KHO H V NG NGH VI N CÔNG NGH SINH H C Ọ Ấ 6 20 ứ ứ ụ ệ ụ ụ ả ệ ứ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Ứ Ế Ứ Ấ Ợ Ế Ừ Ủ Ấ Ừ (Huperzia serrta) 6 20 Cơ quan chủ trì Viện Công nghệ sinh học ủ ệ TS L[.]
KHO H V NG NGH VI N CÔNG NGH SINH H C Ọ ứ ứ Ấ ệ ụ ụ 6-20 ệ ụ ả ứ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Ứ : Ấ Ế Ứ Ợ Ế Ừ (Huperzia serrta) Ấ : 6-20 Cơ quan chủ trì: ủ ệ ự Ừ Viện Cơng nghệ sinh học : TS Lê Thị Minh Thành ệ : 10/2016 – 09/2019 Hà N i – 03/2020 Ủ T P TH CÁN B THAM GIA THỰC HIỆ TAI KC.10.01/16-20 TT Họ tên ơq Chức vụ tro TS Lê Thị Minh Thành Chủ nhiệm đề tài Viện Công nghệ sinh học PGS.TS.Nguyễn Phương Nhuệ Thư ký đề tài Viện Công nghệ sinh học PGS.TS Đồng Văn Quyền Th nh vi n h nh Viện Công nghệ sinh học ThS Hoàng Thị Hồng Anh Th nh vi n h nh Viện Công nghệ sinh học TS Đỗ Thị Tuyên Th nh vi n h nh Viện Công nghệ sinh học GS.TS Phạm Thị Minh Huệ Th nh vi n h nh Đại họ PGS.TS Chử Văn Mến Th nh vi n h nh Họ viện Qu n Y DS Nguyễn Xuân Hoàng Th nh vi n h nh Công ty IMC TS Lê Thị Bích Thủy Th nh vi n h nh Viện Công nghệ sinh học 10 TS Trịnh Thị Thu H Th nh vi n h nh Viện Công nghệ sinh học V th nh vi n th m gi kh H N i Ừ Ế TTRC Thạ h t ng VNNS Vi nấm n i sinh AD Alzheimer AChE Acetylcholinesterase ACh Acetylcholine HPLC High Performance Liquid Chromatography TLC Thin layer chromatography PCR Polemerase Chain Reaction PDA Potato dextrose agar PDB Potato dextrose broth YM Yeast Mould PVP K30 Polyvinylpyrrolidone HPMC Hydroxypropyl Methyl cellulose DTNB 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) T Tiru hu n ĐVN n Việt N m KLTB Khối ng trung nh QCVN Qui hu n Việt N m LD Lethal dose IC Inhibitory concentration WHO World Health Organization MDA malondialdehyde SOD superoxide dismutase GSH-Px glutathione peroxidase CAT Catalase EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid MỤC LỤC Trang MỞ ẦU ươ ỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu thạch tùng cưa 1.2 Vi nấm nội sinh thực vật 1.3 ng quan v hoạt chất up r in 1.4 Các nghiên cứu nâng cao sinh t ng hợp 10 up vi nấm nội sinh 1.5 Các nghiên cứu v tách chiết, tinh sạch, thu nhận hoạt chất ươ up T LIỆ 14 16 17 2.1 Vật liệu 17 2.2 Hóa chất trang thiết bị thí nghiệm 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh có khả sinh tổng hợp up r in t h h t ng up r i s rr t i tN 18 a) Phương ph p thu mẫu 18 ) Phương ph p ph n ập bảo quản nấm n i sinh 18 ) Phương ph p nu i ấy, n m n hủng vi nấm 18 d) Phương ph p t h hiết Hup rzin )X định khả sinh tổng h p hoạt hất Hup rzin )X định h m ng Hup g) Định danh vi nấm sơ 18 : phương ph p truyền thống 18 19 21 h) Định danh vi nấm n i sinh phương ph p sinh học phân tử 22 2.3.2 Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp Huperzine A chủng nấ tu ển chọn 23 ) Phương ph p đ t biến chủng tia UV 23 ) Phương ph p đ t biến chủng hóa chất NTG 23 ) Phương ph p khảo s t điều kiện nuôi cấy 25 d) Phương ph p nu i thu sinh khối nấm 23 ) Phương ph p bảo quản vi nấm cấy truyền ống thạch nghiêng 25 ) Phương ph p ảo quản vi nấm chất chống đ ng v điều kiện lạnh sâu 25 2.3.3 Nghiên cứu quy trình lên men chủng nấm sản sinh ho t chất Huperzine A qui mô pilot 26 ) Khảo s t m i trường nh n giống v )X n m n 26 định điều kiện n m n sinh tổng h p Hup 26 ) Nghi n ứu đ ng th i n m n sinh tổng h p Hup 27 d) L n m n sản xuất Hup 27 2.3.4 Nghiên ứu qu trình ơng ngh tá h hiết, tinh s h, thu nhận ho t hất Huperzine t sinh khối nấ 27 ) Phương ph p thu sinh khối nấm 27 ) Phương ph p ph v tế o 27 phương ph p hiết xuất 27 ) d) Phân lập Hup A 28 )Phương ph p sắ ký t si i g )Phương ph p sắ ký t s ph d x 29 29 g)Phương ph p tinh c t than hoạt tính 29 h)Tinh sạ h ằng sắ ký tr o đổi nion m r it IR 400 i)Tinh sắ ký tr o đổi anion DEAE-sepharose 29 29 k)X 30 định đ sạ h v h m ng Hup )Phương ph p x định tồn dư m th no , th no , tạp hất kh , kim oại n ng 30 2.3.5 Nghiên cứu qu trình o hế v sản uất viên n ng ứng ho t hất up qui ô ph ng th nghi 30 2.3.5.1 Nghi n ứu ựa chọn t dư c, xây dựng vi n n ng ứng 30 2.3.5.2 Phương ph p đ nh gi đ t nh ủ ng thứ v qui tr nh o hế