Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 1 - ThS. Nguyễn Thành Luân

Các phương pháp nuôi cấy tế bào nhằm trình bày được kiến thức chung về nuôi cấy tế bào, những hiểu biết chung về môi trường và điều kiện nuôi cấy, cũng như các phương pháp nuôi cấy cơ bản ở các mô tế bào khác nhau như vi sinh vật, thực vật hoặc động vật.

BÀI GIẢNG CÁC PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY TẾ BÀO

ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC

Tên học phần: CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI

CẤY TẾ BÀO Mã học phần: 08220058

Số tín chỉ: 2 (2, 0, 4)

Trình độ: Dành cho sinh viên đại học

Hệ đào tạo: Đại học

Mục tiêu môn học

– Trình bày được kiến thức chung về nuôi cấy tế

bào, những hiểu biết chung về môi trường và

điều kiện nuôi cấy; cũng như các phương pháp

nuôi cấy cơ bản ở các mô tế bào khác nhau như

vi sinh vật, thực vật hoặc động vật

– Hiểu được sự ảnh hưởng của các điều kiện

ngoại cảnh đến khả năng nuôi cấy và sinh

trưởng, phát triển của tế bào cũng như xuất hiên

các biến dị của mô hoặc tế bào sinh vật khi có

sự thay đổi các yếu tố ngoại cảnh

Nội dung cơ bản của môn học

─ Cơ bản về nuôi cấy tế bào

─ Cấu trúc cơ bản của tế bào và sự di

truyền của nó sau khi nuôi cấy

─ Cơ chế điều hòa và hoạt động của hệ

gen đối với tế bào nuôi cấy

─ Các phương pháp và kỹ thuật áp dụng

cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào

─ Ứng dụng thực tiễn của kỹ thuật nuôi cấy

mô & tế bào

Tài liệu học tập

• Sách, giáo trình chính

[1] Nguyễn Hoàng Lộc Giáo trình Công

nghệ tế bào, NXB Đại học Huế 2006

[2] Bùi Trang Việt Nuôi cấy mô và tế bào

thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục 2005

[3] Nguyễn Đình Giậu, Nguyễn Chi Mai,

Trần Thị Việt Hồng Sinh lý học người và

động vật Tủ sách Đại học Khoa học Tự

nhiên TP HCM 2000

Tài liệu tham khảo

 Novakovic, G.V & Freshney, R.I Culture

of Specialized Cells – Culture of Cells for

Tissue Engineering, Wiley-Liss, New

Jersey, USA 2006

 Mather, J.P & Roberts, P.E Introduction

to Cell and Tissue Culture: Theory And

Technique, Plenum Press, New York

1998

Tiêu chí đánh giá môn học

 Dự lớp: 80% trở lên tính theo số tiết

lên lớp

 Thi giữa học phần: 0%

 Thi kết thúc học phần: 70%

 Khác: 30% (Thảo luận, tiểu luận…)

Đánh giá tiểu luận (30%)

• Seminar + tiểu luận theo nhóm

• Thời gian: 15 phút/nhóm, phải có đầy đủ thành

viên báo cáo

• Chủ đề về 1 tài liệu chuyên ngành về:

– Nuôi cấy tế bào VSV

– Nuôi cấy tế bào thực vật

– Nuôi cấy tế bào động vật

• Chú trọng vào các phương pháp nuôi cấy hiện

đại, ứng dụng cao

• Mỗi nhóm tiểu luận: <= 5 người

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

• Sinh viên tự chọn lọc tên đề tài phù hợp

về các lĩnh vực nuôi cấy tế bào vi sinh

vật, thực vật & động vật

• Chọn lọc phương pháp nuôi cấy hiện đại,

theo quy trình nuôi cấy theo công nghiệp

(thành phẩm)

• Ước lượng rõ ràng giá cả, phân tích ưu

và nhược điểm của thiết bị và hiệu suất

sử dụng cho đối tượng cụ thể

Cấu trúc bài báo cáo seminar

CỦA CÁC NHÓM VÀO ĐĨA VÀ GỞI ĐĨA

VỀ KHOA VÀO NGÀY 05/07/2013

(Không nhận bài sau ngày trên)

