Bài giảng các phương pháp nuôi cấy tế bào chương 2 ths nguyễn thành luân

5/17/2013 Khoa CNSH & KTMT Bài giảng Môn học CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO Chƣơng II CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO CƠ BẢN Nội dung • Xác định sinh trưởng tế bào VSV • Các phương pháp nuôi cấy tế bào VSV • Các thiết bị nuôi cấy VSV Mục đích xác định sinh trƣởng tế bào “Mọi sinh trưởng định nghĩa tăng thành phần hóa học Tăng đơn khối lượng phản ánh đầy đủ sinh trưởng, tế bào tăng hàm lượng sản phẩm dự trữ chúng glycogen, poly-βhydroxybutyrite,… ” 5/17/2013 Mục đích xác định trình sinh trƣởng/nuôi cấy tế bào • Khảo sát trình sinh trưởng kết hợp với nhân đôi sinh khối với đặc tính xác định khác sinh vật/ quần thể như: protein, DNA, RNA nước nội bào • Mặt khác, trình nuôi cấy nhằm cân & trì thành phần hóa học không đổi • Môi trường dinh dưỡng thích hợp mà sau tế bào thích nghi trạng thái sinh trưởng tối ưu • Chọn lọc xác định số lượng tế bào, sinh khối tế bào hoạt tính tế bào Phƣơng pháp đếm trực tiếp • Haemocytometer: Buồng đếm tế bào máu dùng cho tế bào có đường kính ≥ μm • Petroff-Hausser counting chamber: Buồng đếm PetroffHausser dùng chủ yếu cho vi khuẩn phân tích mẫu tinh trùng Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc • Các tế bào phát triển tế bào phân chia tạo khuẩn lạc Phương pháp cho phép đếm tế bào phát triển đĩa nuôi cấy • Phương pháp đếm đĩa petri: – Phương pháp đĩa trải/hộp trải (spread plate) – Phương pháp đĩa rót/hộp đổ (pour plate) 5/17/2013 PP hộp trải (Spreading plate) Sinh khối sinh vật phát triển môi trường canh (lỏng) sử dụng thể tích nhỏ 100 - 200 μL trải khắp bề mặt agar Phƣơng pháp hộp trải • Kỹ thuật hộp trải (Sự phân tán tế bào dựa kỹ thuật Drigalsky) phương pháp hoàn thiện với ứng dụng rộng rãi thực tập VSV phòng TN • Rất nhiều kỹ thuật sử dụng để xác định số lượng VK mẫu nghiên cứu Phƣơng pháp hộp đổ (Pouring plate) • Mẫu vật trộn với agar nóng chảy (đã để nguội đến khoảng 60oC) rót đĩa vô trùng 5/17/2013 Dựa PP pha loãng nồng độ R.Koch, khuẩn lạc cố định đĩa petri chưa có môi trường, sau đổ môi trường có chứa agar đun nóng làm lạnh khoảng 45-55 độ C So sánh phƣơng pháp Streaking plate (PP Cấy ria) 5/17/2013 Ƣu điểm • Có khả phân lập hàng triệu TB bề mặt • Những nhóm TB đơn lẻ phát triển dính vào với tế bào khác • Các khuẩn lạc phân lập riêng biệt • Không lẫn lộn vào khuẩn lạc khác • Tạo dòng nhóm tế bào VK đơn môi trường vô trùng Ƣu điểm • Chỉ cần thiết bị tối thiểu • Các kết thu nhanh • Có thể quan sát đặc điểm hình thái thể 5/17/2013 Nhƣợc điểm • Thường khó phân biệt tế bào chết tế bào sống • Không thích hợp cho dịch huyền phù có mật độ thấp • Các tế bào có kích thước nhỏ thường khó quan sát kính hiển vi không thấy