Nghiên cứu đặc điểm phân tử hệ gen virus canine parvovirus 2 (cpv 2) gây bệnh trên chó tại hà nội năm 2022

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ HỆ GEN VIRUS CANINE PARVOVIRUS-2 (CPV-2) GÂY BỆNH TRÊN CHÓ TẠI HÀ NỘI NĂM 2022” Hà Nội, 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ HỆ GEN VIRUS CANINE PARVOVIRUS-2 (CPV-2) GÂY BỆNH TRÊN CHÓ TẠI HÀ NỘI NĂM 2022” Sinh viên : Đỗ Thị Lan Hƣơng Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hƣớng dẫn : TS Đồn Thị Thanh Hƣơng Viện Cơng nghệ sinh học TS Nguyễn Hữu Đức Học viện Nông nghiệp Việt Nam Hà Nội, 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận hồn tồn hồn thiện tìm hiểu nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn TS Đoàn Thị Thanh Hương, Phịng Miễn dịch học – Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Hữu Đức, Bộ môn Công nghệ sinh học động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tất số liệu, hình ảnh, kết trình bày khóa luận hồn tồn trung thực, khơng chép tài liệu, cơng trình nghiên cứu người khác, mà không ghi rõ nguồn tham khảo Những nội dung khóa luận có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí website liệt kê danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước hội đồng Học viện Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Đỗ Thị Lan Hƣơng i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Đoàn Thị Thanh Hương – Trưởng phòng, Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian thực khóa luận Tơi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tồn thể cán phịng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học quan tâm hướng dẫn tận tình cho tơi suốt thời gian thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo TS Nguyễn Hữu Đức – Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam quan tâm sát sao, hướng dẫn dạy tận tình cho tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Tiếp theo, tơi muốn gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam ln tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ tơi suốt bốn năm đại học Cuối cùng, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, người thân gia đình tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên đồng hành năm tháng giảng đường đại học Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Đỗ Thị Lan Hƣơng ii C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh Parvo chó (Canine Parvovirus – CPV) 1.1.1 Lịch sử bệnh Parvo chó 1.1.2 Triệu chứng lâm sàng 1.1.3 Bệnh tích 1.1.4 Con đường xâm nhập cách lây lan 1.1.5 Phương pháp phòng điều trị bệnh 1.2 Tổng quan Canine Parvovirus (CPV-2) 1.2.1 Cách gọi tên phân loại 1.2.2 Đặc điểm sinh học CPV-2 1.3 Các phương pháp chẩn đoán CPV-2 11 1.3.1 Chẩn đoán theo triệu chứng 11 1.3.2 Chẩn đoán huyết học 12 1.3.3 Chẩn đoán phương pháp sinh học phân tử 12 1.4 Tình hình nghiên cứu CPV-2 13 1.4.1 Một số nghiên cứu CPV-2 giới 13 1.4.2 Một số nghiên cứu CPV-2 Việt Nam 15 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm thực nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng 18 2.1.2 Thời gian 18 2.1.3 Địa điểm 18 iii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.2 Các bước tiến hành 19 2.3 Vật liệu nghiên cứu 19 2.3.1 Vật liệu 19 2.3.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Thu nhận bảo quản mẫu 21 2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 21 2.4.3 Phương pháp thiết kế mồi 23 2.4.4 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 24 2.4.5 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 25 2.4.6 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 26 2.4.7 Phương pháp giải trình tự 28 2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 29 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết chẩn đoán CPV-2 phương pháp PCR 30 3.2 Kết thu nhận hệ gen hoàn chỉnh số chủng CPV-2 nghiên cứu 31 3.3 Kết thu nhận trình tự genome hoàn chỉnh chủng CPV-2 nghiên cứu 33 3.4 Thu nhận trình tự gen VP2 xác định genotype ba chủng nghiên cứu 36 3.5 So sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide amino acid vùng gen VP2 mẫu CPV-2 nghiên cứu 38 3.6 Phân tích trình tự amino acid VP2 42 3.7 Kết phân tích phả hệ nguồn gốc dựa vào gen VP2 genome chủng CPV-2 nghiên cứu 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 Kết luận 50 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iv Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách mẫu nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 20 Bảng 2.3 Quy trình tách chiết DNA tổng số 22 Bảng 2.4 Các cặp mồi thiết kế sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 3.1 Mẫu bệnh phẩm 30 Bảng 3.2 Vị trí gen mã hóa CPV-2 35 Bảng 3.3 Danh sách chủng CPV-2 sử dụng nghiên cứu để so sánh tương đồng vùng gen VP2 39 Bảng 3.4 Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đường chéo) amino acid (dưới đường chéo) vùng gen VP2 chủng CPV-2 40 Bảng 3.5 Kết phân tích đặc điểm gen VP2 dựa trình tự amino acid suy diễn chủng nghiên cứu 43 v Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc Canine parvovirus Hình 1.2 Sơ đồ minh họa genome chủng CPV-2 Hình 1.3 Một số trình tiến hóa CPV-2 chó 10 Hình 2.1 Phịng thí nghiệm Miễn dịch học 18 Hình 2.2 Sơ đồ minh họa vị trí cặp mồi để thu nhận tồn hệ gen CPV-2 24 Hình 3.1 Kết PCR chẩn đoán CPV-2 31 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại genome hoàn chỉnh chủng CPV-2 nghiên cứu 32 Hình 3.3 Kết đọc trình tự chủng Par1-VN-2022 qua phần mềm BioEdit 33 Hình 3.4 Kết truy cập Ngân hàng gen so sánh tương đồng hệ thống BLAST-NCBI 34 Hình 3.5 So sánh trình tự genome chủng nghiên cứu chủng tham chiếu CPV-SH1516 phân lập Trung Quốc 35 Hình 3.6 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng CPV-2 Việt Nam giới (có Ngân hàng gen), dựa trình tự nucleotide gen VP2 có kích thước 1755 bp, sử dụng chương trình MEGA7, phương pháp Maximum Likelihood với hệ số tin cậy bootstrap 1000 46 Hình 3.7 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng CPV-2 Việt Nam giới (có Ngân hàng gen), dựa trình tự tồn khung đọc mở hệ gen, sử dụng chương trình MEGA7, phương pháp Maximum Likelihood với hệ số tin cậy bootstrap 1000 48 vi Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ aa Acid amin bp Base pair (Cặp base) CPV Canine Parvovirus cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid kb Kilobase nt Nucleotide NS Non-structural protein ORF PCR Open reading frame (Khung đọc mở) Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi) VP Viral protein µl Microliter vii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÓM TẮT Canine parvovirus type (CPV-2) xuất vào cuối năm 1970, tác nhân gây bệnh viêm ruột tiêu chảy nghiêm trọng chó, thường gây tử vong Hiện nay, virus lưu hành hầu khắp quốc gia giới với tốc độ biến đổi phức tạp CPV-2 ban đầu thay ba biến thể kháng nguyên mới, CPV-2a, CPV-2b CPV-2c Mục đích nghiên cứu cung cấp thông tin đặc điểm phân tử hệ gen chủng CPV-2 thu thập Hà Nội năm 2022 Các mẫu nghiên cứu chẩn đoán phát CPV-2 phương pháp sinh học phân tử Gen viral protein (VP2) virus CPV-2 vùng định tính kháng ngun, có biến đổi quan trọng, thị phân tử cho biến thể kháng nguyên Kết giải trình tự phân tích trình tự gen VP2 chủng Việt Nam cho thấy mối liên hệ chặt chẽ với chủng CPV-2c có nguồn gốc châu Á; đặc biệt có đặc trưng riêng đột biến A5G I447M, khác biệt với chủng giới Kết so sánh tương đồng nucleotide amino acid, với phân tích trình tự amino acid protein VP2 cho thấy chủng nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng cao so với chủng thuộc CPV-2c nhóm châu Á (> 99,54%) tỷ lệ tương đồng thấp so với chủng vaccine VanguardPlus (97,43 – 98,58%) Mặc dù tỷ lệ sai khác không nhiều, đột biến xảy vị trí quan trọng, dẫn tới giảm hiệu lực vaccine, chó tiêm vaccine mắc CPV-2 Phân tích phả hệ nguồn gốc dựa vào trình tự nucleotide gen VP2 toàn khung đọc mở mẫu CPV-2 thu thuộc genotype CPV-2c nhóm châu Á viii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện nay, Việt Nam nước có số lượng chó ni tương đối lớn Theo Cục Thú y, tháng đầu năm 2022, tổng đàn chó nước gần triệu (Trang Thông tin điện tử Cục Thú Y (cucthuy.gov.vn)) Đặc biệt, việc ni chó cảnh làm thú cưng ngày có xu hướng tăng lên theo nhu cầu điều kiện kinh tế tăng Tuy nhiên, đa dạng giống nên sức đề kháng khả thích nghi chúng khác nhau, với điều kiện khí hậu mơi trường nóng ẩm dễ tạo điều kiện cho nhiều loại bệnh truyền nhiễm lây lan phát triển Canine parvovirus type (CPV-2) tác nhân gây bệnh viêm ruột tiêu chảy nghiêm trọng chó nhà chó hoang dã, với tỷ lệ mắc tử vong cao, đặc biệt chó nhỏ, chưa tiêm vaccine (Appel cs., 1979; Mylonakis cs., 2016) Bệnh parvo virus gây chó dễ lây lan, chiếm 26% tỉ lệ tử vong bệnh virus tỷ lệ tử vong lên đến 10% chó trưởng thành, 91% chó (Appel cs., 1979; Trương Quang Lâm cs., 2022) Các biểu lâm sàng nhiễm CPV-2 xuất sau 3-7 ngày ủ bệnh, bao gồm chán ăn, trầm cảm, nôn mửa, tiêu chảy máu phân nhầy, thường xuyên nước sốt CPV-2 ghi nhận vào cuối năm 1970 lan rộng khắp giới vào năm 1978 (Appel cs., 1979) CPV-2 thuộc chi Protoparvovirus, họ Parvoviridae xếp vào loài Carnivore protoparvovirus (ICTV, 2021), với Feline panleukopenia virus (FPV) gây bệnh giảm bạch cầu mèo, Mink enteritis virus (MEV) gây viêm ruột chồn Raccoon parvovirus (RPV) gấu mèo CPV-2 đặt tên để phân biệt với Canine minute virus (CnMV) – trước gọi Canine parvovirus type CPV-2 không liên quan mặt di truyền kháng nguyên với CnMV - đưa vào chi Bocavirus với parvovirus bò parvovirus người (Decaro cs., 2011) Bộ gen CPV-2 dài khoảng 5,2 kb, gồm gen mã hóa protein phi cấu trúc (non-structural protein) NS1, NS2 gen mã hóa protein cấu trúc (viral Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an protein) VP1 VP2 (Reed cs., 1988; Shackelton cs., 2005) Vỏ capsid CPV-2 tạo thành từ phức hợp khoảng 60 VP1 VP2 với tỷ lệ tương đương khoảng 10% 90% Trong đó, protein VP2 yếu tố độc lực chính, có vai trị quan trọng tương tác virus tế bào vật chủ; protein VP1 hình thành nên cấu trúc khối 20 mặt, giúp chúng có khả chống lại axit, bazơ, dung môi nhiệt độ lên tới 50°C (Decaro Buonavoglia, 2012) Hai gen không cấu trúc NS1 NS2 đóng vai trị thiết yếu cho nhân lên virus trình ―tế bào chết theo chương trình‖ (apoptosis) (Callaway cs., 2017) Từ trở nên phổ biến vào năm 1978, nhiều biến thể kháng nguyên CPV-2 xuất lưu hành nhiều quốc gia Dựa khác biệt kháng nguyên, CPV-2 chia thành loại biến thể (CPV-2a, CPV-2b CPV-2c), thể qua biến đổi vị trí amino acid 426 (Asparagine-Asn CPV-2a, Axit aspartic-Asp CPV-2b, Axit glutamic-Glu CPV-2c) gen VP2 (Nakamura cs., 2004; Zhou cs., 2017) Ở Việt Nam, ca nhiễm CPV-2 xuất từ năm 1994 Nghiên cứu Nakamura cộng năm 2004 Việt Nam lây truyền rộng rãi CPV-2b chó mèo Hiện nay, ba biến chủng CPV-2a, CPV-2b, CPV-2c có mặt Việt Nam (Minh Hoàng cs., 2019) Kết nghiên cứu Hoàng cộng năm 2019 cung cấp chứng cho thấy CPV-2c biến thể phổ biến Việt Nam Hiện nay, nghiên cứu CPV-2 chó Việt Nam phát triển, nhiên công bố chủ yếu tập trung vào chẩn đốn phát hiện, giải mã phân tích hệ gen VP2 (Đoàn Thị Thanh Hương cs., 2021) Các