Trích ly là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ thực vật, đóng vai trò quan trọng và quyết định đến kết quả và sự thành công cuối cùng của nghiên cứu.
Qúa trình trích ly có thể thực hiện bằng các phương pháp khác nhau gồm: các phương pháp truyền thống (chiết Soxhlet, ngâm dầm và ngấm kiệt), các phương pháp hiện đại trích ly có sự hỗ trợ của sóng siêu âm, xung điện, enzyme, vi sóng, trích ly ở áp suất cao, trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn.
2.3.1. Các phương pháp trích ly flavonoid
Chiết Soxhlet
Dược liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết. Dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu. Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông xuống bình cầu bên dưới, mang theo các chất hòa tan từ dược liệu. Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp nguyên liệu để hòa tan các chất tan còn lại. Cứ như vậy cho đến khi nguyên liệu được chiết kiệt.
Ưu điểm: quá trình chiết xuất liên tục, tốn ít dung môi, dịch chiết không cần phải lọc.
Nhược điểm: Dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các chất không bền với nhiệt dễ bị phá hủy, không thực hiện được sự khuấy trộn.
Ngâm dầm
Là phương pháp cho dược liệu đã chia nhỏ tới độ mịn thích hợp, tiếp xúc với dung môi trong thời gian nhất định, sau đó gạn, ép, lắng, lọc thu lấy dịch chiết.
Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện nhưng cũng có những nhược điểm như: năng suất thấp, mất nhiều thời gian.
Ngấm kiệt
Là phương pháp cho dung môi chảy rất chậm qua khối nguyên liệu đựng trong một dụng cụ “ngấm kiệt” theo quy định, trong suốt quá trình không khuấy trộn. Nguyên liệu luôn được tiếp xúc với dung môi mới, luôn tạo ra sự chênh lệch nồng độ hoạt chất cao nên có thể chiết kiệt được hoạt chất. Ưu điểm của phương pháp này là nguyên liệu được chiết kiệt, dung dịch chiết đầu đậm đặc. Nhược điểm: năng suất thấp, thao tác thủ công.
Chiết có hỗ trợ siêu âm
Chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (UAE), còn được gọi là chiết xuất siêu âm, sử dụng năng lượng sóng siêu âm trong quá trình chiết xuất. Siêu âm trong dung môi tạo ra tăng tốc độ hòa tan và khuếch tán chất tan cũng như truyền nhiệt, giúp cải thiện hiệu suất chiết. Ưu điểm khác của UAE bao gồm ít dung môi và năng lượng thấp, và giảm nhiệt độ và thời gian chiết. UAE được ứng dụng để chiết xuất các hợp chất dễ biến đổi về nhiệt và không ổn định.
Ưu điểm: Thiết bị tương đối đơn giản, bảo quản và vận hành đơn giản, thiết bị không quá đắt tiền, chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi chiết khá đa dạng, lượng mẫu có thể lên đến hàng trăm gam, giảm được nhiệt độ và áp suất, ưu điểm này được ưu tiên áp dụng để chiết cho các hoạt chất không bền với nhiệt.
Nhược điểm: Dung môi khó được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dài, sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết.
Chiết có hỗ trợ vi sóng
Trong chiết xuất, khi chiếu xạ vi sóng vào môi trường chiết chứa nguyên liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi. Hơn nữa, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật, tạo điều kiện cho chất tan giải phóng vào môi trường dễ dàng, làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm cho dịch chiết lẫn nhiều tạp chất hơn.
Ưu điểm: Không có quán tính nhiệt, hiệu suất chiết cao hơn so với một số phương pháp chiết thông thường, sản phẩm trích ly chất lượng tốt, thời gian chiết nhanh.
Nhược điểm: Không áp dụng cho các phân tử không phân cực, khó áp dụng cho quy mô công nghiệp vì đầu tư cho thiết bị tạo vi sóng là không nhỏ để có đủ công suất, nhiệt độ sôi của các dung môi đạt được rất nhanh, có thể gây nổ.
2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly flavonoid
Loại dung môi
Với mỗi loại nguyên liệu khác nhau thì cần phải dùng những dung môi khác nhau để chiết được những hợp chất mong muốn. Tùy thuộc vào bản chất của hợp chất cần tách chiết để lựa chọn loại dung môi hữu cơ hay vô cơ, phân cực hay không phân cực.
Vì vậy, cần phải lựa chọn loại dung môi để thu được dịch chiết có hàm lượng cao nhất.
Nồng độ dung môi
Trong quá trình tách chiết, mỗi loại nguyên liệu sẽ được chiết với một hoặc một số dung môi nhất định. Nồng độ dung môi có thể ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất được tách chiết ra khỏi nguyên liệu. Nồng độ quá cao hoặc quá thấp có thể tách chiết được ít hàm lượng chất cần thiết hoặc tách thêm được các hợp chất không mong muốn.
Vì vậy, dung môi được lựa chọn thường sẽ quan tâm đến khả năng hòa tan, mức độ phân cực và nồng độ của dung môi đó.
Thời gian chiết
Thời gian chiết ảnh hưởng lớn đến quá trình tách chiết, nó làm cho hàm lượng chất cần chiết tăng lên hoặc giảm xuống. Thời gian chiết cần phải đủ để tách chiết được các hợp chất ra khỏi nguyên liệu. Vì vậy, tùy thuộc vào bản chất chất cần chiết và loại dung môi chiết để lựa chọn thời gian chiết.
