,TrầnDuyQuý(2001),“Nhữngkếtquảb−ớcđầusửdụngchỉthịphânt ử l i ê n k ế t vớig e n khángđạoôntrongcôngtácchọngiốnglúakhángbệnh”,Thôngtincôngngh ệ ứngdụng,Số2/2001.
18 PhanCựNhân(2000),“Ditruyềnhọcđộngvật vàứngdụng”,NXBGiáoDục,198tr.
20 NguyễnTrịnhToàn,NguyễnThịKimDung,NguyễnThịNinhThuận,VũĐứcQuang,T rầnDuyQuý(2000),“Tìmchỉthịphântửliênkếtvớigenkhángđạo ônởcácgiốnglúađịaphươngViệtNam ”KếtquảnghiêncứukhoahọcViệnDitruyềnNôn gnghiệp2001,tr.129-138.
22 TrungtâmThôngtint−liệukhoahọcvàCôngnghệQuốcgia,“Câytrồngbiến đổigen-Tìnhhìnhnghiêncứuứngdụngvàcácquanđiểmpháttriển”,số4 / 2003.
23 TrungtâmTrithứctoàncầuvềCôngnghệS i n h họcc â y trồng(2003),“SảnphẩmCôngn ghệSinhhọcthựcphẩm(Hiệnnayđangđ−ợcbántrênthịtr−ờng)”,PocketKN 0.2.
24 ĐỗNăngVịnh,LêhuyHàm,PhạmThịLýThu,U.Ryschka(2001),“Chuyển gentrựctiếpvàotếbàotrầnởB.olebaceaL.Var.BotrytisthôngquaPEG”,Tạpc h í NN&
26 ViệnSinhHồcNhiệtượi(2001),“CNSHvẾnẬngnghiệpsinhthÌibềnvứng”,NXBNẬngN ghiệpTP.HCM,195tr.
27 http://www.isaaa.org ,“TìnhtrạngcâytrồngCNSH/câytrồngchuyểngenđ−ợc đưavàocanhtácvớimụcđíchthươngmạihoátrênthếgiớitrongnăm2005”.
28 http://www.sinhhocvietnam.com.vn ,“CâyCG–1thậpkỷthuavàthắng”.
(1995),“Applicationofmolecularbiologyt o biomedicineandtoxicology”,J.Environ.S ci.HealthC11,p1-51.
34 Anonymous(1998),“Councilregulation(EC)No.1139/98,concerningthecompulsory indicationofth e labellingofcertainfoodstuffsproducedfromgeneticallymodifiedorga nisms”,OfficialJ.Eur.Communities:Legislation159,p4–7.
S e c t i o n ofFood& F e e d Microbiology,U l l e v a a l s v e i e n 68,P.O.Box8156Dep.0 033Oslo,Norway.
36 BaileyJMandWhippsJ M (1995),“Riskassessmentandthereleaseofg e n e t i c a l l y mo difiedmicroorganismsi n t o t h e environment”,DepartmentoftheEnvironment,Trans portandtheRegions(DETR)ResearchReportno.7,p1-66.
37 BerdalKG,Holst-JensenA.(2001),“RoundupReadysoybeanevent-specificreal- timequantitativeP C R a s s a y a n d estimationo f thepracticaldetectionandquantific ationlimitsinGMOanalyses”,EuropeanFoodResearchandTechnology.
41 CharlesF Chilcutt& B r u c e E Tabashnik(2004),“GeneflowfromtransgenicBtCorn tonon-BtCornrefuges”,ISBNewsReportJuly2004,p1-4.
(2002),“GMOregulationinTaiwan.ProceedingsInternationalWorkshoponImpactsa ndBiosafetyofGeneticallyModifiedAgriculturalProducts”,(Pan,T.M.ed)p61-
43 ChenLJ,LeeDS,SongZP,SuhHS,LuBR.
47 DoneganK.K.,PalmC.J.,FielandV.J.,PorteousL.A.,GanioL.M.,SchallerD.L.,BucaoL
(1995),“Changesi n levels,species,andD N A fingerprintsofsoilmicroorganismsass ociatedwithcottonexpressingtheBacillusthuringiensisvar.kurstakiendotoxin”,Appli edSoilEcol.2,p111-124.
48 DoneganK.K.,SchallerD.L.,StoneJ.K.,GanioL.M.,ReedG.,HammP.B.,andSeidlerR.
(1999),“Transgenicrabbitmodelsforbiomedicalresearch:Currentstatus,basicmetho dsandfutureperspectives”,PathologyInternational49,p583-594.
51 FukuokaSandK.Okuno(2001),“QTLanalysisandmappingofpi21,arecessivegeneforf ieldresistancetoriceblastinJapaneseuplandrice”,TheorApplGenet(2001)103,p185
52 GachetE,MartinGG,VigneauF andM e y e r G (1999),“Detectionofg e n e t i c a l l y modifiedorganisms(GMOs)byP C R : a briefr e v i e w ofmethodologiesavailable”,T rendsinFoodScience&Technology9,p380-388.
(2003),“Genef l o w betweenredrice(Oryzasativa)andherbicide- resistantrice(O.sativa):Implicationsforweedmanagement”,WeedTechnology17:62
54 GeneScanEurope(2001),“GMOC h i p : TestK i t f o r theDetectionofGMOsinFoodPr oducts”,Cat.No.5321300105,Bremen,Germany.
55 González,I.,García,T.,Fernández,A.,Sanz,B.,Hernández,P.E.,Marín,R.
(1991),“TheCecropinLocusCloningandexpressionofa geneclusterencodingthreeant ibacterialpeptidesin Hyalophoracecropia”,TheJ o u r n a l ofBiologicalChemistry,V ol.266,No.18,IssueofJune25,p11510-11517.
Ready)inprocessedfoodproducts",Berl.Munch.Tierarztl.Wochenschr.113,p454–
58 HalfordNG,ShewryPR(2000),“Geneticallymodifiedcrops:methodologybenefits,reg ulationandpublicconcerns”,BrMedBull,56/2000,p62-73.
Jensen2andKnutG Berdal2,*(2005),“DesignofaDNAchipfordetectionofunknowngenetic allymodifiedorganisms(GMOs)",BioinformaticsVol.21,No9/2005,p1917-1926.
62 Hellebrand,M.,Nagy,M.,Murrsel,J.T.(1998),"DeterminationofDNAtracesin rapeseedoil",ZLebensmUntersForschA206,p237–242.
(1998),“Bacterialwiltdisease:molecularandecologicalaspects:BehaviorofBiolumin escentRalstoniasolanacearumY N 5 containingt h e luxCDABEi n tomatoessuscepti bleandresistantt o bacterialwilt”,p233-242.
66 Hill,M.(1999),"Identificationof theaphI V genefromprotoplasts- derivedmaizeplantsbya simplenonradioactiveDNAhybridizationmethod",InVitroC ell.Dev.Biol.35.p154–156.
68 HugoR Permingeat,MartinI.GeggiardoandRubenH.Vallejos(2002).“Detectionand quantificationoftransgenesi n grainsbymultiplexandreal- timePCR”,JAgric.FoodChem50,p4431-4436.