ốm v vi n n ng ứng 31 2.3.5.3 Nâng cấp th m định quy trình sản xuất vi n n ng ứng quy m 10.000 viên nang/mẻ 32 2.3.5.4 Nghi n ứu ự 34 họn o v thiết kế o đóng gói ấp 2.3.5.5 Theo dõi đ ổn định củ vi n n ng ứng Hup thường lão hóa cấp tốc điều kiện 35 2.3.6 Xây dựng tiêu chuẩn sở bán thành phẩm thành phẩm 36 2.3.6.1 X y dựng ti u hu n sở nguy n iệu Hup 37 2.3.6.2 X y dựng ti u hu n sở th nh ph m vi n n ng ứng chứa HupA 38 Đánh giá t nh n to n thự nghi 38 ộ t nh v tá dụng hỗ trợ ải thi n tr nhớ 2.3.7.1 Nghiên cứu tính an tồn củ Hup rzin tr n đ ng vật thực nghiệm 38 2.3.7.2 Đ nh gi t dụng cải thiện trí nhớ, tăng ường khả học tập nhận thức thần kinh trung ương tr n hu t nhắt trắng bị gây thiếu máu não cục b làm giảm hoạt đ ng thần kinh, giảm trí nhớ 39 2.3.7.3 Đ nh gi t 41 dụng cải thiện trí nhớ, tăng ường khả học tập nhận thức thần kinh trung ương tr n hu t nhắt trắng già 2.3.7.4 Nghiên cứu hế tác dụng củ Hup rzin Ế Q Ả n tế o n o hu t 43 Ả 46 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh có khả sinh t ng hợp up r in t câ hạch tùng cưa up r ia s rrata iệt Nam 46 3.1.1 Thu thập mẫu v ph n ập nấm nội sinh t mẫu thu thập t i Đ L t v , i tN 46 s rr t 3.1.2 Xá ịnh khả sinh tổng hợp ho t chất Huperzine A chủng nấm nội sinh phân lập ợ v tu ển họn ợ hủng khả sinh tổng hợp up 48 3.1.3 Định danh chủng nấm nội sinh phân lập 52 ợc t Th ch tùng Nghiên cứu nâng cao sinh t ng hợp chủng nấm tu ển chọn Đột iến hủng ng ti t ngo i nh n ng o khả sinh tổng hợp họn v up up r in 54 ng h hất g ột iến ủ hủng vi nấ tu ển 54 2 Nghiên ứu th nh ph n ôi tr ng v i u ki n nuôi ấ nh khả sinh tổng hợp up r in ủ hủng vi nấ tu ển họn o 60 gố sản 70 Nghiên cứu qu trình lên m n chủng nấm sản sinh hoạt chất Huperzine A qui mô pilot 72 3 Nghiên ứu i u ki n ảo quản, sinh up o v ổn ịnh 3.3 u gi 3 Nghiên ứu ôi tr ng nh n giống, ên sản sinh ho t hất up r in 3.3.2 Nghiên ứu ự Huperzine A họn nguồn 3 Nghiên ứu ảnh h ởng ủ sinh tổng hợp up r in n ng hủng giống nấ n th h hợp ho hủng nấ on v nitơ th h hợp ho sinh tổng hợp nguồn uối khoáng v ti n hất ến 3 Nghiên ứu i u ki n ên n: Độ thông kh , p , nhi t ộ, tuổi giống ho sinh tổng hợp Huperzine A 72 74 76 ợng giống, 79 up rzine A theo 82 3.3.6 X dựng qu trình nh n giống v qu trình ên n hủng nấ sản sinh ho t hất up r in th o ẻ qu 5-10 lít 80-100 lít 85 3.3.7 Nghiên ứu i u ki n ên n v dựng qu trình ên n hủng nấ sản sinh ho t hất Huperzine A qu ô thiết ị ên n 500 t 92 3.3.8 Lên 97 3 Nghiên ứu ộng thái trình ên n sinh tổng hợp ẻ thiết ị ên n 5-10 80-100 lít n sản uất Huperzine A Nghiên cứu qu trình cơng nghệ tách chiết, tinh sạch, thu nhận hoạt chất up r in t sinh hối nấm 100 Nghiên ứu ự họn i u ki n ông ngh tá h hiết, tinh s h v thu nhận ho t hất up r in t sinh khối nấ th o qu ô ph ng th nghi suất 2-3 g ẻ 100 3.4.1.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện công nghệ t h hiết hoạt chất Huperzine A từ sinh khối nấm quy m ph ng th nghiệm 100 3.4.1.2 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện công nghệ tinh thu nhận hoạt chất HupA từ sinh khối nấm quy mơ phịng thí nghiệm 103 3.4.1.3 Xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết, tinh thu nhận hoạt chất huperzine A từ sinh khối nấm quy mô 2-3 g/mẻ 114 Nghiên ứu ự họn i u ki n ông ngh tá h hiết, tinh s h v thu nhận ho t hất up r in th o qu ô pi ot suất ≥ 0g ẻ 118 3.4.2.1 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ thiết bị thích h p đ t h hiết hoạt chất Hup rzin từ sinh khối nấm thu đư quy m pi ot 118 3.4.2.2 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ thiết bị thích h p đ tinh thu nhận hoạt chất Huperzine A từ sinh khối nấm quy mơ pilot 122 3.4.2.3 Xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết, tinh thu nhận hoạt chất huperzine A từ sinh khối nấm quy m ≥ 10 g/mẻ 126 h o dõi ộ ổn ịnh củ ngu ên i u hóa cấp tốc nguyên li u HupA 132 up i u ki n th ng lão 3.5 Nghiên cứu qu trình o chế v sản uất viên nang cứng chứa hoạt chất up qui mô ph ng th nghiệm 135 3.5.1 Nghiên cứu lựa chọn công thức, công ngh bào chế viên nang, lựa chọn thiết kế o ì ng g i sản phẩm 135 3.5.1.1 Nghiên cứu lựa chọn t dư c xây dựng cơng thức, qui trình bào chế vi n n ng ứng quy mơ phịng thí nghiệm (3000 viên nang/mẻ) 135 3.5.1.2 Nâng cấp th m định quy trình sản xuất vi n n ng ứng quy m 10.000 viên nang/mẻ Sản xuất vi n n ng ứng quy mô 10.000 viên nang/mẻ 141 3.5.1.3 Nghi n ứu ự 150 họn o v thiết kế o đóng gói ấp 3.5.2 Th o dõi đ ổn định củ vi n n ng ứng Hup điều kiện thường lão hóa cấp tốc với tiêu: hình thứ , h m ng, đ rã/ đ hoà tan, giới hạn tạp chất â 36 X 362 X 152 ựng tiêu chu n sở án th nh ph m v th nh ph m 158 dựng tiêu huẩn sở ủ ngu ên i u up 158 dựng tiêu huẩn sở ủ viên n ng ứng up 170 ánh giá t nh an to n thực nghiệm ộc t nh v tác Đánh giá ộ t nh ấp L 50 v huột ống th o ng uống ng h trợ cải thiện tr nhớ ánh giá ộ t nh án tr ng di n 174 174 3.7.1 Kết nghi n ứu đ t nh ấp 174 3.7.1.2 Kết nghi n ứu đ t nh 174 n trường diễn Đánh giá tá dụng hỗ trợ ải thi n tr nhớ thự nghi 183 3.7.2.1 Kết đ nh gi t dụng ải thiện tr nhớ, tăng ường khả họ tập v nhận thứ ủ thần kinh trung ương tr n hu t nhắt trắng ị g y thiếu m u n o ụ m giảm hoạt đ ng thần kinh, giảm tr nhớ 183 3.7.2.2.Đ nh gi t dụng cải thiện trí nhớ, tăng ường khả học tập nhận thức thần kinh trung ương chu t nhắt trắng già 186 Nghiên ứu hế tá dụng ủ 188 3.7.3.1 Kết đ nh gi khả ứ up r in hế ên tế o n o huột hE x vivo 188 3.7.3.2 Kết đ nh gi khả ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) in vitro 189 3.7.3.3 Kết đ nh gi t 189 KẾT LU dụng chống oxy hóa não Huperzine A NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 194 196 95 96 97 98 RĐL RĐL 11 RĐL 13 RĐL 26 3 Nhóm HTKL 3: TT Tên Số ngày chủng nuôi cấy Tsp Đ Đ Đ Đ Lạt Lạt Lạt Lạt Khu Khu Khu Khu n lạc tròn n lạc tròn n lạc tròn n lạc tròn, không xẻ Trắng Trắng Trắng Chấm xanh, viền trắng ặ Ngu n gốc Sa Pa Khuẩn lạc Tròn, viền liền Tsp 4h 10 Sa Pa Tròn, viền liền Tsp Sa Pa Tròn, viền liền Tsp Sa Pa Tròn, viền liền Tsp 16 Sa Pa Tròn, viền liền Tsp 21 Tsp 24 5 Sa Pa Sa Pa Khu n lạc tròn, viền liền Khu n lạc tròn, viền liền Tsp 27 Sa Pa Khu n lạc tròn, viền liền Tsp 28 Sa Pa Khu n lạc tròn, viền liền 10 11 Tsp 29 Tsp 33 Sa Pa Sa Pa Khu n lạc tròn, viền liền Khu n lạc tròn, viền liền 12 13 14 Tsp 36 Tsp 37 Tsp 39 5 Sa Pa Sa Pa Sa Pa Khu n lạc tròn, viền liền Tròn Khu n lạc tròn 15 16 17 18 Tsp 43 Tsp 46 Tsp 49 Tsp 51 5 Sa Pa Sa Pa Sa Pa Sa Pa Khu Khu Khu Khu 19 Tsp 54 Sa Pa Khu n lạc tròn 20 Tsp 57 Sa Pa Khu n lạc tròn 21 22 Tsp 61 Tsp 63 5 Sa Pa Sa Pa 23 Tsp 66 Sa Pa Khu n lạc tròn Khu n lạc trịn, khơng xẻ, m t dạng b t Khu n lạc tròn 24 Tsp 58 Sa Pa Khu n lạc tròn 25 26 Tsp 69 Tsp 73 5 Sa Pa Sa Pa Khu n lạc tròn, viền liền Khu n lạc tròn, viền đều, n lạc tròn n lạc trịn n lạc trịn n lạc trịn m hình thái Sợ ưỡng Vàng nhạt Hồng xen ghi nhạt, viền hồng Trắng, bên xanh Trắng, bên m u x nh đậm Nâu nhạt, viền trắng Nâu nhạt xen trắng Đ n nhạt, xen trắng V ng m, viền trắng Màu trắng nhờ, ngo i x n t đ n, viền vàng nhạt Ghi nhạt xen trắng Vàng nhạt, màu trắng ngà Nâu nhạt xen trắng Nâu, xanh Trắng xen hồng vàng Trắng, x n đ n Trắng, xen đ n Đ n, x n trắng Tím khoai mơn, xen s i trắng Tím khoai mơn, xen s i trắng Trắng, rìa xung quanh nâu X nh đ n Hồng nhạt xen, chấm vàng N u đậm, viền vàng nâu N u đậm, viền vàng nâu Ghi nhạt xen trắng X nh đ n Trắng Trắng Trắng Xanh viền trắng Sợ ất Vàng nhạt nâu Hồng đậm Trắng xen xanh đậm Trắng Nâu nhạt Nâu Đ n Vàng cam nhạt Đ n nhạt Ghi nhạt Vàng Nâu Nâu Hồng xen trắng vàng Đ n Đ n Đ n Tím khoai mơn Tím khoai mơn Nâu X nh đ n Hồng N u đậm, viền vàng nâu N u đậm, viền vàng nâu Ghi nhạt Xanh 206 27 Tsp 74 Sa Pa m t dạng b t Khu n lạc tròn, viền liền 28 29 Tsp 76 Tsp 78 Sa Pa Sa Pa Khu n lạc tròn, viền liền Khu n lạc tròn 30 Tsp 82 Sa Pa Khu n lạc tròn, viền liền 31 32 Tsp 83 Tsp 84 Sa Pa Sa Pa Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn, viền liền 33 Lsp Sa Pa 34 Lsp Sa Pa Khu n lạc tròn 35 36 Lsp Lsp 5 Sa Pa Sa Pa Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn 37 Lsp Sa Pa Khu n lạc tròn 38 Lsp Sa Pa 39 Lsp Sa Pa Khu n lạc tròn, viền đều, m t dạng b t Khu n lạc tròn 40 Lsp 11 Sa Pa Khu n lạc tròn 41 42 Rsp Rsp 5.1 Sa Pa Sa Pa Khu n lạc tròn Tròn 43 Rsp Sa Pa Khu n lạc tròn 44 Rsp 7 Sa Pa Khu n lạc tròn 45 Rsp Sa Pa Khu n lạc trịn, khơng xẻ 46 Rsp 10 10 Sa Pa Tròn, viền liền 47 Rsp 12 Sa Pa 48 Rsp 15 Khu n lạc trịn, khơng xẻ Khu n lạc tròn, viền liền 49 Rsp 16 Sa Pa 50 51 Rsp 19 TĐL 5 Sa Pa Đ Lạt 52 TĐL Đ Lạt Khu n lạc tròn, viền liền Khu n lạc trịn, khơng xẻ Khu n lạc trịn, khơng xẻ 53 TĐL Đ Lạt Khu n lạc trịn, khơng xẻ Sa Pa Khu n lạc tròn Tròn, viền liền V ng m, viền trắng Ghi nhạt xen trắng Tím khoai mơn, xen s i trắng Màu trắng nhờ, ngo i x n t đ n, viền vàng nhạt Nâu nhạt, V ng m, viền trắng Hồng xen tráng vàng N u đậm, viền vàng nâu X nh đ n N u đậm, viền vàng nâu Nâu đậm, viền vàng nâu Xanh lá, viền trắng Vàng cam nhạt N u đậm, viền vàng nâu N u đậm, viền vàng nâu Nâu nhạt, Hồng đậm xen trắng Hồng xen trắng vàng Hồng xen vàng, trắng N u đậm, viền vàng nâu Hồng xen ghi nhạt, viền hồng Nâu, xen trắng N u đậm, viền vàng nâu N u đậm, viền vàng nâu Nâu nhạt Hồng đậm Màu trắng nhờ, ngo i x n t đ n, viền vàng nhạt Trắng, bên m u x nh đậm Ghi nhạt xen trắng Nâu, xen trắng Đ n nhạt Đ n, x n t hấm trắng Xanh, viền trắng Đ n Ghi nhạt Tím khoai mơn Đ n nhạt Nâu nhạt Vàng cam nhạt Hồng xen trắng N u đậm, viền vàng nâu X nh đ n N u đậm, viền vàng nâu N u đậm, viền vàng nâu Xanh Hồng xen trắng vàng Hồng xen trắng vàng N u đậm, viền vàng nâu Hồng đậm Trắng Trắng Ghi nhạt Trắng Xanh viền trắng 207 Đ Lạt Khu n lạc tròn Xanh viền nâu nhạt Đ Lạt Khu n lạc tròn, viền Đ Lạt 57 TĐL 12.1 TĐL 11.2 TĐL 20.1 TĐL 21 Đ Lạt 58 59 60 TĐL 23 TĐL 24 TĐL 25 7 Đ Lạt Đ Lạt Đ Lạt 61 62 TĐL 26 TĐL 27 Đ Lạt Đ Lạt 63 64 65 66 TĐL 29 TĐL 32 TĐL 34 TĐL 36 5 5 Đ Đ Đ Đ Lạt Lạt Lạt Lạt 67 68 69 70 71 72 TĐL 41 TĐL 42 TĐL 44 TĐL 46 TĐL 48 TĐL 49 5 5 5 Đ Đ Đ Đ Đ Đ Lạt Lạt Lạt Lạt Lạt Lạt Khu n lạc trịn, khơng xẻ, m t dạng b t Khu n lạc tròn, viền đều, m t dạng b t Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn, viền đều, m t dạng b t Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn, viền đều, m t dạng b t Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn, viền đều, m t dạng b t Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn Vàng xanh, viền trắng Hồng nhạt xen, chấm vàng X nh đ n 73 74 TĐL 51 TĐL 14 Đ Lạt Đ Lạt Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn 75 TĐL 16 Đ Lạt 76 TĐL 17 77 TĐL 65 78 54 55 56 Xanh viền nâu nhạt Vàng chanh Hồng Xanh X nh đ n Tím nhạt xen trắng Xanh lá, viền trắng X nh đ n Tím xen trắng Xanh N u đỏ Xanh lá, viền trắng N u đỏ Xanh X X X X n n n n X nh đ n X nh đ n X nh đ n Xanh N u đỏ N u đỏ N u đỏ N u đỏ X nh đ n Hồng Khu n lạc tròn N u đỏ N u đỏ N u đỏ N u đỏ X nh đ n Hồng, viền trắng xen vàng X nh đ n X nh đậm viền trắng Xanh, viền trắng Đ Lạt Khu n lạc tròn Xanh, viền trắng Đ Lạt Khu n lạc tròn, viền liền TĐL 67 10 Sa Pa Tròn, viền liền 79 TĐL 70 Sa Pa Tròn, viền liền 80 TĐL 71 10 Sa Pa Tròn, viền liền 81 TĐL 73 Đ Lạt Khu n lạc trịn, khơng xẻ 82 TĐL 76 10 Đ Lạt Tròn, viền liền 83 84 85 TĐL 79 LĐL LĐL 3 Đ Lạt Đ Lạt Đ Lạt Khu n lạc tròn Khu n lạc tròn, viền Khu n lạc tròn, viền Màu trắng nhờ, ngo i x n t đ n, viền vàng nhạt Hồng xen ghi nhạt, viền hồng Trắng, bên m u x nh đậm Hồng xen ghi nhạt, viền hồng N u đậm, viền vàng nâu Hồng xen ghi nhạt, viền hồng Nâu nhạt, Nâu nhạt, Xanh, viền trắng nh đ nh đ nh đ nh đ X nh đ n Xanh Xanh, viền trắng Xanh, viền trắng Đ n nhạt Hồng đậm Trắng Hồng đậm N u đậm, viền vàng nâu Hồng đậm Nâu nhạt Nâu Xanh, viền trắng 208 86 87 LĐL LĐL 4.4 Đ Lạt Đ Lạt 88 89 LĐL LĐL 5 Đ Lạt Đ Lạt 90 91 LĐL 17 LĐL 21 Đ Lạt Đ Lạt 92 LĐL 23 93 LĐL 26 94 Khu n lạc trịn, khơng xẻ Khu n lạc tròn, viền đều, m t dạng b t Khu n lạc trịn, khơng xẻ Khu n lạc trịn, không xẻ Hồng, viền trắng Xanh lá, viền trắng Hồng Xanh Hồng, viền trắng Xanh, viền trắng Đ Lạt Khu n lạc trịn Khu n lạc trịn, khơng xẻ, m t dạng b t Khu n lạc tròn Đ Lạt Khu n lạc trịn, khơng xẻ LĐL 31 Đ Lạt Khu n lạc tròn, viền liền 95 LĐL 32 Đ Lạt Khu n lạc trịn, khơng xẻ 96 RĐL Đ Lạt Khu n lạc tròn, không xẻ 97 RĐL 3.1 Đ Lạt Khu n lạc trịn, khơng xẻ 98 RĐL 1.2 Đ Lạt Khu n lạc trịn Tím nhạt xen trắng Hồng nhạt xen, chấm vàng Hồng xen tráng vàng N u đậm, viền vàng nâu V ng m, viền trắng Đ n, x n t hấm trắng Hồng xen trắng, vàng N u đậm, viền vàng nâu Xanh, viền trắng Hồng Xanh, viền trắng Tím nhạt Hồng 99 RĐL Đ Lạt Tròn 100 101 102 103 104 RĐL RĐL 14 RĐL 15 RĐL 16 RĐL 17 7 5 Đ Đ Đ Đ Đ Khu Khu Khu Khu Khu 105 RĐL 19 Sa Pa Tròn, viền liền 106 RĐL 23 10 Đ Lạt Tròn, viền liền 107 RĐL 25 Đ Lạt Khu n lạc trịn, khơng xẻ 108 RĐL 28 Đ Lạt Khu n lạc tròn, viền đều, m t dạng b t Nhóm HTKL 4: STT Tên chủng Tsp 14 Tsp 32 Tsp 20 Lạt Lạt Lạt Lạt Lạt Số ngày nuôi cấy 10 Ngu n gốc Sa Pa 10 Sa Pa 10 Sa Pa n lạc tròn n lạc tròn n lạc tròn n lạc tròn, viền liền n lạc trịn, khơng xẻ Hồng đậm xen trắng Tím xen trắng Xanh xen trắng Xanh xen trắng Ghi nhạt xen trắng N u đậm, viền vàng nâu Trắng, bên màu x nh đậm Hồng xen ghi nhạt, viền hồng N u đậm, viền vàng nâu X nh đ n Hồng xen trắng N u đậm, viền vàng nâu Vàng cam nhạt Đ n Hồng N u đậm, viền vàng nâu Xanh, viền trắng Hồng đậm Tím xen trắng Xanh xen trắng Xanh xen trắng Ghi nhạt N u đậm, viền vàng nâu Trắng Hồng đậm N u đậm, viền vàng nâu Xanh ặ Khuẩn lạc Kh ng n đỗi, kh đồng tâm Khu n lạc tròn, viền liền Khu n lạc tròn, viền liền m hình thái Sợ ưỡng Trắng, viền m u đ n xen vàng nhạt Mọc th Vàng cam nhạt, màu ghi nhạt, viền đ n nhạt Mọc th Trắng Mọc th đ n trắng Sợ ất N uđ n xen trắng Đ n nhạt xen trắng Trắng 209 PHỤ LỤC hợp HupA chủng nấm bằ pháp TLC Bảng Khảo sát khả STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 ủ Tsp Tsp 5v Tsp 11 Tsp 15 Tsp 18 Tsp 34 Tsp 41 Tsp 45 Tsp 47 Tsp 55 Tsp 60 Tsp 72 Tsp 75 Tsp 80 Tsp 81 Tsp 85 Tsp 86 Lsp 17 Lsp 17.1 Lsp 21 Lsp 22 Lsp 25 Lsp 29 Lsp 31 Lsp 33 Lsp 32.1 Rsp Rsp Rsp 5.3 Rsp 5.3 Rsp Rsp 13 Rsp 17 Rsp 20 TĐL 18 TĐL 19 TĐL 21 TĐL 28 TĐL 30 TĐL 35 TĐL 39 TĐL 64 TĐL 68 TĐL 74 TĐL 79 TĐL 80 ả ợ ổ ( + - STT ủ ) 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 TĐL 62 TĐL 63 TĐL 66 TĐL 69 TĐL 72 TĐL 75 TĐL 77 TĐL 78 LĐL LĐL LĐL LĐL10 LĐL 11 LĐL 13 LĐL 14 LĐL 22 LĐL 15 LĐL 19 LĐL 20 LĐL 25 LĐL 28 LĐL 29 LĐL 35 RĐL 1.1 RĐL 4.2 RĐL RĐL RĐL7 RĐL8 RĐL RĐL 10 RĐL 11 RĐL 13 RĐL 20 RĐL 22 RĐL 26 RĐL 29 Tsp Tsp 4h Tsp Tsp Tsp 16 Tsp 21 Tsp 24 Tsp 27 Tsp 28 ươ ả ợ ổ ( ) 210 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 TĐL 82 LĐL 12 LĐL 16 LĐL 18 LĐL 24 LĐL 27 LĐL 30 LĐL 33 LĐL 38 RĐL 3.2 RĐL 4.1 RĐL 12 RĐL 18 RĐL 21 RĐL 24 RĐL 27 Tsp Tsp Tsp Tsp 10 Tsp 12 Tsp 13 Tsp 17 Tsp 19 Tsp 20 Tsp 22 Tsp 23 Tsp 25 Tsp 26 Tsp 30 Tsp 31 Tsp 35 Tsp 38 Tsp 42 Tsp 44 Tsp 48 Tsp 50 Tsp 52 Tsp 53 Tsp 56 Tsp 59 Tsp 62 Tsp 64 Tsp 65 Tsp 67 Tsp 68 Tsp 70 Tsp 71 Tsp 79 Tsp 87 Tsp 88 Lsp + + - 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 Tsp 29 Tsp 33 Tsp 36 Tsp 37 Tsp 39 Tsp 43 Tsp 46 Tsp 49 Tsp 51 Tsp 54 Tsp 57 Tsp 61 Tsp 63 Tsp 66 Tsp 58 Tsp 69 Tsp 73 Tsp 74 Tsp 76 Tsp 78 Tsp 82 Tsp 83 Tsp 84 Lsp Lsp Lsp Lsp Lsp Lsp Lsp Lsp 11 Rsp Rsp 5.1 Rsp Rsp Rsp Rsp 10 Rsp 12 Rsp 15 Rsp 16 Rsp 19 TĐL TĐL TĐL TĐL 12.1 TĐL 11.2 TĐL 20.1 TĐL 21 TĐL 23 TĐL 24 TĐL 25 TĐL 26 211 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 Lsp Lsp 10 Lsp 12 Lsp 15 Lsp 16 Lsp 18 Lsp 19 Lsp 20 Lsp Lsp 23 Lsp 26 Lsp 27 Lsp 30 Lsp 34 Lsp 34.1 Rsp Rsp 5.2 Rsp 11 Rsp 14 Rsp 18 Rsp 21 TĐL TĐL TĐL TĐL TĐL TĐL TĐL 10 TĐL 11 TĐL 13.1 TĐL 11.1 TĐL 15 TĐL 22 TĐL 31 TĐL 33 TĐL 37 TĐL 38 TĐL 40 TĐL 43 TĐL 45 TĐL 47 TĐL 48 TĐL 50 TĐL 53 TĐL 56 TĐL 57 TĐL 58 TĐL 59 TĐL 60 TĐL 61 Chú th ch + + ương t nh 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 261 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 TĐL 27 TĐL 29 TĐL 32 TĐL 34 TĐL 36 TĐL 41 TĐL 42 TĐL 44 TĐL 46 TĐL 48 TĐL 49 TĐL 51 TĐL 14 TĐL 16 TĐL 17 TĐL 65 TĐL 67 TĐL 70 TĐL 71 TĐL 73 TĐL 76 TĐL 79 LĐL LĐL LĐL LĐL 4.4 LĐL LĐL LĐL 17 LĐL 21 LĐL 23 LĐL 26 LĐL 31 LĐL 32 RĐL RĐL 3.1 RĐL 1.2 RĐL RĐL RĐL 14 RĐL 15 RĐL 16 RĐL 17 RĐL 19 RĐL 23 RĐL 25 RĐL 28 Tsp 14 Tsp 32 TĐL 52 + - -) âm tính 212 PHỤ LỤC ặ - m chi nhóm nấm Chi Mucor: Thu c ngành Zygomycota, lớp Mucormycotina, b Mucorales, họ Mucoraceae Mucor nhóm nấm ó o i thường hoại sinh xác bã hữu đ c biệt dày ngựa trâu bò, có lồi ký sinh rễ thực vật, nhiều chúng gây bệnh tr n đ ng vật ni, nhiều lồi ph t t n đất ũng ó số o i ó h ph n hủy tinh b t th nh đường, Khu n lạc màu trắng đến màu be ho c màu xám phát tri n nhanh chóng Các khu n lạc mơi trường ni cấy có th n đến vài cm chiều cao Khu n lạ trưởng th nh đổi s ng m u x m đến nâu phát tri n bào tử Bào tử hình thành túi bào tử hình cầu; túi bào tử phát tri n cọng mang bào tử Bào tử khơng có roi, gần tr n, đồng nhất, đ nh n nằm túi m u đen gọi túi bào tử, m t túi bào tử phát tri n đơn đ c tận cọng mang bọc bào tử bọc bào tử có m u đ n Có 10 chủng phân lập đư c thu c Mucor; đó: ó hủng phân lập từ th n (TĐL 31, TĐL 33, TĐL 48, TĐL 69, TĐL 77, Tsp 71), ó hủng phân lập từ (LĐL 1, LĐL 25, Lsp 34) v hủng phân lập từ rễ (RĐL 20) - Chi Paecilomyces: Thu họ Trichocomaceae, Eurotiales, ớp Eurotiomycetes, ng nh Ascomycota trú r ng kh quy n, đất, nướ , tổ m nhiều o i thự vật, m đ ng vật v m ủ người ó ảnh hưởng qu n trọng tới kinh tế, m i trường sinh th i, m t số o i đư sử dụng tạo hế ph m sinh họ diệt n tr ng (P fumosoroseus) Khu n m u trắng, viền khu n iền, Thời gi n sinh trưởng khoảng ng y o tử sinh sản từ ụm th h nh thon, hẹp dần nh r đầu tr n ủ th nh o tử h nh th nh th o dạng huỗi, gồm hỉ m t tế o ả o tử v s i nấm thường kh ng m u h y ó m u s ng Có chủng thu c chi Paecilomyces; đó, hủng phân lập từ th n (Tsp 1, Tsp 9, TĐL 72, TĐL 70), chủng từ (LĐL 3) v hủng từ rễ (Rsp 16, RĐL 19) - Chi Acremonium: ng nh Ascomycota, b Hypocreales, họ Hypocreaceae Khu n lạ thường ó m u v ng n u, v ng đất, màu trắng, trắng ngà ho c xám nhạt Giá bào tử trần khơng có ho c ngắn, khơng ho c phân nhánh, có vách ngang Tế bào sinh bào tử trần nhỏ dần từ phần gố đến đỉnh kết thúc m t đỉnh Bào tử trần, hình dạng biến thi n, kh ng ngăn v h, đư c tạo thành đỉnh tế bào sinh bào tử trần, thành chuỗi ho c tụ họp lại thành khối cầu RĐL 3.1, Tsp 66, Tsp 58, Lsp 2, Lsp 5, Lsp 6, Lsp 9, Lsp 11, TĐL 73, Rsp 8, Lsp 24, RĐL 17, RĐL 25 Trong 296 chủng nấm phân lập đư c, có 13 chủng thu c nhóm hình thái chi Acremonium; đó, ó chủng phân lập từ th n (Tsp 66, Tsp 58, TĐL 73), hủng phân lập từ ( Lsp 2, Lsp 5, Lsp 6, Lsp 9, Lsp 11, Lsp 24) chủng từ rễ (RĐL 3.1, Rsp 8, RĐL 17, RĐL 25) - Chi Alternaria: Thu c ng nh Ascomycota, ớp Dothideomycetes, Pleosporales, họ Pleosporaceae Nhóm nấm phổ biến, có nhiều o i hoại sinh gây chết phần trồng; gây bệnh gỉ sét khoai tây, cà chua m t số trồng họ cà (Solanace) Khơng phải lồi Aternaria sp n o ũng t nhân gây bệnh cho cây, m t số o i đ đư c báo cáo vi nấm n i sinh có khả sản sinh hoạt chất có hoạt tính sinh học cao Khu n lạc phát tri n nh nh, thường ó m u đ n, x nh đ n ho c xám Hệ s i nấm phân nhánh, có vách ngăn o tử trần có hình chai l n ngư c, hình trứng ho c hình cầu; bào tử trần đơn đ c ho đ nh thành m t chuỗi d i tr n đỉnh TĐL 18, LĐL 16, LĐL 18, Tsp 55, Tsp 60, Lsp 21, Lsp 17.1, TĐL 79, Tsp 80, RĐL 27, Rsp 17, LĐL 38, Lsp 31 Có 13 chủng phân lập đư x định thu c chi Alternaria: chủng phân lập từ th n (TĐL 18, Tsp 55, Tsp 60, TĐL 79, Tsp 80), hủng phân lập từ (LĐL 16, LĐL 18, Lsp 21, Lsp 17.1, LĐL 38, Lsp 31) chủng từ rễ (Rsp 17, RĐL 27) - Chi Penicillium: Thu ng nh Ascomycota, ớp Eurotiomycetes, Eurotiales, họ Trichocomaceae Là m t chi nấm có tầm quan trọng tự nhi n ũng sản xuất thực ph m thuốc Gồm nhiều lồi ó đất, tr n hất tự nhiên, sản ph m nông nghiệp, công nghiệp S i nấm ngăn 213 vách, phân nhánh, không màu ho c màu nhạt, đ i m u sẫm Cọng bào tử phân nhánh với th bình cấp 1, và tận , v Hình thái khuẩn l o t nấm chi Mucor Hình thái khuẩn l v o t nấm chi Paecilomyces Hình thái khuẩn l v o t nấm chi Acremonium Hình thái khuẩn l v o t nấm chi Alternaria Hình thái khuẩn l v o t nấm chi Penicillium 214 Hình thái khuẩn l v o t nấm chi Trichoderma Hình thái khuẩn l c bào t nấm thuộc chi Fusarium Hình thái khuẩn l v sợi nấ nh nấ ất thụ vá h Hình thái khuẩn l c sợi nấm nhóm nấm thể K t ịnh danh vi nấm n i sinh bằ ươ Tiến hành chọn chủng nấm đ trưng nhóm hi đ ph n oại phương pháp truyền thống đ tiến h nh định danh phân tích trình tự vùng rADN – ITS phương ph p P R nhằm có th phân loại đư đến hi h nh x h h y ó th tìm thêm chi/loài nấm khác chủng nấm phân lập đư c: - Chi Mucor: Tsp 71 - Chi Paecilomyces: Tsp - Chi Penicillium: LĐL 4.4, Tsp 33, Tsp 41 - Chi Fusarium: TĐL 1, Rsp 5.2 215 - Chi Alternaria: Lsp 21 - Chi Trichoderma: TĐL 11 - Nhóm nấm bất thụ có vách: Tsp 4h, Tsp 5v, Tsp 7, Tsp 13, Tsp 25, LĐL 8, RĐL - Nhóm nấm th quả: Tsp 20 ADN 17 chủng nấm đư c tách chiết m tả phần phương ph p Kết ki m tra m y đo qu ng phổ cho thấy AND tổng số tách chiết đư ó đ tinh cao (A260/280= 1,85 ÷ 1,91) đư c sử dụng làm khu n đ thực phản ứng PCR C p mồi ITS1 ITS4 khuế h đại đoạn gen ITS1-5,8S-ITS4 chủng nấm ó k h thước tính tốn theo lý thuyết 500 ÷ 600 bp Kết phản ứng P R đư c ki m tra gel agarose 1% (hình 3.2) 11 10 M 12 13 14 15 0.6kb 16 M 0.6kb 0.5kb 0.5kb Hình 3.2: Kết điện di sản ph m PCR khuế h đại gen ITS1-5,8S-ITS4 m t số chủng vi nấm nghiên cứu gel agarose 1% (M: Marker 1-Tsp 25, 2-TĐL 11, 3- Tsp 7, 4- Tsp 33, 6- Tsp 1, 7Tsp 5v, 8- LĐL , 9: LĐL 4.4 , 10- Lsp 21 , 11- Tsp 20 , 12-RĐL 4, 13- Rsp 5.2, 14-Tsp 4h , 15- Tsp 13, 16 -Tsp 41) Các sản ph m P R n y đư c tinh theo Kit tinh sản ph m PCR củ h ng v đư c xác định trình tự nucleotide máy giải trình tự gen tự đ ng Sản ph m khuế h đại vùng ITS chủng nấm đư đọc máy giải trình tự AEI PRISM @ 3700 Genetic Analyzer Trình tự v ng đư đối chiếu ngân hàng liệu gen NCBI với sản ph m BLAST So sánh chủng đối chiếu có trình tự tương đồng cao hàng loạt chủng khác Bảng 3.2 Mứ đ tương đồng gen ITS chủng nấm so sánh với trình tự chủng GenBank STT Tên Chủng so sánh dài Mứ chủng ạn so ươ ng Tên Mã số sánh % % Tsp 71 Mucor fragilis NR_131304 100 98 Mucor bainieri NR_103628 100 98 Mucor circinelloides f lusitanicus NR_126127 100 98 Mucor ramosissimus NR_103627 100 95 Mucor circinelloides f janssenii NR_126123 100 95 Tsp Penicillium brefeldianum NRRL 710 Penicillium limosum CBS 339.97 Penicillium limosum CBS 339.97 Penicillium raperi NRRL 2674 Penicillium ehrlichii NRRL 708 NR 138263 NR 111496.1 NR 138339.1 NR 121230.1 NR 121229.1 93 90 93 93 93 99 98 97 97 97 216 LĐL 4.4 Tsp 41 Tsp 33 Penicillium citrinum NRRL 184 Penicillium hetheringtonii CBS 122392 Penicillium tropicum CBS 112584 Penicillium sizovae CSS 423.69 Penicillium malacaense NRRL 35754 NR 121224.1 NR 111482.1 88 84 99 98 NR 111485.1 NR 111487.1 NR 121344.1 82 82 88 96 96 94 Penicillium reticulisporum NRRL 3447 Penicillium pedernalense Penicillium pulivllorum CBS 280.39 Penicillium canariense NRRL 710 Penicillium ochrochloron CBS 357.48 NR 121231.1 100 99 NR 146250.1 NR 138292.1 NR 121277.1 NR 111509.1 100 96 100 96 98 99 97 98 Talaromyces radicus CBS 100489 Talaromyces islandicus CBS 338.48 Talaromyces loliensis CBS 643.80 Talaromyces allahabadensis CBS 453.93 Talaromyces variabllis CBS 385.48 NR 103666.2 NR 103664.2 NR 103680.2 NR 111687.1 97 96 96 87 96 96 96 98 NR 103670.2 96 95 TĐL Fusarium fujikuroi CBS 221.76 Fusarium annulatum CBS 258.54 Fusarium acutatum CBS 402.97 Fusarium beomiforme NRRL 13606 Fusarium sublunatum CBS 189.34 NR 111889.1 NR 138275.1 NR 111143.1 NR 111885.1 NR 111606.1 96 96 96 92 89 94 93 93 94 93 Rsp 5.2 Fusarium sp DoF9 Fusarium sp DoF7 Fusarium sp WF110 Fusarium sp TA-60 JQ388254.1 JQ388252.1 HQ130669.1 FJ449951.1 96 96 96 96 99 99 99 99 Lsp 21 Alternaria alternata Alternaria cerealis Alternaria arborescens Alternaria idiriaustralis Alternaria betae – kenyensis NR 131316 NR 136117 NR 077186 NR 136120 NR 138118 100 100 100 100 100 99 98 97 96 96 TĐL 11 Trichoderma sp S1-1 Trichoderma hazinum isolate FIS21 Trichoderma hazinum strain ZG-2-21 Trichoderma hazinum strain NZDmf16 LT623984.1 KY378955.1 KT192387.1 91 91 91 99 99 99 KM278120.1 91 99 HQ43567.1 FJ48792.1 JN19722.1 82 82 79 99 99 99 10 Tsp 20 Xylaria sp XF15 Xylaria sp ZJ12-6B Xylaria sp UFMGCB 5027 217 Xylaria sp WL-2011 Xylaria venosula 11 Tsp 4h JN198509.1 AB462754.1 79 82 99 98 Fungal endophyte isolate 5020 Fungal endophyte isolate 6135 KR015942.1 KR016268.1 92 92 99 99 Fungal endophyte isolate 4893 KR015891.1 92 99 12 Tsp 5v Fungal endophyte sp MS25 Fungal sp CMU21 Fungal sp RTB2.1 DQ485958.1 GQ924914.1 KF688127.1 97 97 91 96 96 99 13 RĐL Fungal sp Isolate E2706B Fungal endophyte culture-collection STRI:ICBG-Panama:TK44 Fungal endophyte culture-collection STRI:ICBG-Panama:TK43 Fungal endophyte culture-collection STRI:ICBG-Panama:TK1415 Fungal endophyte culture-collection STRI:ICBG-Panama:TK412 KT996043.1 KF435852.1 89 89 99 99 KF435851.1 89 99 KF435850.1 89 99 KF435849.1 89 99 14 Tsp 13 Fungal sp ARIZ B088 Fungal endophyte isolate 6485 Fungal endophyte isolate 4987 Fungal endophyte isolate 5160 FJ612908.1 KR016453.1 KR015931.1 KR015972.1 95 95 95 95 99 99 96 96 15 Tsp 25 Fungal endophyte sp MS25 Fungal sp CMU27 Fugal sp RTB2.2 DQ485958.1 GQ924914.1 KF688127.1 97 97 91 96 96 99 16 LĐL Phoma herbarum strain LS2-CGS13 Phoma herbarum strain LL2-CGL13 Phoma herbarum strain FL10-CJL2 Phoma herbarum isolate LS2 Phoma herbarum strain FT16 KP900308.1 KP900303.1 KP9002441.1 KM520025.1 KP900326.1 98 98 98 98 98 99 99 99 99 99 17 Tsp Cephalotrichum cyclindricum UAMH 1348 Cephalotrichum asperulum CBS 582.71 Cephalotrichum dendrocephalum CBS 528.85 Cephalotrichum columnare CBS 159.66 NR 146264.1 95 99 NR 146262.1 95 98 NR 146265.1 95 97 NR 146263.1 95 96 K t quả: - Chủng nấm Tsp 41 ó đ tương đồng cao so với chủng Penicillium reticulisporum (đ d i đoạn so sánh 100%, mứ đ tương đồng 99%); chủng Tsp 41 đư x định Penicillium reticulisporum 218 - Chủng nấm Lsp 21 ó đ tương đồng cao so với chủng Alternaria alternata (đ d i đoạn so sánh 100%, mứ đ tương đồng 99%), chủng Lsp 21 đư x định Alternaria alternata - Chủng LĐL ó đ d i so s nh đạt 98%, mứ đ tương đồng 99% với chủng thu c lồi Phoma herbarum; vậy, chủng LĐL đư x định loài Phoma herbarum - Các chủng nấm cịn lại ó đ tương đồng < 98 v đ d i đoạn so sánh < 97% so với chủng đư c đối chiếu GenBank, kết so sánh không th khẳng định h nh x đư đến lồi chủng, có th khẳng định chúng thu c chi với loài có mứ đ tương đồng cao với chúng, bao gồm chủng thu hi: Tsp 1, LĐL 4.4 – Penicillium; TĐL 1, Rsp 5.2 – Fusarium; TĐL 11 – Trichoderma; Tsp 33 – Talaromyces; Tsp 20 – Xylaria, Tsp – Cephalotrichum - Riêng chủng Tsp 4h, Tsp 5v, Tsp 13, Tsp 25, RĐL thu c nhóm nấm bất thụ, so s nh v đối chiếu liệu ngân hàng Gen nk, húng ó đ tương đồng cao so với chủng hư x định đư đến hi v hư đư đ t tên phân loại Trong kết định d nh sơ phương ph p truyền thống, chủng Tsp 33 đư c xếp vào chi Penicillium, chủng Tsp thu c chi Paecilomyces Tuy nhiên, kết định danh phương ph p P R x định chủng Tsp 33 thu c chi Talaromyces chủng Tsp lại thu c chi Penicillium Chi Talaromyces thu c ngành Ascomycota, lớp Eurotiomycetes, họ Eurotiales Chi Talaromyces đư c biết đến lần đầu ti n năm 1955, nhà khoa họ người Mỹ Chester Ray Benjamin phát phân chi chi Penicillium (dựa vào sinh sản hữu tính trình tự ITS) Còn chi Paecilomyces m t chi gần với Penicillium bên cạnh chi Talaromyces, Eupenicillium, chúng có đ m hình thái gần tương đồng Hai chủng LĐL v Tsp đư c xếp vào nhóm nấm bất thụ ó v h th o phương ph p định danh truyền thống So sánh với kết định danh sinh học phân tử, chủng LĐL đư x định thu c loài Phoma herbarum chủng Tsp thu c chi Cephalotrichum Có th giải thích rằng, q trình ni cấy phát tri n nghiên cứu hình thái chủng này, chúng không sinh bào tử hay th nên việ đư c phân loại vào nhóm nấm bất thụ hệ thống nhóm nấm bị thiếu ho c không phát đư c đ m nấm hoàn chỉnh (tiếp h p, nang ho đảm) Việ định danh dựa trình tự vùng ITS cịn nhiều hạn chế lồi có tương đồng trình tự vùng rADN - ITS M t khác, theo phân loại truyền thống m t số chủng nghiên cứu thu c nhóm nấm bất thụ có vách, có th chúng thu c m t lồi hư đư c mơ tả cần thiết tiến hành thêm phương ph p ó hiệu o đ định d nh phương ph p giải trình tự th ng ng cao (high – throughput s qu n ing), … ũng ần x định vùng gen chuyên biệt v ng m hó tin, modu in, ndo hitin s , v ng Tef giúp h nh x việc phân biệt đư c nhóm với hay lồi nhóm 219 PHỤ LỤC ặ m hình thái chủng vi nấm T calidicanius T44C, Phyllosticta sp M1.10 Talaromyces calidicanius T44C Phyllosticta sp M1.10 220