Bg hoa phan tich 2 phan 2 9058

PHẦN THỨ BA – CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH Trong phân tích hóa học, vấn đề đặt xác định chất phân tích số đối tượng mẫu phức tạp là: Ảnh hưởng môi trường mẫu Hàm lượng chất phân tích q nhỏ Nhiều chất có tích chất hóa học vật lý giống Vì vậy, khó định lượng xác định lượng riêng chất, cần phải tách loại tạp chất làm giàu chất phân tích, sử dụng kỹ thuật gọi sắc ký để tách chất khỏi để định lượng Do đó, phần đề cập đến hai phương pháp là: Các phương pháp tách sắc ký Các phương pháp chiết 64 CHƯƠNG CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 1.1 Khái niệm chung 1.1.1 Lịch sử phát triển Năm 1903, M C Txvet tiền hành tách chất có tính chất giống chlorophyl, -chlorophyl, -xatophyl, -xatophyl, thành dãy màu khác Txvet gọi “Chromatography” “Chroma” có nghĩa màu “Graphy” có nghĩa ghi Năm 1931, Vinterstin Ledere tách carotin, Năm 1941, Martin Synge phát triển sắc ký giấy đưa lý thuyết đĩa để giải thích q trình sắc ký Đồng thời nghiên cứu tách alcaloid từ thuốc để bào chế dược phẩm, Từ năm 1952, máy sắc ký đời hàng loạt kỹ thuật phát triển: GC-MS, LC-MS 1.1.2 Quá trình tách sắc ký định nghĩa a Quá trình tách sắc ký Quá trình tách sắc ký chuỗi phản ứng phức tạp từ lúc nạp mẫu vào cột tách chất phân tích khỏi cột b Định nghĩa Sắc ký phương pháp tách, phân ly, phân tích chất dựa vào phân bố khác chúng pha tĩnh pha động cho pha động qua pha tĩnh Dựa theo tính chất pha động, sắc ký chia thành loại: Sắc ký khí: pha động khí Sắc ký lỏng: pha động chất lỏng Theo mục đích nghiên cứu Sắc kí phân tích dùng để xác định danh tính nồng độ phân tử hỗn hợp Sắc ký tinh chế dùng để tinh chế chất có hỗn Q trình sắc ký khác với trình tách khác điểm: 65 Sự phân bố chất phân tích lên pha lặp lặp lại nhiều lần Pha động qua pha tĩnh Hình 1.1 Quá trình tách sắc ký 1.1.3 Phân loại phương pháp sắc ký a Phân loại theo hệ pha PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ SẮC KÝ LỎNG (LC) SẮC KÝ KHÍ (GC) SK K–R SK ĐDMQ SK K–L SK PB L–L HPLC SK R–L SKLM SK Phẳng SK Giấy b Phân loại theo chế tách Cơ chế tách nói lên chất liên kết chất phân tích với pha tĩnh, khơng cần phân biệt hệ pha, có loại chế tách chính: SK Hấp phụ SK Phân bố SK ion SK Rây PT Sắc ký hấp phụ (SKHP): Chất phân tích phân bố pha tĩnh pha động nhờ tương tác phân tử (lực Vander-van) thông qua trung tâm hấp phụ 66 Sắc ký phân bố lỏng – lỏng (L-L): Phân biệt sắc ký phân bố L-L phân bố thông thường chỗ: Sự phân bố L-L gọi sắc ký chiết Sự phân bố nói chung phân chia chất phân tích vào pha khơng xét tới trạng thái Sự khác sắc ký phân bố L-L SKHP: Sắc ký phân bố L-L có đường đẳng nhiệt tuyến tính khoảng nhiệt độ lớn, phương pháp có độ nhạy cao Pha tĩnh khơng bền vững, tượng trôi pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm Sắc ký Ion (Trao đổi ion): Pha tĩnh chất rắn có khả trao đổi ion với ion chất phân tích pha động Lực liên kết ion chất phân tích pha tĩnh liên kết tĩnh điên, phụ thuộc nhiều vào điện tích ion chất phân tích, pH dung dịch bán kính Hydrat hóa ion chất phân tích Sắc ký rây phân tử: Pha tĩnh chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có đường lịng chất rắn – mao quản có kích thước cỡ phân tử Các phân tử chất phân tích thấm vào chất rắn mức độ khác tùy theo kích thước chúng Các phân tử có kích thước lớn khơng sâu vào pha tĩnh rửa giải nhanh, có kích thước bé sâu vào pha tĩnh rửa giải chậm Thời gian lưu chất tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử chúng c Phân loại theo cách hình thành sắc đồ Phân tích tiền lưu Phân tích đẩy Phân tích rửa giải 1.1.4 Các lực liên kết hệ sắc ký Trong hệ sắc ký có thành phần chủ yếu: chất phân tích, pha tĩnh., pha động a Lực liên kết ion 67 Trên pha tĩnh, xét phân tử R–SO3H R–SO3H  R–SO3– + H+ , R–SO3– + M+  R–SO3M Trung tâm hoạt động ion Chất phân tích Tương tác tương tác tĩnh điện, gọi liên kết ion Trong pha động tồn trung tâm hoạt động ion Pha tĩnh có trung tâm cation lưu giữ anion ngược lại Các phương pháp sắc ký có tham gia liên kết ion gọi “Sắc ký ion”, “Sắc ký cặp ion” b Lực phân cực Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải pha động phân tử pha tĩnh có trung tâm phân cực Các trung tâm liên kết với lực liên kết phân cực Sự phân cực chênh lệch độ phân cực thường nhỏ Nhưng yếu tố quan độ bền liên kết khác nhau, dẫn đến phân chia phép tách sắc ký c Lực Van-de-van (lực phân tán) Lực chất điện, nhiên khơng có cực điện hệ Do tương tác phân tán phân tử chứa mạch hydrocacbon d Lực tương tác đặc biệt Lực tương tác đặc biệt tạo liên kết hydro liên kết cho nhận, Sự hình thành liên kết hydro thường xảy với nguyên tố có độ âm điện cao O, N, F, Năng lượng liên kết giảm dân theo thứ tự sau: F – H – F > O – H – O > N – H – N > C – H – C 1.2 Các đại lượng đặc trưng 1.2.1 Hệ số phân bố Cấu tử A phân bố pha động – tĩnh, cân thiết lập, AS  AM S: pha tĩnh, M: pha động 68 Hệ số phân bố pha KD = [AS] / [AM] Trong đó, [AS], [AM] nồng độ cấu tử A pha tĩnh pha động Cân sắc ký cân động, có dạng cân sau: Cân Lỏng – Lỏng (L – L) Cân Lỏng – Khí (L – K) Cân Lỏng – Rắn (L – R) Cân Rắn – Khí (R – K) Xét đĩa thứ n có phân bố A pha, pha động di chuyển nên A lại xuống đĩa n + xuất cân Để xác định KD cân phải thiết lập nhanh Vì vậy, pha tính phải mỏng, hệ số khuếch tan A pha tĩnh lớn, hệ số khuếch tán A pha động nhỏ Xác định KD phương pháp tĩnh, tức đo nồng độ A pha động pha tĩnh sau cân sau: Trong đó, M lượng A ban đầu (g), M1 lượng A lại sau tiếp xúc (g), V thể tích pha động (ml), m lượng chất hấp phụ (g) 1.2.2 Sự liên hệ tốc độ di chuyển A KD Gọi fA phần thời gian chất A pha động, ta có: Chia tử mẫu cho [A]m Vm: Trong đó, k’A hệ số dung tích Tốc độ tuyến tính A pha động: uA = u fA = u / (1 + k’A) 69 Trong đó, u tốc độ tuyền tính pha động (cm/s) KDA hay k’A lớn chất A di chuyển chậm ngược lại 1.2.3 Thời gian lưu (tRA) thời gian lưu