nghiên cứu giải mã phân tích tồn hệ gen CPV-2 Việt Nam hạn chế, có hai cơng bố Nguyễn Mạnh Tường cộng năm 2020; Võ Văn Hải cộng năm 2022 Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm phân tử hệ gen virus Canine Parvovirus (CPV-2) gây bệnh chó Hà Nội năm 2022” nhằm Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an cập nhật, bổ sung thông tin đặc điểm phân tử hệ gen CPV-2 lưu hành Hà Nội Mục đích nghiên cứu Giải mã phân tích đặc điểm phân tử hệ gen số chủng virus CPV-2 gây bệnh chó Hà Nội năm 2022 Yêu cầu nghiên cứu - Chẩn đoán phát CPV-2 phương pháp PCR - Thu nhận, giải trình tự hệ gen số chủng virus CPV-2 lưu hành Hà Nội - Phân tích đặc điểm phân tử xác định kiểu gen số chủng CPV-2 lưu hành Hà Nội dựa liệu gen kháng nguyên VP2 - Phân tích phả hệ nguồn gốc chủng virus CPV-2 nghiên cứu dựa liệu gen VP2 toàn hệ gen Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh Parvo chó (Canine Parvovirus – CPV) 1.1.1 Lịch sử bệnh Parvo chó Bệnh Parvo chó bệnh Canine Parvovirus (CPV-2) gây ra, hay gọi bệnh viêm dày-ruột Bệnh lây lan nhanh chóng có tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt chó chó chưa tiêm phịng đầy đủ (Appel cs., 1979; Mylonakis cs., 2016) Năm 1978, CPV-2 đồng thời ghi nhận khắp giới nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy virus chó (Parrish, 1990) Sự lây lan tồn cầu CPV-2 kiểm tra cách phân tích huyết lưu trữ, thu thập từ chó năm 1970 Các báo cáo huyết dương tính với CPV-2 sớm thu thập Hy Lạp vào năm 1974 (Koptopoulos cs., 1986) Huyết dương tính thu thập Bỉ Hà Lan vào cuối năm 1976 năm 1977 Virus lây lan nhanh chóng khắp giới năm 1978, thu thập Úc vào tháng 5, Hoa Kỳ tháng 6, Đan Mạch từ tháng đến tháng 6, New Zealand từ tháng đến tháng 10 Nhật Bản tháng năm 1978 (Parrish, 1990) Ở Việt Nam, trường hợp nhiễm CPV chó xuất từ năm 1994 Sau có đợt bùng phát bệnh với tỷ lệ mắc tử vong cao xảy toàn quốc (Nakamura cs., 2004) 1.1.2 Triệu chứng lâm sàng Thời gian ủ bệnh dao động khoảng từ đến 14 ngày (Trương Quang Lâm cs., 2022) Bệnh biểu ba thể lâm sàng: thể ruột, thể viêm tim thể tim - ruột kết hợp (canineparvovirus.org) Thể ruột: - Là dạng phổ biến nhất, thường gặp chó – 10 tuần tuổi - Chó sốt kéo dài, ủ rũ, bỏ ăn, nơn mửa - Chó tiêu chảy có phân màu hồng lẫn máu, nhầy, có mùi - Chó chết tiêu chảy nước cân điện giải Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Thể viêm tim: - Thường gặp chó – tuần tuổi, chó bị suy tim cấp virus công gây hoại tử tim - Thường chưa biểu triệu chứng chết đột ngột - Có thể biểu thiếu máu nặng, niêm mạc nhợt nhạt, nôn mửa Thể kết hợp tim – ruột: Xuất chó – 16 tuần tuổi, chó chết sau 24 từ có triệu chứng 1.1.3 Bệnh tích - Bệnh tích chủ yếu ruột, viêm, xuất huyết niêm mạc ruột già ruột non - Thành ruột mỏng bị bào mòn - Hạch lympho mạc treo ruột lưng, xuất huyết - Phù phổi viêm tim thể kết hợp tim – ruột (Decaro cs., 2012; Moon cs., 2019) 1.1.4 Con đƣờng xâm nhập cách lây lan Nguồn lây nhiễm CPV-2 từ phân chó bệnh Canine Parvovirus-2 lây qua tiếp xúc miệng với phân bị nhiễm, thông qua bề mặt ô nhiễm CPV-2 có khả chống lại tác động nhiệt độ, chất tẩy rửa cồn, nên chúng tồn lâu môi trường xung quanh (Mylonakis cs., 2016) Bệnh lây nhiễm trực tiếp tiếp xúc với phân chó bệnh, gián tiếp thơng qua lơng, chuồng ni, dây xích, quần áo da người tiếp xúc với mầm bệnh, hay môi trường bệnh viện thú y, cửa hàng thú cưng, sân chơi,… CPV-2 tồn tháng mơi trường ngồi điều kiện thuận lợi (Jacob cs., 1980) Do đó, việc quản lý chăm sóc chó bệnh cần đặc biệt ý, việc tăng cường vệ sinh khu vực nuôi nhốt, điều kiện nuôi dưỡng để hạn chế lây lan rộng CPV-2 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 1.1.5 Phƣơng pháp phòng điều trị bệnh Tiêm chủng biện pháp hiệu cần thiết để bảo vệ cá thể chó, đồng thời thúc đẩy ―miễn dịch bầy đàn‖ Vaccine sống giảm độc lực sử dụng toàn giới với khả miễn dịch kéo dài (7 năm lâu hơn) giúp bảo vệ chống lại bệnh tật nhiễm trùng (Mylonakis cs., 2016) Mũi tiêm phòng tiêm chó từ – tuần tuổi, sau tiêm nhắc lại – tuần, 16 tuần tuổi Nếu chó tiêm phòng mũi đầu sau 16 tuần tuổi, khuyến cáo tiêm hai liều cách – tuần Sau đó, vaccine CPV tiêm nhắc lại khơng thường xun năm (Day cs., 2016) Các nghiên cứu loại vaccine CPV có, chứa biến thể CPV-2 CPV-2b mang lại khả bảo vệ, chống lại tất biến thể tự nhiên, bao gồm CPV-2c Tuy nhiên, ngày có nhiều báo cáo ghi nhận đợt bùng phát CPV nghiêm trọng chó nhỏ chó trưởng thành, tiêm phòng cách (Mylonakis cs., 2016) Bên cạnh tiêm chủng, việc chăm sóc sức khỏe chó phần khơng thể thiếu Giữ vệ sinh tốt chuồng nuôi, bao gồm khử trùng tất bề mặt tiếp xúc người chăm sóc quan trọng Chó nhiễm bệnh có tỷ lệ sống sót thấp tới 9% khơng điều trị, cao 80% điều trị sở chun mơn Chó điều trị nội trú đảm bảo tốt hơn, tỷ lệ chó khỏi bệnh điều trị bệnh viện (78,3%), điều trị nhà 63,2% Với chó có biểu bệnh nhẹ điều trị nhà (Mylonakis cs., 2016) Các phương pháp điều trị parvo tập trung vào điều trị triệu chứng phòng tránh nhiễm khuẩn thứ phát (Mylonakis cs., 2016) - Tiến hành truyền nước cho chó bệnh truyền tĩnh mạch, tránh nước bổ sung ringer lactate, nước muối sinh lý 0.9%, glucose 5%, kaliclorid 10% Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an - Sử dụng kháng sinh đường tiêm chó nhiễm CPV-2 có nguy nhiễm trùng máu cao - Sử dụng thuốc chống nôn, đồng thời bổ sung thuốc bổ, vitamin để tăng cường sức đề kháng cho chó bệnh - Kiểm sốt đau thuốc giảm đau 1.2 Tổng quan Canine Parvovirus (CPV-2) 1.2.1 Cách gọi tên phân loại  Tên khoa học: Canine Parvovirus type  Phân loại: Family (Họ): Parvoviridae Subfamilies (Phân họ): Parvovirinae Genus (Chi): Protoparvovirus Species (Loài): Carnivore protoparvovirus Virus: Canine parvovirus CPV-2 thuộc chi Protoparvovirus, họ Parvoviridae xếp vào loài Carnivore protoparvovirus (ICTV, 2021) 1.2.2 Đặc điểm sinh học CPV-2 1.2.2.1 Hình thái cấu trúc hệ gen CPV-2 Canine Parvovirus có hình cầu, kích thước nhỏ, đường kính khoảng 25nm Cấu trúc capsid khơng có vỏ bao bọc Vật chất di truyền phân tử DNA sợi đơn, mạch thẳng với độ dài khoảng 5,2 kb (Reed cs., 1988) (Hình 1.1) Phân tử DNA chứa hai khung đọc mở (open reading frame, ORF) Khung đọc mở mã hóa hai gen phi cấu trúc NS1 (non-structural protein 1) NS2 (non-structural protein 2) nằm đầu 3’ hệ gen, khung đọc mở thứ hai nằm đầu 5’ mã hóa cho hai gen cấu trúc VP1 (viral protein 1) VP2 (viral protein 2) (Reed cs., 1988; Shackelton cs., 2005) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 1.1 Cấu trúc Canine parvovirus (Nguồn: http://www.virology.wisc.edu/virusworld/viruslist.php?virus=cpv) Hai gen không cấu trúc NS1 NS2 đóng vai trị thiết yếu cho nhân lên virus gây trình ―chết theo chương trình‖ (apoptosis) tế bào vật chủ (Callaway cs., 2017) NS1 loại protein đa chức năng, cần thiết để bắt đầu điều khiển trình chép DNA virus Ngồi ra, NS1 cịn có vai trị q trình đóng gói virus chuyển hóa số chất xúc tác NS2 tạo từ khung đọc mở bên trái gen virus, chứa 87 acid amin đầu tận với protein không cấu trúc (NS1) liên kết với 78 acid amin từ khung đọc mở Tuy nhiên, đặc tính chức NS2 chưa nghiên cứu xác (Wang cs., 1998) Khung đọc mở thứ hai mã hóa cho hai gen cấu trúc VP1 VP2, với vai trò cấu tạo nên vỏ capsid, ghép từ VP1 54 VP2 Chúng kháng nguyên tạo nên kháng thể trung hòa yếu tố gây độc lực (Nakamura cs., 2004; Zhou cs., 2017) VP1 chiếm khoảng 10%, đóng vai trị chủ chốt trình lây nhiễm capsid tế bào, lại khơng đóng góp cao việc hình thành vỏ virus Chúng thường nằm sâu bên capsid khó bị phát kháng thể Vùng kết thúc VP1 chứa số nhóm acid amin giống với trình tự hạt nhân cổ điển, bao gồm trình tự bảo tồn gần đầu cuối vùng kết thúc, bao gồm bốn acid amin bản, mà peptit hoạt động để vận chuyển protein khác vào nhân tế bào (Vihinen-Ranta cs., 2002) VP2 chiếm khoảng 90% Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an protein capsid, quan trọng tương tác virus tế bào vật chủ, tính dinh dưỡng mơ khả sinh miễn dịch Protein VP2 virus CPV-2 đa dạng mặt di truyền kháng nguyên Các đột biến số vị trí quan trọng gây thay đổi acid amin làm thay đổi phạm vi vật chủ tính kháng nguyên virus (Callaway cs., 2018) Các protein capsid có lõi trung tâm bảo tồn cao, linh hoạt sợi β tương tác với để tạo nên hầu hết bề mặt capsid Các đặc điểm bề mặt capsid bao gồm vùng nhô lên dài 22 Å (spike) trục gấp ba, chỗ lõm sâu 15 Å (canyon) xung quanh cấu trúc hình trụ trục gấp năm chỗ lõm sâu 15 Å (dimple) hai trục gấp đôi Ngoài ra, trục gấp ba vùng kháng nguyên capsid mục tiêu để trung hòa kháng thể (Miranda cs., 2016) Hình 1.2 Sơ đồ minh họa genome chủng CPV-2 1.2.2.2 Các biến chủng CPV-2 Mặc dù CPV-2 virus DNA, tỷ lệ thay gen khoảng 10-4 vị trí năm, tương tự virus RNA (Zhou cs., 2017) Năm 1978, CPV-2 lần đầu xác định từ bùng nổ dịch chó Hoa Kỳ Úc (Appel cs., 1979), sau đó, báo cáo nhiều quốc gia năm 1978 1979 CPV-2 có liên quan chặt chẽ với parovirus mèo (FPV), thế, giả định biến thể vật chủ FPV CPV-2 đặt tên để phân biệt với Canine minute virus (CPV-1) Các protein VP2 virus CPV-2 đa dạng mặt di truyền tính kháng nguyên Đột biến vị trí quan trọng gây thay đổi acid amin ảnh hưởng đến phạm vi vật chủ, tính kháng nguyên độc lực virus, đồng thời làm phức tạp trình phân tích phát sinh gen xác định kiểu gen chủng CPV-2 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Năm 1980, CPV-2 ban đầu thay hoàn toàn hai biến thể kháng nguyên mới, gọi CPV loại 2a (CPV-2a) 2b (CPV-2b) Năm 2000, CPV-2c với thay acid glutamic vị trí 426 (Asn 2a, Asp 2b) báo cáo Ý (Zhou cs., 2017) Khi biến thể xuất hiện, chúng nhanh chóng thay cho biến thể cũ Cho đến nay, ba biến thể CPV-2 phân bố toàn giới, với tỷ lệ tương đối khác theo năm quốc gia thu nhận Phân tích dịng thời gian biến thể kháng nguyên CPV-2 cho thấy CPV-2 đặc trưng đột biến so với FPV K80R, K93N, V103A, D323N, N564S A568D VP2, sau đó, thay CPV-2a M87L , I101T, A300G, D305Y, V555I Năm 1984, CPV-2a thay CPV-2b (N426D I555V) cuối năm 1990, đầu năm 2000, CPV-2b thay CPV-2c, mang đột biến D426E (Miranda cs., 2016) Hình 1.3 Một số q trình tiến hóa CPV-2 chó 10 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 1.2.2.3 Cơ chế gây bệnh Khi chó bị nhiễm CPV-2, thời gian ủ bệnh ngắn – ngày sau xuất triệu chứng lâm sàng CPV-2 sử dụng nguyên liệu tế bào vật chủ để nhân lên hàng loạt Trước tiên, virus công hạch bạch huyết vùng hầu họng tiếp tục xâm nhập vào tế bào lympho (Prittie cs., 2004) Những virus cản trở đường tế bào lympho, đồng thời lẩn tránh khỏi hệ thống phòng thủ vật chủ tiếp tục xâm nhập vào máu Nhiều tế bào lympho bị nhiễm CPV-2 bị tiêu diệt, dẫn đến số lượng bạch cầu giảm Khi vào máu, virus nhanh chóng cơng vào tủy xương phá hủy tế bào miễn dịch non giảm số lượng bạch cầu làm suy yếu khả miễn dịch vật chủ Cùng với đó, virus cơng vào biểu mơ ruột non làm vơ hiệu hóa khả bổ sung chất dinh dưỡng khả chống nước thể vật chủ Chu kỳ nhân lên CPV-2 xảy nhân tế bào vật chủ phân chia cuối pha S đầu pha G2 Sự lây nhiễm nhân lên diễn nhanh chóng, thường tác động tủy xương đường ruột vật chủ Một gram phân chó nhiễm trùng nặng chứa đủ vật chất