69 HupferC,HotzelH,SachseKandEngelKH(1998),“Detectionofthegeneticmodificatio ninheat- treatedproductsofBtmaizebypolymerasechainreaction”,ZLebensmUntersForschA2
70 HurstCD,KnightAandBruceIJ(1999),“PCRdetectionofgenetically modifiedsoya andmaizeinfoodstuffs”,Mol.Breed 5,p579-586.
71 Hurburgh,C.R.,Rippke,G.R.,Heithoff,C.,Roussel,S.A.,Hardy,C.L.
(2000),"Detectionofgeneticallymodifiedgrainsbynear- infraredspectroscopy",ProceedingsPITTCON2000–Scienceforthe21stCentury,
#1431 New Orleans, La 12–17 March 2000 or Internet
72 Hsu-YangLin,Lih-Chiueh,DanielYang-
ChihShih(2000),“Detectionofgeneticallymodifiedsoybeansandmaizebyt h e Polyme rasechainreactionmethod”,JournalofFoodandDrugAnalysis,8(3),p200-207.
73 IRRI(1991),“Reporto f them e e t i n g t o discusscoordinationofriceRFLPmappin g”,In:RiceGeneticsII.P.O.Box933,Manila,Philippines,p815.
TC34WG7N26(2001),“Detectionofgeneticallymodifiedorganismsandderivedprod ucts.Qualitativenucleic acidbasedmethods”,Anexes,p47-50.
(2000),“GlobalstatusofCommercialisedTransgenicCrops:2000”ISAAABriefsNo2 3.ISAAA,Ithaca,NewYork,2001.
77 JavedAkhterPhD,MohammedQutubPhD,NormanBurnhamMBA,MohammedAkht arMD.FCAP(2001),“Geneticallymodifiedfoods:healthandsafetyissues”,AnnalsofS audiMedicine,21(3-4),p161-164.
78 JoanaF a l c a o Salles1;PatriciadeMedeirosGitahy;LeifSkot;JoseIvoBaldani(2000),“
Theuseofendophyticdiazotrophicbacteriaasavectortoexpressthecry3Agenefr om B acillusthuringiensis”,BrazilianJournalofMicrobiology.31,p155-161.
79 KeatleyKL(2000),“Controversyovergeneticallymodifiedorganisms:thegoverningla wsandregulations”,QualAssur2000Jan-Mar,8(1),p33-36.
80 KhushGS(1993),Floralstructure,pollinationbiology,breedingbehaviour,transferdis tanceandisolationconsiderations,WorldBankTechnicalPaper,BiotechnologySeries
(1989),“SpermcellsasvectorsforintroducingforeignDNAi n t o eggs:genetictrans formationofmice”,Cell57,p717-723.
83 LenskiRE(1993),“Evaluatingthefateofgeneticallymodifiedmicroorganismsi n thee nvironment:aretheyinherentlylessfit?”,Experentia.49,p201-209.
84 Lih-ChingC,Yen-LingC,Jei-HwaY andYang-ChihShihD.
85 Li-HuangZHU1,YingCHEN1,Yuu-BinXU2,Ji-ChenXU1,Hong-
ZhuanLING4(1993),“Constructionofamolecularmapofriceandgenemappingusinga doublehaploidpopulationofacrossbetweenIndicaandJaponicavarieties”,RiceGenet icsNewsletter,Vol.10/1993,p132-135.
(1999),"IUPACcollaborativetrialstudyofa methodt o detectgeneticallymodifiedsoyb eansa n d m a i z e i n driedpowder",J.AOACInt.82,p923–928.
(2000),"Guidelinesforthevalidationanduseofimmunoassaysfordeterminingofintrod ucedproteinsi n biotechnologyenhancedcropsandderivedfoodingredients",FoodAg ric.Immunol.12,p153–164.
89 Matsuoka,T.,H.Kuribara,H.Akiyama,H.Miura,Y.Goda,Y.Kusakabe,K.Isshiki,M.T oyoda& A.Hino(2001),“AmultiplexPCRmethodofdetecting recombinantDNAsfromfivelinesofgeneticallymodifiedmaize”,J.FoodHyg.Soc.Japan
90 MartaHerna´ndez,AdolfoRı o,´o, TeresaEsteve,Salome ´o,P r at, andMariaPla*(2001),"ARapeseed-SpecificGene,Acetyl-
91 McCouch,S.R.,G Kochert,Z.H.Yu,Z.Y.Wang,G.S.Khush,W.R.CoffmanandS.D.Ta nksley(1988),“Molecularmappingofricechromosomes”,Theor.Appl.Genet.76,p815
92 McCouchS R , RJNelson,J TohmeandRSZ e i g l e r (1994),“Mappingofblastresistan cegenesinrice”.In:RiceblastdiseaseofR.Zeigler,S.A.LeongandP.
93 McPherson,M.J.andMứller,S.G.(2000),PCR,Springer-Verlag.
94 MesseguerJ , FogherC,GuiderdoniE,MarfaV,C a t a l a MM,BaldiG,MeleE
95 MesseguerJ,MarfaV,CatalaMM,GuiderdoniE,MeleE.
(2004),“Afieldstudyofpollen- mediatedgeneflowfromMediterraneanGMriceto conventionalriceandtheredricewe ed”, Molecular Breeding 13:103–112.
(2000),“Geneticengineeringandcloningm a y improvemilk,livestockproduction”,Cal iforniaAgriculture54,p57-65.
101 Nielsen,K.M.,F.Gebhard,K.Smalla,A.M.Bones,J.D.V a n Elsaa(1997c),“Evaluatio nofpossiblehorizontalgenetransferfromtransgenicplantst o the
(1997),"Detectionofa geneticmodificationofpotatoesb y amplificationo f t h e modifi edDNAsequenceusingthepolymerasechainreaction(PCR)andhybridizationoftheP
103 OfficialCollectionofTestMethods(1998),“Detectionofa geneticmodificationofsoybe ansb y amplificationofthemodifiedDNAsequencebymeansofthepolymerasechainre action(PCR)andhybridizationofthePCRproductwitha DNAprobe”,GermanFederal
FoodstuffsAct–FoodAnalysis,article35,L23.01.22–1.Beuth,BerlinKửln.
104 OkaHI,ChangW T (1961),“HybridswarmbetweenwildandcultivatedricespeciesOry zaperennisandO.sativa”,Evolution15,p418–430.
(1999),“TransgenicF a r m A n i m a l s InTransgenicAnimalsinAgriculture”,Murray JDetal(eds),CABIInternational,p1-18.
112 RavinderSardana,S t e f a n Dukiandjiev,MarcGiband,XiongyingCheng,KyraCowa n,ConnieSauder,andIllimarAltosaar.
(1996),“Constructiona n d rapidt e s t i n g ofsyntheticandmodifiedt o x i n g e n e se quencesCryIA(b&c)byexpressioninmaizeendospermculture”,PlantCellRep.15,p
113 Rogan,G.J.(1999),"Immunodiagnosticmethodsforselectionof5- enolpyruvylshikimate-3- phosphatesynthaseinRoundupReady®soybeans",FoodControl10,p407–414.
(1993),“Perilsa m i d s t t h e promise:ecologicalrisksoftransgeniccropsi n a globalma rket”,UnionofConcernedScientists.Cambridge,MA.
115 SallaudC , M.Lorieux,E Roumen,D.Tharreau,R.Berruyer,O.Garsmeur,P.Svestasran i,A.Ghesquiere,J.-
L.Notteghem(2003),“Identificationoffivenewblastresistancegenesi n thehighlybl ast- resistantricevarietyIR64usinga QTLmappingstrategy”,TheorApplGenet106:794-
(2000),“MolecularCloning,ALaboratoryManual(3 rdedn)”, ColdSpringHarborLaborati ryPress.
