Nghiên cứu điều kiện khử trùng và cảm ứng tạo chồi để nhân giống vô tính cây trân châu xanh (nervilia aragoanagaudich)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 XÉT GIẢI THƢỞNG "TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT" NĂM 2014 Nghiên cứu điều kiện khử trùng cảm ứng tạo chồi để nhân giống vơ tính Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học Tự nhiên TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 XÉT GIẢI THƢỞNG "TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT" NĂM 2014 Nghiên cứu điều kiện khử trùng cảm ứng tạo chồi để nhân giống vơ tính Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học Tự nhiên Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Xuân Thùy Nam, Nữ: Huỳnh Ngọc Anh Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: C11SH02, Khoa Khoa học Tự nhiên Năm thứ: /Số năm đào tạo: Ngành học: Cao đẳng Sƣ phạm Sinh học Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Nguyễn Thanh Thuận UBND TỈNH BÌNH DƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện khử trùng cảm ứng tạo chồi để nhân giống vơ tính Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Xuân Thùy Huỳnh Ngọc Anh - Lớp: C11SH02 Khoa: Khoa học Tự nhiên Năm thứ: Số năm đào tạo: - Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Nguyễn Thanh Thuận Mục tiêu đề tài: - Xác định điều kiện khử trùng để thu đƣợc mẫu vô trùng tốt - Xác định điều kiện tối ƣu cho tạo chồi điều kiện in vitro Tính sáng tạo: - ây đối tƣợng nghiên cứu mới, chƣa đƣợc thử nghiệm Việt Nam Kết nghiên cứu: - Xác định đƣợc nồng độ chất khử trùng thời gian tối ƣu cho khử trùng mẫu t củ Trân châu xanh - Xác định đƣợc môi trƣờng th ch hợp cho tạo chồi chồi đỉnh đoạn thân Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: - K t đề tài kh i đ u cho nghiên cứu ti p theo để nhân giống vơ t nh đối tƣợng này, góp ph n tạo nguồn dƣợc iệu chất ƣợng, dồi dào, n định ph c v công tác điều trị ệnh, đồng thời góp ph n ảo tồn ồi thực vật qu hi m - Góp ph n th c đ y hoạt động nghiên cứu khoa học, ph c v công tác giáo d c đào tạo, nâng cao uy t n, vị th nhà trƣờng Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài Nguyễn Thị Xuân Thùy Nhận xét ngƣời hƣớng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài ề tài đ ác định đƣợc chất khử trùng, nồng độ thời gian khử trùng th ch hợp đối tƣợng Trân châu anh ồng thời ác định đƣợc điều kiện môi trƣờng, nồng độ chất điều h a sinh trƣ ng c ng nhƣ hàm ƣợng nƣớc d a sung th ch hợp cho nảy chồi chồi đỉnh đoạn thân ây k t ƣớc đ u đáng th ch ệ việc nghiên cứu ây dựng qui tr nh vi nhân giống đối tƣợng, ph c v cơng tác ảo tồn ồi tạo nguồn dƣợc iệu n định K t đề tài đ đóng góp thêm hiểu i t k thuật ni cấy mơ, có ngh a nghiên cứu khoa học c ng nhƣ ứng d ng thực t ề tài đ hoàn thành đ ng m c tiêu đề Tuy nhiên, thời gian nghiên cứu ng n nên điều kiện thử nghiệm c n hạn ch Ki n nghị tác giả: - Ti p t c nghiên cứu khả khử trùng chất ên ph n khác nhƣ cuống á, để t m hiệu khử trùng tốt - Ti p t c khảo sát y u tố ảnh hƣ ng đ n tạo rễ chồi in vitro - Khảo sát thêm y u tố môi trƣờng dinh dƣỡng nhƣ: nồng độ khoáng, nồng độ đƣờng, ánh sáng, nhiệt độ để t m điều kiện tối ƣu cho phát triển chồi in vitro Xác nhận lãnh đạo khoa Ngày tháng năm Ngƣời hƣớng dẫn UBND TỈNH BÌNH DƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƢỢC VỀ SINH VIÊN: Ảnh 4x6 Họ tên: Nguyễn Thị Xuân Thùy Sinh ngày: 08 tháng 04 năm 1993 Nơi sinh: Tịnh Hiệp – Sơn Tịnh – Quảng Ng i Lớp: C11SH02 Khóa: 2011-2014 Khoa: Khoa học Tự nhiên ịa iên hệ: 5/2/11 KP2, P Ph H a, Tp Thủ D u Một, tỉnh B nh Dƣơng iện thoại: 0986 893 511 Email: nguyenxthuy93@gnail.com II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP * Năm thứ 1: Ngành học: Sƣ phạm Sinh học K t Khoa: Khoa học tự nhiên p oại học tập: X p oại Sơ ƣợc thành t ch: * Năm thứ 2: Ngành học: Sƣ Phạm Sinh học K t Khoa: Khoa học tự nhiên p oại học tập: X p oại Sơ ƣợc thành t ch: Xác nhận lãnh đạo khoa Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA H C T NHI N CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ộc ập - Tự - Hạnh ph c B nh Dƣơng, ngày Kính gửi: tháng năm Ban tổ chức Giải thƣởng “Tài khoa học trẻ Đại học Thủ Dầu Một” Chúng là: Nguyễn Thị Xuân Thùy Huỳnh Ngọc Anh Sinh ngày tháng 04 năm 1993 Sinh ngày 15 tháng 08 năm 1993 Sinh viên năm thứ: T ng số năm đào tạo: Lớp, khoa : C11SH02 Khoa : Khoa học tự nhiên Ngành học: Cao đẳng sƣ pham sinh học Thông tin cá nhân sinh viên chịu trách nhiệm chính: ịa iên hệ : Tịnh Hiệp – Sơn Tịnh – Quảng Ng i Số điện thoại : 0986 893 511 ịa emai : nguyen thuy93@gmai com àm đơn k nh đề nghị Ban t chức cho đƣợc gửi đề tài nghiên cứu khoa học để tham gia ét Giải thƣ ng “Tài khoa học trẻ ại học Thủ D u Một” năm 2014 Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện khử trùng cảm ứng tạo chồi để nhân giống vơ tính Trân châu xanh (Nervilia aragoana Gaudich) Chúng xin cam đoan đề tài ch ng thực dƣới hƣớng dẫn ThS Nguyễn Thanh Thuận; đề tài chƣa đƣợc trao giải thƣởng khác thời điểm nộp hồ sơ luận văn, đồ án tốt nghiệp N u sai, ch ng xin chịu trách nhiệm trƣớc khoa Nhà trƣờng Xác nhận lãnh đạo khoa Ngƣời làm đơn DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI STT Họ tên MSSV Lớp Khoa Nguyễn Thị Xuân Thùy 111C840072 C11SH02 KHTN Huỳnh Ngọc Anh 111C840002 C11SH02 KHTN i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT iii DANG MỤC BẢNG BIỂU .iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU 1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài Lý lựa chọn đề tài Mục tiêu đề tài Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu tài liệu 4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu phịng thí nghiệm 4.2.1 Điều kiện môi trƣờng nuôi cấy 4.2.2 Nghiên cứu khả khử trùng mẫu 4.2.3 Nghiên cứu khả tạo cụm chồi điều kiện in vitro Phƣơng pháp xử lý thống kê số liệu 4.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 5.1 Đối tƣợng nghiên cứu 5.2 Phạm vi nghiên cứu Chƣơng CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1.1 Lƣợc sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Những ƣu điểm hạn chế công nghệ nhân giống vơ tính in vitro 12 1.1.2 Ƣu điểm nhân giống vơ tính in vitro 12 1.1.3 Hạn chế nhân giống vơ tính in vitro 13 1.2 Ứng dụng nhân giống vơ tính in vitro số dƣợc liệu 13 Chƣơng QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 15 Chƣơng KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 16 3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu 16 3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng BAP đến khả tạo cụm chồi mẫu 17 3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng BAP kết hợp với nƣớc dừa lên khả tạo cụm chồi từ chồi đỉnh 18 ii 3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng BAP kết hợp với nƣớc dừa lên khả tạo cụm chồi từ chồi nách 21 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 14 Sau gần năm nghiên cứu, Dƣơng Tấn Nhựt, Phó viện trƣởng Viện Sinh học Tây Nguyên (Đà Lạt, Lâm Đồng) thành công việc nhân giống sâm Ngọc Linh phƣơng pháp phát sinh phơi vơ tính Từ mơ tế bào lá, thân, củ, rể đƣợc nuôi cấy sau đem cấy phịng thí nghiệm thời gian – tháng cho cao khoảng 10cm Lúc đem mơi trƣờng tự nhiên để trồng M i phôi nuôi cấy tạo đƣợc nhiều Không tạo giống sâm từ kỹ thuật phát sinh phơi vơ tính, Dƣơng Tấn Nhựt tạo dƣợc liệu từ sâm, mà không cần phải lấy từ củ sau nhiều năm trồng Tuy nhiên, cần nhiều thời gian để kiểm chứng khả tác dụng sâm nhân giống phƣơng pháp với sâm có nguồn gốc tự nhiên [15] Kỹ thuật nhân giống in vitro Đại học Huế c ng giúp bảo tồn tạo nhiều dƣợc liệu Điển hình qua lâu - lồi dƣợc liệu q chứa nhiều hợp chất hóa học có giá trị nhƣ loại protein kháng virus Mẫu qua lâu để nhân giống đƣợc lấy từ Vƣờn Quốc gia Bạch Mã khử trùng, sau đƣa vào mơi trƣờng ni cấy Sau tuần nuôi cấy, tỷ lệ nảy chồi tới 88% Cây giống qua lâu đƣợc trồng phổ biến đất thịt, cát cho tỷ lệ sống suất cao Ngoài ra, kỹ thuật nhân giống in vitro cịn thành cơng với dƣợc liệu khác nhƣ nha đam (lô hội) cho tỷ lệ sống đến 75%; đ c biệt sử dụng kỹ thuật nhân giống in vitro để tái sinh chồi cụm chồi ni cấy hà thủ đỏ [16] Ngồi ra, việc ứng dụng kỹ thuật cịn góp phần chuẩn hóa nguồn giống nguyên liệu làm giống dƣợc liệu, đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn GAP (Good Agriculture Practices): Đúng giống trồng (danh pháp, giống trồng trọt), chất lƣợng giống đƣợc đảm bảo theo tiêu chuẩn ngành (có xuất xứ, nơi sản xuất, tiêu chuẩn đạt yêu cầu) Tự sản xuất giống có hồ sơ đầy đủ trình sản xuất đánh giá giống theo tiêu chuẩn ngành Quản lý kiểm soát đƣợc nguồn bệnh trình sản xuất, lƣu trữ lƣu thông giống [7] Trong bối cảnh ngành Dƣợc xây dựng tiêu chuẩn GMP (Good Manufacturing Practices) cho nhà máy sản xuất dƣợc phẩm vấn đề tiêu chuẩn hóa nguyên liệu thuốc đ c biệt dƣợc liệu trở nên cấp bách hết Những thành tựu nhƣ mở hƣớng đầy hứa hẹn tƣơng lai, góp phần giải vấn đề thiết việc tạo nguồn dƣợc liệu, bảo tồn thiên nhiên, c ng nhƣ thúc đẩy phát triển kinh tế xã hội 15 Chƣơng QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM Quy trình thí nghiệm đƣợc chúng tơi trình bày tóm tắt sơ đồ sau: Khử trùng mẫu (củ) Chồi in vitro Môi trƣờng WPM + BAP Môi trƣờng Môi trƣờng WPM + BAP + WPM + BAP + NƢỚC DỪA NƢỚC DỪA (Chồi đỉnh) (Chồi nách) Tạo cụm chồi in vitro Xử lý thống kê số liệu 16 Chƣơng KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu 3.1 Sau tuần, số mẫu từ củ vô trùng nảy chồi, kết khử trùng đƣợc trình bày Bảng 3.1 Nhìn chung với chất khử trùng khác cho hiệu khử trùng khác Nƣớc Javen HgCl2 cho tỉ lệ mẫu vô trùng tốt, nhƣng hai chất chất khử trùng mạnh nên tỉ lệ mẫu nảy chồi thấp Đối với bảng Bảng 3.1, Ca(OCl)2 cho hiệu khử trùng tốt nhất, tỉ lệ % mẫu vô trùng thấp HgCl2 nhƣng tỉ lệ mẫu vô trùng nảy chồi cao nhiều (4% tổng số) Điều đƣợc giải thích củ Trân châu xanh có lớp vỏ mỏng bọc ngồi, g p chất khử trùng mạnh ho c nồng độ cao, thời gian dài làm khả vô trùng tăng Nhƣng chất lại làm tổn thƣơng phơi, mơ củ nên tỉ lệ nghịch với khả nảy chồi Đối với chất nồng độ pha loãng, khả khử trùng tăng tăng thời gian khử trùng Điều thấy rõ (Bảng 3.1) Theo Latha P G (1999), điều kiện khử trùng thích hợp ngâm mẫu thuốc tẩy Teepol 1% (v/v) 10 phút, chuyển sang ethanol 70 o 30 giây Sau khử trùng HgCl2 0,1% phút, rửa nƣớc cất lần [18] Bảng 3.1 Tỉ lệ (%) mẫu đƣợc vô trùng nảy chồi sau tuần nuôi cấy Nƣớc Javen (1:3; Ca(OCl)2 (10%, 10 HgCl2 (0.1%, 10 HgCl2 (0.1%, 15 phút) phút) phút) phút) % % % mẫu mẫu mẫu mẫu nhiễm sống tạo % % % mẫu mẫu mẫu nhiễm sống tạo chồi Củ 75 25 % % % mẫu mẫu mẫu nhiễm sống tạo chồi 85 15 % % % mẫu mẫu nhiễm sống tạo chồi 95 chồi 13 87 17 Hình 3.1 Cây chồi in vitro từ củ Trân châu xanh 3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng BAP đến khả tạo cụm chồi mẫu Cây in vitro đƣợc tạo thành từ củ làm nguyên liệu cho thí nghiệm Kết nuôi cấy chồi đỉnh sau tuần mơi trƣờng WPM có bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng BAP đƣợc trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Sự thành lập cụm chồi từ chồi đỉnh in vitro BAP (mg/l) Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi (cm) 1,0 c ± 0,11 1,84 c ± 0,02 0,5 3,67 a ± 0,13 2,23 b ± 0,03 1,0 1,93 b ± 0,09 2,62 a ± 0,05 Qua q trình nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy có tạo chồi hầu hết môi trƣờng, nhiên nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng khác cho kết tạo cụm chồi mẫu khác Ở môi trƣờng không bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng, mẫu chồi đỉnh có kéo dài chồi, môi trƣờng chiều cao chồi 1,84 cm Nhìn chung mơi trƣờng bổ sung BAP 0.5 mg/l cho kết tạo cụm chồi tốt với số chồi trung bình 3,67 Chồi phát triển tốt Sau tuần nuôi cấy mẫu bắt đầu có 18 tƣợng tạo chồi Chồi có màu hồng nhạt xen kẻ màu xanh nhạt Chồi nhanh chóng phát triển chiều cao trung bình đạt 2.23 cm Có tƣợng đáng lƣu ý sau khoảng tuần ni cấy chồi khơng có tƣợng hƣớng lên mà có xu hƣớng đâm xuống mơi trƣờng dinh dƣỡng Khi đâm vào môi trƣờng dinh dƣỡng chồi có màu sáng trắng Điều đƣợc giải thích tƣợng không cung cấp đủ chất đinh dƣỡng rễ không đƣợc tạo thành Ở môi trƣờng bổ sung 1,0 mg/l BAP, mẫu chồi đỉnh cho số chồi trung bình, chiều cao chồi thấp so với 0,5 mg/l BAP Chồi sau tuần đƣợc tạo thành Chồi phát triển khỏe mạnh Nghiên cứu Latha P G (1999) c ng cho thấy số chồi tạo từ củ Trân châu xanh 3,1 ± 0,83 sau tuần nuôi cấy môi trƣờng WPM bổ sung 0,5 mg/l BA g/l agar Những chồi tạo rễ môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l NAA [18] Chow H T (1986) thành công việc nhân giống từ thân củ Trân châu xanh môi trƣờng MS (Murashige and Skoog medium) bổ sung BA (2,5 mg/l), NAA (0,4 mg/l), peptone (1,5 mg/l), than hoạt tính (1,5 mg/l), sucrose (30 g/l) agar (10 g/l) 25 oC, 16 h chiếu sáng Ngoài ra, củ c ng đƣợc nhân giống dạng dinh dƣỡng h n hợp Hyponex số (3 g/l), sucrose (30 g/l), (1,5 mg/l), peptone (1,5 g/l), NAA (5 mg/l) agar (10 g/l) [15] 19 Hình 3.2 Chồi in vitro hình thành sau tuần ni cấy môi trƣờng WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP 3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng BAP kết hợp với nước dừa lên khả tạo cụm chồi từ chồi đỉnh Chồi đỉnh củ nảy chồi từ thí nghiệm đƣợc cắt khúc cm, cấy lên môi trƣờng WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp với nƣớc dừa với thể tích từ – 20% Sau - tuần nuôi cấy, mẫu bắt đầu cảm ứng dài Một số mẫu có tƣợng tạo chồi Kết sau tuần ni cấy đƣợc trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng BAP kết hợp với nƣớc dừa lên khả tạo cụm chồi chồi đỉnh BAP (mg/l) Nƣớc dừa (% V) Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi (cm) 0,5 3,67 d ± 0,13 2,23 a ± 0,03 0,5 10 5,96ab ± 0,18 0,59bc ± 0,16 0,5 15 6,33a ± 0,12 0,84 b ± 0,19 0,5 20 5,17c ± 0,62 0,62bc ± 0,08 20 Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với P< 0,05 Từ kết bảng 3.3, nhận thấy tất mơi trƣờng có khả tạo cụm chồi Chồi phát triển khỏe mạnh Tuy nhiên, mơi trƣờng có bổ sung nƣớc dừa chồi phát triển khỏe mạnh hơn, chồi hình thành sớm so với môi trƣờng không bổ sung nƣớc dừa Ở môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp 15% nƣớc dừa cho kết tốt Số chồi trung bình cao đạt 6,33 chồi/mẫu Chiều cao trung bình 0,84 cm Sau tuần nuôi cấy thấy khác biệt Chồi to khỏe, số mẫu sau thời gian kéo dài (3 tuần) có tƣợng thắt ngọn, từ hình thành cụm chồi Nƣớc dừa kích thích chồi phát triển mạnh thân nƣớc dừa chứa vitamin, acid amin, đƣờng cần thiết cho Trân châu xanh phát triển Bên cạnh đó, số chồi to khỏe khơng tạo chồi mà kéo dài có tƣợng tạo Lá to, có màu xanh phát triển sau tuần nuôi cấy Môi trƣờng WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP bổ sung nƣớc dừa với tỉ lệ thể tích 10%, 20% cho kết tốt với số lƣợng chồi cao, chồi khỏe mạnh Các tƣợng tƣơng tự nhƣ môi trƣờng WPM chứa 0.5 mg/l BAP bổ sung nƣớc dừa với tỉ lệ thể tích 15% Từ đó, chúng tơi rút kết luận BAP kích thích tạo cụm chồi, nƣớc dừa kích thích chồi phát triển nhanh khỏe Khi chồi đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng cần thiết số lƣợng chồi c ng tăng lên 21 Hình 3.3 Chồi in vitro hình thành từ chồi đỉnh sau tuần nuôi cấy môi trƣờng WPM bổ sung 0.5 mg/l BAP 15% nƣớc dừa 3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng BAP kết hợp với nước dừa lên khả tạo cụm chồi từ chồi nách Chồi nách củ nảy chồi từ thí nghiệm đƣợc cắt khúc cm, cấy lên môi trƣờng WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp với nƣớc dừa với thể tích từ – 20% Sau - tuần nuôi cấy, mẫu bắt đầu cảm ứng dài Một số mẫu có tƣợng tạo chồi Kết sau tuần ni cấy đƣợc trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng BAP kết hợp với nƣớc dừa lên khả tạo cụm chồi từ chồi nách BAP (mg/l) Nƣớc dừa (% V) Số chồi/ mẫu Chiều cao chồi (cm) 0,5 1,67 c ± 0,13 0,23 cd ± 0,03 0,5 10 2,81b ± 0,18 0,38ab ± 0,16 0,5 15 4,53a ± 0,12 0,46a ± 0,19 0,5 20 3,02b ± 0,62 0,32bc ± 0,08 22 Từ kết bảng 3.4, nhận thấy tất mơi trƣờng có khả tạo cụm chồi Chồi phát triển khẻ mạnh Tuy nhiên mơi trƣờng có bổ sung nƣớc dừa chồi phát triển khỏe mạnh hơn, chồi hình thành sớm so với môi trƣờng không bổ sung nƣớc dừa Ở môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp 15% nƣớc dừa cho kết tốt Số chồi trung bình cao đạt 4,53 chồi/mẫu Chiều cao trung bình 0,46 cm Sau tuần ni cấy mẫu nhú chồi Chồi to khỏe Một số mẫu sau thời gian tuần có tƣợng tạo củ Củ phình to, có màu trắng có tƣợng tạo chồi từ củ Nƣớc dừa kích thích chồi phát triển mạnh thân nƣớc dừa chứa vitamin, acid amin, đƣờng cần thiết cho chồi náchcây Trân châu xanh phát triển.Môi trƣờng WPM bổ sung 0,5 mg/l BAP bổ sung nƣớc dừa với tỉ lệ thể tích 10%, 20% cho kết tốt với số lƣợng chồi cao, chồi khỏe mạnh Các tƣợng tƣơng tự nhƣ môi trƣờng WPM chứa 0,5 mg/l BAP bổ sung nƣớc dừa với tỉ lệ thể tích 15% Từ đó, chúng tơi rút kết luận BAP kích thích tạo cụm chồi từ chồi nách, nƣớc dừa kích thích chồi phát triển nhanh khỏe tạo củ Khơng có tƣợng tạo rễ Nguyễn Văn Song (2010) với đề tài “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum)” lồi lan có nguy tuyệt chủng, Tạp chí khoa hoc, Đại học Huế (số 64, trang 127) c ng thấy môi trƣờng tốt cho nảy mầm, phát sinh protocom, nhân nhanh protocom, phát sinh chồi từ protocom môi trƣờng MS bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng kết hợp với 15% nƣớc dừa Huỳnh Thi Đan San, Võ Thị Bạch Mai (2009) với đề tài “Tìm hiểu phát sinh phôi soma từ mô sẹo hà thủ đỏ Polygonum multiflorum Thunb in vitro”, Tạp chí phát triển KH CN (tập 12, số 17) c ng khẳng định nƣớc dừa 10% bổ sung vào môi trƣờng MS cho kết tốt cho phát sinh phơi soma 23 Hình 3.4 Chồi in vitro hình thành từ chồi nách sau tuần ni cấy môi trƣờng WPM bổ sung 0.5 mg/l BAP 15% nƣớc dừa 24 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận: Trên sở kết nghiên cứu thu đƣợc, rút số kết luận sau: - Nồng độ chất khử trùng thời gian tối ƣu cho khử trùng mẫu từ củ Trân châu xanh Ca(OCl)2 nồng độ 10%, 10 phút Tỉ lệ mẫu vô trùng 15%, tỉ lệ mẫu tạo chồi 4% - Trong môi trƣờng bổ sung BAP, mơi trƣờng có bổ sung 0,5 mg/l BAP môi trƣờng tối ƣu cho việc tạo cụm chồi in vitro từ chồi đỉnh nảy mầm từ củ in vitro, với số chồi trung bình/mẫu 3,67 chồi/mẫu, chiều cao chồi trung bình 2,23 cm - Trong mơi trƣờng ni cấy chồi đỉnh có bổ sung BAP kết hợp với nƣớc dừa, môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp 15% nƣớc dừa cho khả tạo cụm chồi in vitro tốt với số chồi trung bình 6,33 chồi/mẫu Chiều cao trung bình 0,84 cm - Trong mơi trƣờng ni cấy chồi nách có bổ sung BAP kết hợp với nƣớc dừa, môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l BAP kết hợp 15% nƣớc dừa cho khả tạo cụm chồi in vitro tốt với số chồi trung bình 4,53chồi/mẫu Chiều cao trung bình 0,46 cm Khuyến nghị: Cây Trân châu xanh lồi q hiếm, có nguy tuyệt chủng tự nhiên cao tƣơng lai khơng xa Là lồi nằm sách đỏ Việt Nam c ng lồi có giá trị dƣợc liệu cao, sinh sản ít, thời gian sinh sản theo mùa m i năm từ củ thƣờng cho Để bảo vệ nhân nhanh loài khuyến nghị: - Tiếp tục nghiên cứu khả khử trùng chất lên cuống lá, để tìm hiệu khử trùng tốt - Tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến tạo rễ chồi in vitro 25 - Khảo sát yếu tố môi trƣờng dinh dƣỡng nhƣ: nồng độ khoáng, nồng độ đƣờng, ánh sáng, nhiệt độ để tìm điều kiện tối ƣu cho phát triển chồi in vitro - Theo dõi khả phát triển vƣờn ƣơm 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Đái Duy Ban Lê Thanh Hịa (1996), Cơng nghệ sinh học vật nuôi trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội [2] Đ Tất Lợi (2003), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y Học, Hà Nội [3] Dƣơng Mộng Hùng (2005), "Nhân giống lan tai trâu phƣơng pháp nuôi cấy ống nghiệm", T p ch Nông nghiệp phát triển nông thôn 3, Tr.126-127 [4] Dƣơng Tấn Nhựt Đ Thị Tâm (1996), "Nhân giống vơ tính số giống địa lan Cymbidium đỉnh sinh trƣởng", T p ch Sinh học 18(1), Tr.4042 [5] Lê Ngọc Tú, Đ Ngọc Liên, Đ ng Thị Thu (2002), Tế bào trình sinh học, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [6] Mai Văn Phơ Nguyễn Hồng Lộc (1995), "Nuôi cấy mô lan nghing xuân", TT Khoa học công nghệ Thừa Thiên-Huế, Tr.65-67 [7] Nguyễn Đức Lƣợng Nguyễn Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, Nxb Y học, Hà Nội [8] Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội [9] Nguyễn Hồng Lộc (1998), "Cơng nghệ gen thực vật bậc cao", T p chí Sinh học 20(2), Tr.4-11 [10] Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Lê Văn Vi, cs (2008), "Xây dựng quy trình kỹ thuật ni trồng địa lan Cymbidium spp cấy mô", TC Nông nghiệp phát triển nông thôn, Tr.18-22 [11] Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, Nxb Nơng Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh [12] Phan Xuân Huyên, Nguyễn Trung Ái, Nguyễn Thị Lang, cs (2004), "Phục tráng nhân nhanh giống địa lan Cymbidium nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng", T p ch Sinh học 26(1), Tr.48-54 27 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI [13] Arditti Joseph (2008), Micropropagation of orchids, Blackwell Pub., Malden, MA ; Oxford [14] Chen Jenn-Yih Mau-Shing Yeh (2002), "In vitro Propagation of Nervilia purpurea (Hay.) Schetr And N aragoana Gaud", Journal Of Agriculture and Forestry, National Chung Hsing University College of Agriculture 51(2), Tr.21-32 [15] Du Q., W L Chen, Z H Wang (2005), "Study on tissue culture and plant regeneration of Nervilia fordii", China journal of Chinese materia medica 30(11), Tr.812-814 [16] He Fuchang, He Dingquan, Chen Xinghua (1990), "In vitro culture of Nervilia fordii", Chinese Journal of Tropical Crops 11(1), Tr.97-101 [17] Li Bin (2008), "Tissue Culture of Nervilia fordii(Hance)Schltr Corm", Journal of Anhui Agricultural Sciences (35), Tr.15358-15359 [18] M Atique Akbar Shyamal Roy K (2006), "Effects of liquid medium on rooting and acclimation of regenerated micro shoots of banana (Musa sapientum L.) cv Sagar", Plant Tissue Culture & Biotech 16(1), Tr.11-18 [19] Reddy K Himakar, P.V.G.K Sharma, O.V.S Reddy (2010), "A comparative in vitro study on antifungal and antioxidant activities of Nervilia aragoana and Atlantia monophylla", Pharmaceutical Biology 48(5), Tr.595602 [20] ShouLing Li, Bai YanBing, Gao Yan, cs (2009), "Propagation technique for Nervilia fordii corm tissue culture.", Guangxi Agricultural Sciences 40(7), Tr 810-812 [21] T Rober N Dennis J G (2000), Plant Tisue Culture Concept and Lahoratory Exercises, CRC Press, New York