Nghiên Cứu Đặc Điểm Thực Vật Học Và Hoạt Tính Sinh Học Của Cao Chiết Từ Loài Adinandra Bockiana.pdf

Untitled ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÂN THỊ KIM PHƯỢNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ LOÀI Adinandra bockiana LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái N[.]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÂN THỊ KIM PHƯỢNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ LỒI Adinandra bockiana LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, tháng 12/2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÂN THỊ KIM PHƯỢNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ LOÀI Adinandra bockiana Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Hữu Quân Thái Nguyên, tháng 12/2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020 Tác giả luận văn Thân Thị Kim Phượng XÁC NHẬN XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN PGS.TS Nguyễn Hữu Quân i LỜI CẢM ƠN Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hữu Quân, giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ em q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Văn Khang, giảng viên Khoa Hóa học hướng dẫn em tách chiết định tính chất hóa học Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ Trần Thị Hồng, kỹ thuật viên Phịng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, cô Cao Thị Phương Thảo, kỹ thuật viên Phịng thí nghiệm Thực vật học thuộc Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp em suốt trình nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Khoa Sinh học thầy cô giáo thuộc phận sau đại học, Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè động viên, khuyến khích giúp đỡ em tiến trình học tập hoàn thành luận văn Em xin cảm ơn hỡ trợ kinh phí từ đề tài Quỹ Nafosted “Phân tích thành phần hóa học tìm kiếm hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng ung thư kháng viêm từ số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) Việt Nam”, mã số 106.02-2018.338 Thái Nguyên, tháng 12 năm 2020 Tác giả luận văn Thân Thị Kim Phượng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra) 1.1.1 Chi Dương đồng (Adinandra) 1.1.2 Loài Adinandra bockiana 1.2 Hoạt tính sinh học thành phần hóa học lồi thuộc chi Adinandra 1.2.1 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 12 2.1.1 Vật liệu môi trường nuôi cấy 12 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 12 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu .14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Phương pháp phân loại hình thái 14 2.2.2 Phương pháp giải phẫu thực vật 14 2.2.3 Phương pháp điều chế mẫu thử hoạt tính .15 2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 16 2.2.5 Phương pháp xác định khả chống oxy hóa DPPH .16 2.2.6 Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư ni cấy dạng đơn lớp .16 2.2.7 Phương pháp định tính cao chiết 17 iii 2.2.8 Phân lập hợp chất 19 2.2.9 Phương pháp xử lý phân tích kết 20 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .21 3.1 Đặc điểm hình thái, giải phẫu lồi Adinandra bockiana 21 3.1.1 Đặc điểm hình thái lồi Adinandra bockiana 21 3.1.2 Đặc điểm giải phẫu loài Adinandra bockiana .22 3.2 Hoạt tính sinh học cao chiết từ lồi Adinandra bockiana 25 3.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ loài A bockiana 25 3.