Nghiên cứu môi trường thích hợp để nhân nhanh cây trân châu xanh (nervilia aragoana gaudich) in vitrobình dương, tháng 4 năm 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2014-2015 NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG THÍCH HỢP ĐỂ NHÂN NHANH CÂY TRÂN CHÂU XANH (NERVILIA ARAGOANA GAUDICH) IN VITRO Bình Dương, tháng năm 2015 i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HÌNH .v MỞ ĐẦU Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài Lý lựa chọn đề tài .7 Mục tiêu đề tài .9 Phương pháp nghiên cứu .9 Đối tượng phạm vi nghiên cứu .10 5.1 Đối tượng nghiên cứu 10 5.2 Phạm vi nghiên cứu 11 Chương 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 Giới thiệu chung Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) .12 1.1.1 Đặc điểm hình thái .13 1.1.2 Đặc điểm phân bố 14 1.2 Nhân giống Trân châu xanh 14 1.2.1 Nhân giống củ .14 1.2.2 Nhân giống in vitro 15 1.3 1.2.2.1 Lược sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật 15 1.2.2.2 Cơ sở khoa học nhân giống in vitro .20 1.2.2.3 Ý nghĩa nhân giống in vitro 20 1.2.2.4 Các phương thức nhân giống vơ tính in vitro 22 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy [3] .22 1.3.1 Ảnh hưởng điều kiện khử trùng mẫu cấy .22 1.3.2 Ảnh hưởng thành phần hóa học 22 1.3.3 Ảnh hưởng yếu tố vật lý 25 1.4 Quy trình sản xuất cấy mơ 25 1.5 Ứng dụng nhân giống vơ tính in vitro số dược liệu 25 Chương QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 28 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2014-2015 NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG THÍCH HỢP ĐỂ NHÂN NHANH CÂY TRÂN CHÂU XANH (NERVILIA ARAGOANA GAUDICH) IN VITRO Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thịnh Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: C12SH01, Khoa khọc tự nhiên Ngành học: Sư phạm sinh học Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thanh Thuận Bình Dương, tháng năm 2014 Nam, Nữ: Nữ Năm thứ: 3/3 ii 2.1 Điều kiện môi trường nuôi cấy .28 2.2 Nghiên cứu khả khử trùng mẫu chất khử trùng 30 2.3 Nghiên cứu khả tạo cụm chồi điều kiện in vitro 32 2.4 Xử lý thống kê .33 Chương KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 34 3.1 Thí nghiệm 1: Xác định khả khử trùng mẫu chất khử trùng 34 3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng BAP đến khả tạo cụm chồi mẫu 36 3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng BAP kết hợp với nước dừa lên khả tạo cụm chồi từ chồi đỉnh 38 3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng BAP kết hợp với nước dừa lên khả tạo cụm chồi từ đoạn thân .40 3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA lên khả tạo cụm chồi từ chồi đỉnh .42 3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng, aga, than hoạt tính lên khả tạo chồi đỉnh 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu mơi trường thích hợp để nhân nhanh Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) in vitro - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thịnh - Lớp: C12SH01 Khoa: Khoa học tự nhiên Năm thứ: 3/3 - Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thanh Thuận Mục tiêu đề tài: Xác định điều kiện khử trùng mẫu tìm mơi trường thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro Tính sáng tạo: - Đây đối tượng nghiên cứu mới, chưa thử nghiệm ở Việt Nam Kết nghiên cứu: - Xác định nồng độ chất khử trùng thời gian tối ưu cho khử trùng mẫu từ củ Trân châu xanh - Xác định môi trường thích hợp cho tạo chời nhân nhanh của chời đỉnh đoạn thân Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: - Kết quả của đề tài khởi đầu cho nghiên cứu tiếp theo để nhân giống vô tính đối tượng này, góp phần tạo nguồn dược liệu chất lượng, dồi dào, ổn định phục vụ công tác điều trị bệnh, đồng thời góp phần bảo tồn một loài thực vật quí hiếm - Góp phần thúc đẩy hoạt động nghiên cứu khoa học, phục vụ công tác giáo dục đào tạo, nâng cao uy tín, vị thế của nhà trường Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) Nguyễn Thị Thịnh iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt BAP DNA Ý nghĩa Benzyl amino purine Deoxyribonucleotide acid GA Gibberellin IAA β – indolacetic acid INRA Institut National de la Recherche Agronomique MS Murashige & Skoog NAA 1-Naphthaleneacetic acid WPM Woody plant medium Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài (phần người hướng dẫn ghi): Đề tài đã xác định chất khử trùng, nồng độ thời gian khử trùng thích hợp đới tượng Trân châu xanh Đồng thời xác định điều kiện môi trường, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng cũng hàm lượng nước dừa bở sung thích hợp cho nảy chồi chồi đỉnh đoạn thân Đây những kết quả bước đầu đáng khích lệ việc nghiên cứu xây dựng qui trình vi nhân giớng đới tượng, phục vụ cơng tác bảo tồn lồi tạo nguồn dược liệu ổn định Kết quả đề tài đã đóng góp thêm những hiểu biết kỹ thuật nuôi cấy mô, có ý nghĩa nghiên cứu khoa học cũng ứng dụng thực tế Đề tài đã hoàn thành đúng mục tiêu đề Tuy nhiên, thời gian nghiên cứu ngắn nên điều kiện thử nghiệm còn hạn chế Kiến nghị tác giả: - Tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến tạo chồi in vitro - Khảo sát thêm yếu tố môi trường dinh dưỡng như: nồng độ khoáng, nồng độ đường, ánh sáng, nhiệt độ để tìm điều kiện tới ưu cho phát triển chồi in vitro Xác nhận lãnh đạo khoa (ký, họ tên) Ngày tháng năm Người hướng dẫn (ký, họ tên) iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Thành phần môi trường MS ( Murashige & Skoog, 1962 ) .29 Bảng 2.2 Thành phần môi trường WPM (Woody plant medium) 30 Bảng 3.1 Tỉ lệ (%) mẫu vô trùng nảy mầm sau tuần nuôi cấy 34 Bảng 3.2 Sự thành lập cụm chồi từ chồi đỉnh in vitro 37 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP kết hợp với nước dừa lên khả tạo cụm chồi chồi đỉnh 37 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP kết hợp với nước dừa lên khả tạo cụm chồi từ đoạn thân 39 Bảng 3.5 Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA lên khả tạo cụm chồi từ chồi đỉnh 41 Bảng 3.6 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng, aga, than hoạt tính, nước dừa lên khả tạo chồi đỉnh .43 UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN: Ảnh 4x6 Họ tên: Nguyễn Thị Thịnh Sinh ngày: 10 tháng 10 năm 1992 Nơi sinh: Sơn Mỹ - Hàm Tân – Bình Thuận Lớp: C12SH01 Khóa: 2012 - 2015 Khoa: Khoa học tự nhiên Địa chỉ liên hệ: Đường Huỳnh Văn Lũy, P Phú Lợi, TP TDM, Bình Dương Điện thoại: 0962842432 Email: Nguyenthithinh1010@gmail.com II QUÁ TRÌNH HỌC * Năm thứ 1: Ngành học: Sư phạm sinh học Khoa: Khoa học tự nhiên Kết quả xếp loại học tập: Trung bình Sơ lược thành tích: * Năm thứ 2: Ngành học: Sư phạm sinh học Khoa: Khoa học tự nhiên Kết quả xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: Xác nhận lãnh đạo khoa (ký, họ tên) Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) v Chương 1.DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Chồi in vitro từ củ Trân châu xanh .35 Hình 3.2 Chồi in vitro hình thành sau tuần nuôi cấy môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP .37 Hình 3.3 Chồi in vitro hình thành từ chồi đỉnh sau tuần ni cấy môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP 15% nước dừa 39 Hình 3.4 Chồi in vitro hình thành từ đoạn thân sau tuần nuôi cấy môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP 15% nước dừa 41 Hình 3.5 Chồi in vitro từ đoạn thân sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung BAP kết hợp với NAA .42 Hình 3.6 Chồi in vitro từ chồi đỉnh sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung than hoạt tính pepton .43 35 Đối với bảng Bảng 3.1, Ca(OCl)2 cho hiệu khử trùng tốt nhất, tỉ lệ % mẫu vô trùng thấp HgCl2 tỉ lệ mẫu vô trùng nảy chồi cao nhiều (6.67% tổng số) Điều giải thích củ Trân châu xanh có lớp vỏ mỏng bọc ngoài, gặp chất khử trùng mạnh hoặc nồng độ cao, thời gian dài làm khả vơ trùng tăng Nhưng chất lại làm tổn thương phôi, mô củ nên tỉ lệ nghịch với khả nảy chồi Thời gian khử trùng thích hợp 30 phút chất khử trùng (CaOCl)2 Hình KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.1 Chồi in vitro từ củ Trân châu xanh 9.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng BAP đến khả tạo cụm chồi mẫu Cây in vitro tạo thành từ củ làm nguyên liệu cho thí nghiệm Kết nuôi cấy chồi đỉnh sau tuần môi trường WPM có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng BAP trình bày Bảng 3.2 36 Bảng KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.4 Sự thành lập cụm chồi từ chồi đỉnh in vitro BAP (mg/l) Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi (cm) 1,0 c ± 0,11 1,84 c ± 0,02 0,5 3,67 a ± 0,13 2,23 b ± 0,03 1,0 1,93 b ± 0,09 2,62 a ± 0,05 Qua q trình nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy có tạo chồi hầu hết mơi trường, nhiên nồng độ chất điều hịa sinh trưởng khác cho kết tạo cụm chồi mẫu khác Ở môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, mẫu chồi đỉnh có kéo dài chồi, mơi trường chiều cao chồi 1,84 cm Nhìn chung mơi trường bổ sung BAP 0,5 mg/l cho kết tạo cụm chồi tốt với số chồi trung bình 3,67 Chồi phát triển tốt Sau tuần nuôi cấy mẫu bắt đầu có tượng tạo chồi Chồi có màu hồng nhạt xen kẻ màu xanh nhạt Chồi nhanh chóng phát triển chiều cao trung bình đạt 2,23 cm Có tượng đáng lưu ý sau khoảng tuần ni cấy chồi khơng có tượng hướng lên mà có xu hướng đâm xuống mơi trường dinh dưỡng Khi đâm vào môi trường dinh dưỡng chồi có màu sáng trắng Điều giải thích tượng khơng cung cấp đủ chất đinh dưỡng rễ không tạo thành Ở môi trường bổ sung 1,0 mg/l BAP, mẫu chồi đỉnh cho số chồi trung bình, chiều cao chồi thấp so với 0,5 mg/l BAP Chồi sau tuần tạo thành Chồi phát triển khỏe mạnh Nghiên cứu Latha P G (1999) cũng cho thấy số chồi tạo 3,1 ± 0,83 sau tuần nuôi cấy môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BA g/l agar Những chồi tạo rễ môi trường bổ sung 0,5 mg/l NAA [10] Chow H T (1986) thành công việc nhân giống từ thân củ môi trường MS (Murashige and Skoog medium) bổ sung BA (2,5 mg/l), NAA (0,4 mg/l), peptone (1,5 mg/l), than hoạt tính (1,5 mg/l), sucrose (30 g/l) agar (10 g/l) 37 25 oC, 16 h chiếu sáng Ngồi ra, củ cũng nhân giống dạng dinh dưỡng hỗn hợp Hyponex số (3 g/l), sucrose (30 g/l), (1,5 mg/l), peptone (1,5 g/l), NAA (5 mg/l) agar (10 g/l) [7] Hình KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.2 Chồi in vitro hình thành sau tuần nuôi cấy môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP 9.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng BAP kết hợp với nước dừa lên khả tạo cụm chồi từ chồi đỉnh Chồi đỉnh nảy mầm từ thí nghiệm cắt khúc cm, cấy lên môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp với nước dừa với thể tích từ - 20% Sau - tuần nuôi cấy, mẫu bắt đầu cảm ứng dài Một số mẫu có tượng tạo chồi Kết sau tuần ni cấy trình bày bảng 3.3 Bảng KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.5 Ảnh hưởng BAP kết hợp với nước dừa lên khả tạo cụm chồi chồi đỉnh BAP (mg/l) Nước dừa (% V) Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi (cm) 0,5 3,67 d ± 0,13 2,23 a ± 0,03 0,5 10 5,96ab ± 0,18 0,59bc ± 0,16 0,5 15 6,33a ± 0,12 0,84 b ± 0,19 38 0,5 20 5,17c ± 0,62 0,62bc ± 0,08 Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với P< 0,05 Từ kết bảng 3.3, chúng tơi nhận thấy tất mơi trường có khả tạo cụm chồi Chồi phát triển khỏe mạnh Tuy nhiên, mơi trường có bổ sung nước dừa chồi phát triển khỏe mạnh hơn, chồi hình thành sớm so với môi trường không bổ sung nước dừa Ở môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp 15% nước dừa cho kết tốt Số chồi trung bình cao đạt 6,33 chồi/mẫu Chiều cao trung bình 0,84 cm Sau tuần ni cấy thấy khác biệt Chồi to khỏe, số mẫu sau thời gian kéo dài (3 tuần) có tượng thắt ngọn, từ hình thành cụm chồi Nước dừa kích thích chồi phát triển mạnh thân nước dừa chứa vitamin, acid amin, đường cần thiết cho Trân châu xanh phát triển Bên cạnh đó, số chồi to khỏe không tạo chồi mà kéo dài có tượng tạo Lá to, có màu xanh phát triển sau tuần ni cấy Mơi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP bổ sung nước dừa với tỉ lệ thể tích 10%, 20% cho kết tốt với số lượng chồi cao, chồi khỏe mạnh Các tượng tương tự môi trường WPM chứa 0,5 mg/l BAP bổ sung nước dừa với tỉ lệ thể tích 15% Từ đó, chúng tơi rút kết luận BAP kích thích tạo cụm chồi, nước dừa kích thích chồi phát triển nhanh khỏe Khi chồi cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết số lượng chồi cũng tăng lên 39 Hình KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.3 Chồi in vitro hình thành từ chồi đỉnh sau tuần nuôi cấy môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP 15% nước dừa 9.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng BAP kết hợp với nước dừa lên khả tạo cụm chồi từ đoạn thân Đoạn thân nảy mầm từ thí nghiệm cắt khúc cm, cấy lên môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp với nước dừa với thể tích từ - 20% Sau - tuần nuôi cấy, mẫu bắt đầu cảm ứng dài Một số mẫu có tượng tạo chồi Kết sau tuần ni cấy trình bày bảng 3.4 Bảng KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.6 Ảnh hưởng BAP kết hợp với nước dừa lên khả tạo cụm chồi từ đoạn thân BAP (mg/l) Nước dừa (% V) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) 0,5 1,67 c ± 0,13 0,23 cd ± 0,03 0,5 10 2,81b ± 0,18 0,38ab ± 0,16 0,5 15 4,53a ± 0,12 0,46a ± 0,19 0,5 20 3,02b ± 0,62 0,32bc ± 0,08 40 Từ kết bảng 3.4, nhận thấy tất mơi trường có khả tạo cụm chồi Chồi phát triển khẻ mạnh Tuy nhiên mơi trường có bổ sung nước dừa chồi phát triển khỏe mạnh hơn, chồi hình thành sớm so với môi trường không bổ sung nước dừa Ở môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp 15% nước dừa cho kết tốt Số chồi trung bình cao đạt 4,53 