VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: cây ích mẫu được trồng và thu mua tại tỉnh Cao Bằng Cây ích mẫu được thu hoạch sau khi trồng được 70-80 ngày Sau đó được phơi khô đến độ ẩm dưới 8% (cụ thể là 7,15%), tiếp theo được nghiền nhỏ đến kích thước hạt có đường kính là 0,5-1 mm để tiến hành các thí nghiệm.
Hình 3.1 Cây ích mẫu sau phơi khô và nghiền nhỏ 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
STT Tên hóa chất Nơi sản xuất
6 Pb(CH3COO)2 Trung Quốc
Bảng 3.2 Dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm
STT Tên dụng cụ STT Tên dụng cụ
1 Bình tam giác 150 ml 8 Giá đỡ ống nghiệm
2 Bình định mức 50 ml 9 Pipet 1 ml
3 Bình định mức 100 ml 10 Pipet 2 ml
6 Giấy lọc 13 Cốc đong thủy tinh 100 ml
7 Ống nghiệm 14 Cốc đong thủy tinh 50 ml
Bảng 3.3 Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
STT Thiết bị thí nghiệm Nơi sản xuất
1 Cân phân tích Nhật Bản
5 Bình hút ẩm Việt Nam
6 Khúc xạ kế Trung Quốc
Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác của phòng thực hành khoa Công nghệ thực phẩm dùng để phục vụ nghiên cứu.
Phạm vi nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ chế biến, khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa học và Công nghệ Thực phẩm, Khoa Công nghệ thực phẩm.
Thời gian thực hiện nghiên cứu: từ 3/2021-8/2021.
Nội dung nghiên cứu
Phân tích định tính sự có mặt của flavonoid toàn phần trong cây ích mẫu.
Nghiên cứu lựa chọn dung môi phù hợp để tách chiết flavonoid toàn phần từ cây ích mẫu.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng tách chiết hàm lượng flavonoid toàn phần.
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng tách chiết hàm lượng flavonoid toàn phần.
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu quả tách chiết flavonoid toàn phần Đồng thời, bài viết cũng đề xuất quy trình công nghệ tối ưu để tách chiết flavonoid từ cây ích mẫu, nhằm nâng cao chất lượng và hiệu suất thu hồi.
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết flavonoid từ cây ích mẫu với dung mỗi hữu cơ bằng phương pháp ngâm chiết theo sơ đồ quy trình sau:
Hình 3.2 Quy trình chiết chung thu nhận flavonoid từ cây ích mẫu dự kiến
Cây ích mẫu (phần trên không)
Nguyên liệu chính là cây ích mẫu, chỉ thu hoạch phần trên không và loại bỏ những cây bị thối hỏng Sau khi thu hoạch, ích mẫu được phơi khô và bảo quản ở nhiệt độ phòng để giữ được chất lượng.
Để tăng cường hiệu quả trích ly, mẫu đã phơi khô cần được cắt nhỏ và nghiền mịn bằng máy nghiền Việc nghiền mẫu giúp dung môi dễ dàng thẩm thấu vào, đồng thời tăng diện tích tiếp xúc giữa mẫu và dung môi.
Ngâm mẫu đã nghiền nhỏ với dung môi trong lọ thủy tinh có nắp đậy.
Mẫu sau khi được ngâm chiết với dung môi trong thời gian cố định sẽ được lọc bằng giấy lọc loại bỏ bã thu lấy dịch chiết.
3.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1 nhằm phân tích định tính sự có mặt của flavonoid trong cây ích mẫu Bột nghiền từ cây ích mẫu được ngâm chiết bằng dung môi ethanol 70% trong 20 giờ ở nhiệt độ phòng Sau khi ngâm chiết, 1 ml dịch chiết được lọc và thu nhận, sau đó thêm từ từ 1 ml dung dịch Pb(CH3COO)2 10% Sau 1-2 phút, quan sát hiện tượng màu sắc để xác định sự hiện diện của flavonoid Nếu dịch chiết xuất hiện kết tủa màu vàng, điều này chứng tỏ flavonoid có mặt trong dịch chiết.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu lựa chọn dung môi phù hợp để tách chiết flavonoid toàn phần được thực hiện bằng cách sử dụng ba loại dung môi khác nhau: nước (H2O), ethylacetate (CH3COOC2H5) và ethanol 80% (C2H5OH) Mục tiêu của thí nghiệm là xác định loại dung môi tách chiết hiệu quả nhất cho flavonoid.
Cân 0,2 g bột ích mẫu cho vào các lọ thuỷ tinh có nắp tách chiết với các dung môi nước cất, ethyacetate và ethanol.
Chiết flavonoid trong cùng các điều kiện cố định:
Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu: 50/1 (ml/g).
Nhiệt độ tách chiết: nhiệt độ phòng.
Sau khi hoàn tất quá trình chiết xuất, tiến hành xác định hàm lượng flavonoid tổng cộng Dựa trên kết quả phân tích, lựa chọn loại dung môi phù hợp nhất Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại Kết quả thu được từ thí nghiệm thứ hai sẽ được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 3 nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng tách chiết hàm lượng flavonoid toàn phần Các mức nồng độ dung môi được khảo sát bao gồm 60%, 70%, 80% và 90% Sau đó, tiến hành thí nghiệm để đánh giá hiệu quả tách chiết flavonoid.
Cân 0,2 g bột ích mẫu và cho vào các lọ thuỷ tinh có nắp Tiến hành tách chiết bằng dung môi đã được xác định ở TN2 với các nồng độ là 60%, 70%, 80% và 90%.
Chiết flavonoid trong cùng các điều kiện cố định:
Loại dung môi: từ kết quả của thí nghiệm 2.
Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu: 50/1 (ml/g).
Nhiệt độ tách chiết: nhiệt độ phòng.
Cuối quá trình chiết, tiến hành xác định hàm lượng flavonoid toàn phần Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn nồng độ dung môi tối ưu nhất Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu một yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại ba lần Kết quả từ thí nghiệm ba sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 4 nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng flavonoid toàn phần, với các mốc thời gian là 18 giờ, 20 giờ, 22 giờ và 24 giờ Trong thí nghiệm, 0,2 g bột ích mẫu được cân và cho vào các lọ thuỷ tinh có nắp, sau đó tiến hành chiết bằng dung môi đã xác định ở thí nghiệm 2 và nồng độ dung môi đã xác định ở thí nghiệm 3 Thời gian chiết được thực hiện theo các mốc thời gian đã nêu.
Chiết flavonoid trong cùng các điều kiện cố định:
Loại dung môi: từ kết quả của thí nghiệm 2.
Nồng độ dung môi: từ kết quả của thí nghiệm 3.
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 50/1 (ml/g).
Nhiệt độ tách chiết: nhiệt độ phòng.
Sau khi hoàn tất quá trình chiết xuất, tiến hành xác định hàm lượng flavonoid toàn phần Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn thời gian tách chiết tối ưu nhất Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu một yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên và được lặp lại ba lần Kết quả từ thí nghiệm thứ tư sẽ được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 5 tập trung vào việc nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng tách chiết hàm lượng flavonoid toàn phần Các tỉ lệ dung môi/nguyên liệu được khảo sát bao gồm 30/1, 40/1, 50/1 và 60/1 (ml/g) Để thực hiện thí nghiệm, 0.2 g bột ích mẫu được cân và cho vào các lọ thuỷ tinh có nắp, sau đó tiến hành tách chiết bằng dung môi đã xác định ở thí nghiệm trước (TN1), với nồng độ dung môi và thời gian tách chiết được xác định từ các thí nghiệm TN2 và TN3.
Chiết flavonoid trong cùng các điều kiện cố định:
Loại dung môi: từ kết quả của thí nghiệm 2.
Nồng độ dung môi: từ kết quả của thí nghiệm 3.
Thời gian chiết: từ kết quả của thí nghiệm 4.
Nhiệt độ tách chiết: nhiệt độ phòng.
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng flavonoid toàn phần và lựa chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tối ưu dựa trên kết quả phân tích Thí nghiệm được bố trí theo kiểu một yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại Kết quả từ thí nghiệm 5 sẽ được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.3.1 Phương pháp định tính flavonoid trong dịch chiết
Ngâm 0,2 g bột ích mẫu với 10 ml ethanol 70% trong 20 giờ, sau đó lọc để thu dịch lọc và loại bỏ bớt dung môi nhằm thu được flavonoid Tiếp theo, hút 1 ml dịch chiết flavonoid vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch Pb(CH3COO)2 10% Nếu trong mẫu có chứa flavonoid, sẽ xuất hiện kết tủa màu vàng do phản ứng thế hidro trong gốc hidroxyl của các hợp chất flavonoid (Tiwari và cộng sự, 2011).
3.4.3.2 Phương pháp định lượng flavonoid trong dịch chiết
Xây dựng đường chuẩn quercetin
Hàm lượng flavonoids tổng số được xác định bằng phương pháp so màu, trong đó flavonoids tạo phức màu vàng với AlCl3 Phương pháp này sử dụng quercetin (QE) làm chất chuẩn tham chiếu để xây dựng phương trình đường chuẩn (Chang và cộng sự, 2002).
Hòa tan 0,1 mg quercetin trong dung dịch ethanol 80%, sau đó pha loãng thành các nồng độ 20, 40, 60, 80 và 100 μg/ml Đối với mỗi nồng độ, lấy 0,5 ml dung dịch cho vào ống nghiệm, thêm 1,5 ml ethanol 95%, 0,1 ml AlCl3 10%, 0,1 ml CH3COOK 1M và 2,8 ml nước cất Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó đo màu ở 415 nm Mẫu trắng được thực hiện tương tự nhưng thay AlCl3 bằng nước cất.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả định tính flavonoid trong cây ích mẫu
Bột ích mẫu được ngâm trong dung môi ethanol 70% trong 20 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó được lọc để thu được dịch chiết Một ml dịch chiết được cho vào ống nghiệm và thêm 1 ml dung dịch Pb(CH3COO)2 10%, để yên 1-2 phút cho phản ứng diễn ra Kết quả cho thấy sự xuất hiện kết tủa vàng, chứng tỏ dịch chiết chứa hợp chất flavonoid Phân tích định tính này là cơ sở để thiết kế thí nghiệm tách chiết hàm lượng flavonoid toàn phần từ cây ích mẫu.
(A) Dịch chiết (B) Dịch chiết + Pb(CH 3 COO) 2
Hình 4.1 Kết quả định tính sự có mặt flavonoid trong cây ích mẫu
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết flavonoid từ cây ích mẫu
4.2.1 Ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần
Mức độ hòa tan của các chất trong hệ dung môi khác nhau, do đó, nghiên cứu này bắt đầu bằng việc khảo sát các loại dung môi để lựa chọn loại phù hợp cho quá trình tách chiết sau này Chúng tôi đã sử dụng ba loại dung môi: nước cất, ethylacetate và ethanol, vì chúng có tính ưu việt như giá thành rẻ, dễ kiếm và dễ thu hồi để tái sử dụng.
Ba công thức sử dụng các loại dung môi gồm nước cất (H₂O), ethylacetate (C₂H₄O₂) và ethanol (C₂H₅OH) 80% với thời gian chiết xuất là 20 giờ Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu được duy trì ở mức 50/1 (ml/g) tại nhiệt độ phòng Kết quả xác định hàm lượng flavonoid được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của loại dung môi tách chiết đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần Công thức Loại dung môi Hàm lượng flavonoid (mg/g)
Ghi chú: các chữ a, b thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa�= 5%.
Kết quả từ bảng 4.1 cho thấy hàm lượng flavonoid được tách chiết từ các dung môi khác nhau có sự khác biệt rõ rệt Cụ thể, ethanol cho hàm lượng flavonoid cao nhất là 0,38 ± 0,05 (mg/g), tiếp theo là ethylacetate với 0,23 ± 0,02 (mg/g), và nước cất có hàm lượng thấp nhất là 0,17 ± 0,01 (mg/g) Dung môi phân cực như ethanol có khả năng hòa tan tốt các hợp chất flavonoid do mức độ phân cực tương đương Kết quả phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa phương pháp tách chiết bằng ethanol so với nước cất và ethylacetate với mức ý nghĩa α = 5%.
Trong nghiên cứu của Liu và cộng sự (2018), flavonoid đã được tách chiết từ cây ích mẫu bằng dung môi ethanol, cho thấy hiệu suất tách chiết cao Zhang và cộng sự (2007) cũng khẳng định rằng ethanol là dung môi tối ưu cho việc tách chiết flavonoid Vì vậy, để đảm bảo an toàn và đạt được hàm lượng flavonoid cao nhất, chúng tôi lựa chọn ethanol làm dung môi cho quá trình tách chiết.
4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần Động lực của quá trình trích ly là do sự chênh lệch gradient nồng độ giữa cấu tử trính ly trong nguyên liệu và dung môi Sự vận chuyển chất tan từ bên trong tế bào thực vật ra bên ngoài dung môi qua con đường khuếch tán là chủ yếu Sự khuếch tán này sẽ giúp cho qúa trình chiết rút các cấu tử cần trích lý từ trong nguyên liệu vào dung môi sẽ xảy ra nhanh và triệt để hơn Do đó lượng dung môi khác nhau sẽ dẫn đến hàm lượng chất tan được chiết rút ra là khác nhau Vì vậy, chúng ta cần khảo sát nồng độ dung môi để chọn tỉ lệ thích hợp nhất cho ra hàm lượng flavonoid cao nhất Bảng 4.2 thể hiện kết quả tách chiết với các nồng độ khác nhau của ethanol trong thời gian ngâm 20 giờ và ở nhiệt độ phòng:
Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến khả năng chiết flavonoid toàn phần Công thức Nồng độ dung môi (%) Hàm lượng flavonoid (mg/g)
Ghi chú: các chữ a, b thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa�= 5%.
Theo bảng 4.2, nồng độ ethanol tăng thì hàm lượng flavonoid cũng tăng theo, nhưng giảm khi nồng độ đạt 80% và 90% Cụ thể, khi nồng độ ethanol thay đổi từ 60% lên 70%, hàm lượng flavonoid tăng từ 0,35 ± 0,04 (mg/g) lên 0,50 ± 0,02 (mg/g), với 70% ethanol cho giá trị flavonoid cao nhất Ngược lại, khi nồng độ ethanol tăng lên 80% và 90%, hàm lượng flavonoid giảm còn 0,42 ± 0,04 (mg/g) và 0,35 ± 0,07 (mg/g) Phân tích thống kê cho thấy hàm lượng flavonoid tại nồng độ 70% (0,50 ± 0,02 mg/g) có sự khác biệt đáng kể so với các nồng độ 60%, 80% và 90% với mức ý nghĩa α = 5%.
Quá trình tách chiết flavonoid phụ thuộc vào lượng dung môi sử dụng; dung môi ít dẫn đến tách chiết không triệt để, trong khi tăng lượng dung môi làm tăng sự tiếp xúc và khuếch tán của các cấu tử Tuy nhiên, khi đạt trạng thái cân bằng, sự chênh lệch gradient nồng độ giảm, dẫn đến hàm lượng flavonoid không tăng thêm Nghiên cứu của Trần Văn Chí và cộng sự (2019) cho thấy hàm lượng flavonoid tách chiết được là 35,58 mg với dung môi ethanol 70%, kết quả tương tự với nghiên cứu của chúng tôi.
Từ các phân tích trên, chúng tôi lựa chọn nồng độ dung môi ethanol 70% để tách chiết nhằm thu được hàm lượng flavonoid cao nhất.
4.2.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần
Thời gian trích ly đóng vai trò quan trọng trong quá trình chiết xuất flavonoid, ảnh hưởng đến hiệu quả và kinh tế Kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng flavonoid cao nhất đạt được khi thời gian ngâm là 20 giờ, với giá trị 0,55 ± 0,04 (mg/g) Các thời gian ngâm khác như 18 giờ, 22 giờ và 24 giờ lần lượt cho hàm lượng 0,51 ± 0,05 (mg/g), 0,55 ± 0,07 (mg/g) và 0,50 ± 0,06 (mg/g) Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể giữa các thời gian ngâm 18 giờ, 20 giờ, 22 giờ và 24 giờ với mức ý nghĩa 5%.
Thời gian chiết là yếu tố quan trọng trong quá trình tách chiết, vì nếu thời gian quá ngắn, các chất cần chiết sẽ không được tách ra hoàn toàn, trong khi thời gian quá dài có thể dẫn đến sự phân hủy của một số chất Kết quả này có thể được lý giải bằng định luật thứ hai của Fick về khuếch tán, cho thấy rằng nồng độ chất tan trong ma trận rắn có thể đạt được trạng thái cân bằng sau một khoảng thời gian nhất định Do đó, chúng tôi quyết định chọn thời gian tách chiết là 20 giờ.
Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng chiết flavonoid toàn phần Công thức Thời gian chiết (h) Hàm lượng flavonoid (mg/g)
Ghi chú: các chữ a thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa�= 5%.
4.2.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng flavonoid thu được, với quá trình tách chiết diễn ra nhờ sự chênh lệch nồng độ và cơ chế khuếch tán Vận chuyển chất tan từ nguyên liệu ra dung môi chủ yếu thông qua khuếch tán; nếu dung môi quá ít, không đủ để hòa tan các cấu tử, trong khi dung môi quá nhiều sẽ gây lãng phí và tăng chi phí Để tối ưu hàm lượng flavonoid, thí nghiệm khảo sát được thực hiện với các tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 30/1, 40/1, 50/1, 60/1 (ml/g), ngâm với ethanol 70% trong 20 giờ ở nhiệt độ phòng, như thể hiện trong bảng 4.4.
Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần Công thức Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu
Ghi chú: các chữ a, b thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa�= 5%.
Theo bảng 4.4, hàm lượng flavonoid tăng khi tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tăng, nhưng giảm xuống ở tỉ lệ 60/1 (ml/g), đạt giá trị thấp nhất Cụ thể, hàm lượng flavonoid lần lượt là 0,47 ± 0,04 (mg/g), 0,54 ± 0,01 (mg/g), 0,57 ± 0,05 (mg/g) và 0,45 ± 0,03 (mg/g) Tỉ lệ tối ưu để thu được hàm lượng flavonoid cao nhất là 50/1 (ml/g) với giá trị 0,57 ± 0,05 (mg/g), có sự khác biệt đáng kể so với các tỉ lệ 30/1 (ml/g), 40/1 (ml/g) và 60/1 (ml/g) với mức ý nghĩa p=5% Tuy nhiên, hàm lượng flavonoids tổng sẽ không tăng thêm khi đã đạt được sự cân bằng.
Vì vậy để vừa đạt hiệu quả tách chiết vừa tiết kiệm dung môi, tôi đã lựa chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 50/1 (ml/g).
Đề xuất quy trình tách flavonoid toàn phần từ cây ích mẫu
Hình 4.2 Sơ đồ quy trình tách chiết flavonoid từ cây ích mẫu
Nguyên liệu: Cây ích mẫu sau khi trồng khoảng 70-80 ngày sẽ được thu hoạch (3/4 cây tính từ ngọn cây xuống).
Phơi khô là quá trình quan trọng sau khi thu hoạch cây, trong đó các phần hư hỏng được loại bỏ và nguyên liệu được phơi khô đến độ ẩm dưới 8% Mục đích của việc phơi khô là giảm hàm lượng nước, từ đó cải thiện hiệu quả bảo quản nguyên liệu.
Ngâm chiết (Trong 20 giờ, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 50/1 ml/g )
Dịch chiết chứa flavonoid toàn phần
Cây đã phơi khô sẽ được nghiền nhỏ đến kích thước 0,5-1 mm bằng máy xay cối nhỏ Việc nghiền nhỏ nguyên liệu giúp phá vỡ cấu trúc tế bào, tạo điều kiện cho dung môi thẩm thấu dễ dàng hơn và tăng diện tích tiếp xúc, từ đó nâng cao hiệu quả trích ly Sau khi nghiền, các mẫu được cho vào túi zip PE để tránh hút ẩm và được bảo quản ở nhiệt độ phòng (25-30°C).
Để ngâm chiết cây ích mẫu, cân 0,2 g bột ích mẫu cho vào lọ thủy tinh có nắp đậy để tránh bay hơi dung môi Tiến hành ngâm với dung môi ethanol 70% theo tỉ lệ 50 ml dung môi cho mỗi gram nguyên liệu trong 20 giờ ở nhiệt độ phòng, nhằm thu được hàm lượng flavonoid tối đa từ cây ích mẫu.
Lọc: Mẫu sau khi ngâm trong 20 giờ sẽ được lấy ra lọc bằng giấy lọc để loại bỏ bã và thu dịch chiết flavonoid toàn phần.