PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.4. Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết flavonoid từ cây ích mẫu với dung mỗi hữu cơ bằng phương pháp ngâm chiết theo sơ đồ quy trình sau:
Hình 3.2. Quy trình chiết chung thu nhận flavonoid từ cây ích mẫu dự kiến Cây ích mẫu
(phần trên không)
Phơi khô
Nghiền nhỏ
Ngâm chiết
Bã Lọc
Dung môi
Dịch chiết
Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu: Cây ích mẫu thu hoạch phần trên không (loại bỏ những cây bị thối hỏng).
Sau đó, đem đi phơi khô và được bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Lấy mẫu đã phơi khô, cắt nhỏ và sử dụng máy nghiền để nghiền nhỏ mẫu. Mẫu được nghiền nhỏ với mục đích để dung môi dễ thẩm thấu vào mẫu, tăng diện tích tiếp xúc, làm tăng hiệu quả trích ly.
Ngâm chiết:
Ngâm mẫu đã nghiền nhỏ với dung môi trong lọ thủy tinh có nắp đậy.
Lọc:
Mẫu sau khi được ngâm chiết với dung môi trong thời gian cố định sẽ được lọc bằng giấy lọc loại bỏ bã thu lấy dịch chiết.
3.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Phân tích định tính sự có mặt của flavonoid toàn phần trong cây ích mẫuBột nghiền từ cây ích mẫu được ngâm chiết với dung môi ethanol 70% trong 20
giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng. Kết thúc quá trình ngâm chiết, lọc và thu nhận 1 ml dịch chiết, sau đó nhỏ từ từ 1 ml dung dịch Pb(CH3COO)2 nồng độ 10% vào dịch chiết vừa thu nhận, để yên 1-2 phút cho phản ứng diễn ra hoàn toàn, quan sát hiện tượng màu sắc trước và sau phản ứng để ghi nhận có hay không sự có mặt flavonoid trong dịch chiết. Nếu dịch chiết xuất hiện kết tủa màu vàng sau khi nhỏ thuốc thử Pb(CH3COO)2chứng tỏ dịch chiết chứa thành phần flavonoid.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu lựa chọn dung môi phù hợp để tách chiết flavonoid toàn phần
Để nghiên cứu lựa chọn được loại dung môi tách chiết thích hợp, sử dụng 3 loại dung môi khác nhau: nước (H2O), ethylacetate (CH3COOC2H5) và ethanol 80%
(C2H5OH). Sau đó, tiến hành thí nghiệm như sau:
Cân 0,2 g bột ích mẫu cho vào các lọ thuỷ tinh có nắp tách chiết với các dung môi nước cất, ethyacetate và ethanol.
Chiết flavonoid trong cùng các điều kiện cố định:
Thời gian chiết: 20 giờ.
Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu: 50/1 (ml/g).
Nhiệt độ tách chiết: nhiệt độ phòng.
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng flavonoid toàn phần. Dựa trên kết quả phân tích lựa chọn loại dung môi thích hợp nhất. Thí nghiệm bố trí theo kiểu một yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. Kết quả của thí nghiệm 2 được sử dụng cho thí nghiệm sau.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng tách chiết hàm lượng flavonoid toàn phần
Ảnh hưởng của nồng độ dung môi tách chiết đến hàm lượng flavonoid được khảo sát ở các mức nồng độ: 60%, 70%, 80% và 90%. Sau đó, tiến hành thí nghiệm như sau:
Cân 0,2 g bột ích mẫu cho vào các lọ thuỷ tinh có nắp tách chiết bằng loại dung môi đã được xác định ở TN2 với các nồng độ dung môi lần lượt là 60%, 70%, 80% và 90%.
Chiết flavonoid trong cùng các điều kiện cố định:
Loại dung môi: từ kết quả của thí nghiệm 2.
Thời gian chiết: 20 giờ.
Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu: 50/1 (ml/g).
Nhiệt độ tách chiết: nhiệt độ phòng.
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng flavonoid toàn phần. Dựa trên kết quả phân tích lựa chọn nồng độ dung môi thích hợp nhất. Thí nghiệm bố trí theo kiểu một yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. Kết quả của thí nghiệm 3 được sử dụng cho thí nghiệm sau.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng tách chiết hàm lượng flavonoid toàn phần
Ảnh hưởng của thời gian tách chiết đến hàm lượng flavonoid được khảo sát ở các mốc thời gian: 18 giờ, 20 giờ, 22 giờ và 24 giờ. Sau đó, tiến hành thí nghiệm như sau:
Cân 0,2 g bột ích mẫu cho vào các lọ thuỷ tinh có nắp tách chiết bằng loại dung môi đã xác định được ở TN2, nồng độ dung môi đã xác định được ở TN3 với thời gian tách chiết là các mốc thời gian 18 giờ, 20 giờ, 22 giờ và 24 giờ.