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết loài A.bockiana .28 3.2.3 Hoạt tính kháng tế bào ung thư cao chiết ethanol từ loài A bockiana 30 3.3 Khảo sát hợp chất có dịch chiết A bockiana 31 3.3.1 Định tính polyphenol 31 3.3.2 Định tính tanin 31 3.3.3 Định tính flavonoid 32 3.3.4 Định tính coumarin .32 3.3.5 Phân tích thành phần hợp chất cao chiết loài A bockiana .33 3.4 Kết tách chiết số hợp chất có dịch chiết A bockiana 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 KẾT LUẬN 35 KIẾN NGHỊ 35 CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng việt Tên tiếng Anh DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EC50 Effective concentration 50% Nồng độ 50% tác dụng tối đa ELISA Enzyme linked immunosorbentassay Thử nghiệm miễn dịch gắn enzyme EtOH Ethanol Hep G2 Hepatocellular human HPLC High Performance Chromatography IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể ISSR Inter Simple Sequence Repea Đánh giá sai khác di truyền thực vật LB Luria Bertani Môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật MCF-7 Ardeno carcinoma Ung thư vú MeOH Methanol MIC Minimalinhibitory concentration Nồng độ tối thiểu ức chế MS/MS Mass spectrometry Phương pháp khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân carcinoma Ung thư gan người Liquid Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao OD Mật độ quang học TTC Triphenyl tetrazolium chloride Chỉ thị màu TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách loài thuộc chi Adinandra phân bố Việt Nam Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng thí nghiệm 12 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng thí nghiệm 13 Bảng 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ loài A bockiana 25 Bảng 3.2 Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết 29 Bảng 3.3 Tác động gây độc tế bào ung thư cao chiết .30 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Một số lồi thuộc chi Adinandra Hình 1.2 Mẫu A bockiana phát Trung Quốc [28] Hình 1.3 Các hợp chất flavonoid triterpene saponins từ A nitida Hình 1.4 Các hợp chất saponin thuộc lồi A.nitida .10 Hình 2.1 Một số thiết bị sử dụng thí nghiệm 13 Hình 2.2 Quy trình điều chế mẫu cao chiết lồi A.bockiana 15 Hình 2.3 Sơ đồ phân lập chất 20 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái lồi A bockiana thu xã Liêm Phú, huyện Văn Bàn, tỉnh Lào Cai 21 Hình 3.2 Giải phẫu cắt ngang thân A bockiana .23 Hình 3.3 Giải phẫu cắt ngang A.bockiana 25 Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết vi khuẩn B subtilis 26 Hình 3.5 Hoạt tính kháng cao chiết vi khuẩn L Plantarum .26 Hình 3.6 Hoạt tính kháng cao chiết vi khuẩn E.coli 27 Hình 3.7 Hoạt tính kháng cao chiết vi khuẩn S marcescens .27 Hình 3.8 Hoạt tính kháng cao chiết vi khuẩn S lutea 28 Hình 3.9 Màu sắc mẫu khử gốc tự DPPH trước đo cao ethanol 30 Hình 3.10 Phản ứng với muối sắt (III) (A) với dung dịch H2SO4 đặc (B) 31 Hình 3.11 Định tính tanin phản ứng với thuốc thử vanilin/H2SO4 (A) định tính flavonoid (B) 32 Hình 3.12 Định tính coumarin phản ứng với NaOH (A) HCl đặc (B) .32 Hình 3.13 Sắc kí đồ cao chiết ethanol (T), cao chiết ethyl acetate (E) cao chiết dichloromethane (D) .33 Hình 3.14 Sắc ký lớp mỏng số đoạn cao chiết .34 Hình 3.15 Sắc ký lớp mỏng so sánh cao tổng số chất A1 .34 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam quốc gia nằm vùng nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú với nguồn dược liệu dồi có truyền thống sử dụng nguồn dược liệu từ tự