chồi/mẫu Chiều cao trung bình 0,46 cm Sau tuần nuôi cấy mẫu nhú chồi Chồi to khỏe Một số mẫu sau thời gian tuần có tượng tạo củ Củ phình to, có màu trắng có tượng tạo chồi từ củ Nước dừa kích thích chồi phát triển mạnh thân nước dừa chứa vitamin, acid amin, đường cần thiết cho đoạn thân Trân châu xanh phát triển Môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP bổ sung nước dừa với tỉ lệ thể tích 10%, 20% cho kết tốt với số lượng chồi cao, chồi khỏe mạnh Các tượng tương tự môi trường WPM chứa 0,5 mg/l BAP bổ sung nước dừa với tỉ lệ thể tích 15% Từ đó, chúng tơi rút kết luận BAP kích thích tạo cụm chồi từ đoạn thân, nước dừa kích thích chồi phát triển nhanh, khỏe tạo củ Khơng có tượng tạo rễ Nguyễn Văn Song (2010) với đề tài “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum)” lồi lan có nguy tuyệt chủng, Tạp chí khoa hoc, Đại học Huế (số 64, trang 127) cũng thấy môi trường tốt cho nảy mầm, phát sinh protocom, nhân nhanh protocom, phát sinh chồi từ protocom môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng kết hợp với 15% nước dừa Huỳnh Thị Đan San, Võ Thị Bạch Mai (2009) với đề tài “Tìm hiểu phát sinh phôi soma từ mô sẹo hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb in vitro”, Tạp chí phát triển KH CN (tập 12, số 17) cũng khẳng định nước dừa 10% bổ sung vào môi trường MS cho kết tốt cho phát sinh phôi soma 41 Hình KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.4 Chồi in vitro hình thành từ đoạn thân sau tuần ni cấy môi trường WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP 15% nước dừa 9.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA lên khả tạo cụm chồi từ chồi đỉnh Đoạn thân chồi nảy mầm từ thí nghiệm cắt khúc cm, cấy lên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp với NAA Sau - tuần nuôi cấy, mẫu bắt đầu cảm ứng dài Một số mẫu có tượng tạo chồi Kết sau tuần ni cấy trình bày bảng 3.5 Bảng KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.7 Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA lên khả tạo cụm chồi từ chồi đỉnh BAP (mg/l) NAA (mg/l) Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi (cm) 0,5 1,67 c ± 0,13 0,23 cd ± 0,05 0,5 0,5 2,25b ± 0,11 0,40ab ± 0,05 0,5 1,0 3,27a ± 0,25 0,53a ± 0,09 0,5 1,5 2,14b ± 0,34 0,22bc ± 0,07 42 Từ kết bảng 3.5, nhận thấy tất mơi trường có khả tạo cụm chồi Chồi phát triển khẻ mạnh Tuy nhiên mơi trường có bổ sung NAA chồi có kích thước hơn, chồi hình thành sớm so với môi trường không bổ sung NAA Ở môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp 1,0 mg/l NAA cho kết tốt Số chồi trung bình cao đạt 3,27 chồi/mẫu Chiều cao trung bình 0,53 cm Sau tuần nuôi cấy mẫu nhú chồi Chồi to khỏe Từ đó, chúng tơi rút kết luận BAP kết hợp NAA kích thích tạo cụm chồi từ đoạn thân, kích thích chồi phát triển nhanh, khỏe mạnh Khơng có tượng tạo rễ Hình KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.5 Chồi in vitro từ đoạn thân sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung BAP kết hợp với NAA 9.