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu
Tỷ lệ dung môi ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất do ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán triệt để của chất cần trích ly vào dung môi. Khi tăng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu sẽ tăng chênh lệch nồng độ, giúp quá trình khuếch tán cấu tử hòa tan vào dung môi diễn ra dễ dàng. Tuy nhiên, việc tăng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến một giới hạn nhất định, vì lượng dung môi sử dụng lớn sẽ gây khó khăn cho quá trình xử lý sau trích ly. Vì vậy tuỳ vào dạng bản chất của chất cần thu nhận trong nguyên liệu mà sử dụng tỷ lệ dung môi thích hợp để nâng cao hiệu quả chiết.
2.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về phương pháp tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây ích mẫu
2.4.1. Trên thế giới
Năm 2006, Guan-Zheng Qu và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu các thành phần oxy hoá được tách chiết từ cây ích mẫu. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai axit phenolic, axit gallic và axit syringic và năm flavonoid, apigenin, luteolin, kaempferol, quercetin và myricetin được phân lập từ các bộ phận trên không của Leonurus japonicus có khả năng chống oxy hoá cao đáng kể vớiα − tocopherolvà BHT. Cong và cộng sự (2009) đã phân lập 8 thành phần hóa học từ ích mẫu và nghiên cứu hoạt động chống khối u của chúng chống lại dòng tế bào K562 bệnh bạch cầu. Kết quả của họ bằng cách sử dụng xét nghiệm khả năng tồn tại của MTT chỉ ra rằng IC50 đối với quercetin-3-O-robinobioside (79), rutin (63), isoquercitrin (80), hyperoside (81), quercetin (68), apigenin (82) và axit benzoic (120) so với tế bào K562 lần lượt là 17,29, 21,56, 21,67, 24,12, 6,3, 10,4 và 116,5 mg/l, trong khi IC50 đối với thuốc đối chứng dương tính adriamycin là 1,48 mg/l. Ngoài ra, Yang và cộng sự (2016) đã nghiên cứu sự kết hợp của Artemisia Princeps Pamp, Leonurus japonicas Houtt và Gardenia
jasminoides Ellis làm giảm sự trầm trọng của năng lượng, lipid và glucose bằng cách tăng biểu hiện PGC-1α ở gan ở chuột thiếu estrogen. Kết quả nghiên cứu cho thấy APP + LJH + GJE, nhưng không phải APP, đã cải thiện quá trình chuyển hóa năng lượng và làm giảm mức tiêu hao năng lượng tương tự như estrogen. Hơn nữa, APP + LJH + GJE làm giảm mỡ nội tạng và mỡ bắp và tăng khối lượng cơ thể nạc được đo bằng DEXA nhiều như đối chứng tích cực. Bản thân APP đã ngăn chặn sự gia tăng cholesterol LDL và mức chất béo trung tính ở chuột OVX và APP + LJH + GJE làm giảm rối loạn lipid máu ở chuột OVX. Nồng độ insulin huyết thanh nhịn ăn qua đêm và HOMA-IR giảm theo thứ tự giảm dần APP, APP + LJH, APP + LJH + GJE, đối chứng dương tính ở chuột OVX. APP và APP + LJH làm tăng bài tiết insulin trong phần đầu của OGTT để giảm mức đường huyết trong khi APP + LJH + GJE làm giảm mức đường huyết mà không làm tăng mức insulin huyết thanh trong OGTT. APP + LJH + GJE giảm đề kháng insulin trong ITT ở chuột OVX nhiều hơn so với đối chứng tích cực. Nhóm APP + LJH + GJE có biểu hiện tăng biểu hiện thụ thể kích hoạt peroxisomal peroxisomal ở gan, làm tăng số lượng gen liên quan đến quá trình oxy hóa axit béo và giảm tổng hợp axit béo. Tín hiệu insulin ở gan (pAkt và pGSK-1β) cũng được tăng cường để làm giảm các protein carboxykinase phosphoenolpyruvate.
Nghiên cứu của Huang và cộng sự (2021) đã chứng minh rằng leonurine được tách chiết từ cây ích mẫu có tác dụng như một loại thuốc để điều trị các bệnh về tim mạch và thần kinh trung ương.
2.4.2. Trong nước
Tạp chí Dược học (2012), nhóm tác giả Huỳnh Thị Mai Trang và cộng sự thực hiện nghiên cứu: “Chiết xuất tinh chế hispanon và leoheteronin B từ ích mẫu để làm chất đối chiếu”. Kết quả cho thấy, bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập và tinh chế 2 hợp chất labdan diterpen lacton (hispanon và leoheteromin) có trong cao hexan của cây ích mẫu. Cấu trúc hoá học được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm và so sánh với tài liệu đã công bố. Sản phẩm thu được có độ tinh khiết > 95%, đạt yêu cầu cho chất đối chiếu chiết từ dược liệu. Năm 2021, Trần Hoàng Hải và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu: “Đánh giá tác động của cao chiết methanol cây ích mẫu (Leonurus JapoinicusHoutt) lên tế bào ung thư máu K5662 và khả năng gây độc trên ấu trùng tôm”. Kết quả nghiên cứu cho thấy ích mẫu là cao chiết rất có tiềm năng
trong ức chế tăng sinh của tế bào ung thư máu và không gây độc trên ấu trùng tôm.
Kết quả nghiên cứu này là cơ sở, định hướng cho những nghiên cứu sâu hơn sau này về cơ chế tác động cần được làm rõ để có thêm cơ sở khoa học và đưa Ích Mẫu ứng dụng vào thực tiễn trong điều trị bệnh ung thư máu.