nhiên lâu đời Hệ thực vật coi nguồn nguyên liệu vô quý cho nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, nghiên cứu hoạt tính sinh học theo hướng đại Nghiên cứu hoạt tính sinh học hợp chất có nguồn gốc từ thực vật đóng vai trị quan trọng phát triển lĩnh vực y dược phục vụ cho sống người Xu hướng sử dụng hợp chất thiên nhiên có sẵn để điều chế dược phẩm, thực phẩm nhà khoa học đặc biệt quan tâm Trong số hợp chất thu được, có hợp chất thể hoạt tính gây độc tế bào ung thư, số khác lại thể hoạt tính kháng vi sinh vật Tác dụng chữa bệnh, tăng cường bảo vệ sức khỏe người nhiều loài thực vật chủ yếu hợp chất tự nhiên mà chúng sinh tổng hợp, tích luỹ q trình sinh trưởng phát triển Trên giới có số cơng trình cơng bố thành phần hóa học tác dụng sinh học số loài thực vật thuộc chi Dương đồng (Adinandra), họ Chè (Theaceae) Kết nghiên cứu nhiều hợp chất phân lập từ lồi Adinandra nitida thể hoạt tính kháng rộng kháng viêm, chống oxi hóa, diệt trừ gốc tự do, chống ung thư chống lại số loài vi khuẩn gây bệnh Ở Việt Nam, nghiên cứu chi Adinandra bước đầu tập trung việc thống kê danh sách thành phần loài, ngoại trừ lồi Adinandra lienii cơng bố đặc điểm giải phẫu, hoạt tính sinh học cao chiết trình tự đoạn gen matK Trong lồi Adinandra bockiana chưa có cơng bố đặc điểm thực vật học, hoạt tính sinh học thành phần hóa học Do đó, nghiên cứu đặc tính sinh học tìm cấu trúc hóa học, thành phần hợp chất hoạt tính sinh học hợp chất lồi cần thiết Xuất phát từ sở tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật học hoạt tính sinh học cao chiết từ loài Adinandra bockiana” Mục tiêu nghiên cứu - Phân tích đặc điểm thực vật học loài A.bockiana thu thập Hình 3.3 Giải phẫu cắt ngang A.bockiana Biểu bì trên; Mơ giậu; Mơ xốp; Biểu bì dưới; Vịng mơ cứng; Gỡ; Libe; Mô mềm; Mô dày; 10 Tinh thể canxi oxalat ( Hình ảnh quan sát độ phóng đại 160 lần) So sánh đặc điểm giải phẫu thân loài A bockiana nghiên cứu với lồi A glischroloma, A lienii cơng bố cho thấy đặc điểm giải phẫu loài thuộc chi Adinandra có tương đồng 3.2 Hoạt tính sinh học cao chiết từ loài Adinandra bockiana Loài A bockiana thái nhỏ, phơi bóng mát, sấy khơ nhiệt độ 50°C đến khối lượng không đổi, sau đem nghiền nhỏ Cao chiết phân đoạn lồi A bockiana điều chế theo sơ đồ hình 2.1 phần phương pháp đem sấy khô sử dụng để tiến hành cho thí nghiệm 3.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ lồi A bockiana Cao chiết ethanol (M1, M2, M3), cao ethyl acetate (M4, M5, M6) cao dichloromethane (M7, M8, M9) từ loài A bockiana sử dụng để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn nồng độ tương ứng 20; 60 200 µg/ml Kết thử hoạt tính kháng khuẩn thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ lồi A bockiana Vi khuẩn B subtilis S macessens S lutea L plantarum E.coli M1 6,7 ± 0,3 Đường kính vịng kháng khuẩn (D - d) (mm) M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 16,0 ± 0,6 3,0 ± 0,6 7,7 ± 0,3 7,3 ± 0,3 17,3 ± 0,7 6,3 ± 0,3 15,7 ± 0,3 13,0 ± 0,6 24,7 ± 0,3 15,7 ± 0,3 7,3 ± 0,3 5,0 ± 0,6 17,0 ± 0,6 5,0 ± 0,6 11,0 ± 0,6 6,3 ± 0,3 20,7 ± 0,3 3,7 ± 0,3 0 0 0 25 22,3 ± 0,3 14,0± 0,6 29,7 ± 0,9 20,7 ± 0,3 10,3 ± 0,3 9,3 ± 0,3 8,3 ± 0,3 18,7 ± 0,3 5,3 ± 0,3 5,0 ± 0,6 13,3 ± 0,3 11,0 ± 0,6 20,7 ± 0,3 7,0 ± 0,6 7,0 ± 0,6 M9 24,0 ± 0,6 14,3 ± 0,7 25,0 ± 0,6 21,3 ± 0,3 4,3 ± 0,3 Ghi chú: - DMSO H2O đối chứng - M1, M2, M3: Cao ethanol nồng độ 20; 60 200 µg/ml - M4, M5, M6: Cao