Chiết flavonoid trong cùng các điều kiện cố định:
Loại dung môi: từ kết quả của thí nghiệm 2.
Nồng độ dung môi: từ kết quả của thí nghiệm 3.
Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 50/1 (ml/g).
Nhiệt độ tách chiết: nhiệt độ phòng.
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng flavonoid toàn phần. Dựa trên kết quả phân tích lựa chọn thời gian tách chiết thích hợp nhất. Thí nghiệm bố trí theo kiểu một yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. Kết quả của thí nghiệm 4 được sử dụng cho thí nghiệm sau.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu đến khả năng tách chiết hàm lượng flavonoid toàn phần
Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi nguyên liệu đến hàm lượng flavonoid được khảo sát ở các tỉ lệ: 30/1, 40/1, 50/1 và 60/1 (ml/g). Sau đó, tiến hành thí nghiệm như sau:
Cân 0.2 g bột ích mẫu cho vào các lọ thuỷ tinh có nắp tách chiết bằng loại dung môi đã xác định được ở TN1, nồng độ dung môi đã xác định được ở TN2, thời gian tách chiết ở TN3 với các tỉ lệ dung môi/nguyên liệu lần lượt là 30/1, 40/1, 50/1 và 60/1 (ml/g).
Chiết flavonoid trong cùng các điều kiện cố định:
Loại dung môi: từ kết quả của thí nghiệm 2.
Nồng độ dung môi: từ kết quả của thí nghiệm 3.
Thời gian chiết: từ kết quả của thí nghiệm 4.
Nhiệt độ tách chiết: nhiệt độ phòng.
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng flavonoid toàn phần. Dựa trên kết quả phân tích lựa chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp nhất. Thí nghiệm bố trí theo kiểu một yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. Kết quả của thí nghiệm 5 được sử dụng cho thí nghiệm sau.
3.4.3. Phương pháp phân tích
3.4.3.1. Phương pháp định tính flavonoid trong dịch chiết
Ngâm 0,2 g bột ích mẫu với 10 ml ethanol 70% trong 20 giờ, sau đó lọc thu được dịch lọc. Loại bỏ bớt dung môi để thu được flavonoid. Hút 1 ml dịch chiết chứa flavonoid cho vào ống nghiệm, rồi cho tiếp 1 ml dung dịch Pb(CH3COO)2 10% vào ống nghiệm. Kết tủa màu vàng sẽ xuất hiện nếu trong mẫu có chứa hợp chất flavonoid, do có phản ứng thế hidro trong gốc hidroxyl của các hợp chất flavonoid (Tiwari và cộng sự, 2011).
3.4.3.2. Phương pháp định lượng flavonoid trong dịch chiết
Xây dựng đường chuẩn quercetin
Hàm lượng flavonoids tổng số được xác định theo phương pháp so màu dựa trên nguyên tắc: Flavonoids tạo phức màu vàng với AlCl3 và xây dựng phương trình đường chuẩn với quercetin (QE). Quercetin được dùng làm chất chuẩn tham chiếu (Chang và cộng sự, 2002).
Cho hòa tan 0,1 mg quercetin trong dung dịch ethanol 80%. Từ dung dịch vừa pha tiến hành pha loãng thành các dung dịch với nồng độ 20, 40, 60, 80 và 100 μg/ml. Ứng với mỗi nồng độ dung dịch đã được pha loãng hút 0,5 ml cho vào ống nghiệm sau đó thêm vào: 1,5 ml ethanol 95%; 0,1 ml AlCl3 10%; 0,1 ml CH3COOK 1M; 2,8 ml nước cất. Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, đo màu ở 415 nm, mẫu trắng thực hiện tương tự nhưng thay AlCl3bằng nước cất.
Thực hiện tiến trình thí nghiệm tương tự với 0,5 ml dịch chiết ethanol hoặc 15 dung dịch flavonoid tiêu chuẩn (100ppm) để xác định được hàm lượng flavonoid.
Đồ thị biểu diễn đường chuẩn và phương trình bằng Excel:
Hình 3.3. Biểu diễn đường chuẩn và phương trình đường chuẩn
Xác định TFC trong mẫu
Lấy 0,5 ml dịch chiết cây ích mẫu, làm tương tự các bước xây dựng đường chuẩn.
TFC trong mẫu được tính như sau:
TFC=�.�.�
� 10-3(mg quercetin/g)
Trong đó:
a: hàm lượng quercetin xác định từ đường chuẩn (ppm) V: tổng thể tích dịch chiết (ml)
n: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (g) 3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng phần mềm Exel 2013. Mức độ khác biệt giữa các giá trị trung bình với mức ý nghĩa p < 0,05 được phân tích Anova bằng kiểm định Student’s thông qua phần mềm xử lý số liệu thống kê chuyên dụng Minitab 16.