118 ShiraiN,MommaK,OzawaS,HashimotoW,KitoM,UtsumiSandMurataK(1998),“S afetyassessmentofgeneticallyengineeredfood:Detectionandmonitoringofg l y p h o s a t e - t o l e r a n t soybeans”,Biosci.Biotech.Biochem.62,p1461-1464.
(2000),“Geneticimprovementofcattleandsheep”.FarmingPress,TonbridgeUK2000. Chapter6,DairyCattleBreeding.
120 SodaS,UesugiK,IkeM andFujitaM (1999),“Applicationofa floc- forminggeneticallyengineeredmicroorganismt o a sequencingbatchreactorforphen olicwastewatertreatment”,JournalofBioscienceandBioengineering,88(1),p85-91.
122 SrinivasanV , SubramanianA (1961),“Anoteonnaturalcross- pollinationinriceattheAgroculturalResearchStation,duthurai(ThanjavurDistrict)”,
124 TabienR.E.,Z.Li,A.H.Paterson,M.A.Marchetti,J.W.Stansel,S.R.M.Pinson(2000),“
Mappingoffourmajorriceblastresistancegenesfrom Lemont and‘ ’ ‘Teqing’andevalua tionoftheircombinatoriale f f e c t forf i e l d resistance”,TheorApplGenet101,p1215
125 TabienR.E.,Z.Li,A.H.Paterson,M.A.Marchetti,J.W.Stansel,S.R.M.Pinson(2002),“
MappingQ T L s f o r fieldresistancetother i c e blastpathogenandevaluatingtheiri ndividualandcombinedutilityi n improvedvarieties”,TheorApplGenet105,p313–
126 Tanksley,S.D.,N Ahn,M.Causse,W.R.Coffman,T.Fulton,S.R.McCouch,
G.Second,T.Tai,Z.Y.Wang,K.S Wu andZ.H.Yu(1991),“RFLPmappingofthericege nome).In:RiceGeneticsII.IRRI,P.O.Box933,Manila,Philippines,p435-442.
127 Taoufik,Y , Froger,D.,Benoliel,S.,Wallon,C.,Dussaix,E.,Delfraissy,J.F.,Lantz,O.
(2001),“UseofclonedD N A fragmentsforevent- specificquantificationofgeneticallymodifiedorganismsinpureandmixedfoodproduc ts ,”EuropeanFoodR e s e a r c h andTechnology,213,p417-424.
129 TerryCandHarrisN.(2001),“Event- specificdetectionofRoundupReadySoyausingt w o differentr e a l timeP C R detection chemistries”,EuropeanFoodResearchandTechnology.213,p425-431.
130 Tozzini,A.C.,Martinez,C.M.,Asurmendi,S.Lãpez,M.V.&HoppH.E(2000),“Analyti calmethodf o r detectionandquantificationo f livingmodifiedorganisms(LMOs)ingrai nsbasedonPCR”,SubmittedtoBio-techniques.
131 TrapmannS,LeGuernL,KramerGN,SchimmelH,PauwelsJ,AnklamE,Vand e n Eede
(2000),“Thecertificationofa newsetofreferencematerialsofsoyapowderw i t h differ entmassfractionsofRoundupReady TM soya
”,EUR…ENB- 2440G E E L , March2000.http://www.irmm-jrc.be
132 TrapmannS , LeGuernL,ProkischP,RobouchP,KramerGN,SchimmelH,PauwelsJ,Q uerciM,VandenEedeG andE.Anklam.
(2001),“TheCertificationofReferenceMaterialsofDryMixedMaizeP ow d er with di fferent
413.http://www.irmm.jrc.be/rm/irmm-413.pdf
MingPan(2002),“Currentstatusanddetectionofgeneticallymodifiedorganism”,Journ alofFoodandDrugAnalysis,Vol.10,No.4/2002,p229-241.
135 Vaitilingom,M.(1999)," R e a l - t i m e quantitativeP C R detectionofgeneticallymodifiedmaximizermaizeandRound upReadysoybeani n somerepresentativefoods",J.Agric.FoodChem.47,p5261–
136 Vaitilingom.M.H.pijnenburg,F Gendre& P Brignon(2000),“Real– timequantitativeP C R detectionofgeneticallymodifiedmaximizermaizeandRoundup Readysoybeaninsomerepresentativefoods”,J Agric.FoodC h e m , 47,p5261-5266.
137 VaughanA.Hilder,DonaldBoulter(1999),“Geneticengineeringofcropplantsforinsect resistance-acriticalreview”,CropProtection,Volume18,Number3,p177-191.
139 Wang,Guoliang(1992),“RFLPm a p p i n g ofmajora n d minorg e n e s forb l a s t res istanceina durablyresistancericecultivar”,PhDdissertation.IRRI,P.O.B o x 933,Ma nila,Philippines.
(1998),“Theproductionoftransgenicdomesticlivestock:successes,failuresandthenee dfornucleartransfer”,Reproduction,FertilityandDevelopment10,p659-665.
141 WardTE,BulmerDandWaltonMR(1998),“Developmentofgeneticallyengineeredbac teriafortrichloroethylenedegradation”,JournalofEnvironmentalSciencea n d Healt hPartA-Toxic/HazardousSubstances& EnvironmentalEngineering,33(2),p179-193.
142 WindelsP,TaverniersI,DepickerA,VanBockstaeleE , DeLooseM
145 WSAtkinsEnvironment,FinalReport(2002),“GeneticallyModifiedOrganismsf or th e BioremediationofOrganicandInorganicPollutants:Theuseofmicroorganismsforthe bioremediationofpollutants”.
(1999),DetectionMethodsf o r NovelFoodsDerivedfromGeneticallyMo dified Orga nisms,ILS IEurope.
147 K.Zenbayashi,T.Ashizawa,T.Tani,S.Koizumi(2002),“MappingoftheQTL(quantitat ivetraitlocus)conferringpartialresistanceto leaf blastinricecultivarChubu32”,Theo rApplGenet104,p547–552.
148 ZhengK.-L.,R.-Y.Chai,M.-Z.Jin,J.-L.Wu,Y.-Y.Fan,H.LeungandJ.-
Y.Zhuang(2000),“Mappingofleafandn e c k blastresistancegeneswithRFLP,RAPDa ndresistancegeneanalogueinrice.Advancesin RiceBlastResearch”,Tharreauetal.ed s.,KluwerAcademicPublishers,p28-33.
149 ZhuangJ.-Y.,R.-Y.Chai,W.-B.Ma,J.Lu,M.-Z.JinandK.-
L.Zheng(1997),“Geneticanalysisoftheblastresistanceatvegetativeandreproductives tagesi n rice”,RGN14,p62-64.
150 Zimmermann.A,M.Liniger,J.Luthy,J.Pauli(1998),“Asensitivedetectionmethodf o r geneticallymodifiedMaisGardTMcornusinga nestedPCR-system”,Lebensm-Wiss. u.Technol,31,p664-667.
Phô lôc A:QUY TR×NHNHËNBIÕT gmos
Quyt r ì n h t á c h c h i ế t A D N c ủ a c á c giốngc â y t r ồ n g c h u y ể n g e n d ự a the op h−ơngphápcủaHugo&CS(1995)cócảitiến.
Quy trìnhtáchchiếtđ−ợctiếnhành nh−sau:
- Cắt1glánonvàotrongốngeppedoff1,5ml,bổsung200lđệmchiếtvànghiền.B ổsungtiếp200lđệmchiếtvànghiền.