BÌA ĐĨA GHI: BÀI TIỂU LUẬN MÔN…

LỚP:………

Thi kết thúc học phần

• Hình thức thi: Trắc nghiệm

• Bao gồm tất cả nội dung đã được học trong

toàn bộ môn học và giáo trình liên quan

• Gồm 4 phần chính: Đại cương nuôi cấy tế

bào, PP nuôi cấy TB VSV, Thực vật, Động

vật (Có câu hỏi tiếng Anh)

ĐỀ CƯƠNG CHI TIẾT

STT Nội dung Số tiết

2 Chương 2: Sinh trưởng và bất động của tế bào 4

3 Chương 3: Động học sinh trưởng của tế bào 4

4 Chương 4: Thiết kế hệ lên men 4

5 Chương 5: Nuôi cấy tế bào vi sinh vật 4

6 Chương 6: Nuôi cấy tế bào động vật 4

7 Chương 7: Nuôi cấy tế bào thực vật 4

Các giảng viên phụ trách môn học

• ThS Nguyễn Thành Luân (PP nuôi cấy

TB VSV - 3 tuần đầu)

• ThS Phạm Văn Lộc (PP nuôi cấy TB

thực vật - 2 tuần tiếp theo)

• ThS Lại Đình Biên (PP nuôi cấy TB

động vật - 3 tuần cuối)

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU

ĐẠI CƯƠNG VỀ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

• Khái niệm Công nghệ sinh học hiện đại

• Lịch sử hình thành Công nghệ tế bào

• Các quá trình sinh học trong công nghệ

tế bào

• Tại sao lại là: Nuôi cấy tế bào?

• Các ưu và nhược điểm của công nghệ

tế bào

Công nghệ sinh học hiện đại

• “Công nghệ sinh học hiện đại là các quá

trình sản xuất ở quy mô công nghiệp mà

nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là

các tế bào sống (vi sinh vật, thực vật và

động vật) Mỗi tế bào sống của cơ thể sinh

vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này

được xem như một lò phản ứng nhỏ”

Công nghệ sinh học hiện đại

• Thuật ngữ “Công nghệ sinh học” thường được sử dụng

Câu hỏi

• Hãy cho biết bản chất của phương

pháp DNA tái tổ hợp và dung hợp tế

bào?

• Các ứng dụng của 2 phương pháp trên

Nhu cầu của CNSH hiện đại

• Các dược phẩm:

– Sản xuất Insulin để chữa bệnh đái tháo

đường

– Sản xuất các Hormone sinh trưởng người

để điều trị bệnh còi của trẻ em

– Các Interferon (IFNs) để chống viêm nhiễm,

vaccine phòng bệnh và các kháng thể đơn

dòng dùng để chẩn đoán

QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY

TẾ BÀO ĐIỂN HÌNH

Nhu cầu của CNSH hiện đại

• Các con giống sạch bệnh hoặc khoẻ mạnh

hơn, các vật nuôi dùng làm thực phẩm có

sản lƣợng cao có thể đƣợc phát triển

• Các loài cây trồng quan trọng đƣợc biến

đổi di truyền để có các tính trạng chống

chịu stress

• Chống chịu chất diệt cỏ và kháng côn

trùng

• Phát triển các vi sinh vật đƣợc biến đổi di

truyền (genetically modification organisms)

Recombinant DNA (rDNA) - Cloning

 Là những kỹ thuật cho phép thao tác trực tiếp nguyên liệu di truyền của các tế bào riêng biệt

 Có thể đƣợc sử dụng

để phát triển các vi sinh vật sản xuất các sản phẩm mới cũng nhƣ các cơ thể hữu ích khác

Mục tiêu chính của công nghệ rDNA

• Gắn một gen ngoại lai (foreign gene) mã

hóa cho một sản phẩm mong muốn vào

trong các dạng DNA mạch vòng (plasmid

vector) của vi khuẩn

• Chuyển gene vào trong một cơ thể vật

chủ  gen ngoại lai có thể biểu hiện để

sản xuất sản phẩm của nó từ cơ thể này

Dung nạp tế bào (cell fusion)

Dung nạp tế bào

• Là quá trình hình thành một tế bào lai đơn

(single hybrid cell) với nhân và tế bào chất

từ hai loại tế bào riêng biệt để tổ hợp các

đặc điểm mong muốn của cả hai loại tế

bào này

• Ứng dụng trong việc ứng dụng sản xuất

tế bào lai trong sản xuất kháng thể đơn

dòng, ghép mô tế bào,…

Công nghệ nuôi cấy tế bào

• Các công nghệ DNA tái tổ hợp hoặc dung

nạp tế bào được khởi đầu bởi những

nghiên cứu thuần túy và các kết quả cuối

cùng có thể phát triển thành một loại tế bào

mới có thể sản xuất sản phẩm có ý nghĩa

thương mại

 Đòi hỏi phải phát triển thành quy trình

công nghiệp với một công nghệ khả thi và

có hiệu quả kinh tế  Nhu cầu tìm hiểu các

phương pháp nuôi cấy tế bào tối ưu nhất

Lịch sử hình thành

Từ khi nào chúng ta đã biết có công nghệ

nuôi cấy tế bào?

Công nghệ nuôi cấy tế bào ngày nay khác

với công nghệ nuôi cấy tế bào ngày xa xưa

như thế nào?

Mục đích của nuôi cấy tế bào hiện đại?

Lịch sử hình thành

“Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều

đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành“ hay “Tế

bào là đơn vị sống căn bản của mọi cấu trúc

sinh vật” (Schleiden và Schwann, 1838)

Lịch sử hình thành

Sydney Ringer (1836 – 1910), người Anh khám phá ra dung dịch Ringer’s Solution quyết định nồng độ ưu trương từ các loại muối gồm 6.5g NaCl, 0.42g KCl, 0.25g CaCl2 and 1 mole Natri bicarbonate

Ứng dụng trong tất cả các thí

nghiệm in vitro về các mô và cơ

quan (cơ, tim của chim, cá, động vật có vú )

Lịch sử hình thành

Vào năm 1885, Roux chuyển 1 mẫu đĩa môi trường nuôi cấy tế bào thần kinh of 1 phôi tế bào gà và duy trì trong 1 môi trường muối saline,

mở đầu cho việc phát triển công nghệ nuôi cấy

Ross Granville Harrison

(Mỹ)

Lịch sử hình thành

• Đến năm 1960, Melcher và Bergman là những tác giả đầu tiên tách

và nuôi cấy thành công tế bào đơn của thực vật trong các bình lên men ở môi trường nhân tạo

Mục đích tìm hiểu

• Các chất xúc tác sinh học và tế bào được

chọn lọc hoặc sửa đổi di truyền phải thích

hợp cho các hoạt động sản xuất

• Phù hợp với mô hình sản xuất quy mô

công nghiệp ứng dụng

• Tìm hiểu các phương pháp tối ưu nhất

cho nhu cầu thu nhận sinh khối 1 sản

phẩm thương mại

Các quá trình sinh học (Bio-processing)

– Phải thu được các chất xúc tác sinh học tốt

nhất (vi sinh vật, tế bào động vật, tế bào thực

vật,hoặc enzyme)

– Tạo ra môi trường tốt nhất có thể cho sự xúc

tác bằng cách thiết kế các bioreactor/fermenter

thích hợp với phương thức tối ưu nhất

– Phân tách các sản phẩm mong muốn từ hỗn

hợp phản ứng trong một phương thức kinh tế

nhất

NHẮC LẠI

Bio-prossessing

Kỹ thuật tạo dòng tế bào

Bể phản ứng sinh học

Bể phản ứng sinh học

Theo anh/chị, bể phản ứng sinh học là

gì?

Nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy tế bào là

chọn lọc các tế bào

ở giai đoạn phát triển tối ưu nhất

trong quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào sinh vật sống gồm 4 giai đoạn là: thích nghi, tăng trưởng, cân bằng và suy tàn

Phương pháp nuôi cấy tế bào

• Điểm khác biệt giữa phương pháp nuôi

cấy tế bào đơn thực vật và động vật,

VSV ở:

– Mức độ vô trùng

– Tồn tại dưới dạng huyền phù

– Tốc độ phân chia  sinh khối

Các dạng nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy tế bào vi sinh vật

 Nuôi cấy tế bào vi khuẩn

 Nuôi cấy virus và các bacteriophage

 Nuôi cấy tế bào VSV eukaryotes: nấm men, nấm mốc, tảo (algae),

ĐV nguyên sinh (metazoa)

Sơ lược về lịch sử phát hiện và giới thiệu

kháng sinh penicillin

Phát hiện tình cờ vào năm 1928 do A Fleming

Kháng sinh penicillin

• Khi mới phát hiện

trong môi trường

Hiệu quả kinh tế

• Với nguồn cơ chất chính là glucoza và lên

men theo phương pháp chìm

• Nồng độ penicillin G trong dịch lên men

những năm 80 - 90 của thế kỷXX đạt

khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng năng suất

khoảng 40 - 50 kg penicillin G/m3 dịch lên

men )