virus để lây nhiễm cho 10 triệu chó khác qua tiếp xúc đường tiêu hóa (Prittie cs., 2004) Virus bắt đầu nhân lên mô bạch huyết hầu họng vào huyết tương, tiếp biểu mơ đường ruột thường nhiễm ngày thứ Kháng thể xuất khoảng ngày thứ sau nhiễm bệnh tăng lên đối đa từ ngày thứ đến ngày thứ 10 Các dấu hiệu lâm sàng xuất từ ngày đến ngày 10 sau nhiễm virus (Prittie cs., 2004) 1.3 Các phƣơng pháp chẩn đốn CPV-2 Vì CPV-2 lây nhiễm nhanh nên việc phát sớm, xác để cách ly điều trị chó bệnh vơ quan trọng Dưới số phương pháp áp dụng để chẩn đoán CPV-2 1.3.1 Chẩn đoán theo triệu chứng CPV-2 chó gây triệu chứng ủ rũ, chán ăn, sốt, nôn mửa tiêu chảy, phân có lẫn máu chất nhầy, mùi Tuy nhiên, chẩn đoán theo 11 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an triệu chứng áp dụng số trường hợp, khơng có CPV2 gây triệu chứng bệnh (Mylonakis cs., 2016) 1.3.2 Chẩn đoán huyết học Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent assay): dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể thực bước sau: Kháng nguyên kháng thể biết gắn giá thể rắn, sau cho mẫu có chứa kháng thể kháng ngun cần tìm vào giếng Bổ sung thêm kháng thể có gắn với enzyme Bước cuối thêm chất, enzyme biến đổi chất tạo tín hiệu màu xác định máy đo huỳnh quang (Prittie, 2004; Dik Şimşek, 2021) Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic – IC): Khi nhỏ huyết cần xác định kháng thể lên sắc ký, kháng thể đặc hiệu (nếu có) huyết kết hợp với kháng nguyên gắn màu, phức hợp miễn dịch kháng thể - kháng nguyên (Dik Şimşek, 2021) Xét nghiệm ngưng kết hồng cầu (hemagglutination – HA) xét nghiệm nhanh chóng đơn giản để phát CPV-2 (Dik Şimşek, 2021) Tuy nhiên, kỹ thuật có độ nhạy tương đối thấp (Decaro Buonavoglia, 2012) 1.3.3 Chẩn đoán phƣơng pháp sinh học phân tử Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction – PCR) sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiễm trùng CPV-2 Phương pháp chẩn đốn nhanh chóng có độ xác cao Ngồi ra, PCR giúp xác định kiểu gen virus gây bệnh thông qua việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm phản ứng PCR sử dụng để giải trình tự trực tiếp, cho kết trình tự nucleotide Qua việc sử dụng phần mềm tin sinh học, xác định tỷ lệ tương đồng phân tích nguồn gốc chủng CPV-2 (Decaro Buonavoglia, 2012) 12 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 1.4 Tình hình nghiên cứu CPV-2 1.4.1 Một số nghiên cứu CPV-2 giới Năm 2001, Buonavoglia cộng phân lập chủng CPV từ chó bệnh Nghiên cứu xác định thay đổi acid amin vị trí 426 (Asp thành Glu), vị trí kháng nguyên capsid virus, đánh dấu xuất chủng CPV-2c Ý, cung cấp chứng tiến hóa CPV (Buonavoglia cs., 2001) Năm 2006, Chinchkar cộng nghiên cứu, phân tích trình tự gen VP2 từ chó nhiễm CPV-2 phân lập Ấn Độ Kết cho thấy chủng phân lập Ấn Độ thuộc CPV-2a, ngoại trừ có bốn chủng thuộc CPV-2b So sánh trình tự gen VP2 cho thấy dòng phân lập Ấn Độ có khác biệt so với dịng phân lập Đông Nam Á dường chủng phân lập Ấn Độ tiến hóa độc lập (Chinchkar cs., 2006) Nghiên cứu Nicola Decaro cộng năm 2007 cho thấy biến thể CPV-2c phổ biến số quốc gia châu Âu (Ý, Bồ Đào Nha, Đức) xuất không thường xuyên Anh; CPV-2a thường xuất Bỉ Sự lan rộng CPV-2c giới cho thấy đột biến Glu-426 mang lại lợi định việc nhân lên virus (Decaro cs., 2007) Năm 2018, Torre cộng xác định diện biến thể CPV-2 chó (CPV-2a, CPV-2b, CPV-2c), đặc tính phân tử biến thể dựa gen VP2 chó Ecuador (Torre cs., 2008) Năm 2019, nghiên cứu Kenneth Ikejiofor Ogbu cộng cung cấp kết phân tích gen, để xác định đặc điểm chủng CPV-2 thu thập Nigeria, Châu Phi Kết cho thấy tỷ lệ phổ biến CPV‐2c (91,5%) so với biến thể CPV-2a (8,5%) Trình tự VP2 cho thấy khác biệt so với chủng trước Nigeria có mối liên hệ chặt chẽ với chủng CPV-2 có nguồn gốc từ Châu Á Việc phân tích gen không cấu trúc NS1 chứng minh thay đổi acid amin chưa thấy trước đây, việc thay đổi acid amin I60V NS1 nằm gốc trình tự mã hóa NS2 13 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bốn thay đổi acid amin bổ sung trình tự mã hóa NS2 quan sát thấy: D93E, T94A, D151N M152V Những thay đổi dẫn đến đột biến âm thầm protein NS1 mã hóa tương ứng Kết phân tích phân tử cho thấy nguồn gốc tiến hóa CPV-2 chung hướng với CPV-2 từ Châu Á (Ogbu cs., 2019) Nghiên cứu Bo-Youn Moon cộng năm 2019 xác định trình tự gen với khung đọc mở hoàn chỉnh (4,269 nt) CPV-2c, mã hóa protein cấu trúc (VP) protein khơng cấu trúc (NS) Các chủng Hàn Quốc có tương đồng cao so với chủng Châu Á phân lập Trung Quốc, Ý (một số chó nhập từ Thái Lan) Việt Nam từ năm 2013 đến 2017 Phân tích phát sinh lồi dựa gen NS1 VP2 cho thấy chủng CPV-2c Hàn Quốc liên quan chặt chẽ với chủng Châu Á tách riêng với chủng phân lập Châu Âu, Nam Mỹ, Bắc Mỹ (Moon cs., 2019) Năm 2021, Chengqian Liu cộng nghiên cứu đặc điểm phát sinh loài CPV-2c Thượng Hải, Trung Quốc Nghiên cứu biến thể CPV-2c lan toàn giới trở thành kiểu gen trội chó nhà Thượng Hải Các phân tích đột biến gen cấu trúc protein capsid VP2 loại biến thể "CPV-2c châu Á" mới, sở hữu bốn đột biến vị trí acid amin 5Gly, 267Tyr, 324Ile 370Arg, khác với biến thể CPV-2c báo cáo trước năm 2011 2013 Kết cho thấy acid amin vị trí 426 324 VP2 chịu áp lực chọn lọc, vị trí chúng cấu trúc bậc ba protein VP2 chứng tỏ tầm quan trọng vị trí đột biến acid amin Cần tăng cường giám sát di truyền bệnh thường xuyên biến thể phổ biến CPV-2 (Liu cs., 2021) Năm 2022, nghiên cứu Marilena Carrino cộng cung cấp thông tin đặc điểm di truyền CPV-2 Đông Bắc Ý gần đây, làm sáng tỏ phân nhóm gen đặc biệt CPV-2 Ý Phân tích phát sinh lồi cho thấy tồn dịng di truyền khắp nước Ý có xuất CPV-2 từ nước Đơng Âu Châu Á Chẩn đốn, thu thập liệu bệnh 14 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an học xác định trình tự CPV-2 tất bước quan trọng để theo dõi bệnh Nhìn chung, nghiên cứu nhằm mục đích theo dõi tình hình dịch bệnh CPV-2 chó khả tiến hóa virus, nhằm cung cấp thơng tin, phục vụ cho trình nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, chế tạo vaccine cho cơng tác phịng điều trị bệnh Do đó, việc nghiên cứu thơng tin CPV-2 vô cấp thiết, để xây dựng sở liệu, cập nhật tình hình dịch tễ đặc điểm phân tử CPV-2 vùng địa lý giúp cho việc dự đoán xu lây nhiễm biến đổi virus 1.4.2 Một số nghiên cứu CPV-2 Việt Nam Từ xuất lây nhiễm bùng phát CPV-2 Việt Nam vào năm 1994 nay, CPV-2 trở thành mối quan tâm đặc biệt với sức khỏe chó Tuy nhiên, phần lớn nghiên cứu tập trung vào khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh yếu tố liên quan Những nghiên cứu cụ thể virus sinh học phân tử chưa có nhiều Năm 2004, Nakamura cộng nghiên cứu phát biến thể kháng nguyên CPV-2 từ mẫu nghiên cứu Việt Nam Nghiên cứu cho thấy xuất biến chủng CPV-2b, kiểm tra phản ứng hemag-glutination với kháng thể đơn dòng 21C3 19D7 Kết thay acid amin vị trí 426, Asp thành Glu, tương tự thay tìm thấy chủng CPV-2 Ý Nghiên cứu lần thông qua kháng thể đơn dòng để xác định thay acid amin dẫn tới thay đổi kháng nguyên, với đó, nghiên cứu cho thấy có xuất biến chủng khác Việt Nam (Nakamura cs., 2004) Nghiên cứu Trần Ngọc Bích cộng năm 2013, ―Khảo sát tỷ lệ bệnh parvovirus chó từ đến tháng tuổi Thành phố Cần Thơ‖ dựa vào kit test nhanh, Parvovirus Rapid test kit CPV Ag (CPV Ag) Kết cho thấy 84 tổng số 184 chó nghi mắc bệnh bị nhiễm CPV với tỷ lệ 45,1% 15 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Chó bốn tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm từ 45 - 55% cao so với chó lứa tuổi từ đến tháng tuổi (21,7%) (Trần Ngọc Bích cs., 2013) Một nghiên cứu khác Nguyễn Thị Yến Mai cộng từ tháng 11 năm 2017 đến tháng năm 2018, khảo sát tình hình bệnh parvo chó phòng mạch thú y địa bàn tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ Kết cho thấy tỷ lệ chó nhiễm bệnh tỉnh tương đồng 30 - 34%, chó từ – tháng tuổi có tỷ lệ mắc cao hơn, khoảng 60%, khơng có khác biệt lây nhiễm giống đực giống Chó tiêm ngừa vaccine có tỷ lệ bệnh thấp so với chó chưa tiêm (Nguyễn Thị Yến Mai cs., 2018) Năm 2018, nghiên cứu Nguyễn Văn Dũng cộng cho thấy có thay đổi genotype lưu hành chó ni Thành phố Hồ Chí Minh từ CPV2b sang CPV-2c nhiều đột biến quan trọng đồng thời xảy protein VP2 (A5G, Y324I, F267Y, Q370R) chủng CPV-2c phát hiện, đột biến ảnh hưởng tới đặc tính kháng nguyên tính sinh bệnh virus (Nguyễn Văn Dũng cs., 2018) Nghiên cứu Nguyễn Thị Hiếu Dân cộng năm 2019 ―Khảo sát bệnh viêm ruột parvovirus gây chó Thành phố Bến Tre‖ đưa kết tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhóm chó nhỏ – tháng, thấp nhóm chó tiêm phịng (Nguyễn Thị Hiếu Dân cs., 2019) Năm 2019, nhóm nghiên cứu tác giả Minh Hoàng cộng khảo sát lưu hành phân bố kiểu gen CPV-2 ba miền Bắc, Trung, Nam Việt Nam từ tháng 11 năm 2016 đến tháng năm 2018 Kết thu mẫu (2,31%) xác định CPV-2a, 251 mẫu (96,54%) xác định CPV-2c Ở miền Bắc, tỷ lệ CPV-2a CPV-2c 2,9% 97,3% Ở miền Trung, tỷ lệ CPV-2a CPV-2c 1,1% 98,8% Ở miền Nam, tỷ lệ CPV-2a CPV-2c 3,0% 96,9% CPV-2b không quan sát thấy nghiên cứu Các gen VP2 CPV-2c Việt Nam tương đồng mặt di truyền với gen CPV-2c Trung Quốc Đài Loan (Minh Hoàng cs., 2019) 16 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Năm 2020, nghiên cứu Nguyễn Mạnh Tường cộng phân tích đặc điểm phân tử phát sinh lồi CPV-2c chó Việt Nam Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả xác định đặc điểm trình tự gen đầy đủ chủng CPV-2c thu từ 59 chó Việt Nam Phân tích cho thấy CPV-2c Việt Nam có chung kiểu tiến hóa với nhánh CPV-2c châu Á Ngoài ra, chủng CPV-2c Việt Nam biểu đột biến Thr112Ile Ile447Met trình tự VP1 VP2 tương ứng Tỷ lệ thay nucleotide 42 năm qua mức cao, vào khoảng 2,49×10–4 lần thay nucleotide vị trí năm, với ước tính VP1/2 NS1/2 3,06×10–4 3,16×10–4 lần thay nucleotide vị trí năm (Nguyễn Mạnh Tường cs., 2020) Năm 2021, nhóm tác giả Đồn Thị Thanh Hương cộng phân tích trình tự gen mã hóa bề mặt VP2 (1755 bp) Việt Nam Ở nghiên cứu này, 33 mẫu thu thập từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2019 tỉnh miền Bắc miền Trung Việt Nam Kết so sánh trình tự VP2 phân tích nguồn gốc cho thấy diện hai nhóm lớn chủng CPV-2c Việt Nam: ―new‖ ―new-var‖ Sự phổ biến đột biến 5G/447M CPV-2c quan sát từ năm 2016 đến 2019 Sự thay đổi acid amin VP2 nguyên nhân dẫn đến biến thể phụ gây ảnh hưởng tới tính kháng nguyên, tính sinh miễn dịch độc lực virus (Đoàn Thị Thanh Hương cs., 2021) Nghiên cứu Võ Văn Hải cộng năm 2022 số đặc tính phân tử CPV-2 chó phân lập Thành phố Hà Nội Kết giải trình tự phân tích trình tự gen VP2 chủng nghiên cứu có mức độ tương đồng cao với chủng vaccine Pfizer/vaccine/06 Mỹ chủng CPVpf Hàn Quốc Kết phân tích phả hệ chủng có nguồn gốc khác từ chó mèo, có chủng nằm nhánh phát sinh chủng parvovirus gây bệnh giảm bạch cầu mèo (FPV) chủng nằm nhánh phát sinh chủng parvovirus gây bệnh chó (CPV) (Võ Văn Hải cs., 2022) 17 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, thời gian địa điểm thực nghiên cứu 2.1.1 Đối tƣợng Virus CPV-2 (Canine Parvovirus type 2) gây bệnh chó số phòng khám Thú y Hà Nội 2.1.2 Thời gian Thời gian thực khóa luận từ tháng năm 2022 đến tháng 02 năm 2023 2.1.3 Địa điểm - Phịng Miễn dịch học – Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Hình 2.1 Phịng thí nghiệm Miễn dịch học 18 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.2 Các bƣớc tiến hành Thu nhận bảo quản mẫu bệnh phẩm Tách chiết DNA tổng số Thực phản ứng PCR Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Tinh sản phẩm PCR Giải trình tự Xử lý phân tích số liệu 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu Mẫu nghiên cứu: Gồm ba mẫu phân nước phân chó nhiễm CPV-2 Phịng khám Thú y Mỹ Đình, thu nhận tăm bông, bảo quản lạnh chuyển phịng thí nghiệm vịng 24 Sau bảo quản -20℃ sử dụng Chó xác định nhiễm CPV-2 kit Canine Parvovirus Antigen Test Kit, Blot Test (BIONOTE) Bảng 2.1 Danh sách mẫu nghiên cứu STT Kí hiệu Giống Tuổi Triệu chứng Par1-VN-2022 Fox tháng Tiêu chảy, phân lẫn máu Par2-VN-2022 Corgi tháng Nôn mửa, tiêu chảy Par4-VN-2022 Fox soc tháng Tiêu chảy 19 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.3.