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng, agar, than hoạt tính lên khả tạo chồi đỉnh Đoạn thân nảy mầm từ thí nghiệm cắt khúc cm, cấy lên môi trường khác Kết sau tuần ni cấy trình bày bảng 3.6 43 Bảng KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.8 Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng, agar, than hoạt tính, nước dừa lên khả tạo chồi đỉnh Môi trường Số chồi/mẫu Chiều cao Khả chồi tạo WPM + 0,5g/l BAP+15% nước 2,33 b ± 0,10 0,79 a ± 0,03 - dừa + 4g/l agar MS + 1,5 g/l pepton +1,5 g/l 2.54 a ± 0,12 0.43 b ± 0,05 - 1,48 c ± 0,11 0.32 c ± 0,01 - than hoạt tính +10 % nước dừa MS + 1g/l than hoạt tính +10 % nước dừa Từ kết bảng 3.6, nhận thấy tất mơi trường có khả tạo cụm chồi hệ số nhân chồi thấp Chồi phát triển khỏe mạnh sau tuần đỉnh chồi phình to bắt đầu tạo chồi Đặc biệt môi trường bổ sung than hoạt tính, có lơng tơ xuất với số lượng nhiều, chồi phát triển thời gian đâm xuống môi trường kể chồi hình thành Tuy nhiên tất mơi trường chưa thấy xuất Hình KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM.6 Chồi in vitro từ chồi đỉnh sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung than hoạt tính pepton 44 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận: Trên sở kết qủa nghiên cứu thu được, rút số kết luận sau: - Nồng độ chất khử trùng thời gian tối ưu cho khử trùng mẫu từ củ Trân châu xanh Ca(OCl)2 nồng độ 10%, 30 phút Tỉ lệ mẫu vô trùng 6.67%, tỉ lệ mẫu tạo chồi 6.67% - Trong môi trường bổ sung BAP, mơi trường có bổ sung 0,5 mg/l BAP môi trường tối ưu cho việc tạo cụm chồi in vitro từ chồi đỉnh nảy mầm từ củ in vitro, với số chồi trung bình/mẫu 3,67 chồi/mẫu, chiều cao chồi trung bình 2,23 cm - Trong mơi trường ni cấy chồi đỉnh có bổ sung BAP kết hợp với nước dừa, môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp 15% nước dừa cho khả tạo cụm chồi in vitro tốt với số chồi trung bình 6,33 chồi/mẫu Chiều cao trung bình 0,84 cm - Trong mơi trường ni cấy đoạn thân có bổ sung BAP kết hợp với nước dừa, môi trường bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp 15% nước dừa cho khả tạo cụm chồi in vitro tốt với số chồi trung bình 4,53 chồi/mẫu Chiều cao trung bình 0,46 cm - Trong môi trường bổ sung BAP kết hợp với NAA, môi trường bổ sung 0,5 BAP kết hợp 1,0, mg/l NAA cho kết tốt với hệ số nhân chồi đạt 3,27 chồi/mẫu, chiều cao trung bình 0,53 cm - Các mơi trường có thay đổi agar, bổ sung pepton, than hoạt tính hệ số nhân chồi thấp, chưa thấy xuất Khuyến nghị: Cây Trân châu xanh lồi q hiếm, có nguy tuyệt chủng tự nhiên cao tương lai khơng xa Là lồi nằm sách đỏ Việt Nam cũng lồi có giá trị dược liệu cao, sinh sản ít, thời gian sinh sản theo mùa năm từ củ thường cho Để bảo vệ nhân nhanh loài khuyến nghị: 45 - Tiếp tục nghiên cứu mơi trường khác để hình thành hồn chỉnh - Tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình đưa đất in vitro 46 47 Chương 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Võ Văn Chi (2013), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học [2] Dương Mộng Hùng (2005), "Nhân giống lan tai trâu phương pháp ni cấy ống nghiệm", Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn 3, Tr.126127 [3] Phí Thị Cẩm Miện (2012), Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan kim tuyến (anoectochilus setaceusblume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý, luận văn thạc sĩ khoa học trường Đại học khoa học tự nhiên, Hà Nội [4] Dương Tấn Nhựt Đỗ Thị Tâm (1996), "Nhân giống vơ tính số giống địa lan Cymbidium đỉnh sinh trưởng", Tạp chí Sinh học 18(1), Tr.40-42 [5] Nguyễn Thị Xuân Thùy, (2013), Nghiên cứu điều kiện khử trùng cảm ứng tạo chồi để nhân giống vơ tính Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich), Nghiên cứu khoa học sinh viên 2013 - 2014 [6] Lê Ngọc Tú, Đỗ Ngọc Liên, Đặng Thị Thu (2002), Tế bào trình sinh học, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [7] Mai Văn Phơ Nguyễn Hồng Lộc (1995), "Nuôi cấy mô lan nghing xuân", TT Khoa học công nghệ Thừa Thiên-Huế, Tr.65-67 [8] Nguyễn Đức Lượng Nguyễn Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, Nxb Y học, Hà Nội [9] Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội [10] Nguyễn Hồng Lộc (1998), "Công nghệ gen thực vật bậc cao", Tạp chí Sinh học 20(2), Tr.4-11 [11] Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Lê Văn Vi, cs (2008), "Xây dựng quy trình kỹ thuật ni trồng địa lan Cymbidium spp cấy mô", TC Nông nghiệp phát triển nông thôn, Tr.18-22 [12] Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, Nxb Nơng Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh 48 [13] Phan Xuân Huyên, Nguyễn Trung Ái, Nguyễn Thị Lang, cs (2004), "Phục tráng nhân nhanh giống địa lan Cymbidium ni cấy đỉnh sinh trưởng", Tạp chí Sinh học 26(1), Tr.48-54 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI [14] Arditti Joseph (2008), Micropropagation of orchids, Blackwell Pub., Malden, MA ; Oxford [15] Chen Jenn-Yih Mau-Shing Yeh (2002), "In Vitro Propagation of Nervilia purpurea (Hay.) Schetr And N aragoana Gaud", Journal Of Agriculture and Forestry, National Chung Hsing University College of Agriculture 51(2), Tr.2132 [16] Chow H T (1986), "In vitro propagation of Nervilia aragoana Gaud.", Journal of the College of Science and Engineering, National Chung Hsing University 23, Tr.47-58 [17] Du Q., W L Chen, Z H Wang (2005), "Study on tissue culture and plant regeneration of Nervilia fordii", China journal of Chinese materia medica 30(11), Tr.812-814 [18] EK Dilipkumar GR Janardhana (2013), “Antidiabetic and regenerative effects of alcoholic com extract of Nervilia aragoana gaud in streptozotocinnicotincimide induced NIDDM rats”, International Journal of Phytomedicine., Tr.207-210 [19] Elizabeth Thomas, Aneesh, Della Grace Thomas R.Anandan (2013), “GC-MS Analysis of phytochemical compounds present in the rhizomes of Nervilia”, Asian journal of Pharmaceutical and clinical research Vol 6, Suppl , Tr.6874 [20] He Fuchang, He Dingquan, Chen Xinghua (1990), "In vitro culture of Nervilia fordii", Chinese Journal of Tropical Crops 11(1), Tr.97-101 [21] Latha P G (1999), "In vitro culture of the regionally endangered medicinal orchid, Nervilia aragoana Gaud.", J Orchid Soc India 13, Tr.59–64 [22] Li Bin (2008), "Tissue Culture of Nervilia fordii(Hance)Schltr Corm", Journal of Anhui Agricultural Sciences (35), Tr.15358-15359 49 [23] M Atique Akbar Shyamal Roy K (2006), "Effects of liquid medium on rooting and acclimation of regenerated micro shoots of banana (Musa sapientum L.) cv Sagar", Plant Tissue Culture & Biotech 16(1), Tr.11-18 [24] Reddy K Himakar, P.V.G.K Sharma, O.V.S Reddy (2010), "A comparative in vitro study on antifungal and antioxidant activities of Nervilia aragoana and Atlantia monophylla", Pharmaceutical Biology 48(5), Tr.595-602 [25] ShouLing Li, Bai YanBing, Gao Yan, cs (2009), "Propagation technique for Nervilia fordii corm tissue culture.", Guangxi Agricultural Sciences 40(7), Tr 810-812 [26] Tripathi L, and Tripathi JN (2003), “Role of biotechnology in medicinal plants”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2( 2): 243-253 [27] T Rober N Dennis J G (2000), Plant Tisue Culture Concept and Laboratory Exercises, CRC Press, New York