Nuôi cấy tế bào thực vật

 Nuôi cấy mô tế bào thực vật khởi nguồn từ sự tách chiết các nhóm mô

từ rễ, lá, mầm (explant culture) thành các mô sẹo (callus) trên môi trường dinh dưỡng in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường nhân tạo được kiểm soát

Nuôi cấy hoa lan Mokara

Hình Lan Mokara đỏ

 Lan Mokara là một loài hoa đẹp có giá trị kinh tế cao

 Mokara có hoa nhiều màu sắc được rất nhiều người ưa thích & là loại hoa có lượng tiêu thụ lớn trên thị trường

Nuôi cấy tế bào côn trùng

• Ruồi giấm (Drosophila melanogaster)

– Nghiên cứu phản ứng sinh hóa học

Công nghệ tế bào gốc (stem cell)

Sản phẩm của quá trình sinh học

• Sản phẩm biến dƣỡng của sinh vật

• Sản phẩm sơ cấp: carbohydrate, acid béo

(fatty acid), amino acid,…

Saponin

• Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi

lắc với nước, có tác dụng nhũ hóa và tẩy sạch

• Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất

loãng

• Độc với cá và động vật máu lạnh; có tác dụng

diệt những loài thân mềm như giun, sán, ốc

sên

• Kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt

• Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các

chất 3-ß-hydroxysteroid khác

Ứng dụng nuôi cấy TB trong y dược

• Bao gồm:

– Sản xuất các hoạt chất như Diosgenin,

Codeine, Morphine, Atropine,

Hyoscy-amine, ScopolHyoscy-amine, Digoxin, Digitoxin,

Quinine, Reserpine, Artemisinin

• Điều kiện môi trường thích hợp

• Chọn lựa chủng có năng suất cao

• Biến đổi tiền chất

Cố định tế bào

• Một hệ thống cố định có thể duy trì sự sống của

tế bào qua một khoảng thời gian dài và phóng

Gây đột biến tế bào

• Các dạng đột biến điều hòa và đột biến khuyết dƣỡng đƣợc

sử dụng rộng rãi để sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm nhƣ

amino acid, nucleotide, kháng sinh,…

• Sự gia tăng hoạt động biến dƣỡng bằng cách sử dụng các đột

biến điều hòa có thể thực hiện

• Việc chọn lọc các kiểu tế bào đồng dạng cho mục đích nuôi

cấy là một yếu tố quan trọng để sản xuất ra các loại sản phẩm

nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng thực

vật, pH, nhiệt độ, độ thông khí, độ lay

chuyển, ánh sáng,…

Ví dụ: Auxin thường được bổ sung vào môi

trường để cảm ứng sự tạo mô sẹo, và nó sẽ

được giữ lại với một hàm lượng rất thấp hoặc

loại bỏ hẳn để tế bào sản xuất các chất biến

dưỡng

Các lưu ý trong sử dụng phương

pháp nuôi cấy tế bào

• Không nên nuôi cấy tế bào một cách đại trà mà

không tính toán đến khả năng tạo ra những sản

phẩm đặc biệt của loài đó

• Không phải tất cả các cơ quan đều có khả năng

tạo ra chất mà ta quan tâm

• Trong quá trình nuôi cấy, luôn luôn phải tiến hành

tuyển chọn để nâng cao năng suất tạo ra các sản

phẩm bậc 2

• Bổ sung cơ chất tương ứng

• Tìm ra môi trường đặc hiệu cho từng loại tế bào

Các ưu điểm

• Điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, ôn hòa:

quá trình sinh học ít ảnh hưởng so với quá

• Các tài nguyên có thể đổi mới

• Công nghệ DNA tái tổ hợp: hỗ trợ việc chọn

lọc dòng/giống

Các ưu điểm

• Điều kiện nuôi cấy có thể được kiểm soát

và có thể được tối ưu cho việc sản xuất

sản phẩm trao đổi chất thứ cấp

• Tế bào có thể được chọn lọc và cải thiện

bằng cách nhân dòng in vitro

• Có thể dễ dàng nghiên cứu chuyển hóa

các chất trong tế bào và cơ chế sản xuất

KẾT THÚC CHƯƠNG I

THANK YOU FOR

YOUR ATTENTION!