ethyl acetate nồng độ 20; 60 200 µg/ml - M7, M8, M9: Cao dichloromethane nồng độ 20; 60 200 µg/ml Cao ethanol, cao ethyl acetate cao dichloromethane thể hoạt tính kháng vi khuẩn B subtilis nồng độ Hoạt tính kháng vi khuẩn B subtilis tăng dần từ nồng độ 20 µg/ml, nồng độ 60 µg/ml mạnh nồng độ 200 µg/ml Đường kính vịng kháng khuẩn dao động khoảng từ 6,7-24 mm Trong đó, cao chiết dichloromethane nồng độ 200 µg/ml có hoạt tính kháng B subtilis cao nhất, đường kính vịng kháng khuẩn đạt khoảng 24 mm (Hình 3.4) Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết vi khuẩn B subtilis Với vi khuẩn L plantarum, ba loại cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn nồng độ khảo sát Đường kính vịng kháng khuẩn thu nằm khoảng từ 3- 21,3 mm Hoạt tính kháng vi khuẩn L plantarum thấp nồng độ 20 µg/ml, nồng độ 60 µg/ml cao nồng độ 200 µg/ml Trong đó, cao dichloromethane có hoạt tính kháng vi khuẩn L plantarum mạnh so với cao ethanol cao ethyl acetate Ở nồng độ 200 µg/ml đường kính vịng kháng vi khuẩn L plantarum từ cao dichloromethane đạt khoảng 21,3 mm (Hình 3.5) Hình 3.5 Hoạt tính kháng cao chiết vi khuẩn L Plantarum 26 Đối với vi khuẩn E coli, cao chiết nồng độ 20 µg/ml khơng có hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng vi khuẩn E coli có cao chiết nồng độ 60 µg/ml cao ethyl acetate nồng độ 200 µg/ml cao ethanol dichloromethane Tuy nhiên, hoạt tính có loại chiết vi khuẩn E coli yếu, đường kính vịng kháng khuẩn đạt khoảng 4,3-10,3 mm cao chiết ethyl acetate (Hình 3.6) Hình 3.6 Hoạt tính kháng cao chiết vi khuẩn E.coli Đối với vi khuẩn S marcescens, cao chiết nồng độ khảo sát có hoạt tính kháng khuẩn, ngoại trừ cao ethanol nồng độ 20 µg/ml khơng có hoạt tính kháng khuẩn Tuy nhiên, hoạt tính kháng vi khuẩn S marcescens có cao ethanol nồng độ 60; 200 µg/ml; cao ethyl acetate cao dichloromethane nồng độ 20; 60; 200 µg/ml đạt mức thấp trung bình Đường kính vịng kháng khuẩn có dao động khoảng từ 5-14,3 mm (Hình 3.7) Hình 3.7 Hoạt tính kháng cao chiết vi khuẩn S marcescens Đối với vi khuẩn S lutea, ba loại cao chiết thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh nồng độ 20; 60; 200 µg/ml cao so với loại vi khuẩn khảo sát Đường kính vịng kháng khuẩn dao động khoảng từ 16-29,7 mm Hoạt tính kháng vi khuẩn S lutea mạnh cao ethyl acetate nồng độ 200 µg/ml, tiếp đến cao dichloromethane ethanol (Hình 3.8) 27 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ A bockiana với loài vi khuẩn kiểm định cho thấy: (1) cao chiết ethanol có khả ức chế lồi vi khuẩn B subtilis, S marcessens, S lutea, L plantarum (2) Cao chiết ethyl acetae dichloromethane có khả ức chế loài vi khuẩn B subtilis, S marcessens, S lutea, L plantarum, E coli (3) Cao chiết dichloromethane ethyl acetae có khả ức chế tốt cao chiết ethanol Như vậy, hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethyl acetae dichloromethane tốt so với cao chiết ethanol Hình 3.8 Hoạt tính kháng cao chiết vi khuẩn S lutea So sánh với hoạt tính kháng khuẩn lồi Adinandra lienii thuộc chi Adinandra tác giả Nguyễn Hữu Quân cộng công bố, ta thấy cao chiết ethyl acetate từ lồi A bockiana có hoạt tính kháng khuẩn tốt cao chiết từ ethyl acetate loài A lienii Vì vậy, lồi A bockiana sử dụng lồi cao chiết từ dung mơi ethyl acetate dichloromethane để tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học 3.