đếm • Phương pháp đếm thực tế gây mỏi mệt nhầm lẫn trình đếm • Không thích hợp tế bào xếp thành cụm mycelium (thể sợi nấm) Phƣơng pháp xác định tế bào máy đếm • Ƣu điểm – Tránh đơn điệu đếm trực tiếp kính hiển vi – Kỹ thuật cho phép không đếm số lượng tế bào, mà đo kích thước tế bào • Nhƣợc điểm: – Không thể phân biệt tế bào phần tử bẩn khác – khó sử dụng với thể dạng chuỗi – Không đem lại kết tốt với thể dạng hệ sợi (ví dụ nấm) Máy đếm & chụp hình khuẩn lạc (Colony counter) 5/17/2013 Phƣơng pháp xác định sinh khối tế bào • Các phƣơng pháp trực tiếp – Trọng lượng khô tế bào – Độ đục dịch huyền phù tế bào • Các phƣơng pháp gián tiếp Nguồn Carbon + nguồn Nitrogen + Phosphate + O2 → Sinh khối tế bào + CO2 + H2O + Sản phẩm + Nhiệt – – – – – Sự tiêu thụ chất dinh dưỡng Tạo thành sản phẩm Các thành phần tế bào Giải phóng nhiệt Độ nhớt Các phƣơng pháp bất động tế bào Phƣơng pháp gắn bề mặt (Microcarriers) 5/17/2013 Microcarriers • Vi thể mang (microcarrier) xem hỗn hợp hỗ trợ cho phát triển tế bào đính bể phản ứng sinh học (bioreactor) • Là hạt hình cầu có kích thước 125250µm độ đậm đặc chúng nhằm để trì môi trường khuấy canh lỏng nhẹ • Gia tăng mật độ tế bào đính protein hay tăng sinh TB virus mô hình sản xuất công nghiệp (CNSH protein) hay vaccine • Phương pháp nuôi cấy tế bào vi thể mang thực bình xoay (spinner flask), loại thùng/bình khác bể phản ứng sinh học (bể vi trọng lực hay bể dịch đệm) dùng cho nuôi cấy vi thể mang • Ưu điểm: công nghiệp sản xuất vaccine – Dễ dàng so sánh, đo đạc số liệu – Điều khiển điều kiện phát triển TB bể phản ứng sinh học phức tạp, điều khiển máy tính – Sự biến đổi tổng số TB khu vực tầng thể tích ủ đòi hỏi bắt buộc cho quy trình vận hành sản xuất – Biến đổi mạnh mẽ số lượng TB quy mô phòng TN kỹ thuật • Các loại Vi thể mang (microcarrier) thị trường – Vi thể mang dextran (Cytodex, GE Healthcare) – Vi thể mang collagen (Cultispher, Percell) – Vi thể mang polystyrene (SoloHill Engineering)  Khác tính xốp, trọng lực đặc hiệu, cấu hình tối ưu, diện thành phần động vật & hóa chất bề mặt… 5/17/2013 Phƣơng pháp tạo thể xốp (Porous Glass) Thể xốp thủy tinh chứa khoảng 96% silica Các màng dạng sợi rỗng tạo thành cấu trúc hình ống thường hàng bó sợi song song bên buồng hình trụ Các tế bào giữ lại thành sợi rỗng môi trường dinh dưỡng thông khí luân chuyển quanh sợi Loại màng cung cấp thêm bảo vệ chống nhiễm bẩn môi trường Các thể xốp thủy tinh thương mại thị trường VYCOR-Glass (PVG) & Controlled Pore Glass (CPG) Phƣơng pháp tạo thể xốp • Thủy tinh xốp (Porous glasses) thu nhận qua việc tách chiết acid thể thủy tinh Borosilica gel kiềm tách pha • Sản xuất thể thủy tinh xốp với kích cỡ xốp kích cỡ khoảng 0.4-1000nm độ phân bố xốp • Có thể tạo loại nấm mốc khác nhau, phân