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất dung dịch đệm cần pha thí nghiệm đề tài cung cấp phòng Miễn dịch học (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) ghi bảng sau: Bảng 2.2 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm STT Trang thiết Bị Xuất xứ Pipette Mỹ Ống eppendorf Mỹ Đầu côn Mỹ Panh, kéo Việt Nam Máy voltex Đức Máy khuấy từ Italy Hệ thống máy điện di Mỹ Hệ thống chụp điện di Dolphin Đài Loan Máy ly tâm thường Mỹ 10 Máy ly tâm lạnh Hàn Quốc 11 Cân phân tích Nhật Bản 12 Lị vi sóng Hàn quốc 13 Bể ổn nhiệt Thụy Điển 14 Máy PCR Japan, Canada 15 Tủ lạnh sâu -20ºC Nhật Bản 16 Tủ lạnh 4ºC Nhật 17 Tủ an toàn sinh học cấp II Singapore 18 Máy spin Mỹ Hóa chất sử dụng - Bộ Kit tách chiết GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) 20 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an - Bộ Kit DreamTaq PCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) - Bộ Kit tinh GeneJET PCR Purification Kit GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) - Dung dịch Tris-acetate EDTA (TAE) - Dung dịch Ethidium Bromide - Gel agarose - Cồn tuyệt đối - Nước cất 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Thu nhận bảo quản mẫu Mẫu nghiên cứu phân nước phân chó số phòng khám Thú Y Hà Nội, kiểm tra dương tính Canine Parvovirus Antigen Test Kit, Blot Test (BIONOTE), thu nhận tăm bông, bảo quản lạnh chuyển phịng thí nghiệm vịng 24 Mẫu đồng dung dịch nước vô trùng, ly tâm 13.000v/p 15 phút, thu dịch để tách DNA tổng số Bảo quản mẫu nhiệt độ -20⁰C 2.4.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số Toàn DNA tổng số thu nhận, bao gồm DNA nhân tế bào vật chủ DNA hệ gen virus cách sử dụng kit tách chiết DNA tổng số GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ thành phần tạp chất, đặc biệt protein Sự tách chiết dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform /nước) Phương pháp tiến hành theo thứ tự: - Phá vỡ màng tế bào, màng nhân 21 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an - Loại bỏ protein - Tủa DNA Sau tách chiết, DNA tinh nằm thể tích dung dịch lớn Ly tâm cho phép thu nhận DNA dạng cặn tủa dễ bảo quản cần hòa tan lại nước theo nồng độ mong muốn Cách tiến hành: Tách chiết DNA tổng số theo hướng dẫn Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit Các bước cụ thể sau: Bảng 2.3 Quy trình tách chiết DNA tổng số Bƣớc Tiến hành Bổ sung 150µl H2O vào ống eppendorf chứa tăm bơng có mẫu bệnh phẩm, vortex nhiều lần, ủ 37⁰C qua đêm Bỏ tăm bơng (vắt kiệt nước có thể), bổ sung 180µl Digest solution 20µl Protease K, vortex Ủ 56⁰C, vortex liên tục 10 phút dung dịch đồng Bổ sung 20µl enzyme RNase A, vortex, để nhiệt độ phòng 10 phút Bổ sung 200µl Lysis solution, vortex dung dịch đồng Bổ sung 400µl Ethanol 50%, votex nhẹ Chuyển dịch lên cột lọc, ly tâm 10.000 vịng/phút phút, bỏ dịch phía ống hứng Bổ sung 500µl Wash Buffer 1, ly tâm 12.000 vịng/phút phút, bỏ dịch phía ống hứng Bổ sung 500µl Wash Buffer 2, ly tâm 12.000 vịng/phút phút, bỏ dịch phía ống hứng 10 Ly tâm làm khơ 12.000 vịng/phút phút, bỏ dịch phía ống hứng 11 Chuyển cột lọc sang ống thu, bổ sung 30µl Elution, để nhiệt độ phịng phút, sau ly tâm 12.000 vòng/phút phút 12 Thu DNA, bảo quản nhiệt độ -20⁰C 22 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.4.3 Phƣơng pháp thiết kế mồi Các cặp mồi sử dụng để phát CPV-2 khuếch đại trình tự genome thiết kế, dựa theo trình tự chuỗi nucleotide thu thập liệu Ngân hàng gen Bảng 2.4 Các cặp mồi thiết kế sử dụng nghiên cứu Tên mồi Trình tự (5’-3’) Vị trí (5’-3’) PCV-F1 5’-AGTCACACGTCATACGTACG-3’ 74-93 PCV-R1 5’-GCTGCATTATAACAACCAAC-3’ 1531-1550 PCV-F2 5’-TGTCACGCTATAGCATGTGT-3’ 1408-1427 PCV-R2 5’-GTCTGCTTGAGTTTGCTGTG-3’ 2970-2990 PCV-F3 5’-ATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3’ 2795-2814 PCV-R3 5’-GCATTTACATGAAGTCTTGG-3’ 4225-4244 PCV-F4 5’-ACCAACAGATCCAATTGGAG-3’ 4082-4101 PCV-R4 5’- TATAGACAGTATACGAGGCC-3’ 5023-5042 Kích thƣớc (bp) 1476 1582 1449 960 Các trình tự mồi đồng thời kiểm tra chương trình BLASTNCBI để chắn không tương đồng với loại virus khác Trình tự mồi gửi tổng hợp Công ty Phù Sa (Cần Thơ) 23 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 2.2 Sơ đồ minh họa vị trí cặp mồi để thu nhận toàn hệ gen CPV-2 2.4.4 Phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) gọi ―sao chép phân tử‖, kỹ thuật nhanh tiết kiệm sử dụng để khuếch đại-sao chép-các đoạn DNA nhỏ Phản ứng PCR thực máy MJ PTC-100 (USA) Trong phương pháp sử dụng kit ―DreamTaq PCR Master Mix (2X)‖ (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) Nguyên tắc phản ứng PCR: PCR kỹ thuật sử dụng để khuếch đại, chép đoạn DNA nhỏ việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu với hoạt động enzyme chịu nhiệt chu trình nhiệt phù hợp Kỹ thuật PCR phát minh nhà khoa học Kary B Mullis người Mỹ vào năm 1983, đạt giải Nobel Hóa học năm 1993 Tiến hành: phản ứng PCR thực với thành phần chu trình nhiệt bảng 2.5 2.6 đây: 24 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích Dream taq PCR Master Mix (2X) 25µl DMSO 2µl Mồi xi (10pmol/µl) 2µl Mồi ngược (10pmol/µl) 2µl Khn DNA 3µl H2O 16µl Tổng thể tích 50µl Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR Giai đoạn Nhiệt độ - thời gian Giãn xoắn 940C - phút Biến tính 940C – phút Gắn mồi 520C - phút Kéo dài 680C - phút Kết thúc 720C - 10 phút Bảo quản 40C - ∞ Số chu kì 35 Bảo quản Sau phản ứng kết thúc lấy 10 µl sản phẩm điện di gel agarose 1% để kiểm tra kết sản phẩm PCR 2.4.5 Phƣơng pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR Nguyên tắc: Điện di acid nucleic trình di chuyển DNA/RNA từ cực âm (catot) sang cực dương (anot) gel tác dụng điện trường Sự di chuyển xa hay gần acid nucleic phụ thuộc nhiều vào kích thước, khối lượng cấu trúc phân tử 25 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Cách tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị gel điện di: cân 1g agarose (bản gel agarose 1%) sau bổ sung thêm 100 ml dung dịch TAE 1X; cho vào bình đậy nắp lỏng làm nóng lị vi sóng đến gel tan hồn tồn thấy dung dịch suốt Để nguội đến khoảng 50 – 60℃ đổ gel vào khuôn chuẩn bị sẵn Cho gel vào bể điện di, đổ ngập đệm TAE 1X Trộn µl loading dye 6X với 10 µl mẫu Chuyển mẫu trộn với loading dye 6X vào giếng điện di, giếng cho marker (5 µl) Sử dụng Lambda DNA/HindIII Marker Thermo Scientific Tiến hành điện di 25 – 30 phút điện 110V Sau điện di, nhuộm gel Ethidium Bromide khoảng 10 phút, sau đọc kết điện di máy soi gel Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% Sử dụng Lambda DNA/HindIII Marker Thermo để dự đoán kích cỡ gần đoạn DNA, khoảng 125 bp đến 23.130 bp 2.4.6 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR  Với sản phẩm PCR đơn băng, sử dụng sinh phẩm “GeneJET PCR Purification kit” (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) để tinh sản phẩm PCR Quy trình tinh tiến hành theo bước hướng dẫn nhà sản xuất sau: Bƣớc 1: Thêm đệm Binding vào sản phẩm PCR với tỉ lệ thể tích 1:1, trộn Kiểm tra màu dung dịch, dung dịch có màu vàng đạt pH tối ưu, dung dịch có màu cam tím bổ sung thêm 10 µl dung dịch acetate 3M Bƣớc 2: Nếu đoạn DNA ≤ 500bp, thêm isopropanol 100% với tỉ lệ thể tích 1:2 (ví dụ: thêm 100 µl isopropanol vào 100 µl sản phẩm PCR với 100 µl đệm binding) Trộn Bƣớc 3: Chuyển tối đa 800 µl dung dịch từ bước (hoặc bước 2) vào cột tinh GeneJET Ly tâm 30 – 60 giây, loại bỏ dịch chảy xuống ống thu Bƣớc 4: Thêm 700 µl đệm rửa vào cột Ly tâm 30 – 60 giây Loại bỏ dịch chảy xuống đặt cột trở lại ống thu 26 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bƣớc 5: Ly tâm cột rỗng thêm phút để loại bỏ hồn tồn đệm rửa cịn sót lại Bƣớc 6: Chuyển cột sang ống thu sạch, (ống 1,5 ml) Thêm 30 µl đệm Elution vào tâm màng cột tinh GeneJET, đợi phút ly tâm khoảng phút Bƣớc 7: Bỏ cột bảo quản ống thu chứa sản phẩm PCR tinh -20℃  Với sản phẩm PCR đa băng, sử dụng GeneJET Gel Extraction kit (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) để thu nhận băng DNA đích Bƣớc 1: Cắt phần gel chứa mảnh DNA dao mổ lưỡi dao cạo, cắt gần DNA tốt để giảm thiểu thể tích gel Đặt miếng gel cắt vào ống eppendorf 1,5 ml cân trước cân lại để xác định khối lượng miếng gel Bƣớc 2: Thêm 1:1 thể tích đệm Binding vào ống chứa miếng gel (thể tích : khối lượng) (ví dụ: thêm 100 µl đệm Binding cho 100 g gel agarose) Bƣớc 3: Ủ hỗn hợp gel 50 – 60℃ 10 phút đến miếng gel tan hoàn toàn Đảo ống vài phút lần để tạo điều kiện cho trình tan gel Vortex hỗn hợp gel trước chuyển vào cột Kiểm tra màu dung dịch Màu vàng biểu thị pH tối ưu cho gắn DNA Nếu dung dịch màu cam tím, thêm 10 µl natri acetate 3M, dung dịch pH 5,2 lắc Màu dung dịch chuyển vàng Bƣớc 4: Đây bước tùy chọn sử dụng độ dài đoạn DNA ≤500 bp ≥ 10 kb Nếu đoạn DNA ≤500bp, thêm thể tích gel isopropanol 100% vào dung dịch gel hòa tan Trộn kỹ Nếu đoạn DNA ≥ 10 kb, thêm lượng nước thể tích gel vào dung dịch gel hịa tan Bƣớc 5: Chuyển tối đa 800 µl dung dịch gel hòa tan từ bước (hoặc bước 4) vào cột tinh GeneJET Ly tâm phút Loại bỏ dịch chảy xuống ống thu đặt cột trở lại ống thu cũ 27 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bƣớc 6: Tùy chọn: sử dụng bước bổ sung binding DNA tinh dùng cho sequencing Thêm 100 µl đệm Binding vào cột Ly tâm phút Loại bỏ dịch chảy đặt cột lại ống thu Bƣớc 7: Thêm 700 µl đệm Wash vào cột Ly tâm phút, loại bỏ dịch chảy đặt cột trở lại ống thu Bƣớc 8: Ly tâm cột rỗng thêm phút để loại bỏ đệm rửa cịn sót lại Bƣớc 9: Chuyển cột vào ống eppendorf 1,5 ml Thêm 30 µl đệm Elution vào tâm màng cột tinh Ly tâm phút Bƣớc 10: Bỏ cột bảo quản DNA tinh -20℃ 2.4.7 Phƣơng pháp giải trình tự Nguyên tắc: Nguyên tắc phương pháp Sanger: Sử dụng deoxy nucleotides (dNTPs) khơng có nhóm -OH (ddNTPs – dideoxy nucleotides) vị trí 3’ trình kéo dài chuỗi polynucleotide, enzyme polymerase cần gắn chúng vào chuỗi polynucleotide trình kéo dài chuỗi dừng lại Với cách làm tạo đoạn DNA có kích thước nucleotide Từ cở sở ta xác định trình tự nucleotide (Chu Hồng Mậu, 2005) Mơ tả trình tự bước sau: - Bƣớc 1: Biến tính DNA sợi kép thành sợi đơn - Bƣớc 2: Xảy tiếp hợp mồi với DNA sợi đơn - Bƣớc 3: Thành phần phản ứng tổng hợp chuỗi polynucleotide gồm: DNA sợi khuôn, primer, DNA polymerase, dNTPs lượng nhỏ ddNTPs đánh dấu (phóng xạ chất nhuộm huỳnh quang) Khi ddNTP gắn vào chuỗi polynucleotide trình tổng hợp dừng lại - Bƣớc 4: Cuối điện di gel Polyacrylamid để xác định trình tự đoạn DNA Sản phẩm PCR sau tinh gửi giải trình tự gen máy đọc tự động ABI – 3100 Avant Gentic Analyzer Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam phương pháp Sanger Sequencing 28 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.4.