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết lồi A.bockiana Hiện nay, hoạt tính chống oxy hóa từ chất có nguồn gốc sinh học nhà khoa học quan tâm nhiều Các chất chống oxy hóa biết đến vitamin E, vitamin C, lycopen, resveratrol, số chất trao đổi thứ cấp khác Các chất bổ sung vào dược phẩm thực phẩm chức có tác dụng tăng cường khả miễn dịch thể, phòng điều trị bệnh gốc tự sinh tiểu đường, tim mạch, alzheimer, ung thư… Các chất chống oxy hóa nguồn gốc thực vật ưa chuộng đặc điểm lý hóa chúng thân thiện với thể, bền nhiệt… chất thường có chất polyphenol Do vậy, chúng tơi tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật 28 Trong nghiên cứu này, cao chiết ethyl acetate, cao dichloromethane cao ethanol từ loài A bockinana chúng tơi thử nghiệm hoạt tính khử gốc tự DPPH Kết bảng 3.2 cho thấy, hiệu khử gốc tự DPPH cao ethyl acetate, cao dichloromethane cao ethanol tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết, nồng độ cao chiết tăng từ 0,5-128 µg/ml hiệu khử gốc tự tăng dần từ 0-89,8% Cao ethyl acetate có hoạt tính mạnh thể nồng độ khử gốc tự DPPH với giá trị EC50 0,2 µg/ml, tiếp đến cao dichloromethane (giá trị EC50 0,47 µg/ml) cao ethanol (giá trị đạt 5,7µg/ml) Tuy nhiên, nồng độ 128 µg/ml, hoạt tính khử gốc tự cao dichloromethane cao đạt 89,8%; tiếp đến cao ethyl acetate (đạt 84,1%) cao ethanol (đạt 71,5%) Màu sắc dung dịch khử gốc tự DPPH trước đo cao ethanol minh họa hình 3.9 Bảng 3.2 Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết Khả khử gốc tự DPPH (%) Nồng độ (µg/ml) Cao ethyl Cao acetate dichloromethane Cao ethanol 0,5 83,4 53,0 0,0 2,0 84,4 71,0 1,4 8,0 87,9 88,6 70,1 32 87,7 89,1 77,9 128 84,1 89,8 71,5 EC50 0,2 µg/ml 0,47 µg/ml 5,7 µg/ml 29 Hình 3.9 Màu sắc mẫu khử gốc tự DPPH trước đo cao ethanol 3.2.3 Hoạt tính kháng tế bào ung thư cao chiết ethanol từ loài A bockiana Gao et al (2010) phân lập camellianin A, loại flavonoid từ loài Adinandra nitida chứng minh chất có hoạt tính ức chế tăng sinh trình apoptosis tế bào ung thư gan (Hep G2) ung thư tuyến vú (MCF-7)[14] Một số hợp chất dị vòng chứa coumarin có liên quan đến đặc tính chống viêm (El-Haggar and Al-Wabli, 2015), kháng khuẩn (Shi and Zhou, 2011), kháng virus (Tsay et al., 2014) chống ung thư (Jacquot et al., 2007) Ngoài ra, coumarin thể tác dụng gây độc tế bào ung thư tế bào Hep2 (loại biểu mô người), ảnh hưởng tới trình apoptosis, biến lớp màng vi nhung mao, làm giảm hàm lượng huyết tương tế bào chất phân hủy nhân (Mirunalini et al., 2014) Trong nghiên cứu chúng tôi, cao chiết từ loài A bockiana xác định bước đầu có chứa flavonoid hợp chất coumarin, hợp chất liệu có khả kháng tế bào ung thư khơng Do đó, chúng tơi tiến hành xác định sơ hoạt tính kháng tế bào ung thư cao chiết từ loài A bockiana làm sở cho trình tinh hợp chất flavonoid coumarin đạt hiệu cao Nghiên cứu thử nghiệm ba dòng tế bào ung thư MDA-MB-231 (ung thư vú), AGS (ung thư dày) A549 (ung thư phổi) Bảng 3.3 Tác động gây độc tế bào ung thư cao chiết Nồng độ (µg/mL) % ức chế phát triển dòng tế bào A549 AGS MDA-MB-231 100 93,20 ± 1,50 85,08 ± 1,23 91,20 ± 1,59 20 24,32 ± 1,31 18,48 ± 0,75 27,72 ± 1.47 14,81 ± 0,67 11,22 ± 0,98 10,49 ± 0,62 0.8 6,07 ± 0,93 3,64 ± 1,02 0,62 ± 1,29 IC50 48,73 ± 3,76 58,62 ± 1,45 43,15 ± 2,39 Kết bảng 3.3 cho thấy cao chiết từ lồi A bockiana có khả ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư MDA-MB-231 (ung thư vú), AGS (ung thư dày) A549 (ung thư phổi) với giá trị IC50 đạt 43,15±2,39; 58,62±1,45 