Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 4 - ThS. Nguyễn Thành Luân

Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 4 - ThS. Nguyễn Thành Luân

Phương pháp định lượng vi sinh vật

(Nhắc lại)

Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được

định lượng bằng nhiều phương pháp

 Trực tiếp như đếm trên kính hiển vi

 Gián tiếp thông qua:

định

pháp pha loãng tới hạn (MPN)

Phương pháp đếm trực tiếp

•Ưu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh

chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu

Phương pháp đếm khuẩn lạc

bậc 10 liên tiếp cho độ pha loãng với

mật độ tế bào thích hợp

• Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong

khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa

Phương pháp đếm khuẩn lạc

• Phương pháp này dễ sai số nên

cần thực hiện lặp lại trên ít nhất ba

đĩa

định lượng vi sinh vật ở mật độ

thấp trong mẫu

Phương pháp MPN (Most Probable Number)

 Là phương pháp định lượng vi sinh vật theo xác

suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích

mẫu

định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại

Thông thường là lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng

bậc 10 liên tiếp

 Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ

chính xác của phương pháp này càng lớn

Phương pháp đo độ đục

•Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh

vật

•Định lượng mật độ tế bào thông qua đo độ đục

bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA

• Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết

cho định danh VSV

• Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm

kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa

• Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa

để định danh VSV:

•Cách truyền thống

•Sử dụng các bộ KIT

•Sử dụng các thiết bị tự động

Thử nghiệm khả năng lên men

•Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn

CH của các VSV

•Nguyên tắc: VSV sử dụng CH  tao acid  giảm pH

môi trường

•Các loại carbohydrate

•Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose …

•Dicarbonhydrate: sucrose, lactose …

•Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose

•Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO

•Các loại đường rượu: chứa chức -OH

Phenol Red Carbohydrate Broth

Thử nghiệm khả năng lên men

• Môi trường: Phenolred broth

base bổ sung 0,5-1% đường

cần thử nghiệm

• VSV sử dụng được nguồn

đường trong môi trường sẽ

làm giảm pH  thay đổi màu

Thử nghiệm Citrate

• Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat

như là nguồn cacbon duy nhất

• Cở sở sinh hóa:

• VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm

hóa MT

• VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm

duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT

Thử nghiệm Citrate

Môi trường Simmon citrate agar

Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g

Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g

Thử nghiệm Citrate

•Chú ý

- Cấy lượng sinh khối vừa đủ

- Có đối chứng trắng (BLANK) đi kèm

Đối chứng trắng Pứ âm tính Pứ dương tính

Thử nghiệm Urease

• Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease

• Cơ sở sinh hoá:

(NH2)2CO + H2O  2 NH3 + CO2

 tăng pH môi trường  đỏ phenol (vàng – đỏ)

• Môi trường sử dụng:

• Urea Broth (Rustigian – Stuart)

• Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)

Môi trường Urea Broth

• Chuẩn bị môi trường

• Cấy VSV vào 5ml môi

trường

• ủ 37oC/24 giờ

• Quan sát

Thử nghiệm Urease

Thử nghiệm khả năng sinh H 2 S

• Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S

• Cơ sở sinh hóa:

Acid amin chứa S H2S

• Để phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giống

Proteus

• Môi trường sử dụng:

• KIA, TSI (thạch nghiêng)

• SIM, PIA (thạch sâu)

• BSA (thạch đĩa)

Cấy vsv lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48h)

Thử nghiệm khả năng sinh H 2 S

Pancreatic digest of

casein (casitone)

20.0 g

Peptic digest of animal

tissue (beef extract)

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Pứ dương tính Pứ âm tính

37oC / 24h

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

• Là phản ứng giúp phân biệt

• E coli (+) với Klebsiella (-)

• Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+)

• Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)

…

• Đối chứng (+) Proteus rettgeri

(-) Serratia marcescens

Thử nghiệm MR (Methyl red)

•Mục đích : xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì

các acid bền trong quá trình lên men glucose

•Cơ sở sinh hóa:

•Chất chỉ thị pH: methyl red

•MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường

càng acid

•MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có

tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính

 Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC

Thử nghiệm MR (Methyl red)

 Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth)

Chủng VSV

ủ 2 – 5 ngày

37 o C

Pứ âm tính Pứ dương tính ĐC MR-VP broth

Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

• Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin)

trong quá trình lên men glucose

• Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm

khí hoàn toàn

2 pyruvate acetoin + 2 CO2

Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

• Môi trường sử dụng: MR-VP

• Phương pháp tiến hành:

• Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP

• Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37 o C

• Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ

• Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ

Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

• Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng

(+) : Enterobacter cloacea

(-) : E coli

• Đọc kết quả:

(+): màu đỏ trên môi trường

(-): mặt môi trường không đổi màu

(+) (-)

Thử nghiệm Bile Esculin

• Mục đích: xác định khả năng thủy giải

glucoside esculin thành esculetin và

glucose khi có sự hiện diện của muối

mật

• Cơ sở sinh hoá:

• Esculin là hợp chất nhân tạo

• Esculetine được phóng thích phản ứng

với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đen

Môi trường Bile Esculine Agar

Glucose

Esculetine

Phân tử Esculine

Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine

Thử nghiệm Bile Esculin

Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+)

Thử nghiệm Malonate

• Mục đích

Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng

malonate như nguồn carbon duy nhất

• Cơ sở sinh hoá

Malonate là chất cạnh tranh với succinate

Khi VSV phân hủy được malonate thì cũng

phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác 

tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi trường

• Âm tính: MT không đổi màu và

không sinh khối

(+) (-) Đ

C

pH <6,0 6,0 – 7,6 pH >7,6

Thử nghiệm catalase

• Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzym catalase

• Cơ sở sinh hoá:

• Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý

• H2O2 H2O + O2 (bọt khí)

(hydrogen peroxide)

catalase

Thử nghiệm catalase

Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H2O2 30%

Thử nghiệm decarboxylase

• Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác

phân cắt nhóm carboxyl ở một số acid amin

Cấu trúc của phân tử Amino acid

Ba thử nghiệm quan trọng

• Lysine decarboxylase (LDC)

• Ornithine decarboxylase (ODC)

• Arginine decarboxylase (ADC) / Arginine

dehydrolase (ADH)

Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng, chỉ

được tạo ra khi trong môi trường nuôi cấy có cơ

chất tương ứng

•Cơ sở sinh hoá

•Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường  đổi

•Biểu hiện sinh hoá

Dương tính: pH môi trường tăng

Thử nghiệm bằng 2 cách

Thử trên phiến kính

Đọc kết quả

Giọt nước + Sinh khối vsv + Huyết tương người

Thử nghiệm trong ống nghiệm:

Kết quả thử nghiệm Coagulase

(+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương

(-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất

Thử nghiệm Gelatinase

•Mục đích: thử nghiệm khả năng phân giải gelatine bởi

gelatinase

•Cơ sở sinh hóa:

Gelatine polypeptide + acid amin

Gelatine trong môi trường dinh dưỡng môi

Thử nghiệm gelatinase

• Đọc kết quả

(+) môi trường tan chảy (-) môi trường không tan chảy

TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA

• Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển

hoá glucose theo các con đường khác nhau

• Cơ sở sinh hóa:

• Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường

acid cao

• Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí

TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA

• Môi trường sử dụng: Oxidation/Fermentation media (Hugh &

Leifson media)

• Chỉ thị pH: bromocresol purple

pH <5,2 5,2 – 6,8 pH >6,8

TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA

Trực khuẩn gram âm

O (oxidation) Pseudomonas aeruginosa

F (fermentation) Serratia marcescens

Cầu khuẩn gram dương

O (oxidation) Micrococcus luteus

F (fermentation) Staphylococcus aureus

TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA

• Đọc kết quả:

A : đối chứng

B : phản ứng Ôxi hóa

C : phản ứng lên men

Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

• Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrate

Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)

Thử nghiệm oxydase

oxydase (hệ cytochrom C)

Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom C ôxi hoá + H2O

Cytochrom C ôxi hoá + TMPD khử  TMPD ôxi hoá (màu

• Bảo quản lạnh trong tối

• Thời hạn bảo quản: 2 tuần

• Đối chứng (+): Serratia marcescens

Thử nghiệm oxydase

• Lấy VSV từ Nitrient Agar đặt lên giấy thấm

• Nhỏ thuốc thử TMPD

• Quan sát sau 30 giây

Phản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanh

Phản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng

Thử nghiệm oxydase

Thử nghiệm khả năng tan huyết

• Mục tiêu: phát hiện các vi sinh vật có

khả năng làm tan hồng cầu

• Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ …

• Cơ sở sinh hoá:

• Các heamolysine là các tác nhân làm tan

hồng cầu động vật

• Vi sinh vật khác nhau  heamolysine

khác nhau  cường độ và biểu hiện tan

hồng cầu khác nhau

Thử nghiệm khả năng tan huyết

• Phân loại: 3 kiểu tan huyết

• Tan huyết hoàn toàn (ß): vòng tan

huyết trong, rõ

• Tan huyết không hoàn toàn (α):xung

quanhvà dưới khuẩn lạc chuyển đục

và có màu khác

• Không tan huyết (ɣ): hoàn toàn

không tan huyết

Thử nghiệm CAMP

• Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng

hưởng tan huyết giữa các VSV

• Cơ sở sinh hóa:

•S aureus tiết β-lysin gay tan hồng cầu

•VSV tiết cAMP gây tan huyết

Thử nghiệm tính di động

• Mục đích: Xác định khả năng di động của vi

sinh vật

• Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao

• Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào

môi trường thạch mềm (0,5% agar)

•Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục , phát

triển lan ra khỏi vết cấy

•Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh

đường cấy, môi trường không bị đục

Thử nghiệm tính di động

(+) (+) (-)

Ứng dụng thử nghiệm sinh

hóa để định danh VSV

• Mỗi loài vsv có những đặc tính sinh hóa

khác nhau

• Thực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh hóa

có thể giúp xác định tên loài (định danh) vi

sinh vật đó

• Bảng sinh hóa dùng định danh các loài vi

sinh vật đường ruột

Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E

(bioMerieux, Inc)

tích các chỉ tiêu vi sinh vật

Là số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm trên

đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa

chuẩn

Chỉ tiêu này được dùng để đánh giá mức độ

nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm Từ

đó đánh giá tình trạng vệ sinh và các điều

kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả

năng hư hỏng của sản phẩm

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

•Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng

và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự

hiện diện của oxy phân tử (O2)

•Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu

chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm

đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh

dưỡng

•Được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành

khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một

đơn vị khối lượng thực phẩm

Coliforms và Escherichia coli

•Coliforms là những trực khuẩn Gram (-) không

sinh bào tử hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả

năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở

37oC trong 24 – 48 giờ, hiện diện rộng rãi trong

tự nhiên, đặc biệt trong ruột người & động vật

•Chúng bao gồm: Escherichia coli, Enterobacter

spp, Citrobacter spp, Klebsiella spp

thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red

(MR), Voges Proskauer (VP) và Citrate (iC)

thường được gọi chung là IMViC

Các Coliforms khác

•Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả

năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24

giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường canh EC

•Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E.coli giả

định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh

indol khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong

canh Trypton

 Dùng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình

chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm cũng

như chỉ thị sự ô nhiễm phân

Staphylococcus aureus

Vi khuẩn Staphylococcus aureus hình cầu, Gram (+), có

khả năng sinh nội độc tố gây ngộ độc thực phẩm Các tế

bào thường liên kết thành các chùm nho, không tạo bào

tử, không di động, có khả năng sinh coagulase S aureus

hiếu khí hay kỵ khí tùy ý có khả năng lên men và sinh

acid từ manitol, trehalose, saccarose

S aureus còn được gọi là tụ cầu khuẩn gây bệnh, do đó

cần xác định để biết mẫu sản phẩm thực phẩm phân tích

có mang mối nguy hiểm cho người tiêu dùng hay không

Staphylococcus aureus được xác định trên cơ sở các

đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của

các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi

trường phân lập

Clostridium

• Clostridium là các vi khuẩn Gram dương,

hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di

động, có thể thủy phân đường và protein

trong các hoạt động thu nhận năng lượng

• Hầu hết nhóm Clostridium đều ưa nhiệt

vừa tuy nhiên có một số loài ưa nhiệt và

một số loài thuộc nhóm ưa lạnh Các loài

gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là

C.botulinum và C.perfringens

Clostridium

• Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định

bằng cách sử dụng môi trường có chứa

ferri ammonium citrate và disodium

sulphate, ủ ở 37oC trong 1 – 2 ngày

• Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt thì ủ thêm ở

50oC Trên môi trường này các khuẩn lạc

Clostridium có màu đen do phản ứng giữa

ion sulphite (S2-) và ion sắt (Fe2+) có trong

môi trường

Salmonella

•Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc

kỵ khí tùy ý, có khả năng di động, không tạo bào

tử, lên men glucose và manitol sinh acid nhưng

không lên men saccharose và lactose, không sinh

indol, không phân giải ure, không có khả năng

tách nhóm amin từ triptophan, hầu hết đều sinh

H2S

•Tăng sinh chọn lọc Salmonella trên các môi

trường tăng sinh chọn lọc dùng để phát hiện

Salmonella trong các mẫu thực phẩm như: RV

(Rappaport Vassiliadis), Tetrathionate Mueler

Kauffmann Broth (TT)…

Salmonella

•Phân lập: Tách và nhận dạng Salmonella khỏi

quần thể các vi sinh vật khác trong mẫu, môi

trường giúp nhận dạng Salmonella dựa trên vài

đặc tính

- Khẳng định: nhằm xác nhận lại sự có mặt của

các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella xuất hiện

trên môi trường phân lập

ứng sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh đặc

trưng cho Salmonella như KIA/TSI, Indol, LDC,

ODC, urease, lên men manitol, sorbitol,…

Tổng số nấm men, nấm mốc

nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực

phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng

hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có

thể tạo độc tố hay gây ngộ độc thực phẩm

định chung dưới dạng tổng số nấm mốc, nấm

men bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn

lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar

(DG18) hay Dichloran Rose Bengal

Chloramphenicol agar (DRBC)

Các phương pháp phi truyền thống

điểm như: tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả,

mất nhiều công sức, tốn kém…

động được phát triển và thưong mại hóa

phương pháp không truyền thống và có đặc điểm

chung là cho kết quả nhanh hơn phương pháp

truyền thống

PHƯƠNG PHÁP PHI TRUYỀN THỐNG RA ĐỜI

Phương pháp phát quang sinh

học ATP trong giám sát vệ sinh

• Adenosin triphosphate (ATP) được tìm thấy

trong tất cả các tế bào sống nên sự phát

hiện ATP là dấu hiệu nhận biết vật chất

sống đang tồn tại

• ATP có thể được phát hiện một cách nhanh

chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông

qua sự kết hợp với enzyme luciferase nhờ

một máy đo ánh sáng