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu * Chương trình so sánh phân tích chuỗi gen - GeneDoc GeneDoc chương trình (interface application) lập trình cho máy tính PC sử dụng hệ Window, dùng để mở file, đọc phân tích file dạng msf (multiple sequence file) (Nicholas, 1999) GeneDoc cho phép xác định trình tự amino acid gen nhân gen ty thể, đưa cấu hình chuỗi so sánh để chuyển nạp vào MEGA cho phân tích phả hệ Trình tự nucleotide (nt) amino acid (aa) chủng CPV-2 chủng tham chiếu phân tích, so sánh phần mềm Gendoc 2.7 * Chương trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA) MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) hệ chương trình giao diện (interface application) lập trình dễ sử dụng cho nhà nghiên cứu di truyền học phân tử với mục đích so sánh đối chiếu chuỗi gen đồng chức từ chủng loài, từ chủng khác lồi giống/chi thuộc họ từ suy mối quan hệ nguồn gốc phả hệ góc độ tiến hóa phân tử (Kumar cs., 2016).Trong nghiên cứu này, sử dụng chương trình MEGA với tham số Kimura-2 parameter mô thay đổi nucleotide bootstrap 1000 lần 29 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết chẩn đoán CPV-2 phƣơng pháp PCR Ba mẫu bệnh phẩm thu nhận từ chó phịng khám Thú y địa bàn Hà Nội, kiểm tra dương tính với CPV-2 Canine Parvovirus Antigen Test Kit, Blot Test (BIONOTE) Bảng 3.1 Mẫu bệnh phẩm STT Kí hiệu Par1-VN-2022 Par2-VN-2022 Par4-VN-2022 Bệnh phẩm Tình trạng tiêm Kết chẩn đốn vaccine CPVAg test kit Phân Chưa tiêm nước phân vaccine Phân nước phân Dương tính Đã tiêm vaccine Vanguard bệnh Dương tính đầy đủ Phân Chưa tiêm nước phân vaccine Dương tính Các mẫu nghiên cứu tách chiết DNA tổng số kit GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ), sau đó, thực phản ứng PCR với cặp mồi chẩn đoán gen VP2, bao gồm mồi xuôi PCV-F3 (5’-ATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3’) mồi ngược PCV-R3 (5’-GCATTTACAT GAAGTCTTGG-3’) (Bảng 2.4) Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% Kết cho thấy ba mẫu nghiên cứu xuất vạch sáng thạch, băng sáng rõ, kích thước khoảng 1,4 kb, tương ứng với kích thước cặp mồi thiết kế để chẩn đốn CPV-2: PCV-F3/PCV-R3 (Hình 3.1) Sau đó, tiến hành tinh sản phẩm PCR gửi giải trình tự để thu nhận chuỗi gen Trình tự nucleotide mẫu nghiên cứu BLAST lên website NCBI Kết cho thấy chủng virus nghiên cứu xác Canine Parvovirus type (CPV-2) 30 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.1 Kết PCR chẩn đốn CPV-2 Chú thích: giếng M: thang DNA chuẩn (DNA thực khuẩn thể λ cắt enzyme HindIII); giếng 1: mẫu Par1-VN-2022; giếng 2: mẫu Par2-VN-2022; giếng 3: mẫu Par4-VN-2022 Kết kiểm tra cho thấy chó bị nhiễm CPV-2 độ tuổi nhỏ (2-3 tháng) khơng có khác biệt giống chó Kết phù hợp với kết nghiên cứu trước Trần Ngọc Bích cộng năm 2013; Nguyễn Thị Yến Mai cộng năm 2018 Bên cạnh đó, lây nhiễm CPV-2 xuất chó chưa tiêm phịng chó tiêm phòng đầy đủ, điều quan sát thấy nghiên cứu Truyen cộng năm 2006 Altman cộng năm 2017 Do đó, cần có thêm nghiên cứu để đánh giá hiệu vaccine sử dụng Việt Nam với chủng lưu hành 3.2 Kết thu nhận hệ gen hoàn chỉnh số chủng CPV-2 nghiên cứu Từ kết thu nhận trên, tiến hành thiết kế cặp mồi để thu nhận trình tự genome hồn chỉnh mẫu CPV-2 nghiên cứu (Bảng 2.4) Chiều dài ước tính gen CPV-2 khoảng kb, tiến hành khuếch đại đoạn DNA với cặp mồi kích thước sản phẩm PCR dự kiến sau: PCV-F1/PCV-R1, 1476 bp; PCV-F2/PCV-R2, 1582 bp; PCV-F3/PCVR4, 2247 bp (Bảng 2.4) 31 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Kết hình 3.2 cho thấy, sản phẩm PCR khuếch đại genome sử dụng cặp mồi, thành phần thực chu trình nhiệt phù hợp để thu nhận hệ gen chủng CPV-2 nghiên cứu Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% có kích thước tương đương với kích thước mồi sử dụng (Hình 3.2) Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại genome hoàn chỉnh chủng CPV-2 nghiên cứu Chú thích: giếng M: thang DNA chuẩn (DNA thực khuẩn thể λ cắt enzyme HindIII); 1-3: mẫu Par1-VN-2022, Par2-VN-2022, Par4-VN-2022 chạy cặp mồi PCVF1-PCVR1; 4-6: mẫu Par1-VN-2022, Par2-VN-2022, Par4-VN-2022 chạy cặp mồi PCVF2-PCVR2; 7-9: mẫu Par1-VN-2022, Par2-VN-2022, Par4-VN-2022 chạy cặp mồi PCVF3-PCVR4 Kết điện di cho thấy hầu hết sản phẩm PCR có chất lượng tốt, đơn băng, sáng rõ Các sản phẩm tinh sinh phẩm GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) Riêng sản phẩm PCR mẫu Par1-VN-2022 Par4-VN-2022 thu cặp mồi PCVF1-PCVR1 (giếng 3) (Hình 3.2) có thêm băng phụ, tinh sinh phẩm GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific Inc., MA, Mỹ) với mục đích thu nhận DNA đích, có kích thước 1,4 kb Các sản phẩm PCR sau tinh gửi giải trình tự trực tiếp hãng 1st BASE (Singapore) 32 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.3 Kết thu nhận trình tự genome hồn chỉnh chủng CPV-2 nghiên cứu Hình 3.3 Kết đọc trình tự chủng Par1-VN-2022 qua phần mềm BioEdit 33 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Sản phẩm PCR mẫu nghiên cứu tinh sạch, giải trình tự gen phương pháp Sanger máy giải trình tự ABI3500 Applied Biosystems® (Mỹ) Trình tự nucleotide mẫu nghiên cứu BLAST lên website NCBI Hình 3.4 Kết truy cập Ng n hàng gen so sánh tƣơng đồng hệ thống BLAST-NCBI Kết giải trình tự phân tích phần mềm GenDoc2.7, từ thu nhận tồn khung đọc mở mẫu CPV-2 nghiên cứu này, có kích thước 4269 bp Trình tự so sánh sở liệu BLAST – NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) cho thấy mẫu virus nghiên cứu thuộc chủng Canine parvoviruses type với mức độ tương đồng cao >99% Khi so sánh trình tự với chủng tham chiếu CPV-SH1516 (MG013488), phân lập Trung Quốc năm 2017 có trình tự gen đầy đủ 5059 bp, chủng nghiên cứu có vị trí tương ứng nucleotide từ 270 đến 4538 34 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.5 So sánh trình tự genome chủng nghiên cứu chủng tham chiếu CPV-SH1516 phân lập Trung Quốc Trình tự thu bao gồm đầy đủ gen mã hóa cho protein NS1, NS2, VP1 VP2 với kích thước 2007 nt (270-2276), 1972 nt (270-2239), 2256 nt (2283-4538) 1755 nt (2784-4538) (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Vị trí gen mã hóa CPV-2 ORF Tên chủng Par1-VN- ORF NS1 NS2 VP1 VP2 Vị trí Độ dài Vị trí Độ dài Vị trí Độ dài Vị trí Độ dài 270-2276 2007 nt 270-2239 1972 nt 2283-4538 2256 nt 2784-4538 1755 nt 270-2276 2007 nt 270-2239 1972 nt 2283-4538 2256 nt 2784-4538 1755 nt 270-2276 2007 nt 270-2239 1972 nt 2283-4538 2256 nt 2784-4538 1755 nt 2022 Par2-VN2022 Par4-VN2022 35 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Phân tích độ dài vị trí trình tự gen thu được, cho thấy khơng có đột biến thêm đoạn, đột biến xảy đột biến điểm Phân tích trình tự genome chủng Par1-VN-2022 cho thấy tỷ lệ nucleotide A, T, G, C 36.5%, 27%, 20.3%, 16.2% Trong đó, tỷ lệ A+T G+C 63.46% 36.54% Trong cấu trúc DNA, liên kết hidro tạo nên A-T G-C Do đó, tỷ lệ G C trình tự CPV-2 tương đối thấp, nguyên nhân làm cho DNA CPV-2 ổn định dễ phát sinh biến dị trình tiến hóa Tỷ lệ đột biến CPV-2 tương tự RNA virus khoảng 10-4 vị trí năm (Zhou P cs., 2017) 3.4 Thu nhận trình tự gen VP2 xác định genotype ba chủng nghiên cứu Từ trình tự hệ gen, chúng tơi thu tồn gen kháng ngun VP2 CPV-2 có độ dài 1755 bp, từ vị trí 2784 đến vị trí 4538 Kết phân tích cho thấy vùng gen VP2 mang nhiều đột biến phong phú đóng vai trị quan trọng việc kích thích đáp ứng miễn dịch vật chủ Các phân tích trình tự gen VP2 có vai trị việc xác định kiểu huyết CPV-2 dạng CPV-2 ngồi tự nhiên (Soma cs., 2013) Trình tự gen VP2 thu nhận được: >Par1-VN-2022 ATGAGTGATGGAGGAGTTCAACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATgAAAGAGCTACAGGATCTGGGAAC GGGTCTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTTAATAATCAGACGGAA TTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTGCATTTAAATATGCCAGAA AGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGAT ACTCATGCACAAATTGTAACACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGAT TGGCAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTA AAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCGTCATTGATGGTT GCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGG AAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACT AGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTG CCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTATTTTGATTGTAAACCATGTAGACTA ACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGT ACTAACTTTGGTTATATAGGAGTCCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAACACAAACATTATT 36 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an ACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCTACACAA GGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCGAGCAGCAGATGGTGAT CCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATAT ATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACA GAAGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATGTTTAATACT TATGgTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTTGGgATAAAGAaTTTGAT ACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTA AAAGTTGCACCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCA GATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAA ATGAGTATCAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAGTAATATTGGAGGTATGAAAATTGTATATGAAAAA TCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATATTAA >Par2-VN-2022 ATGAGTGATGGAGGAGTTCAACCAGACGGTGGTCAACCTGCTGTCAGAAATgAAAGAGCTACAGGATCTGGGAAC GGGTCTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGTGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTTAATAATCAGACGGAA TTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTGCATTTAAATATGCCAGAA AGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGAT ACTCATGCACAAATTGTAACACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGAT TGGCAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTA AAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCGTCATTGATGGTT GCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGG AAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACT AGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTG CCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTATTTTGATTGTAAACCATGTAGACTA ACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGT ACTAACTTTGGTTATATAGGAGTCCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAACACAAACATTATT ACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCTACACAA GGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCGAGCAGCAGATGGTGAT CCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATAT ATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACA GAAGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATGTTTAATACT TAtGgTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTtgGGATAAAGAaTtTGAT ACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTA AAAGTTGCACCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCA GATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAA ATGAGTATCAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAGTAATATTGGAGGTATGAAAATTGTATATGAAAAA TCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATATTAA >Par4-VN-2022 ATGAGTGATGGAGGAGTTCAACCAGACGGTGGTCAATCTGCTGTCAGAAATGAAaGAGCTACAGGATCTGGGAAC GGGTCTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTTAATAATCAGACGGAA TTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCaAGCAGACTTGTGCATTTAAATATGCCAGAA 37 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an AGTGAAAATTATAgAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGAt ACTCATGCACAAATTGTAACACCTTGGTCATTGGTTGAtGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGAT tGGCAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTA AAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCGTCATTGATGGTT GCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGG AAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACT AGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTACACTATTGAAAATTCTGTG CCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTATTTTGATTGTAAACCATGTAGACTA ACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGT ACTAACTTTGGTTATATAGGAGTCCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAACACAAACATTATT ACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCTACACAA GGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCGAGCAGCAGATGGTGAT CCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATAT ATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACA GAAGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATGTTTAATACT TATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTtGGGATAAAGAATTTGAT ACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTA AAAGTTGCACCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCA GATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAA ATGAGTATCAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAGTAATATTGGAGGTATGAAAATTGTATATGAAAAA TCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATATTAA Trình tự gen VP2 hồn chỉnh CPV-2 gồm 1755 nucleotide, mã hóa cho 584 amino acid, mã khởi đầu ATG mã kết thúc TAA 3.5 So sánh tỷ lệ tƣơng đồng nucleotide amino acid vùng gen VP2 mẫu CPV-2 nghiên cứu Trình tự nucleotide amino acid gen VP2 03 mẫu CPV-2 phân lập nghiên cứu so sánh với chủng giới đăng ký ngân hàng gen, đại diện cho genotype khác Kết trình bày Bảng 3.4 38 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.3 Danh sách chủng CPV-2 sử dụng nghiên cứu để so sánh tƣơng đồng vùng gen VP2 STT Kí hiệu Nguồn gốc /Quốc gia Năm phân lập/ công bố Số ngân hàng gen Ghi Par1-VN-2022 Hà Nội/VN 2022 Nghiên cứu Par2-VN-2022 Hà Nội/VN 2022 Nghiên cứu Par4-VN-2022 Hà Nội/VN 2022 Nghiên cứu PCV28 HCM01 IZSSI-PA544619 Nghệ An/ 2018 MW239603 CPV-2c Viet Nam 2017 MT106234 CPV-2c Italy 2018 MK806283 CPV-2c Taiwan 2018 MN832850 CPV-2c 2017 MK306290 CPV-2c VN Taiwan-2018 Korea-CPV2c-2 CPV-19-Iran Iran 2020 MW653253 CPV-2c 10 CPV03 Peru 2016 MW889097 CPV-2c 11 HNI-4-1 Viet Nam N/2004 AB120727 CPV-2b 12 CPV-8-IN India 2010 KX469430 CPV-2b 13 South Korea CPV-2b/ vaccine FortDodge-Vac- FJ222822 US strain Duramune DAPPI+LC 14 nj01-06 China N/2008 EU310373 CPV-2a 15 Taiwan-9 Taiwan 2000 AB054213 CPV-2a 16 V120 Viet Nam 2000 AB054215 CPV-2a 17 6us80 USA 1980 EU659117 CPV-2 18 HB10 China 2009 GU392242 CPV-2 19 VanguardPlus FJ197847 CPV-2 CPVpf/vaccine 39 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.4 Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đƣờng chéo) amino acid (dƣới đƣờng chéo) vùng gen VP2 chủng CPV-2 STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 99.83 99.83 100 100 99.83 99.83 99.66 99.14 99.14 99.14 99.14 98.63 99.14 98.97 98.97 97.95 97.26 97.6 99.94 99.66 99.83 99.83 99.66 99.66 99.49 98.97 98.97 98.97 98.97 98.46 98.97 98.8 98.8 97.77 97.09 97.43 99.94 99.89 99.83 99.83 99.66 99.66 99.49 98.97 98.97 98.97 98.97 98.46 98.97 98.8 98.8 97.77 97.43 97.43 99.94 99.89 99.89 100 99.83 99.83 99.66 99.14 99.14 99.14 99.14 98.63 99.14 98.97 98.97 97.95 97.26 97.6 99.72 99.66 99.66 99.66 99.83 99.83 99.66 99.14 99.14 99.14 99.14 98.63 99.14 98.97 98.97 97.95 97.26 97.6 99.77 99.72 99.72 99.72 99.72 100 99.83 99.32 99.32 99.32 99.32 98.8 99.32 99.14 99.14 98.12 97.43 97.77 99.72 99.66 99.66 99.66 99.66 99.83 99.83 99.32 99.32 99.32 99.32 98.8 99.32 99.14 99.14 98.12 97.43 97.77 99.60 99.54 99.54 99.54 99.54 99.72 99.66 99.14 99.14 99.14 99.14 98.63 99.14 99.14 98.97 97.95 97.26 97.6 99.15 99.09 99.09 99.09 99.20 99.26 99.20 99.09 100 100 99.66 99.49 99.66 99.83 99.83 98.8 98.12 98.46 10 98.97 98.92 98.92 98.92 99.03 99.09 99.03 98.92 99.83 100 99.66 99.49 99.66 99.83 99.83 98.8 98.12 98.46 11 98.92 98.86 98.86 98.86 98.97 99.03 98.97 98.86 99.54 99.37 99.66 99.49 99.66 99.83 99.83 98.8 98.12 98.46 12 99.26 99.20 99.20 99.20 99.20 99.37 99.32 99.20 99.54 99.37 99.32 99.49 99.49 99.66 99.66 98.63 97.95 98.29 13 99.09 99.03 99.03 99.03 99.15 99.20 99.15 99.03 99.77 99.60 99.43 99.54 99.32 99.49 99.49 98.46 97.77 98.12 14 98.75 98.69 98.69 98.69 98.80 98.86 98.80 98.69 99.26 99.09 98.92 99.26 99.26 99.83 99.83 98.8 98.12 98.46 15 98.80 98.75 98.75 98.75 98.86 98.92 98.86 98.75 99.54 99.37 99.32 99.43 99.54 99.26 100 98.97 98.29 98.63 16 98.80 98.75 98.75 98.75 98.86 98.92 98.86 98.75 99.54 99.37 99.20 99.32 99.54 99.15 99.54 98.97 98.29 98.63 17 98.75 98.69 98.69 98.69 98.80 98.86 98.80 98.69 99.49 99.32 99.15 99.26 99.49 99.09 99.37 99.37 98.97 99.49 18 98.46 98.40 98.52 98.40 98.52 98.58 98.52 98.40 99.20 99.03 98.86 98.97 99.20 98.80 99.09 99.09 99.60 19 98.58 98.52 98.52 98.52 98.63 98.69 98.63 98.52 99.32 99.15 98.97 99.09 99.32 98.92 99.20 99.20 99.72 99.43 98.63 Ghi chú: 1:Par1-VN-2022; 2:Par2-VN-2022; 3:Par4-VN-2022; 4:PCV28; 5:HCM01; 6:IZSSI-PA5446-19; 7:Taiwan-2018; 8:KoreaCPV2c-2; 9:CPV-19-Iran; 10:CPV03; 11:HNI-4-1; 12:CPV-8-IN; 13:FortDodge-Vac-US; 14:nj01-06; 15:Taiwan-9; 16:V120; 17:6us80; 18:HB10; 19:VanguardPlus 40 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Trình tự đầy đủ gen VP2 mẫu nghiên cứu xác định nhằm phân tích đa dạng di truyền mối quan hệ chủng CPV-2c Việt Nam với chủng CPV khác sở liệu NCBI-Genbank Đối với gen VP2, trình tự nucleotide chủng nghiên cứu có mức độ tương đồng cao từ 99,89 - 99,94% Khi so sánh với chủng CPV-2c khác, trình tự VP2 chủng nghiên cứu có mức độ tương đồng cao với chủng CPV-2c có nguồn gốc từ châu Á, bao gồm chủng phân lập Việt Nam trước (MW239603/PCV28, MT106234/HCM01), Đài Loan (MN832850/Taiwan2018), Hàn Quốc (MK306290/Korea-CPV2c-2) chủng phân lập Ý (MK806283/IZSSI-PA5446-19) nhập chó từ Thái Lan với tỷ lệ từ 99,54 - 99,94% (Mira cs., 2019) Bên cạnh đó, chủng CPV-2c phân lập quốc gia khác Peru, Iran có mức độ tương đồng thấp từ 98,92 - 99,15% So sánh trình tự nucleotide chủng nghiên cứu với chủng CPV2b có mức độ tương đồng từ 98,86 - 99,26%, cao so với chủng CPV-2a (98,69 - 98,8%) Các chủng CPV-2c nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng với chủng CPV-2 từ 98,4 - 98,75% Đặc biệt, trình tự nucleotide chủng nghiên cứu chia sẻ mức độ tương đồng trình tự nucelotide thấp với chủng vaccine thương mại VanguardPlus CPV-2 từ 98,52 - 98,58% So sánh trình tự amino acid chủng nghiên cứu có mức độ tương đồng cao từ 99,66 - 99,83% Cả chủng nghiên cứu có trình tự amio acid tương đồng mức cao với chủng CPV-2c có nguồn gốc từ châu Á (99,49 - 100%), cụ thể, chủng nghiên cứu chủng phân lập Việt Nam trước có tỷ lệ tương đồng 99,83 - 100% Khi so sánh với chủng CPV-2c có nguồn gốc khác, trình tự amino acid chủng nghiên cứu có mức độ tương đồng từ 98,97 - 99,14% Trình tự amino acid chủng nghiên cứu so với chủng thuộc genotype khác (CPV-2b, CPV-2a, CPV-2) có mức độ tương đồng thấp từ 97,04 - 99,14% Đáng ý, trình tự amino acid chủng nghiên 41 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an cứu có tương đồng với trình tự amino acid chủng vaccine VanguardPlus mức thấp từ 97,43 - 97,6% Kết so sánh trình tự nucleotide amino acid gen VP2 có thấy, chủng nghiên cứu chia sẻ nguồn gốc với chủng CPV-2c lưu hành châu Á, có chung đường biên giới giao thương nhiều Bên cạnh đó, nhóm CPV-2c châu Á có xuất số quốc gia châu Âu Ý, thông qua hoạt động thương mại Kết khuyến cáo cần phải có biện pháp hiệu để kiểm soát lây lan chủng CPV Ngồi ra, khác biệt lớn trình tự gen VP2 vaccine thương mại VanguardPlus yêu cầu nghiên cứu đánh giá hiệu vaccine so với chủng lưu hành nước ta 3.6 Phân tích trình tự amino acid VP2 Trình tự amino acid suy diễn chủng CPV-2c phân lập Việt Nam năm 2022 so sánh với chủng CPV-2 giới Việt Nam Ngân hàng gen Kết thu nhận thể Bảng 3.5 Việc xác định genotype chủng nghiên cứu dựa vào phân tích trình tự amino acid vị trí 426 gen VP2, coi thị phân tử việc định genotype CPV-2 (Buonavoglia cs., 2001; Zhou cs., 2017) Trong đó, genotype 2a đặc trưng 426-Asparagine, genotype 2b đặc trưng 426-Aspartic acid genotype 2c có đặc trưng 426-Glutamic acid Kết phân tích (Bảng 3.5) cho thấy ba chủng CPV-2 phân lập năm 2022 nghiên cứu thuộc genotype CPV-2c với đặc trưng Glutamic acid vị trí 426 42 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.5 Kết ph n tích đặc điểm gen VP2 dựa trình tự amino acid suy diễn chủng nghiên cứu Tên chủng Năm ph n lập/công bố Số Genbank Genotype 13 23 38 87 101 267 Vị trí amino acid 297 300 305 324 370 426 440 447 555 Chủng tham chiếu HB10-China VanguardPlus-US CPV-15-China Taiwan9-Taiwan SCJM-China V204-Vietnam HCM6-Vietnam HCM8-Vietnam HCM18-Vietnam HIN-2-13-Vietnam 02B9-France K022-Korea 193-USA HS-11-China 695-Italy Argentina HCM7-Vietnam HCM8-Vietnam HCM20-Vietnam CPV1p-Vietnam CPV6p-Vietnam CPV19-Vietnam Par25-Vietnam Par27-Vietnam N/A N/A 1993 1997 2006 1997 2002 2002 2002 2002 2008 2008 2005 2012 2009 2015 2019 2019 2019 2017 2017 2017 2019 2019 Par1-VN-2022 Par2-VN-2022 Par4-VN-2022 2022 2022 2022 GU392242 FJ197847 M24003 AB054213 EF028071 AB054221 AB120720 AB120721 AB120722 AB120724 DQ025950 EU009203 AY742932 JQ743893 AF401519 KM236569 LC214969 LC216907 LC216910 MW239577 MW239578 MW239589 MW239604 MW239605 2 2a 2a 2b 2b 2b 2b 2b 2b new 2a new 2a new 2b new 2b 2c 2c 2c 2c 2c 2c-new-var 2c-new-var 2c-new-var 2c-new-var 2c-new-var A A A A A A A A A A A A A A A A G G G G G G G G P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 2c-new-var 2c-new-var 2c-new-var G G G P P P S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V M M L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L L I I T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T F F F F F F F F Y Y F F F F F F Y Y Y Y Y Y Y Y S S S S A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G D D Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y I Y Y I I I I I I I I Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q