48,73±3,76 µg/ml Trong đó, hiệu ức chế cao chiết dòng tế bào ung 30 thư vú lớn nhất, tiếp đến dòng tế bào ung thư phổi thấp dòng tế bào ung thư dày Như vậy, cao chiết từ loài A bockiana có hoạt tính chống tế bào ung thư vú, ung thư dày ung thư phổi, kết làm để tinh hợp tinh khiết có khả chống ung thư 3.3 Khảo sát hợp chất có dịch chiết A bockiana 3.3.1 Định tính polyphenol Cao chiết lồi A bockiana định tính polyphenol thuốc thử với muối sắt (III), nhận thấy dung dịch ống nghiệm II chuyển sang màu xanh lục khác so với màu ống nghiệm I (Hình 3.10A) Trong định tính dung dịch H2SO4 đặc, dung dịch ống nghiệm II chuyển sang màu vàng nâu đậm màu cao chiết (Hình 3.10B) Như cao chiết lồi A bockiana có chứa nhóm chất polyphenol A B Hình 3.10 Phản ứng với muối sắt (III) (A) với dung dịch H2SO4 đặc (B) I Dung dịch ban đầu; II Dung dịch sau phản ứng 3.3.2 Định tính tanin Về mặt hóa học tanin cấu tạo từ acid tannic acid gallic phổ biến dạng liên kết với đường Tanin chia làm nhóm, tanin thủy phân (pyrogallic tanin) tanin ngưng tụ (condensed tanin) Tanin có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, giảm khả sống sót giun kí sinh, gây tủa protein Kết từ phản ứng cao chiết từ A bockiana với vanilin H2SO4 làm cho dung dịch ống nghiệm II có màu đỏ (Hình 3.11A) chứng tỏ ngun liệu có chứa nhóm chất tanin 31 A B Hình 3.11 Định tính tanin phản ứng với thuốc thử vanilin/H2SO4 (A) định tính flavonoid (B) I Dung dịch ban đầu; II Dung dịch sau phản ứng 3.3.3 Định tính flavonoid Cao chiết lồi A bockiana định tính flavonoid dung dịch axit HCl đặc bột Mg kim loại Kết hình 3.11B nhận thấy, dung dịch ống nghiệm II chuyển sang màu vàng nâu đậm so với cao chiết Như vậy, cao chiết lồi A bockiana có chứa thành phần flavonoid 3.3.4 Định tính coumarin Cao chiết lồi A bockiana định tính coumarin dung dịch NaOH 10% Kết nhận thấy, cho 0,5ml NaOH 10% vào ống nghiệm II, đem đun ống nghiệm bếp cách thủy, sau làm nguội cho thêm 4ml nước cất vào ống dung dịch ống II trở lên (Hình 3.12A) Sau cho vài giọt HCl đặc vào ống nghiệm ống II màu vàng đục (Hình 3.12B) Như vậy, dịch chiết loài A bockiana chứa thành phần coumarin A B Hình 3.12 Định tính coumarin phản ứng với NaOH (A) HCl đặc (B) I Dung dịch ban đầu; II Dung dịch sau phản ứng 32 Từ kết định tính cho thấy, dịch chiết lồi A bockiana có chứa nhiều nhóm hợp chất hữu có hoạt tính sinh học nhóm chất polyphenol, flavonoid, tanin coumarin Các nhóm hợp chất có ý nghĩa việc ứng dụng làm thuốc chữa bệnh sở để tiến hành nghiên cứu 3.3.5 Phân tích thành phần hợp chất cao chiết loài A bockiana Cao chiết ethanol, cao chiết ethyl acetate cao chiết dichloromethane từ loài A bockiana chạy TLC sử dụng hệ dung môi n-hexan:acetone tỉ lệ 1:1 hệ dung mơi dichlomethane:n-hexan tỉ lệ 2:1 Bản TLC sau màu dung dịch H2SO4 đặc để xác định số lượng chất có cao chiết Cao chiết sau chạy TLC sử dụng hệ dung môi n-hexan:acetone tỉ lệ 1:1 màu dung dịch H2SO4, kết Hình 3.13A cho nhận thấy cao chiết ethanol từ loài A.bockiana xuất băng màu, cao chiết ethyl acetate xuất 10 băng màu; cao chiết dichloromethane xuất băng màu Đối với hệ dung môi dichloromethane:n-hexan, chạy TLC màu dung dịch H2SO4 làm cao chiết ethanol từ loài A.bockiana xuất băng màu, cao chiết ethyl acetate xuất băng màu cao chiết dichloromethane xuất băng màu (Hình 3.13B) Như vậy, qua quan sát sắc kí đồ TLC với hai hệ dung mơi khác cho thấy phân đoạn từ cao chiết lồi A bockiana có nhiều vạch băng với nhiều màu sắc khác Từ sắc ký đồ trên, lựa chọn cao chiết ethyl acetate với hệ dung mơi axeton:n-hexan để phân lập nhiều chất B A Hình 3.13 Sắc kí đồ cao chiết ethanol (T), cao chiết ethyl acetate (E) cao chiết dichloromethane (D) A: Hệ dung môi n-hexan:acetone tỉ lệ 1:1 B: Hệ dung môi dichloromethane:n-hexan tỉ lệ 2:1 33 3.4 Kết tách chiết số hợp chất có dịch chiết A bockiana Từ kết sắc ký lớp mỏng, lựa chọn cao chiết từ ethyl acetate để phân lập chất Quá trình phân lập chất khái quát theo sơ đồ hình 2.4 tiến hành chạy sắc ký cột hấp phụ silica gel cao chiết ethyl acetate sử dụng hệ dung môi rửa giải axeton:n-hexan tỉ lệ từ 1:20 đến 1:1 thu phân đoạn Kiểm tra độ tinh khiết phân đoạn chất thu sắc ký lớp mỏng (Hình 3.14) Hình 3.14 Sắc ký lớp mỏng số đoạn cao chiết Kết thu chất rắn màu trắng từ phân đoạn số ống 99 đến 130, ký hiệu chất A1 Các phân đoạn lại chưa tinh khiết chứa chất tinh khiết vừa phân lập Chất A1 kiểm tra độ phương pháp sắc ký lớp mỏng Kết thu băng tương ứng với băng có cao tổng (Hình 3.15) Như vậy, chất A1 bước đầu tinh đủ điều kiện để gửi đọc phổ xác định cấu trúc chất Hình 3.15 Sắc ký lớp mỏng so sánh cao tổng số chất A1 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN (1) Nghiên cứu mô tả đặc điểm hình thái giải phẫu lồi A bockiana thu tỉnh Lào Cai, Việt Nam (2) Cao chiết từ lồi A bockiana có chứa số nhóm chất polyphenol, flavonoid, tanin coumarin thơng qua phương pháp định tính Cao ethanol, cao ethyl acetate cao dichloromethane có hoạt tính ức chế lồi vi khuẩn B subtilis, S marcessens, S lutea, L plantarum E.coli Trong đó, cao ethyl acetate cao dichloromethane có khả ức chế tốt cao chiết ethanol Cao ethyl acetate có hoạt tính oxy hóa mạnh thể nồng độ khử gốc tự DPPH với giá trị EC50 0,2 µg/ml, tiếp đến cao dichloromethane (giá trị EC50 0,47 µg/ml) cao ethanol (giá trị đạt 5,7µg/ml) Cao chiết lồi A bockiana có mức hoạt tính tốt với IC50 từ 43,15-58,62 µg/ml với dịng tế ung thư phổi, ung thư vú ung thu dày người (3) Sử dụng hệ dung môi rửa giải axeton:n-hexan với tỉ lệ 1:20 đến 1:1 qua cột sắc ký có chứa silicagel bước đầu phân lập hợp chất từ cao chiết ethyl acetae loài A bockiana ký hiệu A1 KIẾN NGHỊ (1) Đọc liệu phổ để xác định cấu trúc chất tinh khiết phân lập (2) Xác định hoạt tính sinh học hợp chất tinh 35 CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Hữu Quân, Thân Thị Kim Phượng, Chu Hoàng Mậu (2019), “Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ lồi Sum liên (Adinandra lienii)”, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2019, tr 178-181 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Bá (1974 - 1975), Hình thái thực vật (tập 1) Giải phẫu hình thái thực vật (tập 2), Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây Cỏ Việt Nam 2, Nxb trẻ Tp Hồ Chí Minh Katheri Esau (1995), Giải phẫu thực vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật Phạm Văn Khang, Nguyễn Thị Thanh Hương, Mai Thanh Nga, Phạm Văn Thỉnh (2018), Giáo trình hợp chất thiên nhiên, Nxb Đại học Thái Nguyên Trần Cơng Khánh (1981), Thực tập hình thái giải phẫu thực vật, Nxb Đại học trung học chuyên nghiệp Phan Quốc Kinh (2011), Giáo trình hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, NXB giáo dục Việt Nam N.X.Kixeleva (1998), Giải phẫu hình thái thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Kim Phụng (2007) Phương pháp cô lập chất hữu NXB Đại học