PHẦN IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết flavonoid từ cây ích mẫu
Mức độ hòa tan của một chất trong các hệ dung môi là khác nhau. Vì vậy, trong nghiên cứu này đầu tiên chúng tôi chọn thí nghiệm khảo sát các loại dung môi trước tiên để chọn được loại dung môi thích hợp cho quá trình tách chiết về sau.
Để lựa chọn được loại dung môi tách chiết trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng 3 loại dung môi là: nước cất, ethylacetate và ethanol. Đây là các loại dung môi thường dùng để hòa tan các cấu tử cần tách do tính ưu việt của chúng như rẻ tiền, dễ kiếm và dễ thu hồi dung môi để tái sử dụng. Thí nghiệm được chúng tôi tiến hành với 3 công thức các loại dung môi lần lượt là nước cất (H O), ethylacetate (CH COOC H ),
ethanol (C2H5OH) 80% với thời gian 20 giờ và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 50/1 (ml/g) ở nhiệt độ phòng, sau đó xác định hàm lượng flavonoid, kết quả thu được thể hiện ở dưới bảng 4.1:
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của loại dung môi tách chiết đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần
Công thức Loại dung môi Hàm lượng flavonoid (mg/g)
Công thức 1 Nước cất 0,17±0,01b
Công thức 2 Ethylacetate 0,23±0,02b
Công thức 3 Ethanol 0,38±0,05a
Ghi chú: các chữ a, b thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa�= 5%.
Qua bảng 4.1 ta thấy hàm lượng flavonoid được tách chiết từ các dung môi khác nhau là khác nhau. Cụ thể, tách chiết với ethanol cho hàm lượng flavonoid cao nhất là 0,38 ± 0,05 (mg/g), khi tách chiết với ethylacetate hàm lượng flavonoid thu được là 0,23±0,02 (mg/g) và với nước cất hàm lượng flavonoid thu được thấp nhất là 0,17± 0,01 (mg/g). Dung môi phân cực, có thể hòa tan tốt các cấu tử phân cực, nhưng khó hòa tan cấu tử không phân cực hoặc kém phân cực. Các chất có tính chất tương tự hay mức độ phân cực tương đương nhau thì sẽ hòa tan trong nhau tốt. Nhóm hợp chất flavonoids gồm nhiều thành phần và khác nhau ở từng loại nguyên liệu, nên khả năng hòa tan khác nhau phụ thuộc rất nhiều vào loại dung môi. Hàm lượng flavonoid thu được cao nhất khi tách chiết với ethanol (0,38 mg/g), điều này có nghĩa rằng mức độ phân cực của ethanol và các hợp chất flavonoid trong cây ích mẫu tương đương nhau.
Kết quả cho thấy tách chiết mẫu bằng ethanol khi xử lý thống kê có sự khác biệt so với dung môi là nước cất và ethylacetate với mức ý nghĩaα = 5%.
Trong nghiên cứu của (Liu và cộng sự, 2018), tác giả đã tách chiết được các flavonoid từ cây ích mẫu bằng dung môi ethanol. Zhang và cộng sự (2007), cũng đã sử dụng dung môi ethanol để tách chiết flavonoid, do ethanol cho hiệu suất tách chiết cao hơn các loại dung môi khác. Từ đó, để an toàn cho quá trình sử dụng và thu được hàm lượng flavonoid cao nhất khi tách chiết thì chúng tôi lựa chọn dung môi là ethanol.
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần
Động lực của quá trình trích ly là do sự chênh lệch gradient nồng độ giữa cấu tử trính ly trong nguyên liệu và dung môi. Sự vận chuyển chất tan từ bên trong tế bào thực vật ra bên ngoài dung môi qua con đường khuếch tán là chủ yếu. Sự khuếch tán này sẽ giúp cho qúa trình chiết rút các cấu tử cần trích lý từ trong nguyên liệu vào dung môi sẽ xảy ra nhanh và triệt để hơn. Do đó lượng dung môi khác nhau sẽ dẫn đến hàm lượng chất tan được chiết rút ra là khác nhau. Vì vậy, chúng ta cần khảo sát nồng độ dung môi để chọn tỉ lệ thích hợp nhất cho ra hàm lượng flavonoid cao nhất. Bảng 4.2 thể hiện kết quả tách chiết với các nồng độ khác nhau của ethanol trong thời gian ngâm 20 giờ và ở nhiệt độ phòng:
Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến khả năng chiết flavonoid toàn phần
Công thức Nồng độ dung môi (%) Hàm lượng flavonoid (mg/g)
Công thức 1 60 0,35±0,04b
Công thức 2 70 0,50±0,02a
Công thức 3 80 0,42±0,04ab
Công thức 4 90 0,35±0,07b
Ghi chú: các chữ a, b thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa�= 5%.
Qua bảng 4.2 ta thấy nồng độ ethanol tăng lên thì hàm lượng flavonoid cũng tăng lên khi nồng độ dung môi tăng. Tuy nhiên, khi nồng độ đến 80% và 90% thì hàm lượng flavonoid đã giảm xuống. Cụ thể, khi thay đổi nồng độ từ 60% lên 70% thì hàm lượng flavonoid tăng từ 0,35 ± 0,04 (mg/g) lên 0,50 ± 0,02 (mg/g) và hàm lượng flavonoid thu được khi tách chiết với nồng độ ethanol 70% đạt giá trị cao nhất. Khi nồng độ ethanol được tăng lên 80% và 90% thì hàm lượng flavonoid giảm dần lần lượt là 0,42±0,04 (mg/g) và 0,35±0,07 (mg/g). Khi xử lý thống kê thì ta thấy với nồng độ 70% thì hàm lượng flavonoid thu được là 0,50±0,02 (mg/g) có sự khác biệt so với các nồng độ 60%, 80% và 90% với mức ý nghĩaα = 5%.
Qua đây ta thấy rằng lượng dung môi ít dẫn đến quá trình tách chiết chưa được triệt để và khi tăng lượng dung môi thì sự chênh lệch gradient nồng độ lớn làm cho các cấu tử trong nguyên liệu tiếp xúc với dung môi nhiều hơn làm cho quá trình khuếch
tán tăng cao. Tuy nhiên, khi quá trình tách chiết đã đạt trạng thái cân bằng thì sự chênh lệch gradient nồng độ không còn nhiều nên hàm lượng flavonoid không tăng thêm nữa.
Theo nghiên cứu của Trần Văn Chí và cộng sự (2019), tác giả đã tách chiết được hàm lượng flavonoid là 35,58 mg với dung môi ethanol 70%, kết quả này tương tự với kết quả của chúng tôi.
Từ các phân tích trên, chúng tôi lựa chọn nồng độ dung môi ethanol 70% để tách chiết nhằm thu được hàm lượng flavonoid cao nhất.
4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần Thời gian trích ly cũng đóng vai trò nhất định trong toàn bộ quá trình trích ly flavonoid. Yếu tố thời gian được sử dụng hợp lý không chỉ mang lại lợi ích về hiệu quả trích ly mà còn mang đến lợi ích không nhỏ về mặt kinh tế. Trong thí nghiệm này dựa vào kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 thì ta thấy hàm lượng flavonoid cao nhất khi thời gian ngâm là 20 giờ và thấp nhất là 24 giờ. Cụ thể, hàm lượng flavonoid thu được khi ngâm trong thời gian 18 giờ là 0,51 ± 0,05 (mg/g), trong 20 giờ là 0,55 ± 0,04 (mg/g), trong 22 giờ là 0,55±0,07 (mg/g) và trong 24 giờ là 0,50±0,06 (mg/g). Mặc dù vậy, khi xử lý thống kê tách chiết trong thời gian là 20 giờ không có sự khác biệt so với các mốc thời gian 18 giờ, 22 giờ và 24 giờ với mức ý nghĩa�=5%.
Trong quá trình tách chiết thời gian chiết quá ngắn thì làm cho các chất cần chiết chưa thể được tách ra khỏi nguyên liệu. Ngược lại, nếu chiết trong thời gian quá dài thì có thể làm phân hủy một số chất. Kết quả này có thể được giải thích bằng định luật thứ hai của Fick về sự khuếch tán khi dự đoán trạng thái cân bằng cuối cùng giữa nồng độ chất tan trong ma trận chất rắn trong dung môi có thể đạt được sau một thời gian nhất định (Nicolin và cộng sự , 2016). Vì vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian tách chiết là 20 giờ.
Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng chiết flavonoid toàn phần
Công thức Thời gian chiết (h) Hàm lượng flavonoid (mg/g)
Công thức 1 18 giờ 0,51±0,05a
Công thức 2 20 giờ 0,55±0,04a
Công thức 3 22 giờ 0,55±0,07a
Công thức 4 24 giờ 0,50±0,06a
Ghi chú: các chữ a thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa�= 5%.
4.2.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng flavonoid thu được. Quá trình tách chiết xảy ra nhờ sự chênh lệch nồng độ và bằng cơ chế khuếch tán. Con đường vận chuyển chất tan và các hoạt chất từ nguyên liệu ra bên ngoài dung môi chủ yếu nhờ con đường khuếch tán. Nếu lượng dung môi quá ít thì không đủ để hòa tan, chiết rút các cấu tử ra bên ngoài môi trường, chỉ đủ làm ướt nguyên liệu. Nếu dùng lượng dung môi lớn thì gây lãng phí, tốn kém dung môi, chi phí cao. Vì vậy, để thu được hàm lượng flavonoid cao nhất ta tiến hành thí nghiệm khảo sát với các tỉ lệ dung môi/nguyên liệu sau: 30/1, 40/1, 50/1, 60/1 (ml/g). Kết quả thí nghiệm thực hiện ngâm với ethanol 70% trong thời gian 20 giờ và ở nhiệt độ phòng được thể hiện ở bảng 4.4:
Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng tách chiết flavonoid toàn phần
Công thức Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (ml/g)
Hàm lượng flavonoid (mg/g)
Công thức 1 30/1 0,47±0,04b
Công thức 2 40/1 0,54± 0,01ab
Công thức 3 50/1 0,57± 0,05a
Công thức 4 60/1 0,45± 0,03b
Ghi chú: các chữ a, b thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa�= 5%.
Qua bảng 4.4 ta thấy hàm lượng flavonoid tăng dần khi tỉ lệ dung môi/nguyên liệu tăng dần. Tuy nhiên, khi tăng đến tỉ lệ 60/1 (ml/g) thì hàm lượng flavonoid giảm xuống và đạt giá trị thấp nhất. Cụ thể, khi tách chiết với các tỉ lệ thu được hàm lượng
flavonoid lần lượt là 0,47 ± 0,04 (mg/g), 0,54 ± 0,01 (mg/g), 0.57 ± 0,05 (mg/g), 0,45 ± 0,03 (mg/g). Hàm lượng flavnoid thu được cao nhất khi tách chiết với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 50/1 (ml/g). Khi xử lý thống kê ta thấy, tách chiết với tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 50/1 (ml/g) thì thu được hàm lượng flavonoid là 0,57 ± 0,05 (mg/g) có sự khác biệt so với các tỉ lệ còn lại là 30/1 (ml/g), 40/1 (ml/g) và 60/1 (ml/g) với mức ý nghĩa �=5%. Tuy nhiên, hàm lượng flavonoids tổng sẽ không tiếp tục tăng khi đã đạt được sự cân bằng.
Vì vậy để vừa đạt hiệu quả tách chiết vừa tiết kiệm dung môi, tôi đã lựa chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 50/1 (ml/g).