hiệu chỉnh (t’RA) tRA: thời gian tính từ lúc bơm mẫu vào đầu cột tời píc đạt giá trị cực đại Trong đó, L chiều dài cột (cm) tm thời gian A không lưu giữ cột (thời gian chết): tm = L / u tRA’ thời gian khơng tính đến thời gian chết, tức tRA’ = tRA - tm = tm kA’ 1.2.4 Thể tích lưu (VRA) thể tích lưu hiệu chỉnh (V’RA) VRA thể tích dung dịch rửa giải tính từ bắt đầu bơm mẫu vào cột tới pic đạt giá trị cực đại Gọi F tốc độ chảy pha động (ml/phút), VRA Vm tính sau: VRA = tRA F Vm = tm F  VRA = Vm (1 + k’) V’RA thể tích lưu loại thể tích trống cột V’RA = VRA – Vm = Vm k’ = KDA Vs Thể tích lưu riêng (Vg) thể tích đặc trưng riêng cho A, thể tích dung dịch rửa giải để rửa A đơn vị thể tích pha tĩnh Vg = V’RA / Vs = KDA 1.2.5 Hệ số tách () – gọi hệ số lưu giữ tương đối  đặc trưng cho khả tách chất A B phương pháp sắc ký Được xác định qua công thức sau: 70  = KDA / KDB = k’A / k’B Điều kiện để tách A B   Hệ số phân bố A B pha tĩnh động phải khác Tỷ số hai hệ số phân bố tỷ số thể tích lưu riêng hay tỷ số thời gian lưu riêng A B Vậy xác định:  = KDA / KDB = k’A / k’B = t’RA / t’RB = V’RA / V’RB 1.2.6 Sắc đồ Sắc đồ đường biểu diễn phụ thuộc diện tích (S) chiều cao (h) tín hiệu đo (độ hấp thu quang, độ dẫn, tần số xung) liên quan đến nồng độ chất phân tích vào thời gian Tín hiệu gọi “Pic” sắc ký WA (bề rộng chân pic) thời gian (thể tích mà pic đạt cực đại) 1.2.7 Đĩa lý thuyết (n) cách xác định n thực nghiệm n phần cột mà cân phân bố A từ pha động vào pha tĩnh ngược lại thiết lập Theo Martin Synge, cân thiết lập nhanh chóng, tức thời Tuy nhiên, khơng giải thích tượng giãn rộng vùng mẫu pic sắc ký không cân đối Giả sử pic tuân theo hàm Gauss Gọi  độ lệch chuẩn t (hay V) Đối với cột sắc ký, n lớn pic hẹp  tRA  n 71 Mặt khác, ta có: W =  hay  = W / Vậy, số đĩa lý thuyết xác định: Xác định H (chiều cao đĩa lý thuyết): H = L / n Nếu H nhỏ, số đĩa lý thuyết n lớn, độ phân giải tốt 1.2.8 Độ phân giải, cách làm tăng độ phân giải Độ phân giải (R) nói lên khả tách cấu tử khỏi trình tách sắc ký R xác định sau: R = 2(tRB – tRA) / (WA + WB) = tR / (WA + WB) Có thể dùng VR thay cho tR R lớn khả tách tốt: Khi R = 1, tách khoảng 95%, tức 2,5% A B 2,5% B A Khi R = 1,5 tách khoảng 99,8% Cách làm tăng R: Thay đổi cấu trúc cột: tăng L, kích thước hạt nhồi cột nhỏ, giảm đường kính cột Dựa vào vận hành: tối ưu hóa pha động, giảm mẫu, giảm nhiệt độ 1.3 Nội dung thuyết dòng khuếch tán sắc ký Mặc dù, đưa khái niệm n H không giải thích tượng giãn rộng vùng mẫu, pic sắc ký khơng cân đối Vì vậy, Van Deemter phát triển đưa “Thuyết dòng khuếch tán sắc ký” Khi q trình sắc ký diễn ra, có loại khuếch tán định di chuyển chất tan xuất hiện, gồm: khuếch tán xoáy (H1), khuếch tán dài (H2), khuếch tán chuyển khối (H3) a Khuếch tán xoáy Độ giãn rộng vùng chất cột khuếch tán xốy gây mơ tả bằng: H1 =  dp 72 Trong đó, H1 đại lượng đặc trưng cho khuếch tán xoáy phụ thuộc vào: độ đồng hạt hồi, đường kính hạt