quốc gia T.P HCM Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga (2008), Hình thái - giải phẫu học thực vật, Nxb Đại học Sư phạm Hà Nội, Tr 14 10 Trần Linh Thước (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, Nxb Giáo dục 11 Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục II TÀI LIỆU TIẾNG ANH 12 Nguyen Thai An, Bui The Hung (2008), Study on Flavonoid and Coumarin components of drugs in dispersion method, Journal of Pharmacy, 368, pp.3740 13 Chen Y., Chen G., Fu X., Liu R H (2015), Phytochemical Profiles and Antioxidant Activity of Different Varieties of Adinandra Tea (Adinandra Jack), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63(1), pp 169-176 14 Gao H., Liu B., Liu F., Chen Y (2010), Anti-proliferative effect of camellianin A in Adinandra nitida leaves and its apoptotic induction in human Hep G2 and MCF-7 cells, Molecules, 15(6), pp 3878-3886 37 15 Hughes, J.P., S Rees, S.B Kalindjian, and K.L Philpott (2011), Principles of early drug discovery, British journal of pharmacology, 162, pp.1239-1249 16 Liu B G., Ning Z., Zhan Y., Xu K., Gao J (2008), Characterization and Antioxidant Activity of Flavonoid Extract from Leaves of Adinandra nitida Merr, Chemistry and Chemical Engineering, 28(1), pp 6-10 17 Liu B., Yang J., Ma Y., Yuan E., Chen C (2010), Antioxidant and angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activities of ethanol extract and pure flavonoid from Adinandra nitida leaves, Pharmaceutical biology, 48(12), pp 1432-1438 18 Mahesh B, Satish S (2008), Antimicrobial Activity of Some Important Medicinal Plant Against Plant and Human Pathogens, World Journal of Agricultural Sciences, 4, pp 839-843 19 Monks, A., D Scudiero, P Skehan, R Shoemaker, K Paull, D Vistica, C Hose, J Langley, P Cronise, A Vaigro-Wolff, and M Gray-Goodrich (1991), Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines, Journal of the National Cancer Institute, 83, pp 757-766 20 Hoang Thanh Son, Luong Van Dung (2014), Adinandra hongiaoensis (Theaceae) a New Species from Lam Dong, Vietnam, J Jpn Bot., 89, pp 331334 21 Tabart J., K.C., Pincemail J, Defraigne J O., Dommes J (2009), Comparative antioxidant capacities of phenolic compounds measured by various tests, Food Chem, 113, pp 1226-1233 22 Wang Y., Chen S., Ni J., Yao X., Ye W., Zhao S (2003), Chemical studies on the Adinandra nitida, Zhongguo Yaoke Daxue Xuebao, 34(5), pp 407-409 23 Wang Y., Ye W., Yin Z., Zhao S (2008), Triterpene saponins from Adinandra nitida, YaoXue XueBao, 43(5), pp 504-508 24 Yuan C., Huang L., Joon Hyuk Suh, Wang Y (2019), Bioactivity-Guided Isolation and Identification of Antiadipogenic Compounds in Shiya Tea (Leaves of Adinandra nitida), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 67(24), pp 6785-6791 38 25 Zhang J., Tao D., Duan J., Liang Z., Zhang W., Zhang L., Huo Y., Zhang Y (2006), Separation and identification of compounds in Adinandra nitida by comprehensive two-dienzymesional liquid chromatography coupled to atmospheric pressure chemical ionization source ion trap tandem mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 386(3), pp 586-593 III TÀI LIỆU WEB 26 Thực vật chí Trung Quốc, http://www.efloras.org/, 10/8/2019 27 Trung tâm liệu thực vật Việt Nam, http://www.botanyvn.com/ cnt.asp?param=edir&v=Adinandra&list=genus, 20/8/2019 28 Viện thực vật học Trung Quốc, http://www.zhiwutong.com/, 22/6/2020 39