mảnh TB khác nhau, màng tế bào siêu mỏng, tuýp nhẫn • Trong CNSH, thủy tinh xốp có lợi việc tinh DNA cố định enzyme VSV • Rất phù hợp cho tổng hợp oligonucleotide • Các nucleotide khởi đầu tập hợp phía bề mặt Chiều dài chuỗi oligonucleotide định kích cỡ thể xốp thủy tinh 5/17/2013 Phƣơng pháp bao vi thể (Ethylcellulose) Ethyl cellulose • Ethyl cellulose có nguồn gốc từ cellulose chứa nhiều nhóm glucose bị chuyển hóa nhóm hydroxyl thành nhóm ethyl ether Số lượng ethyl ether tùy thuộc vào nhà sản xuất • Sản xuất chủ yếu dạng màng bao mỏng • Sử dụng chất gia vị thức ăn chất bổ trợ chuyển đổi Ƣu & nhƣợc điểm • Ưu điểm kỹ thuật bao vi thể – tạo diện tích bề mặt lớn cho tiếp xúc chất tế bào – Màng bán thấm cho qua cách chọn lọc thành phần có trọng lượng phân tử thấp • Nhược điểm hệ thống màng – Giá thành cao, – Sự tắc nghẽn màng làm trở ngại cho việc chuyển khối – Khó khăn việc thông khí 10 5/17/2013 Phƣơng pháp bao vi thể (Emulsion) Phƣơng pháp bao vi thể (Emulsion) • Phương pháp tạo thể nhủ (Emulsion) sử dụng pha là: phân tán & liên tục dạng lỏng • Ví dụ: ứng dụng PP thấy include nước trộn dầu giấm, sữa, mayonnaise, số loại thể lưu cần loại bỏ cho công việc hàn kim loại (vàng, bạc…) ứng dụng chất keo (colloid) phim chụp ảnh Phƣơng pháp tự kết khối • Các tế bào tự kết khối kết thành cụm len xem tế bào bất động – Do kích thước lớn chúng – Ưu điểm tương tự bất động phương pháp khác – Ví dụ: nấm mốc tạo tiểu thể tự nhiên, tế bào vi khuẩn nấm men lại cần đến kết cụm – Các nhân tố kết thành cụm nhân tạo nhân tố liên kết ngang (cross-linkers) bổ sung để tăng cường trình 11 5/17/2013 Phƣơng pháp nuôi cấy theo điều kiện chọn lọc • Hóa học: thành phần hóa học, chất,… • Vật lý: pH, nhiệt độ, … • Sinh học: tác nhân sinh học VK tương tác, virus, enzyme,… Điều kiện nuôi cấy: Hiếu khí & kỵ khí Nuôi cấy hiếu khí: có O2 đa số tự động hóa thiết bị nuôi cấy Nguyên lí hoạt động: Dựa khả sống, sinh sản vi sinh vật điều kiện thuận lợi nhiệt độ, khí oxi cung cấp, pH môi trường, tốc độ khuấy Tất yếu tố điều khiển PID, sở điều khiển môi trường sống vi sinh vật thích hợp Hệ thống nuôi cấy vi sinh tự động (Bioengineering, Thụy Sĩ) 12 5/17/2013 Nuôi cấy kỵ khí Thiết bị nuôi cấy kỵ khí: tạo điều kiện môi trƣờng O2 Tài liệu tham khảo • Review of Medical Microbiology /E Jawetz, J Melnick, E A Adelberg/ Lange Medical Publication, Los Altos, California, 2002 – P.46-87 • Medical Microbiology and Immunology: Examination and Board Rewiew /W Levinson, E Jawetz.– 2003.– P.14-16 • Handbook on Microbiology Laboratory diagnosis of Infectious Disease/ Ed by Yu.S Krivoshein, 1989, P 29-74 • Essentials of Medical Microbiology / W.A Volk at al., – Lippincott-Raven, Philadelphia-New-York KẾT THÚC CHƢƠNG II THANK YOU! 13 [...]... ảnh Phƣơng pháp tự kết khối • Các tế bào tự kết khối hoặc kết thành cụm như len cũng có thể được xem như là các tế bào được bất động – Do kích thước lớn của chúng – Ưu điểm tương tự như sự bất động bằng các phương pháp khác – Ví dụ: nấm mốc sẽ tạo ra các tiểu thể tự nhiên, thì các tế bào vi khuẩn hoặc nấm men lại cần đến sự kết cụm – Các nhân tố kết thành cụm nhân tạo hoặc các nhân tố liên kết ngang (cross-linkers)... (cross-linkers) có thể được bổ sung để tăng cường quá trình 11 5/17 /20 13 Phƣơng pháp nuôi cấy theo điều kiện chọn lọc • Hóa học: thành phần hóa học, cơ chất,… • Vật lý: pH, nhiệt độ, … • Sinh học: các tác nhân sinh học như VK tương tác, virus, enzyme,… Điều kiện nuôi cấy: Hiếu khí & kỵ khí Nuôi cấy hiếu khí: có O2 và đa số là tự động hóa các thiết bị nuôi cấy Nguyên lí hoạt động: Dựa trên khả năng sống, sinh sản... nhiệt độ, khí oxi cung cấp, về pH môi trường, về tốc độ khuấy Tất cả các yếu tố này đều được điều khiển PID, trên cơ sở đó có thể điều khiển môi trường sống của vi sinh vật thích hợp Hệ thống nuôi cấy vi sinh tự động (Bioengineering, Thụy Sĩ) 12 5/17 /20 13 Nuôi cấy kỵ khí Thiết bị nuôi cấy kỵ khí: tạo điều kiện môi trƣờng không có O2 Tài liệu tham khảo • Review of Medical Microbiology /E Jawetz, J Melnick,...5/17 /20 13 Phƣơng pháp bao vi thể (Emulsion) Phƣơng pháp bao vi thể (Emulsion) • Phương pháp tạo thể nhủ (Emulsion) được sử dụng ở cả 2 pha là: phân tán & liên tục ở dạng lỏng • Ví dụ: ứng dụng PP này có thể thấy include nước trộn dầu giấm, sữa, mayonnaise, và 1 số loại thể lưu cần loại bỏ cho các công việc hàn kim loại (vàng, bạc…) cũng như ứng dụng các chất keo (colloid) trong phim chụp ảnh Phƣơng pháp. .. Microbiology /E Jawetz, J Melnick, E A Adelberg/ Lange Medical Publication, Los Altos, California, 20 02 – P.46-87 • Medical Microbiology and Immunology: Examination and Board Rewiew /W Levinson, E Jawetz.– 20 03.– P.14-16 • Handbook on Microbiology Laboratory diagnosis of Infectious Disease/ Ed by Yu.S Krivoshein, 1989, P 29 -74 • Essentials of Medical Microbiology / W.A Volk at al., – Lippincott-Raven, Philadelphia-New-York ... trùng Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc • Các tế bào phát triển tế bào phân chia tạo khuẩn lạc Phương pháp cho phép đếm tế bào phát triển đĩa nuôi cấy • Phương pháp đếm đĩa petri: – Phương pháp đĩa trải/hộp... + O2 → Sinh khối tế bào + CO2 + H2O + Sản phẩm + Nhiệt – – – – – Sự tiêu thụ chất dinh dưỡng Tạo thành sản phẩm Các thành phần tế bào Giải phóng nhiệt Độ nhớt Các phƣơng pháp bất động tế bào. .. lạc (Colony counter) 5/17 /20 13 Phƣơng pháp xác định sinh khối tế bào • Các phƣơng pháp trực tiếp – Trọng lượng khô tế bào – Độ đục dịch huyền phù tế bào • Các phƣơng pháp gián tiếp Nguồn Carbon