Nghiên cứu đặc điểm phân tử hệ gen virus canine parvovirus 2 (cpv 2) gây bệnh trên chó tại hà nội năm 2022

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ HỆ GEN VIRUS CANINE PARVOVIRUS-2 (CPV-2) GÂY BỆNH TRÊN CHÓ TẠI HÀ NỘI NĂM 2022” Hà Nội, 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ HỆ GEN VIRUS CANINE PARVOVIRUS-2 (CPV-2) GÂY BỆNH TRÊN CHÓ TẠI HÀ NỘI NĂM 2022” Sinh viên : Đỗ Thị Lan Hƣơng Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hƣớng dẫn : TS Đồn Thị Thanh Hƣơng Viện Cơng nghệ sinh học TS Nguyễn Hữu Đức Học viện Nông nghiệp Việt Nam Hà Nội, 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận hồn tồn hồn thiện tìm hiểu nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn TS Đoàn Thị Thanh Hương, Phịng Miễn dịch học – Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Hữu Đức, Bộ môn Công nghệ sinh học động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tất số liệu, hình ảnh, kết trình bày khóa luận hồn tồn trung thực, khơng chép tài liệu, cơng trình nghiên cứu người khác, mà không ghi rõ nguồn tham khảo Những nội dung khóa luận có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí website liệt kê danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước hội đồng Học viện Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Đỗ Thị Lan Hƣơng i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Đoàn Thị Thanh Hương – Trưởng phòng, Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian thực khóa luận Tơi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tồn thể cán phịng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học quan tâm hướng dẫn tận tình cho tơi suốt thời gian thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS Nguyễn Hữu Đức – Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam quan tâm sát sao, hướng dẫn dạy tận tình cho tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Tiếp theo, tơi muốn gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam ln tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ tơi suốt bốn năm đại học Cuối cùng, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, người thân gia đình tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên đồng hành năm tháng giảng đường đại học Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Đỗ Thị Lan Hƣơng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh Parvo chó (Canine Parvovirus – CPV) 1.1.1 Lịch sử bệnh Parvo chó 1.1.2 Triệu chứng lâm sàng 1.1.3 Bệnh tích 1.1.4 Con đường xâm nhập cách lây lan 1.1.5 Phương pháp phòng điều trị bệnh 1.2 Tổng quan Canine Parvovirus (CPV-2) 1.2.1 Cách gọi tên phân loại 1.2.2 Đặc điểm sinh học CPV-2 1.3 Các phương pháp chẩn đoán CPV-2 11 1.3.1 Chẩn đoán theo triệu chứng 11 1.3.2 Chẩn đoán huyết học 12 1.3.3 Chẩn đoán phương pháp sinh học phân tử 12 1.4 Tình hình nghiên cứu CPV-2 13 1.4.1 Một số nghiên cứu CPV-2 giới 13 1.4.2 Một số nghiên cứu CPV-2 Việt Nam 15 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm thực nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng 18 2.1.2 Thời gian 18 2.1.3 Địa điểm 18 iii 2.2 Các bước tiến hành 19 2.3 Vật liệu nghiên cứu 19 2.3.1 Vật liệu 19 2.3.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Thu nhận bảo quản mẫu 21 2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 21 2.4.3 Phương pháp thiết kế mồi 23 2.4.4 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 24 2.4.5 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 25 2.4.6 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 26 2.4.7 Phương pháp giải trình tự 28 2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 29 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết chẩn đoán CPV-2 phương pháp PCR 30 3.2 Kết thu nhận hệ gen hoàn chỉnh số chủng CPV-2 nghiên cứu 31 3.3 Kết thu nhận trình tự genome hồn chỉnh chủng CPV-2 nghiên cứu 33 3.4 Thu nhận trình tự gen VP2 xác định genotype ba chủng nghiên cứu 36 3.5 So sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide amino acid vùng gen VP2 mẫu CPV-2 nghiên cứu 38 3.6 Phân tích trình tự amino acid VP2 42 3.7 Kết phân tích phả hệ nguồn gốc dựa vào gen VP2 genome chủng CPV-2 nghiên cứu 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 Kết luận 50 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách mẫu nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 20 Bảng 2.3 Quy trình tách chiết DNA tổng số 22 Bảng 2.4 Các cặp mồi thiết kế sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 3.1 Mẫu bệnh phẩm 30 Bảng 3.2 Vị trí gen mã hóa CPV-2 35 Bảng 3.3 Danh sách chủng CPV-2 sử dụng nghiên cứu để so sánh tương đồng vùng gen VP2 39 Bảng 3.4 Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đường chéo) amino acid (dưới đường chéo) vùng gen VP2 chủng CPV-2 40 Bảng 3.5 Kết phân tích đặc điểm gen VP2 dựa trình tự amino acid suy diễn chủng nghiên cứu 43 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc Canine parvovirus Hình 1.2 Sơ đồ minh họa genome chủng CPV-2 Hình 1.3 Một số q trình tiến hóa CPV-2 chó 10 Hình 2.1 Phịng thí nghiệm Miễn dịch học 18 Hình 2.2 Sơ đồ minh họa vị trí cặp mồi để thu nhận toàn hệ gen CPV-2 24 Hình 3.1 Kết PCR chẩn đốn CPV-2 31 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại genome hoàn chỉnh chủng CPV-2 nghiên cứu 32 Hình 3.3 Kết đọc trình tự chủng Par1-VN-2022 qua phần mềm BioEdit 33 Hình 3.4 Kết truy cập Ngân hàng gen so sánh tương đồng hệ thống BLAST-NCBI 34 Hình 3.5 So sánh trình tự genome chủng nghiên cứu chủng tham chiếu CPV-SH1516 phân lập Trung Quốc 35 Hình 3.6 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng CPV-2 Việt Nam giới (có Ngân hàng gen), dựa trình tự nucleotide gen VP2 có kích thước 1755 bp, sử dụng chương trình MEGA7, phương pháp Maximum Likelihood với hệ số tin cậy bootstrap 1000 46 Hình 3.7 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng CPV-2 Việt Nam giới (có Ngân hàng gen), dựa trình tự toàn khung đọc mở hệ gen, sử dụng chương trình MEGA7, phương pháp Maximum Likelihood với hệ số tin cậy bootstrap 1000 48 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ aa Acid amin bp Base pair (Cặp base) CPV Canine Parvovirus cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid kb Kilobase nt Nucleotide NS Non-structural protein ORF PCR Open reading frame (Khung đọc mở) Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi) VP Viral protein µl Microliter vii TĨM TẮT Canine parvovirus type (CPV-2) xuất vào cuối năm 1970, tác nhân gây bệnh viêm ruột tiêu chảy nghiêm trọng chó, thường gây tử vong Hiện nay, virus lưu hành hầu khắp quốc gia giới với tốc độ biến đổi phức tạp CPV-2 ban đầu thay ba biến thể kháng nguyên mới, CPV-2a, CPV-2b CPV-2c Mục đích nghiên cứu cung cấp thông tin đặc điểm phân tử hệ gen chủng CPV-2 thu thập Hà Nội năm 2022 Các mẫu nghiên cứu chẩn đoán phát CPV-2 phương pháp sinh học phân tử Gen viral protein (VP2) virus CPV-2 vùng định tính kháng ngun, có biến đổi quan trọng, thị phân tử cho biến thể kháng nguyên Kết giải trình tự phân tích trình tự gen VP2 chủng Việt Nam cho thấy mối liên hệ chặt chẽ với chủng CPV-2c có nguồn gốc châu Á; đặc biệt có đặc trưng riêng đột biến A5G I447M, khác biệt với chủng giới Kết so sánh tương đồng nucleotide amino acid, với phân tích trình tự amino acid protein VP2 cho thấy chủng nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng cao so với chủng thuộc CPV-2c nhóm châu Á (> 99,54%) tỷ lệ tương đồng thấp so với chủng vaccine VanguardPlus (97,43 – 98,58%) Mặc dù tỷ lệ sai khác không nhiều, đột biến xảy vị trí quan trọng, dẫn tới giảm hiệu lực vaccine, chó tiêm vaccine mắc CPV-2 Phân tích phả hệ nguồn gốc dựa vào trình tự nucleotide gen VP2 toàn khung đọc mở mẫu CPV-2 thu thuộc genotype CPV-2c nhóm châu Á viii Bảng 3.5 Kết ph n tích đặc điểm gen VP2 dựa trình tự amino acid suy diễn chủng nghiên cứu Tên chủng Năm ph n lập/công bố Số Genbank Genotype GU392242 FJ197847 M24003 AB054213 EF028071 AB054221 AB120720 AB120721 AB120722 AB120724 DQ025950 EU009203 AY742932 JQ743893 AF401519 KM236569 LC214969 LC216907 LC216910 MW239577 MW239578 MW239589 MW239604 MW239605 13 2 2a 2a 2b 2b 2b 2b 2b 2b new 2a new 2a new 2b new 2b 2c 2c 2c 2c 2c 2c-new-var 2c-new-var 2c-new-var 2c-new-var 2c-new-var A A A A A A A A A A A A A A A A G G G G G G G G P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 2c-new-var 2c-new-var 2c-new-var G G G P P P 23 38 87 101 267 Vị trí amino acid 297 300 305 324 370 426 440 447 555 Chủng tham chiếu HB10-China VanguardPlus-US CPV-15-China Taiwan9-Taiwan SCJM-China V204-Vietnam HCM6-Vietnam HCM8-Vietnam HCM18-Vietnam HIN-2-13-Vietnam 02B9-France K022-Korea 193-USA HS-11-China 695-Italy Argentina HCM7-Vietnam HCM8-Vietnam HCM20-Vietnam CPV1p-Vietnam CPV6p-Vietnam CPV19-Vietnam Par25-Vietnam Par27-Vietnam N/A N/A 1993 1997 2006 1997 2002 2002 2002 2002 2008 2008 2005 2012 2009 2015 2019 2019 2019 2017 2017 2017 2019 2019 Par1-VN-2022 Par2-VN-2022 Par4-VN-2022 2022 2022 2022 S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V M M L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L I I T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T F F F F F F F F Y Y F F F F F F Y Y Y Y Y Y Y Y S S S S A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G D D Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y I Y Y I I I I I I I I Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q R R R R R R R R N N N N D D D D D D N N D D E E E E E E E E E E T T T T T T T T T T A A T T T T T T T T T T T T I I I I I I I I I I I I I I I I I I I M M M M M V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V T T T Y Y Y A A A G G G Y Y Y I I I R R R E E E T T T M M M V V V Chủng nghiên cứu P S S V V V L L L (A-Alanine; R-Arginine; N-Asparagine; D-Axit aspartic; Q-Glutamine; E-Axit glutamic; G- Glycine; I- Isoleucine; L-Leucine; M-Methionine; F- Phenylalanine; P-Proline; S- Serine; T-Threonine; Y-Tyrosine;V-Valine) 43 Từ kết phân tích cho thấy, chủng CPV-2 phân lập Việt Nam năm 2002 thuộc genotype CPV-2b (426D) Các chủng phân lập từ năm 2014 trở lại thuộc genotype CPV-2c (426E) không thấy có xuất genotype khác Chủng vaccine Vanguard®Plus 5-CV (Zoetis) sử dụng Việt Nam thuộc genotype CPV-2 Tất chủng CPV-2 Việt Nam (bao gồm: chủng nghiên cứu này, 03 chủng phân lập năm 2014 Thành phố Hồ Chí Minh 05 chủng phân lập từ 2017-2019 tỉnh phía Bắc Việt Nam) có trình tự điển hình CPV-2c châu Á, bao gồm 80R, 87L, 93N, 101T, 103A, 232I, 267Y, 297A, 300G, 305Y, 323N, 324I, 334A, 341P, 370Q/R, 426N/D/E, 440T, 555V, 564S, 568G (Miranda C cs., 2016) Tuy nhiên, điều đáng ý chủng CPV-2c Việt Nam có đột biến đặc trưng riêng vị trí A5G I447M, hồn tồn khác biệt so với chủng CPV-2c công bố trước Chủng vaccine Vanguard®Plus 5-CV (Zoetis) sử dụng Việt Nam thuộc genotype CPV-2, có nhiều sai khác vị trí quan trọng so sánh với chủng CPV-2c lưu hành Việt Nam Các đột biến quan trọng dường nguyên nhân dẫn đến việc virus thoát khỏi đáp ứng miễn dịch làm giảm hiệu lực vaccine, ghi nhận nhiều quốc gia giới (Altman cs., 2017) Do đó, cần có nghiên cứu cụ thể nhằm đánh giá hiệu vaccine với chủng CPV lưu hành phổ biến nước ta Nghiên cứu chứng minh được, biến thể CPV-2b ghi nhận phổ biến Việt Nam vào năm 2002 (Nakamura cs., 2004), nay, biến thể CPV-2c trở nên chiếm ưu Các chủng CPV-2c Việt Nam sở hữu hai đột biến quan trọng (F267Y, Y324I), nguyên nhân gây giảm hiệu lực vaccine (Altman cs., 2017) Các công bố trước điểm khác biệt amino acid protein VP2 CPV-2 CPV-2a M87L, I101T, A300G, D305Y V555I (Miranda cs., 2016) Tuy nhiên, có số ý kiến cho phân biệt kiểu gen vị trí 555 khơng hợp lý Theo phân tích phát sinh lồi CPV Đài 44 Loan cho thấy dư lượng Valine vị trí 555-VP2 CPV-2a (Wang cs., 2005) Trong nghiên cứu có vị trí acid amin sai khác biến thể CPV-2 CPV-2a M87L, I101T, A300G D305Y Valine-555 quan sát thấy tất kiểu gen Hiện nay, CPV-2c lưu hành hầu khắp quốc gia giới, bao gồm châu Âu, châu Á, châu Phi, Bắc Mỹ, Nam Mỹ dần trở thành biến thể chiếm ưu Bên cạnh đó, CPV-2c biến chủng phổ biến hầu hết quốc gia khu vực châu Á mang đột biến VP2 đặc trưng A5G Q370R (Hao cs., 2022) Trong nghiên cứu này, với nghiên cứu từ 20172019 Đoàn Thị Thanh Hương cộng sự, Nguyễn Mạnh Tường cộng năm 2020 xác định CPV-2c biến thể phổ biến Việt Nam, đồng thời cho thấy đột biến I447M đại diện nước ta khác biệt so với chủng CPV-2c giới (Nguyễn Mạnh Tường cs., 2020; Đoàn Thị Thanh Hương cs., 2021) 3.7 Kết phân tích phả hệ nguồn gốc dựa vào gen VP2 genome chủng CPV-2 nghiên cứu Cây phả hệ nguồn gốc gen VP2 xây dựng từ chủng CPV-2c Việt Nam nghiên cứu với 43 chủng CPV tham chiếu từ quốc gia khác, thu thập Ngân hàng gen nhằm phân tích mối quan hệ trình tự mã hóa gen protein cấu trúc VP2 45 EU659117-CPV2-CPV-6us80-US-1980 EU659116-CPV2-CPV-5us79-US-1979 FJ197847-VanguardPlus GU392242-CPV2-HB10-CN-2009 EU659118-CPV2-13us81-US-1981 EU310373-CPV2a-nj01-06-CN AB054213-CPV2a-Taiwan-9-TW AB054222-CPV2a-LCPV-V139-VN AB054215-CPV2a-V120-VN AB054216-CPV2a-V129-VN FJ222822-CPV2b-FortDodge-Vac-US MF177279-CPV2c-E48-EC-2011 MW653253-CPV2c-CPV-19-Iran-IR-2020 MF177249-CPV2c-Arg71-AR-2010 MW889097-CPV2c-CPV03-PE-2016 MF177261-CPV2c-BRA04-13-BR-2013 KM457131-CPV2c-UY368-UY-2011 KT275256-CPV2c-PT262-14-PT-2014 KU508407-CPV2c-IZSSI-25835-09-IT-2009 AB120727-CPV2b-HNI-4-1-VN-2002 AB120723-CPV2b-HCM-23-2002 AB120726-CPV2b-HNI-3-11-VN-2002 AB120728-CPV2b-HNI-1-18-VN-2002 AB054219-CPV2b-V209-VN-1997 AB054220-CPV2b-V217-VN-1997 AB120722-CPV2b-HCM-18-VN-2002 AB120724-CPV2b-HNI-2-13-VN-2002 KX469430-CPV2b-CPV-8-IN-2010 KR002793-CPV2b-HB1-CN-2013 MK357734-CPV2c-HN7AA-VN-2017 MT106236-CPV2c-DN02-VN-2017 MK806283-CPV2c-Asia-IZSSI-PA5446-19-IT-2018 MH711902-CPV2c-CU21-TH-2016 KP260509-CPV2c-new2c-BJ14-9-CN-2014 LC216910-CPV2c-dog-HCM-20-VN-2013 MN832850-CPV2c-new2c-Taiwan-2018-TW-2018 MW239604-CPV2c-new2c-Par25p-NA-VN-2019 MT106234-CPV2c-HCM01-VN-2017 MK306290-CPV2c-Korea-CPV2c-2-KR-2017 MW239581-CPV2c-new-var-CPV8p-HN-VN-2017 Par1-VN-2022 MH177305-CPV2c-GX373-CN-2017 Par2-VN-2022 MW239603-CPV2c-PCV28-NA-VN-2018 Par4-VN-2022 MK357721-CPV2c-DN8-VN-2016 CPV-2 CPV-2a CPV-2c Châu Âu, Mỹ CPV-2b CPV-2c Châu Á Hình 3.6 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng CPV-2 Việt Nam giới (có Ngân hàng gen), dựa trình tự nucleotide gen VP2 có kích thước 1755 bp, sử dụng chương trình MEGA7, phương pháp Maximum Likelihood với hệ số tin cậy bootstrap 1000 Ghi chú: Hình trám kí hiệu chủng CPV-2 nghiên cứu 46 Kết phả hệ cho thấy, chủng Canine parvovirus tập trung thành nhóm chính, gồm nhóm genotype CPV-2, genotype CPV-2a, genotype CPV-2b genotype CPV-2c Châu Á genotype CPV-2c Châu Âu-Mỹ Trong đó, ba chủng nghiên cứu (Par1-VN-2022, Par2-VN-2022 Par4-VN-2022) thuộc nhóm CPV-2c – châu Á với chủng CPV lưu hành nước châu Á có mối quan hệ gần gũi với chủng phân lập Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan quốc gia có nhập chó Ý (MF510157, MK806283) (Mira cs., 2019) (Hình 3.5) Hơn nữa, nhóm genotype CPV-2c – châu Á nằm tách biệt hồn tồn với nhóm CPV-2c khu vực châu Âu, Bắc Mỹ, Nam Mỹ nằm cách xa với nhóm genotype cịn lại Điều giúp dự đoán đường lây lan virus quốc gia có chung đường biên giới có xuất nhập chó Do đó, cần có biện pháp phù hợp để kiểm soát ngăn chặn để đảm bảo cơng tác phịng điều trị bệnh Bên cạnh đó, chủng parvovirus Việt Nam có tương đồng cao ổn định mặt di truyền, điều thuận lợi cho việc sản xuất sử dụng vaccine hiệu Việt Nam Trình tự VP2 chủng vaccine VanGuardPlus (FJ197847) thuộc vào nhóm CPV-2, dựa vào phả hệ cho thấy, chủng vaccine nằm cách xa với ba chủng nghiên cứu tỷ lệ tương đồng nucleotide mức thấp 98,52 – 98,58% (Bảng 3.4) Các chủng thuộc nhóm CPV-2 chủng thủy tổ phát khác xa nguồn gốc với chủng nghiên cứu Do cần xem xét hiệu loại vaccine sử dụng nước ta nguyên nhân dẫn tới thất bại tiêm chủng, chó tiêm phòng cách mắc bệnh (Mylonakis cs., 2016) 47 KU508693-CPV2c-LW-AU-2015 MW653253-CPV2c-19-IR-2020 KM457104-CPV2c-UY47-UY-2006 KM457131-CPV2c-UY368-UY-2011 KU508407-CPV2c-CPV-IZSSI-25835-09-IT-2009 46 MF177239-CPV2c-288-01-IT-2001 MF177279-CPV2c-E48-EC-2011 47 82 MW889120-CPV2c-CPV26-PE-2017 MF177229-CPV2c-368-12-17-AL-2012 MW889097-CPV2c-CPV03-PE-2016 29 KY073269-CPV2c-UFMT-BR-2015 29 94 MF177261-CPV2c-BRA04-13-BR-2013 MW889113-CPV2a-CPV19-PE-2016 21 MW889115-CPV2a-CPV21-PE-2016 83 63 MW889118-CPV2b-CPV24-PE-2017 MW653251-CPV2b-CPV23-IR-2020 MW653256-CPV2a-2a6-IR-2020 24 EU310373-CPV2a-nj01-CN-2008 13 23 EU659118-CPV2a-13us81-US-1981 MK144544-CPV2c-K01708-1-KR-2017 MH711894-CPV2c-CU24-TH-2016 MW811188-CPV2c-SH2002-CN-2020 98 85 MF805789-CPV2c-Canine-China-01-CN-2016 MK306290-CPV2c-KoreaCPV2c-2-KR-2017 99 MH660909-CPV2c-5MGL-MN-2017 93 MN832850-CPV2c-Taiwan2018-TW-2018 MH476592-CPV2c-Canine-China-23-CN-201748 MK388674-CPV2c-HB2017-CN-2017 Par1-VN-2022 LC214969-CPV2c-dogHCM7-VN-2013 80 Par2-VN-2022 Par4-VN-2022 MG013488-CPV2c-SH1516-CN-2017 MH711902-CPV2c-CU21-TH-2016 MN451678-CPV2c-CPV605-NG-2018 OM721655-CPV2b-K5-TR-2019 KR002794-CPV2a-HB3-CN-2013 68 26 MW653248-CPV2a-strainCPV-IRAN-2020 MZ362882-CPV2a-Roseworthy-SA-5371-AU-2019 MT648208-CPV2a-new2a-AHmas16-CN-2018 22 KM457140-CPV2a-UY365-UY-2011 28 MT106238-CPV2a-HCM16-VN-2017 MH476589-CPV2a-new2a-CanineChina20-2017 24 MN661243-CPV2a-new2a-IN-2016 72 JQ268284-CPV2b-LZ2-CN-2011 21 MH545963-CPV2a-TN-CPV2a-IN-2018 87 KR002793-CPV2b-HB1-CN-2013 90 MG583676-CPV2a-ya1-CN-2015 85 MZ647470-CPV2a-MO-USA-2017 100 57 44 CPV-2c Châu Âu-Mỹ CPV-2c Châu Á Hình 3.7 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng CPV-2 Việt Nam giới (có Ngân hàng gen), dựa trình tự tồn khung đọc mở hệ gen, sử dụng chương trình MEGA7, phương pháp Maximum Likelihood với hệ số tin cậy bootstrap 1000 Ghi chú: Hình trám kí hiệu chủng CPV-2 nghiên cứu 48 Cây phả hệ nguồn gốc hệ gen CPV-2 xây dựng gồm toàn khung đọc mở đầy đủ chủng nghiên cứu (Par1-VN-2022, Par2-VN-2022 Par4VN-2022) 46 chủng CPV tham chiếu (có Ngân hàng gen) Phân tích phả hệ cho thấy chủng Việt Nam nghiên cứu có tính ổn định di truyền với chủng Việt Nam trước có mối quan hệ gần gũi với chủng phân lập Trung Quốc Thái Lan (MG013488, MH711902) Các chủng CPV-2a CPV-2b nằm đan xen, cho thấy mối quan hệ chúng gần gũi so với chủng CPV-2c Phân tích phả hệ nguồn gốc hệ gen cho thấy phân nhóm hồn tồn chủng CPV-2c nhóm châu Á Bên cạnh Trung Quốc Thái Lan quốc gia có chung đường biên giới với Việt Nam, Mông Cổ, Nigeria, Ai Cập ghi nhận chủng phân lập có nguồn gốc châu Á (Temuujin cs., 2019; Ogbu cs., 2020; Zaher cs., 2020) Điều cho thấy có du nhập chủng CPV-2c châu Á tới nhiều quốc gia vùng lãnh thổ khác có giao thương thương mại, cần tìm biện pháp phù hợp để phịng tránh lây lan 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau tiến hành nghiên cứu này, chúng tơi có kết luận sau: - Thu nhận giải trình tự tồn khung đọc mở hệ gen chủng virus gây bệnh chó Hà Nội năm 2022 Trình tự bao gồm 4269 nucleotide, mã hóa 2144 amino acid - Xác định đặc điểm phân tử gen kháng nguyên VP2 chủng CPV-2 nghiên cứu Từ đó, xác định ba chủng gây bệnh thuộc genotype CPV2c, có đặc trưng riêng vị trí đột biến A5G I447M, khác biệt so với chủng CPV-2 giới - Các chủng CPV-2 Hà Nội, Việt Nam có tỷ lệ tương đồng gen VP2 cao so với chủng CPV-2c nhóm châu Á từ 99,54 - 99,94%, so với genotype khác có tỷ lệ tương đồng thấp 97,04 - 99,14% - Phân tích phả hệ nguồn gốc dựa liệu gen VP2 toàn khung đọc mở cho thấy chủng virus nghiên cứu thuộc genotype CPV-2c nhóm châu Á Nghiên cứu chúng tơi góp phần tạo sở liệu đặc điểm phân tử vùng gen VP2 hệ gen chủng CPV-2c Việt Nam hỗ trợ thông tin đặc điểm phân tử virus CPV-2 Việt Nam Kiến nghị Hiện nay, biến đổi nhanh chóng liên tục chủng CPV-2 giới Việt Nam diễn vô phức tạp Do vậy, cần mở rộng thêm nghiên cứu để cung cấp liệu phục vụ cho cơng tác phịng dịch Việt Nam, thu thập nghiên cứu vùng địa lý khác nhau, đặc biệt khu vực miền Nam Việt Nam Bên cạnh đó, cần nghiên cứu hiệu loại vaccine sử dụng Việt Nam so với chủng lưu hành nhằm lựa chọn loại vaccine phù hợp, tăng khả phòng chống dịch 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Ngọc Bích, Nguyễn Thị Yến Mai, Nguyễn Quốc Việt Trần Thị Thảo (2013) Khảo sát tỷ lệ bệnh parvovirus chó từ đến tháng tuổi thành phố Cần Thơ, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, (28), pp.15–20 Nguyễn Thị Hiếu Dân, Trần Ngọc Bích, Nguyễn Thị Yến Mai Trần Văn Thanh (2019) Khảo sát bệnh viêm ruột parvovirus gây chó thành phố Bến Tre, TNU Journal of Science and Technology, 197(04), pp.95–100 Nguyễn Văn Dũng, Phan Xuân Thảo, Vũ Kim Chiến Ken Maeda (2020) Dịch tễ học phân tử Parvovirus chó thành phố Hồ Chí Minh, Khoa học kỹ thuật thú y tập XXV số 4 Võ Văn Hải, Nguyễn Thị Yến, Đào Lê Anh, Hoàng Minh, Bùi Trần Anh Đào, Bùi Thị Tố Nga, Nguyễn Thị Lan Lê Văn Phan (2019) Một số đặc tính phân tử Parvovirus type chó phân lập thành phố Hà Nội, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2019, 17(2): 100-107 Nguyễn Thị Yến Mai, Trần Ngọc Bích, Nguyễn Phúc Khánh, Keovongphet Phuthavong Trần Văn Thanh (2018) Tình hình bệnh viêm ruột parvovirus chó phòng mạch thú y tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp thành phố Cần Thơ, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 54 (Nông nghiệp), p.136 doi:10.22144/ctu.jsi.2018.075 Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Hoa Lê Thị Luyên (2022) Một số đặc tính sinh học chủng canine parvo virus type gây bệnh viêm ruột chó phía Bắc Việt Nam, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(3): 300-310 Trang Thông tin điện tử Cục Thú Y (2022) Chỉ thị việc tập trung triển khai liệt, đồng giải pháp phòng, chống bệnh Dại động vật Truy cập từ https://cucthuy.gov.vn/ ngày 5/12/2022 51 TIẾNG ANH Alexis, V.A., Sonia, V., Daniela, S., Miguel, G., Timothy, H., Valentina, F., Lisette, L and Leonardo, S (2021) Molecular Analysis of Full-Length VP2 of Canine Parvovirus Reveals Antigenic Drift in CPV-2b and CPV-2c Variants in Central Chile, Animals, 11(8), p.2387 doi:10.3390/ani11082387 Altman, K.D., Kelman, M and Ward, M.P (2017) Are vaccine strain, type or administration protocol risk factors for canine parvovirus vaccine failure?, Veterinary Microbiology, 210, pp.8–16 doi:10.1016/j.vetmic.2017.08.019 Appel, M.J., Cooper, B.J., Greisen, H., Scott, F and Carmichael, L.E (1979) Canine viral enteritis I Status report on corona- and parvo-like viral enteritides, The Cornell Veterinarian, 69(3), pp.123–133 Available at: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/223812/ Buonavoglia, C., Martella, V., Pratelli, A., Tempesta, M., Cavalli, A., Buonavoglia, D., Bozzo, G., Elia, G., Decaro, N and Carmichael, L (2001) Evidence for evolution of canine parvovirus type in Italy, The Journal of General Virology, 82(Pt 12), pp.3021–3025 doi:10.1099/0022-1317-82-123021 Callaway, H.M., Feng, K.H., Lee, D.W., Allison, A.B., Pinard, M., McKenna, R., Agbandje-McKenna, M., Hafenstein, S and Parrish, C.R (2016) Parvovirus Capsid Structures Required for Infection: Mutations Controlling Receptor Recognition and Protease Cleavages, Journal of Virology, 91(2) doi:10.1128/jvi.01871-16 Callaway, H.M., Welsch, K., Weichert, W., Allison, A.B., Hafenstein, S.L., Huang, K., Iketani, S and Parrish, C.R (2018) Complex and Dynamic Interactions between Parvovirus Capsids, Transferrin Receptors, and Antibodies Control Cell Infection and Host Range Journal of Virology, 92(13) doi:10.1128/jvi.00460-18 Carrino, M., Tassoni, L., Campalto, M., Cavicchio, L., Mion, M., Corrò, M., Natale, A and Beato, M.S (2022) Molecular Investigation of Recent Canine 52 Parvovirus-2 (CPV-2) in Italy Revealed Distinct Clustering Viruses, 14(5), p.917 doi:10.3390/v14050917 Chinchkar, S.R., Mohana Subramanian, B., Hanumantha Rao, N., Rangarajan, P.N., Thiagarajan, D and Srinivasan, V.A (2006) Analysis of VP2 gene sequences of canine parvovirus isolates in India Archives of Virology, 151(9), pp.1881–1887 doi:10.1007/s00705-006-0753-8 Cornell University (2017) Canine Parvovirus [online] Cornell University College of Veterinary Medicine Available at: https://www.vet.cornell.edu/departments-centers-and-institutes/bakerinstitute/our-research/canine-parvovirus 10.Cotmore, S.F., Agbandje-McKenna, M., Chiorini, J.A., Mukha, D.V., Pintel, D.J., Qiu, J., Soderlund-Venermo, M., Tattersall, P., Tijssen, P., Gatherer, D and Davison, A.J (2013) The family Parvoviridae Archives of Virology, 159(5), pp.1239–1247 doi:10.1007/s00705-013-1914-1 11.Day, M.J., Horzinek, M.C., Schultz, R.D and Squires, R.A (2016) WSAVA Guidelines for the vaccination of dogs and cats Journal of Small Animal Practice, 57(1), pp.E1–E45 doi:10.1111/jsap.2_12431 12.De la Torre, D., Mafla, E., Puga, B., Erazo, L., Astolfi-Ferreira, C and Ferreira, A.P (2018) Molecular characterization of canine parvovirus variants (CPV-2a, CPV-2b, and CPV-2c) based on the VP2 gene in affected domestic dogs in Ecuador Veterinary World, 11(4), pp.480–487 doi:10.14202/vetworld.2018.480-487 13.Decaro, N and Buonavoglia, C (2012) Canine parvovirus—A review of epidemiological and diagnostic aspects, with emphasis on type 2c Veterinary Microbiology, 155(1), pp.1–12 doi:10.1016/j.vetmic.2011.09.007 14.Decaro, N., Desario, C., Lucente, M.S., Amorisco, F., Campolo, M., Elia, G., Cavalli, A., Martella, V and Buonavoglia, C (2008) Specific identification of feline panleukopenia virus and its rapid differentiation from canine 53 parvoviruses using minor groove binder probes Journal of Virological Methods, 147(1), pp.67–71 doi:10.1016/j.jviromet.2007.08.006 15.Decaro, N., Desario, C., Parisi, A., Martella, V., Lorusso, A., Miccolupo, A., Mari, V., Colaianni, M.L., Cavalli, A., Di Trani, L and Buonavoglia, C (2009) Genetic analysis of canine parvovirus type 2c Virology, 385(1), pp.5–10 doi:10.1016/j.virol.2008.12.016 16.Dik, I and Şimşek, A (2021) Comparison of different diagnostic methods in detection of canine parvovirus infection Eurasian Journal of Veterinary Sciences, 37(2), pp.76–81 doi:10.15312/eurasianjvetsci.2021.329 17.Doan, H.T.T., Le, X.T.K., Do, R.T., Nguyen, K.T and Le, T.H (2021) Correction to: Canine parvovirus type 2c in Vietnam continues to produce distinct descendants with new mutations restricted to Vietnamese variants Archives of Virology, 166(7), pp.2069–2069 doi:10.1007/s00705-02105090-2 18.Hoang, M., Lin, W.-H., Le, V.P., Nga, B.T.T., Chiou, M.-T and Lin, C.-N (2019) Molecular epidemiology of canine parvovirus type in Vietnam from November 2016 to February 2018 Virology Journal, 16(1) doi:10.1186/s12985-019-1159-z 19.International Committee on Taxonomy of Viruses: ICTV (2021) Virus Taxonomy: 2021 Release Retrieved from https://ictv.global/taxonomy on December 5, 2022 20.Koptopoulos, G., Papadopoulos, O., Papanastasopoulou, M and Cornwell, H (1986) Presence of antibody cross-reacting with canine parvovirus in the sera of dogs from Greece Veterinary Record, 118(12), pp.332–333 doi:10.1136/vr.118.12.332 21.Kumar, S., Stecher, G and Tamura, K (2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets Molecular Biology and Evolution, 33(7), pp.1870–1874 doi:10.1093/molbev/msw054 54 22.Mira, F., Purpari, G., Di Bella, S., Colaianni, M.L., Schirò, G., Chiaramonte, G., Gucciardi, F., Pisano, P., Lastra, A., Decaro, N and Guercio, A (2019) Spreading of canine parvovirus type 2c mutants of Asian origin in southern Italy Transboundary and Emerging Diseases, 66(6), pp.2297–2304 doi:10.1111/tbed.13283 23.Miranda, C and Thompson, G (2016) Canine parvovirus: the worldwide occurrence of antigenic variants Journal of General Virology, 97(9), pp.2043–2057 doi:10.1099/jgv.0.000540 24.Mylonakis, M., Kalli, I and Rallis, T (2016) Canine parvoviral enteritis: an update on the clinical diagnosis, treatment, and prevention Veterinary Medicine: Research and Reports, Volume 7, pp.91–100 doi:10.2147/vmrr.s80971 25.Nakamura, M., Tohya, Y., Miyazawa, T., Mochizuki, M., Phung, H.T.T., Nguyen, N.H., Huynh, L.M.T., Nguyen, L.T., Nguyen, P.N., Nguyen, P.V., Nguyen, N.P.T and Akashi, H (2004) A novel antigenic variant of Canine parvovirus from a Vietnamese dog Archives of Virology, 149(11), pp.2261– 2269 doi:10.1007/s00705-004-0367-y 26 Nandi, S and Kumar, M (2010) Canine Parvovirus: Current Perspective Indian Journal of Virology, 21(1), pp.31–44 doi:10.1007/s13337-010-0007-y 27.National Human Genome Research Institute (2020) Polymerase chain reaction (PCR) fact sheet Genome.gov Available at: https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Polymerase-ChainReaction-Fact-Sheet 28.Nguyen Manh, T., Piewbang, C., Rungsipipat, A and Techangamsuwan, S (2020) Molecular and phylogenetic analysis of Vietnamese canine parvovirus 2C originated from dogs reveals a new Asia‐IV clade Transboundary and Emerging Diseases doi:10.1111/tbed.13811 29.Nicholas K.B., H.B Nicholas, (1999) GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments, Distributed by authors 55 30.Ogbu, K.I., Mira, F., Purpari, G., Nwosuh, C., Loria, G.R., Schirò, G., Chiaramonte, G., Tion, M.T., Di Bella, S., Ventriglia, G., Decaro, N., Anene, B.M and Guercio, A (2019) Nearly full‐length genome characterization of canine parvovirus strains circulating in Nigeria Transboundary and Emerging Diseases, 67(2), pp.635–647 doi:10.1111/tbed.13379 31.Parrish, C.R (1990) Emergence, Natural History, and Variation of Canine, Mink, and Feline Parvoviruses Advances in Virus Research, pp.403–450 doi:10.1016/s0065-3527(08)60867-2 32.Parrish, C.R (1991) Mapping specific functions in the capsid structure of canine parvovirus and feline panleukopenia virus using infectious plasmid clones Virology, 183(1), pp.195–205 doi:10.1016/0042-6822(91)90132-u 33.Parrish, C.R., Have, P., Foreyt, W.J., Evermann, J.F., Senda, M and Carmichael, L.E (1988) The Global Spread and Replacement of Canine Parvovirus Strains Journal of General Virology, 69(5), pp.1111–1116 doi:10.1099/0022-1317-69-5-1111 34.Prittie, J (2004) Canine parvoviral enteritis: a review of diagnosis, management, and prevention Journal of Veterinary Emergency and Critical Care, 14(3), pp.167–176 doi:10.1111/j.1534-6935.2004.04020.x 35.Reed, A.P., Jones, E.V and Miller, T.J (1988) Nucleotide sequence and genome organization of canine parvovirus Journal of Virology, 62(1), pp.266–276 doi:10.1128/jvi.62.1.266-276.1988 36.Shackelton, L.A., Parrish, C.R., Truyen, U and Holmes, E.C (2005) High rate of viral evolution associated with the emergence of carnivore parvovirus Proceedings of the National Academy of Sciences, 102(2), pp.379–384 doi:10.1073/pnas.0406765102 37.Soma, T., Taharaguchi, S., Ohinata, T., Ishii, H and Hara, M (2013) Analysis of the VP2 protein gene of canine parvovirus strains from affected dogs in Japan Research in Veterinary Science, 94(2), pp.368–371 doi:10.1016/j.rvsc.2012.09.013 56 38.Tamura, K and Nei, M (1993) Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Molecular Biology and Evolution, 10(3) doi:10.1093/oxfordjournals.molbev.a040023 39.Temuujin, U., Tserendorj, A., Fujiki, J., Sakoda, Y., Tseren-Ochir, E.-O., Okamatsu, M., Matsuno, K., Sharav, T., Horiuchi, M., Umemura, T and Chultemdorj, T (2019) The first isolation and identification of canine parvovirus (CPV) type 2c variants during 2016–2018 genetic surveillance of dogs in Mongolia Infection, Genetics & Evolution, 73, pp.269–275 doi:10.1016/j.meegid.2019.05.006 40.Vihinen-Ranta, M., Wang, D., Weichert, W.S and Parrish, C.R (2002) The VP1 N-Terminal Sequence of Canine Parvovirus Affects Nuclear Transport of Capsids and Efficient Cell Infection Journal of Virology, 76(4), pp.1884– 1891 doi:10.1128/jvi.76.4.1884-1891.2002 41.Wang, D., Yuan, W., Davis, I and Parrish, C.R (1998) Nonstructural Protein-2 and the Replication of Canine Parvovirus Virology, 240(2), pp.273–281 doi:10.1006/viro.1997.8946 42.Wang, H.-C., Chen, W.-D., Lin, S.-L., Chan, J.P.-W and Wong, M.-L (2005) Phylogenetic Analysis of Canine Parvovirus VP2 Gene in Taiwan Virus Genes, 31(2), pp.171–174 doi:10.1007/s11262-005-1791-0 43.Zaher, K.S., El-Dabae, W.H., El-Sebelgy, M.M., Aly, N.I and Salama, Z.T (2020) Genotyping and phylogenetic analysis of canine parvovirus circulating in Egypt Veterinary World, 13(2), pp.326–333 doi:10.14202/vetworld.2020.326-333 44.Zhou, P., Zeng, W., Zhang, X and Li, S (2017) The genetic evolution of canine parvovirus – A new perspective PLOS ONE, 12(3), p.e0175035 doi:10.1371/journal.pone.0175035 57