nhồi, khả nhồi cột dp: đường kính hạt nhồi  : Hệ số nạp cột, nạp tốt  = 1,5 b Khuếch tán phân tử pha L pha K Hiện tượng chất phân tích có xu di chuyển phía cột tốc độ pha động vậy, dẫn đến sự khuếch tán dài (dọc) xác định qua biểu thức: H2 =  Dm / u Trong đó, Dm: Hệ số khuếch tán chất phân tích pha động, u: Tốc độ di chuyển thẳng dòng pha động, : Hệ số khúc khuỷu, phụ thuộc vào hình dáng hạt khoảng cách hạt chất nhồi (độ xít đặc) c Sự khuếch tán chuyển khối Các cấu tử có khối lượng phân tử khác có tốc độ di chuyển khác  tốc độ trao đổi chất pha khác Mặt khác, phụ thuộc nhiều vào tốc độ hấp phụ giải hấp H3 = (CS + Cm) u Trong đó, CS đặc trưng cho chuyển khối pha tĩnh Khi tốc độ dòng F  CS  Giá trị CS tính qua biểu thức: CS = K dS2 / DS Trong đó, K: hệ số, dS: chiều dày pha tĩnh, DS: hệ số khuếch tán chất phân tích pha tĩnh Cm đặc trưng cho chuyển khối pha động Giá trị Cm tính qua biểu thức: Cm =  dp2 / Dm Trong đó, : hệ số thực nghiệm, có giá trị từ 0,5 đến 1, dp: chiều dày pha động, Dm: hệ số khuếch tán chất phân tích pha động 73  Hiệu cao  Cột làm việc ổn định  Có thể phân tích cho hai loại cấu tử có đặc tính tương tự khác xa Ổn định nhiệt độ cột (Column Thermostats)  Phần lớn ứng dụng cua HPLC thực nhiệt độ phòng  Tuy chất lượng sắc ký đồ tốt trì nhiệt độ cột không thay đổi (sai số < 0,05°C) 91  Thiết bị HPLC đại trang bị thêm lò gia nhiệt cho cột (Column heater) ổn định nhiệt độ gần 150°C với sai số < 0,05°C  Trang bị hệ thống phun nước làm lạnh (water jackets fed) từ bể ổn nhiệt để khống chế xác nhiệt độ  Các phương pháp nâng cao độ phân giải HPLC  Tăng chiều dài cột (Increase column length)  Giảm đường kính cột (Decrease column diameter)  Giảm lưu lượng pha động (Decrease flow-rate)  Pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) đồng (Uniform stationary phase (packing))  Giảm thể tích bơm mẫu (Decrease sample size)  Lựa chọn pha tĩnh (Select proper stationary phase)  Lựa chon pha động tinh khiết (Select proper mobile phase)  Sử dụng áp suất ổn định (Use proper pressure)  Thành phần pha động thay đổi hợp lý (Use gradient elution)  So sánh HPLC GC (Comparison of HPLC and GLC)  Hiệu quả, độ chọn lọc cao, ứng dụng rộng rãi  Thể tich mẫu nhỏ  Có thể khơng phá hủy mẫu (nondestructive of sample)  Định lượng dễ dàng  Ưu điểm HPLC  Áp dụng với mẫu không bay không bền nhiệt  Áp dụng cho ion vô  Ưu điểm GC  Nhanh chóng 92  Dễ dàng kết Thiết bị đơn giản rẻ  nối với phổ khối 93 Các loại pha tĩnh nhồi cột thường đa dạng, gồm loại sau: 94 • Cột pha thường (Normal phase column) dùng cho phân tích chất phân cực • Cột pha đảo (Reverse phase): thường áp dụng phân tích hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ (< 2000đvC), khơng có mang điện tích, phân cực khơng phân cực, hịa tan dung mơi hữu nước • Cột trao đổi ion (Ion exchange Column) thường áp dụng phân tích hợp chất có mang điện tích (loại hợp chất hịa tan nước có trọng lượng phân tử nhỏ) (