R R R R R R R R N N N N D D D D D D N N D D E E E E E E E E E E T T T T T T T T T T A A T T T T T T T T T T T T I I I I I I I I I I I I I I I I I I I M M M M M V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V V T T T Y Y Y A A A G G G Y Y Y I I I R R R E E E T T T M M M V V V Chủng nghiên cứu P S S V V V L L L (A-Alanine; R-Arginine; N-Asparagine; D-Axit aspartic; Q-Glutamine; E-Axit glutamic; G- Glycine; I- Isoleucine; L-Leucine; M-Methionine; F- Phenylalanine; P-Proline; S- Serine; T-Threonine; Y-Tyrosine;V-Valine) 43 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Từ kết phân tích cho thấy, chủng CPV-2 phân lập Việt Nam năm 2002 thuộc genotype CPV-2b (426D) Các chủng phân lập từ năm 2014 trở lại thuộc genotype CPV-2c (426E) không thấy có xuất genotype khác Chủng vaccine Vanguard®Plus 5-CV (Zoetis) sử dụng Việt Nam thuộc genotype CPV-2 Tất chủng CPV-2 Việt Nam (bao gồm: chủng nghiên cứu này, 03 chủng phân lập năm 2014 Thành phố Hồ Chí Minh 05 chủng phân lập từ 2017-2019 tỉnh phía Bắc Việt Nam) có trình tự điển hình CPV-2c châu Á, bao gồm 80R, 87L, 93N, 101T, 103A, 232I, 267Y, 297A, 300G, 305Y, 323N, 324I, 334A, 341P, 370Q/R, 426N/D/E, 440T, 555V, 564S, 568G (Miranda C cs., 2016) Tuy nhiên, điều đáng ý chủng CPV-2c Việt Nam có đột biến đặc trưng riêng vị trí A5G I447M, hồn tồn khác biệt so với chủng CPV-2c công bố trước Chủng vaccine Vanguard®Plus 5-CV (Zoetis) sử dụng Việt Nam thuộc genotype CPV-2, có nhiều sai khác vị trí quan trọng so sánh với chủng CPV-2c lưu hành Việt Nam Các đột biến quan trọng dường nguyên nhân dẫn đến việc virus thoát khỏi đáp ứng miễn dịch làm giảm hiệu lực vaccine, ghi nhận nhiều quốc gia giới (Altman cs., 2017) Do đó, cần có nghiên cứu cụ thể nhằm đánh giá hiệu vaccine với chủng CPV lưu hành phổ biến nước ta Nghiên cứu chứng minh được, biến thể CPV-2b ghi nhận phổ biến Việt Nam vào năm 2002 (Nakamura cs., 2004), nay, biến thể CPV-2c trở nên chiếm ưu Các chủng CPV-2c Việt Nam sở hữu hai đột biến quan trọng (F267Y, Y324I), nguyên nhân gây giảm hiệu lực vaccine (Altman cs., 2017) Các công bố trước điểm khác biệt amino acid protein VP2 CPV-2 CPV-2a M87L, I101T, A300G, D305Y V555I (Miranda cs., 2016) Tuy nhiên, có số ý kiến cho phân biệt kiểu gen vị trí 555 khơng hợp lý Theo phân tích phát sinh lồi CPV Đài 44 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Loan cho thấy dư lượng Valine vị trí 555-VP2 CPV-2a (Wang cs., 2005) Trong nghiên cứu có vị trí acid amin sai khác biến thể CPV-2 CPV-2a M87L, I101T, A300G D305Y Valine-555 quan sát thấy tất kiểu gen Hiện nay, CPV-2c lưu hành hầu khắp quốc gia giới, bao gồm châu Âu, châu Á, châu Phi, Bắc Mỹ, Nam Mỹ dần trở thành biến thể chiếm ưu Bên cạnh đó, CPV-2c biến chủng phổ biến hầu hết quốc gia khu vực châu Á mang đột biến VP2 đặc trưng A5G Q370R (Hao cs., 2022) Trong nghiên cứu này, với nghiên cứu từ 20172019 Đoàn Thị Thanh Hương cộng sự, Nguyễn Mạnh Tường cộng năm 2020 xác định CPV-2c biến thể phổ biến Việt Nam, đồng thời cho thấy đột biến I447M đại diện nước ta khác biệt so với chủng CPV-2c giới (Nguyễn Mạnh Tường cs., 2020; Đoàn Thị Thanh Hương cs., 2021) 3.7 Kết phân tích phả hệ nguồn gốc dựa vào gen VP2 genome chủng CPV-2 nghiên cứu Cây phả hệ nguồn gốc gen VP2 xây dựng từ chủng CPV-2c Việt Nam nghiên cứu với 43 chủng CPV tham chiếu từ quốc gia khác, thu thập Ngân hàng gen nhằm phân tích mối quan hệ trình tự mã hóa gen protein cấu trúc VP2 45 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an EU659117-CPV2-CPV-6us80-US-1980 EU659116-CPV2-CPV-5us79-US-1979 FJ197847-VanguardPlus GU392242-CPV2-HB10-CN-2009 EU659118-CPV2-13us81-US-1981 EU310373-CPV2a-nj01-06-CN AB054213-CPV2a-Taiwan-9-TW AB054222-CPV2a-LCPV-V139-VN AB054215-CPV2a-V120-VN AB054216-CPV2a-V129-VN FJ222822-CPV2b-FortDodge-Vac-US MF177279-CPV2c-E48-EC-2011 MW653253-CPV2c-CPV-19-Iran-IR-2020 MF177249-CPV2c-Arg71-AR-2010 MW889097-CPV2c-CPV03-PE-2016 MF177261-CPV2c-BRA04-13-BR-2013 KM457131-CPV2c-UY368-UY-2011 KT275256-CPV2c-PT262-14-PT-2014 KU508407-CPV2c-IZSSI-25835-09-IT-2009 AB120727-CPV2b-HNI-4-1-VN-2002 AB120723-CPV2b-HCM-23-2002 AB120726-CPV2b-HNI-3-11-VN-2002 AB120728-CPV2b-HNI-1-18-VN-2002 AB054219-CPV2b-V209-VN-1997 AB054220-CPV2b-V217-VN-1997 AB120722-CPV2b-HCM-18-VN-2002 AB120724-CPV2b-HNI-2-13-VN-2002 KX469430-CPV2b-CPV-8-IN-2010 KR002793-CPV2b-HB1-CN-2013 MK357734-CPV2c-HN7AA-VN-2017 MT106236-CPV2c-DN02-VN-2017 MK806283-CPV2c-Asia-IZSSI-PA5446-19-IT-2018 MH711902-CPV2c-CU21-TH-2016 KP260509-CPV2c-new2c-BJ14-9-CN-2014 LC216910-CPV2c-dog-HCM-20-VN-2013 MN832850-CPV2c-new2c-Taiwan-2018-TW-2018 MW239604-CPV2c-new2c-Par25p-NA-VN-2019 MT106234-CPV2c-HCM01-VN-2017 MK306290-CPV2c-Korea-CPV2c-2-KR-2017 MW239581-CPV2c-new-var-CPV8p-HN-VN-2017 Par1-VN-2022 MH177305-CPV2c-GX373-CN-2017 Par2-VN-2022 MW239603-CPV2c-PCV28-NA-VN-2018 Par4-VN-2022 MK357721-CPV2c-DN8-VN-2016 CPV-2 CPV-2a CPV-2c Châu Âu, Mỹ CPV-2b CPV-2c Châu Á Hình 3.6 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng CPV-2 Việt Nam giới (có Ngân hàng gen), dựa trình tự nucleotide gen VP2 có kích thước 1755 bp, sử dụng chương trình MEGA7, phương pháp Maximum Likelihood với hệ số tin cậy bootstrap 1000 Ghi chú: Hình trám kí hiệu chủng CPV-2 nghiên cứu 46 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Kết phả hệ cho thấy, chủng Canine parvovirus tập trung thành nhóm chính, gồm nhóm genotype CPV-2, genotype CPV-2a, genotype CPV-2b genotype CPV-2c Châu Á genotype CPV-2c Châu Âu-Mỹ Trong đó, ba chủng nghiên cứu (Par1-VN-2022, Par2-VN-2022 Par4-VN-2022) thuộc nhóm CPV-2c – châu Á với chủng CPV lưu hành nước châu Á có mối quan hệ gần gũi với chủng phân lập Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan quốc gia có nhập chó Ý (MF510157, MK806283) (Mira cs., 2019) (Hình 3.5) Hơn nữa, nhóm genotype CPV-2c – châu Á nằm tách biệt hồn tồn với nhóm CPV-2c khu vực châu Âu, Bắc Mỹ, Nam Mỹ nằm cách xa với nhóm genotype cịn lại Điều giúp dự đoán đường lây lan virus quốc gia có chung đường biên giới có xuất nhập chó Do đó, cần có biện pháp phù hợp để kiểm sốt ngăn chặn để đảm bảo cơng tác phịng điều trị bệnh Bên cạnh đó, chủng parvovirus Việt Nam có tương đồng cao ổn định mặt di truyền, điều thuận lợi cho việc sản xuất sử dụng vaccine hiệu Việt Nam Trình tự VP2 chủng vaccine VanGuardPlus (FJ197847) thuộc vào nhóm CPV-2, dựa vào phả hệ cho thấy, chủng vaccine nằm cách xa với ba chủng nghiên cứu tỷ lệ tương đồng nucleotide mức thấp 98,52 – 98,58% (Bảng 3.4) Các chủng thuộc nhóm CPV-2 chủng thủy tổ phát khác xa nguồn gốc với chủng nghiên cứu Do cần xem xét hiệu loại vaccine sử dụng nước ta nguyên nhân dẫn tới thất bại tiêm chủng, chó tiêm phịng cách mắc bệnh (Mylonakis cs., 2016) 47 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an KU508693-CPV2c-LW-AU-2015 MW653253-CPV2c-19-IR-2020 KM457104-CPV2c-UY47-UY-2006 KM457131-CPV2c-UY368-UY-2011 KU508407-CPV2c-CPV-IZSSI-25835-09-IT-2009 46 MF177239-CPV2c-288-01-IT-2001 MF177279-CPV2c-E48-EC-2011 47 82 MW889120-CPV2c-CPV26-PE-2017 MF177229-CPV2c-368-12-17-AL-2012 MW889097-CPV2c-CPV03-PE-2016 29 KY073269-CPV2c-UFMT-BR-2015 29 94 MF177261-CPV2c-BRA04-13-BR-2013 MW889113-CPV2a-CPV19-PE-2016 21 MW889115-CPV2a-CPV21-PE-2016 83 63 MW889118-CPV2b-CPV24-PE-2017 MW653251-CPV2b-CPV23-IR-2020 MW653256-CPV2a-2a6-IR-2020 24 EU310373-CPV2a-nj01-CN-2008 13 23 EU659118-CPV2a-13us81-US-1981 MK144544-CPV2c-K01708-1-KR-2017 MH711894-CPV2c-CU24-TH-2016 MW811188-CPV2c-SH2002-CN-2020 98 85 MF805789-CPV2c-Canine-China-01-CN-2016 MK306290-CPV2c-KoreaCPV2c-2-KR-2017 99 MH660909-CPV2c-5MGL-MN-2017 93 MN832850-CPV2c-Taiwan2018-TW-2018 MH476592-CPV2c-Canine-China-23-CN-201748 MK388674-CPV2c-HB2017-CN-2017 Par1-VN-2022 LC214969-CPV2c-dogHCM7-VN-2013 80 Par2-VN-2022 Par4-VN-2022 MG013488-CPV2c-SH1516-CN-2017 MH711902-CPV2c-CU21-TH-2016 MN451678-CPV2c-CPV605-NG-2018 OM721655-CPV2b-K5-TR-2019 KR002794-CPV2a-HB3-CN-2013 68 26 MW653248-CPV2a-strainCPV-IRAN-2020 MZ362882-CPV2a-Roseworthy-SA-5371-AU-2019 MT648208-CPV2a-new2a-AHmas16-CN-2018 22 KM457140-CPV2a-UY365-UY-2011 28 MT106238-CPV2a-HCM16-VN-2017 MH476589-CPV2a-new2a-CanineChina20-2017 24 MN661243-CPV2a-new2a-IN-2016 72 JQ268284-CPV2b-LZ2-CN-2011 21 MH545963-CPV2a-TN-CPV2a-IN-2018 87 KR002793-CPV2b-HB1-CN-2013 90 MG583676-CPV2a-ya1-CN-2015 85 MZ647470-CPV2a-MO-USA-2017 100 57 44 CPV-2c Châu Âu-Mỹ CPV-2c Châu Á Hình 3.7 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng CPV-2 Việt Nam giới (có Ngân hàng gen), dựa trình tự tồn khung đọc mở hệ gen, sử dụng chương trình MEGA7, phương pháp Maximum Likelihood với hệ số tin cậy bootstrap 1000 Ghi chú: Hình trám kí hiệu chủng CPV-2 nghiên cứu 48 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Cây phả hệ nguồn gốc hệ gen CPV-2 xây dựng gồm toàn khung đọc mở đầy đủ chủng nghiên cứu (Par1-VN-2022, Par2-VN-2022 Par4VN-2022) 46 chủng CPV tham chiếu (có Ngân hàng gen) Phân tích phả hệ cho thấy chủng Việt Nam nghiên cứu có tính ổn định di truyền với chủng Việt Nam trước có mối quan hệ gần gũi với chủng phân lập Trung Quốc Thái Lan (MG013488, MH711902) Các chủng CPV-2a CPV-2b nằm đan xen, cho thấy mối quan hệ chúng gần gũi so với chủng CPV-2c Phân tích phả hệ nguồn gốc hệ gen cho thấy phân nhóm hồn tồn chủng CPV-2c nhóm châu Á Bên cạnh Trung Quốc Thái Lan quốc gia có chung đường biên giới với Việt Nam, Mông Cổ, Nigeria, Ai Cập ghi nhận chủng phân lập có nguồn gốc châu Á (Temuujin cs., 2019; Ogbu cs., 2020; Zaher cs., 2020) Điều cho thấy có du nhập chủng CPV-2c châu Á tới nhiều quốc gia vùng lãnh thổ khác có giao thương thương mại, cần tìm biện pháp phù hợp để phịng tránh lây lan 49 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau tiến hành nghiên cứu này, chúng tơi có kết luận sau: - Thu nhận giải trình tự tồn khung đọc mở hệ gen chủng virus gây bệnh chó Hà Nội năm 2022 Trình tự bao gồm 4269 nucleotide, mã hóa 2144 amino acid - Xác định đặc điểm phân tử gen kháng nguyên VP2 chủng CPV-2 nghiên cứu Từ đó, xác định ba chủng gây bệnh thuộc genotype CPV2c, có đặc trưng riêng vị trí đột biến A5G I447M, khác biệt so với chủng CPV-2 giới - Các chủng CPV-2 Hà Nội, Việt Nam có tỷ lệ tương đồng gen VP2 cao so với chủng CPV-2c nhóm châu Á từ 99,54 - 99,94%, so với genotype khác có tỷ lệ tương đồng thấp 97,04 - 99,14% - Phân tích phả hệ nguồn gốc dựa liệu gen VP2 toàn khung đọc mở cho thấy chủng virus nghiên cứu thuộc genotype CPV-2c nhóm châu Á Nghiên cứu chúng tơi góp phần tạo sở liệu đặc điểm phân tử vùng gen VP2 hệ gen chủng CPV-2c Việt Nam hỗ trợ thông tin đặc điểm phân tử virus CPV-2 Việt Nam Kiến nghị Hiện nay, biến đổi nhanh chóng liên tục chủng CPV-2 giới Việt Nam diễn vô phức tạp Do vậy, cần mở rộng thêm nghiên cứu để cung cấp liệu phục vụ cho cơng tác phịng dịch Việt Nam, thu thập nghiên cứu vùng địa lý khác nhau, đặc biệt khu vực miền Nam Việt Nam Bên cạnh đó, cần nghiên cứu hiệu loại vaccine sử dụng Việt Nam so với chủng lưu hành nhằm lựa chọn loại vaccine phù hợp, tăng khả phòng chống dịch 50 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Ngọc Bích, Nguyễn Thị Yến Mai, Nguyễn