- Cho400lphenol:chloroform:isoamylalcohol(25:24:1),lắcng−ợcốngvàlytâmt rong10phútở12.000vòng/phút.
- Chuyểnlớptrên cùngs a n g ốngeppendoffmớivàbổsung1 thểt í c h (v/ v)dungd ịch phenol:chloroform:i s o am y l alcohol(25:2 4 :1),lắcng−ợcố n g rồil y tâmở 12.0 00vòng/phúttrong10phút.
- Chuyểnlớptrêncùngsangốngeppendoffmớivàbổsung1 thểtíchEthanol100%(v/ v),l y tâm12.000vòng/phúttrongkhoảng10phút,loạibỏdịchvàgiữlạikếttủaA D N
Quyt r ì n h t á c h c h i ế t A D N c ủ a c á c s ả n p h ẩ m thứcă n g i a súcd ự a t h e o Article oftheGermanyFederalFoodAct,Method24.01.1.
- Chovàomáylắccáchthuỷở60 0 Ctrongkhoảng30’60’,rồilấyralắcnhẹởnhiệt độphòngtrong10phút.Lytâm10.000vòng/phútkhoảng10phútởnhiệtđộphòng.
- Lấyra khoảng7 50ldịchtrêncùngchovàoốngep en doff 2mlmớ i v àbổsung750
lhỗnhợpchloroform: isoamylalcohol(24: 1)vào,l ắ c ng−ợcống.L y t â m 10.000vòng/ phúttrong10phútởnhiệtđộphòng.
- Lấyra650ldịch(phatrêncùng)chovàoốngependoff2ml.Bổsung1400lđệmc h i ế t IIv à đ ểở nhiệtđộphòngtrong40phút.Lyt â m 12.000vòng/ phútở nhiệtđộphòngtrongkhoảng30phút,loạibỏdịchvàgiữlạikếttủaADN,hongkhô.
- ChovàotủaADNkhoảng750lđệmmuối,đểtrongtủlắccáchthuỷở45 0 CchođếnkhitủaADN tan.
- Cho750lhỗnhợpchloroform: isoamylalcohol(24: 1),l ắ c nhẹng−ợcố n g v à l y tâm14.000v òng/phútởnhiệtđộphòngtrongkhoảng10phút.
- Lấyra650ldịchtrêncùngchovàoependoff1,5mlvàbổsung650lIsopropanol, đặtởnhiệtđộphòngtrong10phút(hoặcđểquađêmở4 0 C).
- Lytâm10.000vòng/ phútởnhiệtđộphòngtrongkhoảng10phút,loạibỏdịchvàgiữl ạ i kếttủaADN.
- RửatủaADNbằngEthanol70%(400l),sụctủaADNlên vàlytâm10.000vòng/phúttrong10phútở nhiệtđộphòng.LoạibỏEthanol70%,rửatiếpbằng150
CácphảnứngPCRđ−ợcthựchiệntrongthiếtbịEppendorfMastercyclerg r ad ie n t (96giếng),vớithểtíchcuốicùnglà25l/phảnứng.
- CặpmồiHS01/Cry-CR01;PA01/CM01vàPA01/CM03:
+CácphântíchrealtimePCRđ−ợcthựchiệntrongthiếtbịPerkinElmerAB5700SDSsửdụnghệt hốngTaqMan,vớithểtíchcuốicùnglà25l/phảnứng.
Taqpolymerase 1,25U(Hot-StartQuiagenhoặcPlatintừInvitrogen) Mẫudòcóhuỳnhquang 250nM(IDT,USA)
Cácmẫudòđ−ợcđánhdấubằngchấtnhuộmthôngbáohuỳnhquang6- carboxyfluorescein(FAM)ở đầu5’vàthuốcnhuộml à m tắthuỳnhquang6- carboxytetramethylrhodamine(TAMRA)ở đầu3’.
60 0 Ctrong1phút 45chukỳlặplại Cáckếtquảđ−ợcphântích nhờhệthốngxácđịnhtrìnhtự củ a hệthốngsinhhọcứngdụngPE.
3mM(phảnứngmultiplexPCRgồmgenBtvàPat)) dNTP 0,2mM(đốivớicácphảnứngđơn)
Cáchoáchấttrongphảnứngởtấtcảcáctr−ờnghợp đềulàcủahãngPromega,ngoạitrừtrườnghợpcácoligolàcủacôngtyBiosynthesis. +Điềukiệnđểkhuếchđạilà:
CácsảnphẩmPCRđượcđiệnditrêngelagarose2%trong1giờởcườngđộ4 0 m A vàđãnh uémEthydiumbromide.
Rau di ếp xo ăn
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Phươngphápxétnghi ệm Năm biến nạp / Phóngt hích
PCR,Southern,North ern,Westernblotvàth ửnghiệmsinhhọc
5 Kenfeng ChengvàWu(Cornel lUniv.,USA) cor47cADNtừ Arabidopsist h a l i a n a
PS)vàtrehalose-6- phosphatep h o s ph a t a s e (TPP)từ
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
PCR,Northern,West ernblot, SDS-
S-adenosylmethio- ninedecarboxylase(sa mdc)cADNtừDatura stramonium
PCR,RT-PCR, SouthernvàNorthern blot
PCR,RT-PCR, SouthernvàNorthern blot
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
PCR,RT-PCR, SouthernvàNorthern blot
Nghiêncứucơchếđiề ukhiệnsựthểhiệncủa genthamgiatrongq uátrìnhsinhtổnghợp polyamine
CalcineurinAgenetừch uộtkhôngcóC- terminalautoinhibitory domain(CNAtr)
GenS-adenosyl- methio- ninedecarboxylase(s amdc)từTritordeum
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
GenCholineoxidase(c odA)từArt hrobacte rglobiformis
GenGS2(Chlor opl ast glutamines y n t h a s e ) từcâylúa
PCR,Westernblotvàth ửnghiệmsinhhọc 2000 Phòngt hínghiệ m
Genp5cs(Delta1- pyro-line-5carboxy- latesynthase)
GenCOX(Cholineo xidase)từArthrobacte rpascens
GenOsCDPK7(Calciu m- dependentpr o t e i n ki nase)từlúa
PCR,Northern,West ernblotvàthửnghiệm sinhhọc
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
GencodA(Cholinoxi dase)từArthrobact er globiformisi
Genbadh(Betaina l d e h y d e dehydrogena se)từcâylúamạch
PCR,Southern,Northe rnblotvàthửnghiệmsin hhọc
Genhva1(Lateembryo genicprotein)từlúamạ ch
Genhva1từlúamạch Tếbàohuyề nphù /Bắngen
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Gen1-aminocyclo- propane-1- carboxylicacidsynt h ase(OsACS5)
PS)vàtrehalose-6- phosphatep h o s ph a t a s e (TPP)từ
Southernblot,thửngh iệmsinhhọctrehalase vàphântíchhàmlượn gcarbonhydrate
PCR,Southern,North ern,Westernblotvàth ửnghiệmsinhhọc
GenArgininedecarbo xylase(adc)từcâylúay ếnmạch
PCR,RT-PCR, SouthernvàNorthern blot
Nghiêncứusựthểhiệ ncủaargininedecabo xylasegenetừyếnmạ chtrênlúavàảnhhưở ngc ủanóđếnsựphát triểncủacây
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Nghiêncứuchứcnăn gcủaOsTB1t r o n g ứ cchếviệcpháttriểnc hồinhánh(lateral)củ alúa
Antisensecủagen Os PPR1(pentatrico- peptiderepeatprotein) từlúa
PCR,RT-PCR, SouthernvàWesther nbl ot
Nghiêncứuchứcnăn gcủagenOsPPR1tr ongquátrìnhpháttri ểncủalụclạp
Nghiêncứusựthểhi ệncủacyto- chromeCtrênlúavà hoạttínhcủapromot ercủanó
Nghiêncứuảnhhưởn gcủaviệcthểhiệnph ytochromAlênsựph áttriểnc ủalúa
Nghiêncứuvaitròc ủ aOsEXP4trongsin htrưởngvàpháttriển củacây
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
(PohangUni.Science andTechnology,Kor ea)
AntisenseADNcủam ộtdướiđơnvịcủaheter otrimericG proteintừl úa
GenGA2- oxidase1(OsGA2ox1)t ừlúa
OsGA2ox1trongqu átrìnhpháttriểncủa cây
PCR,PRT-PCR, SouthernvàNorthern blot
Nghiêncứuchứcnăn gcủagenOsMADS1 ởlúatrongquátrìnhsi nhtrưởngvàpháttriể ncủachúng
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
O SH6, OSH15,OSH43và OSH71
Nghiêncứusựthểhiệ nvàchứcnăngc ủage nOSHtrongquátrìn hpháttriểnc ủacây
GenCalcium- dependentproteinkin ase(OsCDPK2)từlúa
Nghiêncứuchứcnăn gcủaRCN1vàRCN2 trongquátrìnhpháttr iểncủabônglúa
PCR,Sothern,Wester nblotvàthửnghiệmsi nhhọc
Khángbệnhcháym éplá( Xanthomona soryzaepv.oryzae) vàrầy
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Khángcácloạibệnhn ấ mquahạtnhưBurkhol deriaplan- tariivàB.glumae
Khángbệnhcháym éplá( Xanthomona soryzaepv.oryzae)
Khángbệnhcháym éplá( Xanthomona soryzaepv.oryzae)
PCR,Northern,West ernblotvàthửnghiệm sinhhọc
Khángbệnhcháym éplá( Xanthomona soryzaepv.oryzae)
Khángbệnhcháym éplá( Xanthomona soryzaepv.oryzae)
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Khángbệnhcháym éplá( Xanthomona soryzaepv.oryzae)
Khángbệnhcháym éplá( Xanthomona soryzaepv.oryzae)
(UCDavis,USA) rTGA2.1- nhântốsaochépđãđược biếnđổi(mutant)từlúa
RT- PCR,Southern,Nort hernvàWesternblot
Khángbệnhcháym éplá( Xanthomona soryzaepv.oryzae)
(InstituteofMolecula ra n d CellularBio- sciences,Japan)
GenHC- toxinreductase- like(YK1)từlúa
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
GenMitogen- activatedproteinkinas e1(MK1)từCapsicum annuum
(I wa te Biotechnol ogyResearchCenter ,Japan)
Nghiêncứuvaitròc ủ aAtBI1trongviệcứ cchếquátrìnhchếtcủ atếbàosaukhiđược xửlýbằngchiếtsuấtc ủanấmgâybệnhchá yláM.grisea
GenChitinaset ừPh as e o lus limensisvàβ-1,3- glucanasetừNicotianat abacum
(Max- PlanckInstitutfur Zu chtungsforschung ,Ge rmany)
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
(NiigataUniv,Nation alInstituteofAgrobio logicalSciences,Japa n)
GenChiC(Bacterialfa mily19chitinase)từSt eptomycesgriseusH
PCR,Northern,West ernblotvàthửnghiệm sinhhọc
Beta- glucanase(gns1)từcâ ylúa
PCR,Northern,West ernblotvàthửnghiệm sinhhọc
Magnaporthegrisea) vàcháyméplá(Xanth omonasoryzaepv.ory zae)
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
(InstitutodeBiologí aMoleculard e Barce lona,Spain)
(InstitutodeBiologí aMoleculard e Barce lona,Spain)
79 Senia FengvàLi(Zhongsha nUniversity,China)
GenChitinase(RC24)t ừlúa,glucanase(beta-
Glu)từcỏlinhlăng,ribo some- inactivatingprotein(B-
Genb-23Ribosome- inactivatingprotein(Z m-crip3a)từngô
?/Bắngen Southern,Westernb lotvàthửnghiệmsin hhọc
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
GenkhángTrichothec ene(tri101)vàgenkhử độczearalenone(zdh1
Genmod1(Ribosome- inactivatingprotein)t ừngôvàchitinase(rch
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Upadhyayaetal ADNcùngchiềuvàng ượcchiềucủacácđoạn gensố7và10(khônglà gencấut r úc ) và5,8,v à9(gencấutrúc)củavir usRRSV(RiceRagge dStuntVirus)
ADNtổnghợpmãhoác hođoạnhammerheadri bosomevớimụctiênlà mRNAcủavirusgâybệ nhlùnởlúa
PCR,RT-PCR, Southernblotvàth ửnghiệmsinhhọc
Genmãhoáchođoạnlớn nhất(đoạnsố8)c ủavir usgâybệnhlùntrênlúa(
ProteinvỏP8vàcorepr oteinlõiP3củavirusgâ ybệnhlùntrênlúa
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
GenSalicylatehydrox ylase(nahG)từPseudo monasputida
Tạodònglúakhông cósalicylicaciddùn gnghiêncứutínhkh ángbệnhcủacâytrồ ng
GenN-(hydroxy- c i n n a m o y l ) transfe rase(tht)từcâytiêu
Tănghàmlượngcác chấtdẩnxuấtc ủaser otinintrongr ễcókh ảnănggiatăngsứcđề khángcáctácnhângâ ybệnhtrêncây
GenCecropinB(khángk huẩn,cónguồngốctừc ô n trùng)vàgenbar(khángt huốctrừcỏ,d ù n g chotha nhlọccâychuyểngen)
Khángvikhuẩnvàn g h i ê n cứumốiliênhệgiữ aviệckếtnốicủagenđư ợcchuyểnvàobộgenc âyvàsựthểhiệncủanó.
Gen5-epi- aristolochene(EAS)từ câytiêu
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
PCR,RT-PCR, Southern,Northernv àWesternblot
GenAmylopullu- lanase(apu)từThermo anaerobacterethanoli cus39E
GenPhytasetừS e l e n o m o n a s ruminantiu m(SrPf6)vàEcoli(app A)
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Làmgiảmhàmlượn gglutelint ro ng hạt dùngsảnxuấtrượus ake
PCR,TAIL-PCR, Southernblot,phântíc hđoạnADNkềbên
Tạocácdòngđộtbiế nbằngtransposond ù n g chonghiêncứu genomehọcchứcnă ng
PCR,TAIL-PCR, Southernblot,phântíc hđoạnADNkềbênvà thửnghiệmG U S
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
PCR,TAIL-PCR, Southernblot,phântíc hđoạnADNkềbênvà thửnghiệmG U S
PCR,ExcissionPCR,S outhern,Northernblot, phântíchđoạnADNkềb ênvàquansátthểhiệnc ủagenchỉthị
UAS/GAL4-VP16và genchỉthịGUSvà
UAS/GAL4-VP16và genchỉthịGUS
PCR,Southernblot,ph ântíchđoạnADNkềbê nvàquansátthểhiệncủ agenchỉthịGUS
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Agrobac- terium iPCR,phântíchđoạn ADNkềbênvàthửng hiệmGUS
CytochromeP450genes (cyp1A1,cyp2B6vàcyp2
PCR,Southern,West ernblotvàthửnghiệm sinhhọc
(MieU n i v vàNation alInstituteforAgro- EnvironmentalScien ces,Japan)
Chlorocatecholdioxyg enase(cbnA)từRalston iaeutrophaNH 9
Phânhuỷhợpchấtclo ruavòngthơm(chlor oaromatic- thànhphầnchínhtro ngthuốcbảovệthực vậtvàdungmôihữuc ơ)trongđấtvànước
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
GenCYP2B6(Drug- metabolizingcytochro meP450)từngười
PCR,Southern,West ernblotvàthửnghiệm sinhhọc
Genmãhoáchođoạnsố 9của virusgâybệnhcằnc ỗiở lúa (RRSVS 9)
PCR,RT-PCR, Southernblot,ELIS Avàthửnghiệmsinhh ọc
GenSKTI(Kunitztryp sininhibitor)từcâyđậut ương
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
(CuulongDeltaRice Research Institute,Vi etnam)
GengnavàCryIA(c) ?/Bắngen PCR,SouthernvàWe sternblot
PCR,Sothern,Northe rn,Westernblotvàthử nghiệmsinhhọc
PCR,Southern,Nort hern,phântíchprote in,xácđịnhvịtrícủatr ansgenetrêncácnhiễ msắcthểvàthửnghiệ msinhhọc
Cnaphalocrasisme dinalis)vàsâuđụcth ân(Chilosuppressa lis)
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
GenhợpnhấtN- terminalcủaCryIA(b)v àC- terminalcủaCryIA(c)t ừBacillusthuringiensis
CryIIIAtừBacillusthu ringiensisvar.tenebri onis,genc r y I II A
GenAvidintừgàvớiđo ạnADNmãhoácho25 aminoacidc ủaalphaa mylasesignalpeptidet ừlúamạch
Khángcácloạicôntr ùngtrongquátrình bảoquảnhạtnhưTrib oliumconfusumvàS itotrogacerealella
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Khángcácloạisâuđụ cthân(Chilosuppres salisvàScirpophaga incertulas)
KhángthuốctrừcỏBas ta TM và sâuđụct h â n ( Chilosuppres- sa li s vàSesamiainfer
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
146 Ariete KhannavàRaina(Nati onalResearchCenteronPl antB i o t e c h n o l o g y , India)
PCR,RT-PCR, SouthernvàWesternblo tvàthửnghiệmsinhhọc
PCR,Northern,West ernblot,E LI SA vàt hửnghiệmsinhhọc
GenCryIIIAvàbar ?/Bắngen PCRvàSouthernblot 1997 Phòngt hínghiệ m
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
PCR,Southern,West ernblotvàthửnghiệm sinhhọc
(SichuanAgricultural BiotechnologyEngine eringResearchCenter,Ch ina)
Gengna ?/Bắngen PCR,Southernblotti ngandWestern blo tting
Genlectintừcâygiộttuy ết(gna)vàtrypsininhibi tor(sbti)từđậutương
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Proteinvỏ(cp1,cp2và cp3)củavirushìnhcầu
PCR,Southern,North ernbl ot, ELISA vàt hửnghiệmsinhhọc
(CornellUniversity, USA) Đoạn ABRC1từgenH
V A 2 2 củal ú a mạch(H ordeumvulgareL.)cùng vớicácbiếnthể( k í c h th ước)khácnhaucủaprom oterAct1t ừlúavớigus
1vàkhảnăngứngdụ ngtr on g biếnnạpg en
Nghiêncứuhoạttính củaActin1promoter trongcâylúachuyển gen
PromoterAlcoholdehy drogenase1 (Adhl)từn gôvàgengus
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Promotercủaproteinv ỏcủavirusđườngvânở ngô(MSV)vàgenGU
Nghiêncứutạocâyc huyểngensạchbằngc áchlọaibỏA D N khô ngcầnthiếtthôngqu aviệcsửdụngCre/LoxP
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
(VentriaBioscience, USA) Đồngbiếnnạpchíngenn ằmtrênchínplasmidsk h á c nhau:Hygro- m y c i n phospho- tran s fe ra se , Glucuro - nidase,Luciferase,Phos phinothricinacetyltrans ferase,Alpha-1- antitripsin,H e p a t i t i s Bvirussurfaceantigen,H e p atitis Cviruse n v e l o p protein,BacilisS u b t i l i s i n BPNvàproteinpháth uỳnhquangmàuxanh
Nghiêncứutạocâyc huyểngensạchbằngc áchloạibỏA D N khô ngcầnthiếtthôngqu aviệcsửdụngCre
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Nghiêncứuhệthốngđ ồngbiếnnạpgenvớim ộtplasmidnhịnguyên mang2T-ADN
Nghiêncứuđồngbiế nnạpgentừhaiplasm idtrêncùngmộtdòng vikhuẩnAg r o ba c t e r i u m
Proteinpháthuỳnhqua ngmàuxanhtừloài sứ abiểnAequorea vict oria
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
1,3- glucanaseisoenzym eGIIIrtrongquátrình tươngtáctăngtínhkh ángbệnhbằngsalicyl icacid
Cácdạngđộtbiếnkhác nhaucủapromoterprot einvậnchuyểnlipid(H vLTP2)từlúamạchvà gengus
Nghiêncứuchứcnăn gcủaHvLTP2trongq uátrìnhtươngtáctăn gtínhkhángbệnhbằn gsalicylicacid
Hệthốngbiếnnạpge nsạch(khôngcósele ctablem a r k e r ) dự atrêniptgen
Nghiêncứutạogiống lúabiếnnạpg e n sạch thôngquaAc/Ds
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Vùngđínhkèmthểnhân (MARs)lytríchtừcâyth uốclá(TM2)vàgengus vớihailoạipromoter35 SvàUbiquitin
BP-MAR,đoạn1.3- kbphíatrênliềnvớiđầu 5'củaMARtronglysoz ymelocuscủagà
(HokkaidoUni6ersi ty,Japan) promotercủagenpox
190 IRAT349 Digeonetal.(Unit ´edeBiochimieetBio- logieMol´eculairedesC ´ereales,France)
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
(UnitedStatesDepart mentof Agriculture, USA) promoterUbit ừngôvà gengus
Promotercủagenα- amylase(α- Amy8)và gus
Nghiêncứuhoạttính củapromoterc ủaα- amylase(α-Amy8)
GenGA2-oxidase (OsGA2ox1)từlúa
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
199 Dongjin,Na kdong,Milya ng99,Daesan
,Palgong,Sin geumho,Mil ayng151
MADS- boxtừcâylúa(OsMAD S1,OsMADS5,OsMA DS6,OsMADS7,OsM ADS8,OsMADS14)
Antisensecủagen Os GItừcâylúa,genorthol oguecủaArabidopsis GIGANTEA( G I )
RT- PCR,phântíchmRN Abằngphươngpháp Rnaseprotectionassa y
GenSorbitol-6- p hos phat e d e h y d r o - genase(s6pdh)
?/Bắngen PCR,Southern,West ernblotvàthửnghiệm sinhhọc
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Nghiêncứumốiliên hệgiữasựthểhiệncủ altp1vàquátrìnhhì nhthànhmycorrhiz at r o n g vùngrễ
GenGlutaminesynthet ase(GS1vàGS2)từvik huẩn
Tạokhảnănghìnhth ànhnốtsầncủavikh uẩncốđịnhđạ mtrên lúa
GenLectin(psl)từđậu Hàlan(Pissiumsativu m)và Lectin- nucleotidephospho- hydrolase(gs52)từgiố ngđậuhoangdại(Glysi nesoja)
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Promotercủahaigenv ậnchuyểnphosphatetừ lúamạchđiềukhiểnge ng u s hoặcgfp
GenOsPTF1(Trans- c ri pt io n factor)từlú a
(CentralResearchIns tituteElectricPo we r Indus try, Japan)
RT- PCR,Southern,West ernblotvàthửnghiệm sinhhọc
GenNicotianamineam inotransferase(naatA vànaatB)từlúamạch
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
?/Vitiêm Southern,Westernb lot,ELISAvàthửng hiệmsinhhọc
(LouisianaStateUniv ersity,USA) β-phaseolintừ PhaseolusvulgarisL
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
GenPhytoensyntha setừcâythuỷtiênhoav àng(Narcissuspseud onarcissus)
Tănghànmlượngph ytoene,tiềnchấtc h o provitamineA,tron ghạtgạo
GenPhytoensynthas e(psy)từngô,carotene desaturase(crtI)từErw iniauredovora
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Cácgenmãhoáchocác enzymecầnthiếtchoqu átrìnhsinhtổnghợpPro - vitamineA(psy,lcyvà crtI)
Cácgenmãhoáchocác enzymecầnthiếtchoqu átrìnhsinhtổnghợpPro - vitamineA(psyvàcrtI)
(SwissFe de ra lInsti tuteofTechnology,S witzerland)
Cácgenmãhoáchocác enzymecầnthiếtchoqu átrìnhsinhtổnghợpPro - vitamineA(psyvàcrtI)
Paineetal.(Sygenta) GenPhyt oe ne syntha se(psy)từngô,carotene desaturase(crtI)từErw iniauredovora
Genphospho- mannoseisomerase,p hytoenesynthasevàcr tI-syntheti-
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Sảnxuấtchấtdịứngn guyêndohạtphấncủ acâytuyếtt ù n g Nhậ tBản
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
PCR,RT-PCR, Southern,Westernb lot,ELISAvàthửng hiệmsinhhọc
?/Bắngen Thửnghiệmsinhhọc 2004 Nhàlướ ivàphò ngthíng hiệm
PCR,Southern,phântí chproteinvàthửnghiệ msinhhọc
PromoterPuroindo- lineb,đoạnpeptíttínhiệ u(Tapur)và
?/Vitiêm Southern,và Wester nblot
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Antisensecủa16kDach ấtgâydịứng(RA17)từlú a
Giảmhàmlượngchấtg â y dịứng(RA17)trong hạtgạo
GenTransgluta- minasetừchuột(rTGp - genvậnchuyểnglutam inasetừtuyếntiềnliệtc ủachuột)
(YangzhouUniv,Ch ina) Đoạnantisense756bpc ủagenWxtừlúanằmgi ữaexon6và9
PCR,Southern,North ern,Westernblot,ELI SAvàthửnghiệmsin hhọc
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
RT- PCR,Southern,West ernblotvàthửnghiệm sinhhọc
NADP- malicenzyme(ME)từlúavà genphosphoenolpyruvatec arboxylase(PC),pyruvate,o rthophosphatedikinase(P K),vàPC+PK(CK)từngô
Nghiêncứuảnhhưở ngcủaviệcgiảmhoạ ttínhRu bi s c o acti vaselênRubiscovà quanghợp
NADP- dependentmalicenzy me(NADP-ME)từngô
Northern,Westernbl ot,vàcácthửnghiệmsi nhhọc
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
Phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC)từ ngô
RT- PCR,southern,North ernblotvàSDS- PAGE
Nghiêncứubiếnnạpe nzymethamgiaquát rìnhquanghợpcủacâ yC4vàolúa
Phosphoenolpyruvate carboxylase(pepc)từn gô
(TohokuUniv,Japan ) ĐoạnAntisensecủar bcS(Rubiscosmallsu bunit)từlúa
Cảithiệnnăngsuấtvà hiệuquảsửdụngđạm trongđiềukiệnnồng độCO2trongmôitrư ờngcao
Gensps(Sucrose- p h o s p h a t e synthase )từCyanobacteriumSy nechocystiss p
TT Têngiống Tácgiả/Cơquan Gen/Vector Môsửdụng/
Năm biến nạp / Phóngt hích
265 Kitaake Sakulsingharoj(Was hingtonStateUniv,U SA)
MosantoCompany(USA)Syn-genta seedsA G (Switzerland)
MosantoCompany(USA)KWsS aatAG(Germany)
MON863 Khángsâu Monsanto MosantoCompany(USA) 21/2/2002
PioneerHi-Bred InternationalInc.MycogenSeeds/DowAgroScie
DòngNgôRoundupReadyGA21XMon810 Khángsâu;Chốngch ịuthuốctrừcỏ
DòngNgôRoundupReadyNK603XMON810 Khángsâu;Chốngc hịuthuốctrừcỏ
DòngT25XMON810 Khángsâu;Chốngch ịuthuốctrừcỏ
Dòng1507XNgôRoundupReadyNK603 Khángsâu;Chốngc hịuthuốctrừcỏ
DòngMon863XMON810XNgôRoundupReadyNK603 Khángsâu;Chốngc hịuthuốctrừcỏ
B.tCry34/35Ab1DòngDAS-59122-7 Khángsâu;Chốngc hịuthuốctrừcỏ
MON88017XMON810 Khángsâu;Chốngc hịuthuốctrừcỏ
Dòng1507XB.tCry34/35Ab1DòngDAS-59122-7 Khángsâu;Chốngch ịuthuốctrừcỏ
DòngB.tCry34/35Ab1DòngDAS-59122-7XNK603 Khángsâu;Chốngc hịuthuốctrừcỏ
DòngB.tCry34/35Ab1DòngDAS-59122-7X1507XNK603 Khángsâu;Chốngc hịuthuốctrừcỏ
RF3 Chốngchịuthuốc trừcỏ;Phụchồitínhb ấtdụcđực
DòngRoundupReadyCotton1445XBôngIngard531 Khángsâu;Chống Monsanto MosantoCompany(USA) 30/6/2003
Nơisảnxuất Thờiđiểmho ànthành chịuthuốctrừcỏ JapanLtd.
Dòng15985X BôngRoundupready 1445 Khángsâu;Chốngc hịuthuốctrừcỏ
Dòng281X3006XMON88913 Khángsâu;Chốngc hịuthuốctrừcỏ
BayerCropSciences(Germany) 8/15/2006 phụlụcE:CáCDòNGVISINHVậTĐ∙CHUYểNGENTRÊNTHếGIớI
1 E.coliDH5alpha todC1 Ph©nhuûTCE
BDNF Tăngc−ờngkhảnăngbiệthoávàsốngs ó t củat ếbàothầnkinh
MM294MC1061 và Tab3 Kíchthíchsựhìnhthànhv à thànhthụcc ủ a tế bàoT
HB101DH5alpha hoặc IL4 Kíchthíchsựhìnhthànhv à thànhthụcc ủ a tế bàoT,B
12 E.coliBAC6010 atzA Khử gốc Cl - của atrazine thànhhydroxyatrazine
17 E.coliBJ5183 P53 TrịliệugenbằngAdenoviruttáit ổ h ợ p trongc hữatrịungth−suygiảmp53
19 Pseudomonas ppY101LA linA PhânhuỷsinhhọcLindane
20 Pseudomonaspeusodo alcaligens atzA,atzB,atzC PhânhuỷsinhhọcLindane
21 Pseudomonas stutzeri strain Bhpvàtod PhânhuỷsinhhọcPCB
24 Pseudomonasfluoresce nsF113pcb TnPCB PhânhuỷsinhhọcPCB
27 Pseudomonas putida pp0301 pR0301p l a s m i d Khoángh o á phenoxyacetate
5nhómC Genứcchếkhốiudạngd ạip53 TrịliệugenbằngAdenoviruttáit ổ h ợ p trong chữatrịungth−suygiảmp53
L-2 và kháng Chữaungth−vúdic ă n vàungth−biểubìtếbào thËndic¨n
32 Loài Pichia pastoris dòngGS115 CecropinD Dùnglàmthuốckhángkhuẩn
33 Loài Baccillus dòng168 Nhóm11gen SinhtổnghợpNisin
LoàiRalstoniasolanace arumdòngGMI8172 GenHrpO Sinhbacteriocinsửdụngtrongphòngchốngb ệnhhéoxanhcàchua.
35 Ralstoniasolanacearu mY N 5 pNP126mango p e r o n luxCDABEcủa Vibriof isheriv à m ộ t v ù n g pr omoternhËn đ−ợctừgenomicA D N c ủ a B u r k h o l - deriaglumae
PlasmidpE43(mã h o á c h o g e n oxy- genolyticorthode- chlorinationohb)h o ặ c plasmidpPC3(mãhoác hogenhydrolyticparad e-chlorinationfcb )
KhửgốcCl - vàkhoánghoátoànbộmonochlorobiphenyls t h a y t h ế v ị tríorthovàpara phôlôcF:métsè Website vÒGMOshttp://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scp/outcome_gmo_en.html http://www.ipm.iastate.edu/ipm/icm/ 1999/2-15- 1999/btcornandsr.html http://pgeu.biotec.or.th/our_products.htm http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/TransgenicCrops/ hotmaize.html http://www.agbioforum.org/v7n3/v7n3a01-morse.htm http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/ TransgenicCrops/references.html#Dalton http://www.krishiworld.com/html/New_research1.html http://64.26.172.90/ unl2/dbase.php?action=ShowProd&data=BT11+(X4334CBR%2C+X4734CBR)&frmat=LONG http://www.atcc.org/ Products/vectors.cfm http://www.bdbiosciences.com/clontech/techinfo/vectors/index.shtml http:// www.nature.com/ja02 http://www.plantphys.net/article.php?ch!&id!6 http://www.bdbiosciences.com/nvCategory.jsp?action=SELECT&form=formTree_catBean&item1944 http:// home.rda.go.kr/eng/report/list2.asp http://www.iab.ac.ru http://www.pbs.org/wgbh/harvest/engineer/ transgen_lo.html http://www.invivogen.com/plasmids/plasmids.htm http:// www.promega.com/applications/plant/ http://www.biotechnology.gov.au/biotechnologyOnline/food/food_and_agriculture.htm
339 http://www.wjgnet.com/ http://www.micronet.cn/ journal/CJB/cat-10-3.htm http://www.abbs.info/ menu/menu37-02.htm http:// www.asiabionet.org http://www.hcmier.edu.vn http://www.economia.uniroma2.it/conferenze/ icabr2005/2004ConfPapers.asp http://www.gendatabaseonline.com/ dspMainPage.asp?http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/ index.htm#choice http://www.indsp.org/VIP3A.php http://www.i-sis.org.uk/NGMTLOOF.php http:// bio.argon.acad.bg/labgen/Bacillus.html h t t p : / / b i o t e c h k n o w l e d g e c o m / http://www.icac.org/icac/cotton_info/tis/biotech/documents/ http:// www.bios.net/daisy/bios/392 http://www.checkbiotech.org/root/index.cfm http://www.uky.edu/Ag/
Entomology/entfacts/fldcrops/ef147.htm http://www.extension.umn.edu/ distribution/cropsystems/DC7055.html http://www.ippc.orst.edu/dir/ microbial/bt/ http://www.defra.gov.uk/environment/gm/crops/ index.htm http://www.defra.gov.uk/environment/gm/background/ index.htm http://www.ccst.us http://www.isaaa.org/ ht tps:// www.aginte rnetw ork.net / http:// www.agbiotech.com.vn/vn/ http:// biosafety.ihe.be/ http://genetics.biol.ttu.edu/ geneexp.html http:// www.ncbe.reading.ac.uk http:// www.agbios.com/main.php http:// www.croplife.org/ http://doegenomes.org/ http://www.plantbio.ohiou.edu/epb/instruct/PBIO%20427/ http:// www.bioplanet.com/planetforums/ http://www.ebiotrade.com/emagazine/ index_5.aspx http://www.genomics.com.cn/index.jsp http:// www.kuleuven.ac.be/rega/mvr/files/bioinfv64.htm (hay) http:// nar.oupjournals.org/content/vol31/issue1/index.shtml http:// nar.oupjournals.org/content/vol32/suppl_2/index.shtml http:// us.expasy.org/tools/peptidecutter/ http://www.prettybio.com/upload/NOC.zip http://www.biosino.org/ubb/Forum2/HTML/000302.html http:// noc.ibp.ac.cn/
FTP/Biosoftware/PrimerExpress2.0 http://www.biolover.com/dvbbs/ dispbbs.asp?boardID&ID)95 http://www.biolover.com/ http:// bioinformer.ebi.ac.uk/newsle mitoprotii.html http://www.inra.fr/Internet/
Produits/Predotar http://www.animalbiotechnology.org/references.asp http://www.und.nodak.edu/misc/ndrural/Sustain%20Development.htm ( G M O s ) http:// www.biotechknowledge.monsanto.com/biotech/bbasics.nsf/gene-trans.html http://ejb.ucv.cl/content/vol6/issue1/full/ 4/index.html http://www.arc.agric.za/main/biotech.htm http://www.nwrage.org/modules.php? op=modload&name=News&file=index&catid=&topic=5 http://www.animalbiotechnology.org/references.asp
Mộtsốđịachỉcóphầnmềmvềplasmid:http://www.premierbiosoft.com/ plasmid_maps sv/cloning.html http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/ bioedit.html http://www.premierbiosoft.com/plasmid_maps sv/ cloning.html http://www.premierbiosoft.com/netprimer/ne etprlaunch.html http://www.protocol-online.org/ ach protocolo n l i n e http://www.bioexchange.com/tools/protocols.cfm ĐịachỉtrangwebcóphầnmềmkiểmtravịtrícắtgiớihạnDNA:http:// www.protocol-online.org/prot/Resear ction_Digestion http:// tools.neb.com/NEBcutter2/index.php http:// www.restrictionmapper.org http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/ index.html http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/ download.htm http://molbiol-tools.ca/
NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? db=PubMed HIGHWIRE: http://highwire.stanford.edu/
SCIENCEDIRECT: http:// www.sciencedirect.com GOOGLE: http://www.google.com
GOOGLESCHOOLAR: http:// scholar.goolge.com NATURE: http://www.nature.com
SCIENCEMAG: http:// www.sciencemag.org CELL: http://www.cell.com
Thuậtngữsinhhọc http://cancerweb.ncl.ac.uk/omd/ phụlụcG:mộtsốhìnhảnhvềhộithảokhoahọc“cơsởdữliệusinhvậtbiếnđổigenvàq uảnlýantoànsinhhọc”-hànội,19/12/2006