Quốc Việt Trần Thị Thảo (2013) Khảo sát tỷ lệ bệnh parvovirus chó từ đến tháng tuổi thành phố Cần Thơ, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, (28), pp.15–20 Nguyễn Thị Hiếu Dân, Trần Ngọc Bích, Nguyễn Thị Yến Mai Trần Văn Thanh (2019) Khảo sát bệnh viêm ruột parvovirus gây chó thành phố Bến Tre, TNU Journal of Science and Technology, 197(04), pp.95–100 Nguyễn Văn Dũng, Phan Xuân Thảo, Vũ Kim Chiến Ken Maeda (2020) Dịch tễ học phân tử Parvovirus chó thành phố Hồ Chí Minh, Khoa học kỹ thuật thú y tập XXV số 4 Võ Văn Hải, Nguyễn Thị Yến, Đào Lê Anh, Hoàng Minh, Bùi Trần Anh Đào, Bùi Thị Tố Nga, Nguyễn Thị Lan Lê Văn Phan (2019) Một số đặc tính phân tử Parvovirus type chó phân lập thành phố Hà Nội, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2019, 17(2): 100-107 Nguyễn Thị Yến Mai, Trần Ngọc Bích, Nguyễn Phúc Khánh, Keovongphet Phuthavong Trần Văn Thanh (2018) Tình hình bệnh viêm ruột parvovirus chó phịng mạch thú y tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp thành phố Cần Thơ, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 54 (Nông nghiệp), p.136 doi:10.22144/ctu.jsi.2018.075 Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Thị Hoa Lê Thị Luyên (2022) Một số đặc tính sinh học chủng canine parvo virus type gây bệnh viêm ruột chó phía Bắc Việt Nam, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(3): 300-310 Trang Thông tin điện tử Cục Thú Y (2022) Chỉ thị việc tập trung triển khai liệt, đồng giải pháp phòng, chống bệnh Dại động vật Truy cập từ https://cucthuy.gov.vn/ ngày 5/12/2022 51 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TIẾNG ANH Alexis, V.A., Sonia, V., Daniela, S., Miguel, G., Timothy, H., Valentina, F., Lisette, L and Leonardo, S (2021) Molecular Analysis of Full-Length VP2 of Canine Parvovirus Reveals Antigenic Drift in CPV-2b and CPV-2c Variants in Central Chile, Animals, 11(8), p.2387 doi:10.3390/ani11082387 Altman, K.D., Kelman, M and Ward, M.P (2017) Are vaccine strain, type or administration protocol risk factors for canine parvovirus vaccine failure?, Veterinary Microbiology, 210, pp.8–16 doi:10.1016/j.vetmic.2017.08.019 Appel, M.J., Cooper, B.J., Greisen, H., Scott, F and Carmichael, L.E (1979) Canine viral enteritis I Status report on corona- and parvo-like viral enteritides, The Cornell Veterinarian, 69(3), pp.123–133 Available at: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/223812/ Buonavoglia, C., Martella, V., Pratelli, A., Tempesta, M., Cavalli, A., Buonavoglia, D., Bozzo, G., Elia, G., Decaro, N and Carmichael, L (2001) Evidence for evolution of canine parvovirus type in Italy, The Journal of General Virology, 82(Pt 12), pp.3021–3025 doi:10.1099/0022-1317-82-123021 Callaway, H.M., Feng, K.H., Lee, D.W., Allison, A.B., Pinard, M., McKenna, R., Agbandje-McKenna, M., Hafenstein, S and Parrish, C.R (2016) Parvovirus Capsid Structures Required for Infection: Mutations Controlling Receptor Recognition and Protease Cleavages, Journal of Virology, 91(2) doi:10.1128/jvi.01871-16 Callaway, H.M., Welsch, K., Weichert, W., Allison, A.B., Hafenstein, S.L., Huang, K., Iketani, S and Parrish, C.R (2018) Complex and Dynamic Interactions between Parvovirus Capsids, Transferrin Receptors, and Antibodies Control Cell Infection and Host Range Journal of Virology, 92(13) doi:10.1128/jvi.00460-18 Carrino, M., Tassoni, L., Campalto, M., Cavicchio, L., Mion, M., Corrò, M., Natale, A and Beato, M.S (2022) Molecular Investigation of Recent Canine 52 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Parvovirus-2 (CPV-2) in Italy Revealed Distinct Clustering Viruses, 14(5), p.917 doi:10.3390/v14050917 Chinchkar, S.R., Mohana Subramanian, B., Hanumantha Rao, N., Rangarajan, P.N., Thiagarajan, D and Srinivasan, V.A (2006) Analysis of VP2 gene sequences of canine parvovirus isolates in India Archives of Virology, 151(9), pp.1881–1887 doi:10.1007/s00705-006-0753-8 Cornell University (2017) Canine Parvovirus [online] Cornell University College of Veterinary Medicine Available at: https://www.vet.cornell.edu/departments-centers-and-institutes/bakerinstitute/our-research/canine-parvovirus 10.Cotmore, S.F., Agbandje-McKenna, M., Chiorini, J.A., Mukha, D.V., Pintel, D.J., Qiu, J., Soderlund-Venermo, M., Tattersall, P., Tijssen, P., Gatherer, D and Davison, A.J (2013) The family Parvoviridae Archives of Virology, 159(5), pp.1239–1247 doi:10.1007/s00705-013-1914-1 11.Day, M.J., Horzinek, M.C., Schultz, R.D and Squires, R.A (2016) WSAVA Guidelines for the vaccination of dogs and cats Journal of Small Animal Practice, 57(1), pp.E1–E45 doi:10.1111/jsap.2_12431 12.De la Torre, D., Mafla, E., Puga, B., Erazo, L., Astolfi-Ferreira, C and Ferreira, A.P (2018) Molecular characterization of canine parvovirus variants (CPV-2a, CPV-2b, and CPV-2c) based on the VP2 gene in affected domestic dogs in Ecuador Veterinary World, 11(4), pp.480–487 doi:10.14202/vetworld.2018.480-487 13.Decaro, N and Buonavoglia, C (2012) Canine parvovirus—A review of epidemiological and diagnostic aspects, with emphasis on type 2c Veterinary Microbiology, 155(1), pp.1–12 doi:10.1016/j.vetmic.2011.09.007 14.Decaro, N., Desario, C., Lucente, M.S., Amorisco, F., Campolo, M., Elia, G., Cavalli, A., Martella, V and Buonavoglia, C (2008) Specific identification of feline panleukopenia virus and its rapid differentiation from canine 53 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an parvoviruses using minor groove binder probes Journal of Virological Methods, 147(1), pp.67–71 doi:10.1016/j.jviromet.2007.08.006 15.Decaro, N., Desario, C., Parisi, A., Martella, V., Lorusso, A., Miccolupo, A., Mari, V., Colaianni, M.L., Cavalli, A., Di Trani, L and Buonavoglia, C (2009) Genetic analysis of canine parvovirus type 2c Virology, 385(1), pp.5–10 doi:10.1016/j.virol.2008.12.016 16.Dik, I and Şimşek, A (2021) Comparison of different diagnostic methods in detection of canine parvovirus infection Eurasian Journal of Veterinary Sciences, 37(2), pp.76–81 doi:10.15312/eurasianjvetsci.2021.329 17.Doan, H.T.T., Le, X.T.K., Do, R.T., Nguyen, K.T and Le, T.H (2021) Correction to: Canine parvovirus type 2c in Vietnam continues to produce distinct descendants with new mutations restricted to Vietnamese variants Archives of Virology, 166(7), pp.2069–2069 doi:10.1007/s00705-02105090-2 18.Hoang, M., Lin, W.-H., Le, V.P., Nga, B.T.T., Chiou, M.-T and Lin, C.-N (2019) Molecular epidemiology of canine parvovirus type in Vietnam from November 2016 to February 2018 Virology Journal, 16(1) doi:10.1186/s12985-019-1159-z 19.International Committee on Taxonomy of Viruses: ICTV (2021) Virus Taxonomy: 2021 Release Retrieved from https://ictv.global/taxonomy on December 5, 2022 20.Koptopoulos, G., Papadopoulos, O., Papanastasopoulou, M and Cornwell, H (1986) Presence of antibody cross-reacting with canine parvovirus in the sera of dogs from Greece Veterinary Record, 118(12), pp.332–333 doi:10.1136/vr.118.12.332 21.Kumar, S., Stecher, G and Tamura, K (2016) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets Molecular Biology and Evolution, 33(7), pp.1870–1874 doi:10.1093/molbev/msw054 54 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 22.Mira, F., Purpari, G., Di Bella, S., Colaianni, M.L., Schirò, G., Chiaramonte, G., Gucciardi, F., Pisano, P., Lastra, A., Decaro, N and Guercio, A (2019) Spreading of canine parvovirus type 2c mutants of Asian origin in southern Italy Transboundary and Emerging Diseases, 66(6), pp.2297–2304 doi:10.1111/tbed.13283 23.Miranda, C and Thompson, G (2016) Canine parvovirus: the worldwide occurrence of antigenic variants Journal of General Virology, 97(9), pp.2043–2057 doi:10.1099/jgv.0.000540 24.Mylonakis, M., Kalli, I and Rallis, T (2016) Canine parvoviral enteritis: an update on the clinical diagnosis, treatment, and prevention Veterinary Medicine: Research and Reports, Volume 7, pp.91–100 doi:10.2147/vmrr.s80971 25.Nakamura, M., Tohya, Y., Miyazawa, T., Mochizuki, M., Phung, H.T.T., Nguyen, N.H., Huynh, L.M.T., Nguyen, L.T., Nguyen, P.N., Nguyen, P.V., Nguyen, N.P.T and Akashi, H (2004) A novel antigenic variant of Canine parvovirus from a Vietnamese dog Archives of Virology, 149(11), pp.2261– 2269 doi:10.1007/s00705-004-0367-y 26 Nandi, S and Kumar, M (2010) Canine Parvovirus: Current Perspective Indian Journal of Virology, 21(1), pp.31–44 doi:10.1007/s13337-010-0007-y 27.National Human Genome Research Institute (2020) Polymerase chain reaction (PCR) fact sheet Genome.gov Available at: https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Polymerase-ChainReaction-Fact-Sheet 28.Nguyen Manh, T., Piewbang, C., Rungsipipat, A and Techangamsuwan, S (2020) Molecular and phylogenetic analysis of Vietnamese canine parvovirus 2C originated from dogs reveals a new Asia‐IV clade Transboundary and Emerging Diseases doi:10.1111/tbed.13811 29.Nicholas K.B., H.B Nicholas, (1999) GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments, Distributed by authors 55 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 30.Ogbu, K.I., Mira, F., Purpari, G., Nwosuh, C., Loria, G.R., Schirò, G., Chiaramonte, G., Tion, M.T., Di Bella, S., Ventriglia, G., Decaro, N., Anene, B.M and Guercio, A (2019) Nearly full‐length genome characterization of canine parvovirus strains circulating in Nigeria Transboundary and Emerging Diseases, 67(2), pp.635–647 doi:10.1111/tbed.13379 31.Parrish, C.R (1990) Emergence, Natural History, and Variation of Canine, Mink, and Feline Parvoviruses Advances in Virus Research, pp.403–450 doi:10.1016/s0065-3527(08)60867-2 32.Parrish, C.R (1991) Mapping specific functions in the capsid structure of canine parvovirus and feline panleukopenia virus using infectious plasmid clones Virology, 183(1), pp.195–205 doi:10.1016/0042-6822(91)90132-u 33.Parrish, C.R., Have, P., Foreyt, W.J., Evermann, J.F., Senda, M and Carmichael, L.E (1988) The Global Spread and Replacement of Canine Parvovirus Strains Journal of General Virology, 69(5), pp.1111–1116 doi:10.1099/0022-1317-69-5-1111 34.Prittie, J (2004) Canine parvoviral enteritis: a review of diagnosis, management, and prevention Journal of Veterinary Emergency and Critical Care, 14(3), pp.167–176 doi:10.1111/j.1534-6935.2004.04020.x 35.Reed, A.P., Jones, E.V and Miller, T.J (1988) Nucleotide sequence and genome organization of canine parvovirus Journal of Virology, 62(1), pp.266–276 doi:10.1128/jvi.62.1.266-276.1988 36.Shackelton, L.A., Parrish, C.R., Truyen, U and Holmes, E.C (2005) High rate of viral evolution associated with the emergence of carnivore parvovirus Proceedings of the National Academy of Sciences, 102(2), pp.379–384 doi:10.1073/pnas.0406765102 37.Soma, T., Taharaguchi, S., Ohinata, T., Ishii, H and Hara, M (2013) Analysis of the VP2 protein gene of canine parvovirus strains from affected dogs in Japan Research in Veterinary Science, 94(2), pp.368–371 doi:10.1016/j.rvsc.2012.09.013 56 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn