Giáo trình hoạt chất sinh học từ vi sinh vật

Bỏ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TAO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HA NỘI GIÁO TRÌNH HOẠT CHÁT SINH HỌC TỪ VI SINH VẬT Chủ biên: PGS.TS Phạm Thị Tâm Các tác giả: Lê Minh Hà, Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Thị Thu Hiền, Lê Minh Hải, Võ Thị Bích Thuỷ Hà Nội, 2022 LỜI NÓI ĐẦU Hoạt chất sinh học từ vi sinh vật đổi tượng mà nhà khoa học, nhà sán xuất toàn giới lình vực cơng nghiệp dược, cơng nghiệp thực phẩm sản xuất chế phàm ứng dụng nông nghiệp, lâm nghiệp, nuôi trồng thuý sàn quan tâm Giáo trình giới thiệu nguồn vi sinh vật, quy trinh lên lên thu nhận hoạt chất; giới thiệu hoạt chất phương pháp sàng lọc hoạt chất từ vi sinh vật bao gồm: - Hoạt chất kháng vi sinh vật; - Hoạt chất chống khối u; - Hoạt chất ức che enzyme; - Các hoạt chất có hoạt tính dược lý điều hồ miền dịch vận mạch; - Hoạt chất ứng dụng nông nghiệp; Nguồn phân lập số lồi vi sinh vật có hoạt chất hữu dụng, quy trình lên men cải biến sán xuất hoạt chất từ vi sinh vật Với nội dung đề cập trên, giáo trình tài liệu để giảng dạy học phần Các hoạt chất từ vi sinh vật cho học viên hệ đào tạo thạc sỳ ngành công nghệ sinh học, công nghệ thực phẩm đồng thời tài liệu có giá trị tăng cường, củng cố kiến thức liên quan đến vi sinh vật, công nghệ hoạt chất từ vi sinh vật, công nghệ sán xuất dược phẩm, thực phẩm chức năng; công nghệ sản xuất chế phẩm phục vụ sản xuất nơng nghiệp có nguồn gốc tự nhiên Q trình biên soạn sách có the có thiếu sót định, tập thề tác giả mong nhận ý kiến góp ý cùa người đọc đế hồn thiện sách lần xuất bán sau Trân trọng BAN BIÊN SOẠN MỞ ĐẦU Vi sinh vật sinh vật có kích thước cực nhị, khơng quan sát bàng mắt thường, chúng bao gồm vi khuẩn cố, vi khuấn, vi nấm, động vật nguyên sinh, tảo virus Sự đa dạng vi sinh vật nguồn cung cấp lượng lớn hợp chất có hoạt tính độc đáo, khoảng 23.000 chất chuyển hóa thứ cấp từ vi sinh vật biết đến, xạ khuân tạo khoảng 42%, vi nấm tạo lượng tương đưcmg khoảng 42%, 16% lại tạo bới vi khuấn Những hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tìr vi sinh vật gọi hoạt chất sinh học, help chất chất chuyển hóa thứ cấp, chúng có the hormone tăng trưởng, sắc tố, kháng sinh, kháng virus, chất chống oxy hố, chất chống ung thư, chất điều hồ miền dịch, chất ứng dụng sản xuất nông nghiệp, Các họp chất không sứ dụng cho tăng yi sji|h v(ật chúng có tiềm Ý phát ứng dụng hiệu cho sức khỏe người, vật ni trồng Việc tìm kiếm sử dụng chất chuyến hóa thứ cấp có hoạt tính từ vi sinh vật thu hút ý, quan tâm cùa số lượng lớn nhà khoa học phạm vi toàn cầu, hướng tìm kiếm tiếp cận theo hai hướng, bao gồm đế nhận biết hợp chất tự nhiên có lợi đế xác định sinh vật sản xuất họp chất để khai thác chúng cách hợp lý Từ kết phát vi sinh vật tổng hợp chất chuyền hóa thứ xây dựng chiến lược lưu giữ, bảo quán loài tiềm đế phát triển loại thuốc Các hoạt chất sinh học phát không ngừng gia tăng, hoạt động chúng thay đồi nhiều thập kỷ qua, theo đó, thuốc kháng sinh có đích cơng khơng đơn vi khn mà cịn vi sinh vật khác như nấm, động vật ngun sinh Bên cạnh đó, họp chất hoạt tính sinh học có chất “phi kháng sinh” tăng số lượng với tăng mạnh nguồn vi sinh vật sán xuất chất chuyển hóa Sự phát triển công nghệ sinh học phân từ, đặc biệt cơng nghệ DNA tái tố hợp đóng vai trị quan trọng việc chế tạo giống vi sinh vật biến đối gen sàng lọc vi sinh vật có tiềm Đồng thời, đa dạng phương pháp sàng lọc hoá sinh đại cho phép phát hoạt tính sinh học cùa hợp chất biết dẫn xuất cùa chúng Trước năm 1965, hoạt động tìm kiếm, sàng lọc hoạt chất sinh học từ vi sinh vật tập trung vào mục tiêu thuốc kháng sinh, nhiên, sau đó, nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác quan tâm nghiên cứu Đen năm 1990, tỷ lệ chất có hoạt tính sinh học “phi kháng sinh” phát 53% Trong thập kỷ gần đây, hoạt chất sinh học phát sử dụng nhiều lĩnh vực, bên cạnh loại hoạt chất kháng khuẩn, chúng chất điều hịa miễn dịch, chất ức chế enzym, tác nhân dẫn truyền thần kinh, chống khối u, ức chc enzyme, điều hoà quátrìi5ìiẹỈỊuyệệiWrirờng Đại học Mở Hà Nội CHƯƠNG HOẠT CHÁT KHÁNG VI SINH VẬT Hoạt chất kháng khuẩn Penicillin, phát bới Fleming vào năm 1928, tiếp tục nghiên cứu hoạt tính Chain cơng (1940) chất hóa trị liệu Cùng năm đó, Waksman bắt đầu sàng lọc chất kháng khuẩn xạ khuấn đất tạo ra, phát xạ khuẩn có sản sinh hoạt chất chống khối u Sau nhiều loại kháng sinh có tác dụng tốt mặt lâm sàng streptomycin, chloramphenicol (Chloromycetin), chlortetracycline (aureomycin), neomycin, oxytetracycline (terramycin), erythromycin, phát hiện, hầu hết bệnh nhiễm trùng vi khuẩn dường giải Với liệu pháp kháng sinh, bệnh nhiễm trùng huyết nhiễm Streptococcus Staphylococcus nhiễm trùng đường ruột nặng vi khuấn Gram âm gây giảm đáng ke, tuôi thọ trung binh cùa Mở Hà Nội Tuy nhiên, khoảng 10 nãm sau liệu pháp kháng sinh sử dụng phổ biến giới, số loài vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus, Mycobacterium vi khuấn đường ruột Gram âm xuất kháng lại số loại thuốc kháng sinh Sau đó, chúng vi khuẩn kháng thuốc sử dụng làm sinh vật thử nghiệm đe phát triển loại kháng sinh hữu hiệu Sau chế kháng kháng sinh vi khuấn biến đổi enzyme, giảm tính thấm tế bào, giảm lực ribosome làm sáng tỏ, nhiều dần xuất cúa kháng sinh nghiên cứu mặt hóa học sinh học dựa tảng thông tin chế kháng thuốc Các chiến lược phương pháp sàng lọc kháng sinh hữu ích điều chỉnh Các kết nghiên cứu chế hoạt động cùa kháng sinh áp dụng cho phương pháp sàng lọc, độc tính chọn lọc hoạt chất điều trị phải vượt trội tác dụng phụ Từ quan điếm này, số loại kháng sinh yỡ-lactam chất ức chế sinh tồng hợp thành tế bào vi khuẩn phát bàng phương pháp sàng lọc khác Tuy nhiên, bệnh viện xảy vấn đề nhiễm trùng hội bệnh nhân sau mổ, phần suy giám miễn dịch chống lại mầm bệnh khác nhau, với mầm bệnh yếu Những bệnh nhiễm trùng hội yếu vi khuẩn Gram âm Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus sp Serratia marcescens gây Ngày nay, số nỗ lực to lớn việc tạo loại kháng sinh kháng khuấn thực hiện, chúng vượt trội độc tính chọn lọc, đặc tính dược động học điều trị bệnh nhiễm trùng phức tạp gồm bệnh nhiễm trùng hội Để khám phá loại kháng sinh có hiệu quả, có hai đối tượng cần nghiên cứu mà khơng bị tách rời Một "phát hiện" chất chuyền hóa hai "sân xuất" chất chuyển hóa có hoạt tính, vấn đề bao gồm cách phát vi sinh vật cách để vi sinh vật sán xuất chất chuyến hóa khác nhau, vấn đề thứ hai cần phát hiệu lực hiệu hoạt tính chất chuyển hóa Các phương pháp sàng lọc hoạt chất kháng khuân điều chinh phù hợp với các đặc điểm gây bệnh tác nhân vi sinh vật chế hoạt động kháng sinh Theo truyền thống, hoạt tính kháng khuẩn phát phương pháp khuếch tán thạch sứ dụng số chủng vi khuấn gram dương gram âm làm sinh vật thừ nghiệm Từ năm 1970, phương pháp thay thành công cách phát dựa thay đổi hình thái sinh vật thử nghiệm, sử dụng đột biến siêu nhạy, ức chế hoạt tính enzyme cùa vi khuấn, ứng dụng kháng thể đơn dòng thử nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme Phương pháp thử nghiệm khuếch tán thạch sử dụng số vi khuẩn làm sinh vật thử nghiệm giải pháp đơn giản dỗ sử dụng việc sàng lọc loài vi sinh vật sán sinh hoạt chất có hoạt tính kháng khuấn Tuy nhiên, phương pháp có hạn chế việc xác định chất nhóm chất có hoạt tính kháng khuẩn mẫu vi khuẩn mục tiêu Hiện nay, công nghệ sinh học đại cho phép sử dụng nhiều phương pháp đế sàng lọc hiệu hoạt chất kháng khuấn Sử dụng thể đột biến kháng kháng sinh Sự phát triển tác nhân gây bệnh có khả kháng kháng sinh thúc đay nỗ lực tìm kiếm loại thuốc kháng sinh có hoạt tính chống lại vi khuân kháng thuốc Theo đó, thể đột biến kháng thuốc sừ dụng quy trình sàng lọc chùng kháng thuốc theo chế ức chế enzyme ức chế hệ thống vận chuyền qua màng tế bào Trong quy trình sàng lọc gần đây, để tim kháng sinh ngiowf ta sử dụng chủng đột biến kháng kháng sinh Staphylococcus aureus 4R (có nguồn gốc từ chủng s aureus FDA 209P), chủng có đặc điểm đột biến kháng tetracycline, erythromycin, chloramphenicol streptomycin Đe tìm kháng sinh nhạy cảm với chùng Staphylococcus aureus 4R, khoảng 2.000 chủng xạ khuẩn sử dụng, từ phát loại kháng sinh có bán chất dipeptide có tên alahopcin Thuốc kháng sinh cho chất ức chế tống hợp thành tế bào vi khuấn, ức chế liên kết axit [3H] diaminopimelic Escherichia coli Alahopcin cho thấy khả liên kết với erythromycin chống lại vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt loài vi khuấn kháng macrolid Trong quy trình sàng lọc khác đế phát kháng sinh có chất oligopeptide, chủng đột biến kháng thuốc Bacillus suhtilis SRY-7 sử dụng làm vi sinh vật thử nghiệm Sử dụng chủng vi sinh vật đột biến siêu nhạy vói kháng sinh Để trực tiếp phát lượng nhó kháng sinh tạo dịch nuôi cấy phương pháp khuếch tán thạch truyền thống, người ta sử dụng the đột biến siêu nhạy sinh vật thử nghiệm thông thường Trong phần lớn nghiên cứu sàng lọc hoạt chất kháng khuẩn, chủng đột biến nhạy với nhiều loại thuốc thường sử dụng, nhiên, trường họp đặc biệt, với lượng nhó kháng sinh tạo thi chùng đột biến siêu nhạy với loại kháng sinh cụ thề ưu tiên nghiên cứu sứ dụng Kháng sinh pyrrole-amidine TAN-868 A có hoạt tính chống lại vi khuẩn, nấm động vật nguyên sinh có nguồn gốc từ xạ khưấn Streptomyces idiomorphus phát thông qua chúng vi khuấn Micrococcus flavus siêu nhạy Sử dụng vi khuẩn kỵ khí thủ' nghiệm điều kiện kỵ khí Các bệnh nhiễm trùng hội số vi khn kỵ khí có khả gây tý lệ từ vong cao Đổ tìm kiếm kháng sinh chống lại vi khuẩn kỵ khí, lồi Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Peptococcus, vi khuấn kỵ khí khác sử dụng làm sinh vật thử nghiệm Một số Clostridium difficile, tác nhân gây bệnh gây bệnh viêm đại tràng màng giả loài vi khuấn kỵ khí nghiêm ngặt Để ni cấy Clostridium difficile, đĩa thạch hai lóp chuẩn bị, đó, vi khuẩn cấy bề mặt cúa lớp thạch bên lóp thạch phía có vai trị ngăn oxy cung cấp chất dinh dưỡng Bằng phương pháp này, số kháng sinh thiotetromycin, luminamicin, lustromycin, closetomicin A, B|, B2, c, D tìm thấy Từ năm 1987- 1988, số nhà khoa học mô tá phương pháp việc phát abbeymycin, coloradocin (luminamicin), tirandalydigin kỹ thuật ni yếm khí Người ta thay hoạt tính kháng khuẩn fosfomycin điều kiện kỵ khí mạnh điều kiện hiếu khí, dựa thực tế này, việc sàng lọc kháng sinh có hoạt tính mạnh điều kiện kỵ khí ưu tiên so với điều kiện hiếu khí Trong số vài kháng sinh lựa chọn hệ thống sàng lọc này, kháng sinh SF-2312, axit l,5-dihydroxy-2-oxopyrrolidin-3-yl-phosphonic tìm thấy Phát khả liên họp Trong lĩnh vực lâm sàng, việc sử dụng kết hợp hai nhiều hoạt chất kháng khuẩn đề điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn nghiêm trọng cần thiết Cách tiếp cận dựa sở hoạt chất có the hoạt động phối hợp với thể sống (in vivo) Thử nghiệm sàng lọc kháng sinh có hoạt tính kháng khuấn chống lại vi khuẩn E coli thử nghiệm với spiramycin- loại kháng sinh khơng có hiệu việc chống lại vi khuan gram âm Hoạt chất kháng khuẩn dịch lên men chủng vi sinh vật xác định phương pháp khuếch tán thạch đĩa giấy sử dụng vi khuẩn E coli ATCC 26 làm sinh vật thử nghiệm, liều spiramycin 40 pg/ml Nghiên cứu phát loại kháng sinh ký hiệu CV-1 Mặc dù hoạt tinh kháng khuấn CV-1 yếu, cho tác dụng chống lại vi khuẩn E coli kết hợp với spiramycin CV-1 có cơng thức 1,2-diamino-l, 2-N, N'-carbonyl-l, 2-didcoxy-a-Dglucose hydrat dường hoạt động theo chế ức chế tổng hợp lipopolysaccharide Lipopolysaccharide màng vi khuẩn có vai trò hàng rào vận chuyển, kết hợp CV-1 với màng dường tạo khả xâm nhập cùa spiramycin vào tế bào vi khuẩn E coli tiêu diệt chúng Thú' nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết vói enzyme miễn dịch phóng xạ Các thử nghiệm miền dịch với nhiều loại khác sử dụng rộng rãi phịng thí nghiệm lâm sàng đế phát phân tích định lượng kháng thể, hormones thuốc dịch Trong phịng thí nghiệm vi sinh nơng nghiệp, thí nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) áp dụng đế phát định lượng nhanh độc tố nấm mốc Một số nghiên cứu thực phát triển ELISA đế phát kháng sinh aminoglycoside sinh khối lên men chủng vi sinh vật, kháng sinh dần xuất erythromycin, hoạt chất chống nấm da phát bàng kỹ thuật 1.1 Xác định kháng sinh biết Việc phát kháng sinh ngày trở nên khó khăn hon, nên thử nghiệm cần phái tăng độ nhạy với thời gian thử nghiệm ngắn hon Hơn nữa, việc xác định nhanh chóng xác loại kháng sinh điều hoàn toàn cần thiết đế tránh lãng phí nồ lực trùng lặp Trong hầu hết phịng thí nghiệm, liệu sẵn có phố kháng vi khuấn phố sắc ký lớp mỏng giấy kháng sinh biết sử dụng để xác định phân loại kháng sinh ban đầu môi trường nuôi cấy thô Các nghiên cứu đề cập đến việc xác định sớm kháng sinh dựa kháng sinh đà biết thực dựa phương pháp vật lý, phương pháp tia X, khối phố, cộng hướng tự hạt nhân Đe biết liệu loại kháng sinh phát hay xác định, cần so sánh đặc diem vật lý, hóa học với đặc điểm cùa hợp chất biết sở dừ liệu kháng sinh Ngày nay, 6.000 loại thuốc kháng sinh số lượng tương tự chất chuyển hố khơng hoạt động vi sinh vật tạo đưa vào sớ dừ liệu chứa kháng sinh với đặc điểm vật lý, hóa học sinh học Sàng lọc trực tiếp mục tiêu Phương pháp sàng lọc tiếp cận theo hướng tập trung vào chế hoạt động kháng sinh Thông thường, sờ kết nghiên cứu chế hoạt động kháng sinh có hiệu tốt biết, so đồng phân cấu trúc thay chúng tiếp tục phát Đơi khi, enzyme vị trí thụ the hoạt chất kháng khuấn biết ghi nhận sử dụng làm mục tiêu sàng lọc 1.2 Các chất ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn 10 diacetyl, cá hai cho thấy độ nhạy cao gốc guanidine amidine L-fl-(3-Hydroxyureido)-alanine L-ỡ-(5-Hydroxy-2-pyridyl)-alanine Myxochelin A Arglecin Hình 57 Cấu trúc hố học alkaloid dương tính với thuốc thứ Sàng lọc hóa học sử dụng phản ứng màu mô tả hướng tới việc tim kiếm hợp chất có nhóm chức phân tứ cùa hợp chất kháng sinh có hoạt tính dược lý biết Mặc dù họp chất có hoạt tính sinh học hiệu staurosporine chưa tìm thấy phương pháp nay, nguyên tắc, phương pháp cho hiệu tốt việc tìm kiếm họp chất quan trọng /í-lactams prostaglandins 5.3 Sàng lọc thuốc thử ehrlich tetrazolium Việc phát họp chất bàng phương pháp sàng lọc hóa học dựa phản ứng màu thường gặp phải vấn đề sau: 245 i) Ngay cà họp chất có hoạt tính sinh học phát tách chiết thông qua phương pháp sàng lọc dựa hoạt tính sinh học ứng dụng săn xuất nông nghiệp sản xuất thuốc cho người động vật thấp ii) Nhiều chất chuyến hóa thứ cấp cúa vi sinh vật chưa biết chưa khai thác bới phương pháp sàng lọc thơng thường khơng có phát Phương pháp sàng lọc sử dụng thuốc thứ ehrlich tetrazolium sử dụng đe sàng lọc hợp chất từ xạ khn Streptomyces có tính đặc hiệu cao nhóm chức indole, urea, furan, pyrrole thường có chất chuyển hóa thứ cấp (Hình 58) Urdamycins, bcnzanthraquinoncs biến đổi họp chất dương tính với thuốc thử Ehrlich Các urdamycin cho hoạt tính kháng khuẩn, ức chế phát triển tế bào bạch cầu L-1210 hoạt tính tăng sinh Phức hợp kháng sinh cho thấy ức chế tăng trưởng đặc biệt mạnh mẽ Streptomyces phố kháng khuẩn Elloramycin họp chất liên quan đen tctraccnomycin, phân lập từ s oỉivaceus sp Tu 2353 thể hoạt tính kháng khuấn chọn lọc chống lại vi khuấn gram dương Elloramycin đặc trưng kháng sinh sở hữu khung tetracenon glycosid hóa với L- rhamnose permethyl hóa Streptazolin, axit (3S,8E)-l,3-dihydroxy-8-decene-5-one, axit (E)-3-(lH-pyrrol-3-yl)-2-propenoic phát thuốc thử ehrlich 246 Elloramycin Phosphoramldon Sphydrofurans Hình 58 Cấu trúc hố học số chất chuyến hoá thứ cấp phát bời thuốc thử ehrlich tetrazolium Cùng phương pháp cách tiếp cận trên, hợp chất sphydrofiirans A, A 2, A3, phosphoramidon với gốc cấu trúc nhất, phosphoramide sàng lọc thành công Một hợp chất khác, 2-etyl-5- (3-indoly 1) oxazole cho phản ứng màu đỏ tím với thuốc thử Ehrlich màu xanh lam thử nghiệm Barrollier Hợp chất giống hệt với 247 pimprimethine, thu từ dịch ni cấy cúa Streptoverticiìlium olivoreticuỉi, chất tương tự với pimprinin C; biết có hoạt tính chống động kinh ức chế monoamin oxidase Rất khó đế phát hợp chất thuộc loại từ dịch nuôi cấy bàng cách sàng lọc dựa hoạt tính kháng khuẩn Một số nghiên cứu khác báo cáo việc sứ dụng thuốc thứ tctrazolium màu xanh đố phát số họp chất có cấu trúc hoạt tính sinh học từ Streptomyces có jổ-Oxotryptamine a-hydroxy-/?oxotryptamine, tiền chất pimprinine Họp chat ketalin (7-methyl-2methaleno-4-oxonona-l,3,8-triol) phát theo phương pháp này, hợp chat khơng có hoạt tính kháng khuẩn nhung the hoạt tính tương tự pheromones trìing Ferrithiocin, chất chuyến hóa chứa sulfur phân lập từ s antibioticus Hợp chất khơng thể hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuấn gram dương gram âm giúp tăng cường hiệu cúa cephalosporin c Differolide giúp tăng cường hình thành sợi nấm khí sinh bào tử cùa s Glaucescens sừ dụng yếu tố tăng trưởng nuôi cấy số chùng xạ khuẩn thuộc lồi Síreptomyces KD 16-UI phân lập sau phát phản ứng màu sử dụng thuốc thứ triphenyl tetrazolium chloride có hoạt tính kháng khuẩn 5.4 Các phuong pháp sàng lọc hoá học khác Nhiều hợp chất từ vi sinh vật tìm thấy dịch ni cấy xạ khuẩn Streptomyces với hỗ trợ phương pháp hóa học sử dụng sắc ký lớp móng (TLC) với thuốc thứ nhuộm đặc hiệu cho nhóm chất Hợp chất 3-hydroxyquinoline-2-carboxylic (Hình 59) chất chuyến hóa từ s griseoflavus phát thấy bàng sắc ký TLC silica gel, theo đó, hợp chất xuất huỳnh quang có màu vàng lục đậm ánh sáng uv (366 nm) Dạng muối canxi hợp chat trước chưa phân lập dạng axit tự báo cáo sàn phấm xà phịng hố từ cinropcptin 248 Muối canxi khơng có hoạt tính ức chế tế bào khơng có hoạt tính kháng khuẩn, nhung cho thấy khả kích thích tăng trưởng chống lại virus herpes simplex Cũng bàng phương pháp sứ dụng sắc ký TLC, nhiều hợp chất phát polyol chứa vòng lớn amycins A B có liên quan chặt chẽ với azalomycins; hợp chất SM 196A, 196B angucyclinones tách chiết từ Streptomyces sp; naphthomevalin, dihydro-naphthoquinone có hoạt tính kháng khuẩn; axit saphcnic methyl ether axit 6-axetylphenazine-l-carboxylic tách chiết từ chủng Streptotnyces antibioticus Hỉnh 93 Cấu trúc hóa học số chất chuyển hóa sàng lọc phương pháp hóa học khác Một phương pháp khác sứ dụng đế sàng lọc hợp chất tír vi sinh vật gây tăng tính tham thấu tế bào bàng EDTA, kháng sinh diphenylether đặt tên ethericins A B phân lập từ chúng nấm mốc thuộc loài Aspergillus phát bàng phương pháp này; aspcrmutarubrol phân lập chất ức chế tự phát triển từ Aspergillus, giống với ethericin A 249 Các aurachin, alkaloid quinoline phát dừ liệu quang phổ ‘H-NMR (cộng hưởng từ hạt nhân) từ sinh khối lên men cùa chúng Stigmatella aurantiaca Sg a 15 Các aurachin bao gồm bốn thành phần, A, B, c D có hoạt tính chống lại vi khuẩn gram dương gây ức chế q trình oxy hóa NADH ty tim bò tương tự stigmatellin Sàng lọc hóa học phương pháp đon giàn, nhanh chóng đế phát phân lập chất chuyển hóa Trong thực tế, khả tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học sàng lọc hóa học dường hiệu quà so với phương pháp sàng lọc sinh học thông thường Trong số hợp chất thu sàng lọc hóa học, staurosporine ví dụ điển hình tính hiệu cùa phương pháp Thư viện Trường Đại học Mở Hà Nội 250 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdcl-Gawad, A.M (2002) Biological Control of Some Tomato Diseases Caused by Fusarium spp and Alternaria spp Ph.D Thesis, p: 106 Faculty of Science, Cairo University, Cairo, Egypt Al-Shuneigat J., Cox S.D and Markham J.L.,(2005).Effects of a topical essential oilcontaining formulation on bioflIm-forming coagulasenegative staphylococci Lett Appl Microbiol., 41: 52-55 Arai, K., Rawlings, B.J., Yoshizawa, Y and Vederas, c., (1989) Comparision of stereochemistry of polyketide and fatty acid enoyl thiol ester reductase J Am.Chem.Soc.l 11, 3391-3399 Asha B B., Nayaka s c., Udaya shankar A c., Srinivas c and Niranjana s R., (2011) Selection of effective bio-antagonistic bacteria for biological control of tomato wilt caused by Fusarium oxysporum f Sp Lycopersici The Bioscan 6:239 - 244 Bais Y.G., Nimbekar T.P., Wanjari B.E., Timande S.P., (2012) Isolation of antibacterial compound from marine soil Actinomycetes International journal of Biomedical and Advance Research, 3:193-197 Bhaskar J., Usman M., Smitha s., and Bhat G K (2004): Bacteriological profile of street foods in Mangalore Indian J Med Microbiol 22, 197-198 Bhattacharyya p N and Jha D K (2011) Optimization of cultural conditions affecting growth and improved bioactive metabolite production by a sub surface Aspergillus strain TSF 146 International journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology 11:23 - 29 Burkholder, P.R.; Pfister, R.M & Leitz, F.H (1966) Production of a Pyrrole Antibiotic by marine bacteria Applied Microbiology 14:649- 653 Collins J K., Thornton G., Sullivan G o., (1998) Selection of probiotic strains for human application Int Dairy J., 8, 487-490 10 Dikin A., Sijam K.N., Kadir J and Seman LA (2007) Effect of Different Carbon Sources and Peptones on the Production of Antimicrobial Substances 251 from Bacteria against Schizophyllum commune FR International Journal Of Agriculture & Biology 14:113 - 129 11 Dikin A., K Sijam, J Kadir and A.s Idris, (2005) Extraction of Antimicrobial Substances from Antagonistic Bacteria against Schyzophyllum commune Fr In: Proc 27th Malaysian Microbiology Symposium Innovation through Microbes Grand Plaza Parkroyal Penang Malaysia, 24-27 November 2005 12 Duffy B.K and G Defago, (1999) Environmental factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas fluorescens biocontrol strains Appl Environ Microbiol., 65: 2429-2438 13 Ekelund F., Ronn R and Christensen s., (2001) Distribution with depth of protozoa, bacteria and fungi in soil profiles from three Danish forest sites Soil Biol Biochem 33:475-48 14 El-Banna N.M., (2006) Effect of carbon sources on the antimicrobial activity of Corynebacterium kutscheri and Corynebacteriuni xerosis.African J BiotechnoL, 5: 833-835 15 Esqucnazi E., Coates R.C., Grindbcrg R.V., Ishoey T., Brinda D., (2009) Single Cell genome amplification accelerates identification of the apratoxin biosynthetic pathway from a complex microbial assemblage PLoS ONE 6: e 18565 16 Gebreel, H.M., El-Mehalawy A.A., El-Kholy I.M., Rifaat H.M and Humid A.A., (2008) Antimicrobial Activities of Certain Bacteria Isolated from Egyptian Soil Against Pathogenic Fungi J Agric Biol Sci., 4: 331339 17 Hannusch, D.J and G.J Boland, (1996) Interaction of air temperature, relative humidity and biological control agents on grey mould of bean European J Plant Pathol., 102: 133-142 252 18 Heydari, A and I.J Misaghi, (1998) Biocontrol activity Burkholderia cepacia against Rhizoctonia solani in hcrbicidc-trcatcd soil Plant Soil, 202: 109-116 19 Hirayama K, Rafter J (2000) The role of probiotic bacteria in cancer prevention Microbes Infect 2: 681-686 20 Ismail Kola, Ph.D (Med), is Senior Vice-President of Basic Research at Merck Research Labs, 126 East Lincoln Avenue, Rahway, New Jersey 07075, USA 21 John Landis, Ph.D., is Senior Vice-President Pharmaceutical Sciences and Compliance Clinical Sciences at ScheringPlough Research Institute, 2000 Galloping Hill Road, Kenilworth New Jersey 07033, USA 22 Khamna s., Yokota A., Pcbcrdy J.F., Lumyong s., (2009) Antifungal activity of Streptomyces spp isolated from rhizosphere of Thai medicinal plants Int J Intcgr Biol., 6(3): 143-147 23 Kobayashi M., Aoki, s., Sakai Ẹ), Kawazoe K., Kihara N., Sasaki T., Kitagawa L, Altohyrtin A., (2000) A potent anti-tumor macrolide from the Okinawan marine sponge Hyrtios altum Tetrahedron Lett., 34, 2795-2798 24 Kurze, s and H Bahl, (2001) Biological control of fungal strawberry diseases caused by Scrratia plymuthica HRO-C48 Plant Dis., 85: 529- 534 25 Lee, Y K., Senthilkumar, M., Kim, J H., Swamalakshmi K., Annapurna K., (2008) Purification and partial characterization of antifungal metabolite from Paenibacillus lentimorbus WJ5 World J Microbio and Biotechno 24 (12), 3057- 3062 26 Nakamura, H.; Iitaka, Y.; Kitahara, T.; Okazaki, T.; Okami, Y (1977) Structure of asplasmomycin Journal of Antibiotics, 30, 714-719 27 Newman D J and Cragg G M (2007), “Natural products as sources of new drugs over the last 25 years, ’’Journal of Natural Products, vol 70, no 3, pp 461-477 28 Ogata K,Osawda H,Tani Y (1977) J Ferment Tcchnol 55:28 253 29 Okami, Y (1986) Marine microorganisms as a source of bioactive agents MicrobialEcology 12:65-78 30 Pandey B, Ghimire p, Vishvanath p, Agrawal T.,(2004), Study on the antibacterial activity of the Actinomycetes isolated from the Khumbu Region of Nepal, Proceeding from, the great Himalays: Climate, Health, Ecology, Management and conservation Kathmandu; 12-15 31 Pollock, s & Safer, H M (2001) Bioinformatics in the Drug Discovery Process Annual Reports in Medicinal Chemistry 32 Rajvanshi A., Kulshreshtha s., Nigam V K., Gothwal R K and Pareek R p., (2011) Antagonistic properties of different bacteria isolated from salads Asian J Exp Science 25:45 - 51 33 Rajvanshi A., Nigam V K., Kulshrcshtha s and Parcck R.P., (2012) Characterization of bacteriocin production from a new lactic acid bacteria World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences 1:100 - 1112 34 Rajvanshi, A., (2010) Bacterial load on street vended salads in Jaipur city, India Internet J food Safety., 12, 136-139 35 Shank, R c (1974) "Role of Aflatoxin in Human Disease" In Rodricks, J.v (ed.), Mycotoxins and other fungal related food problems American Chemical Society, Washington, D.c pp 51-58 36 Shiozawa H, Kagasak T, Kinoshita T and Haruyama H, Thiomarinol (1993) a new hybrid antimicrobial antibiotic produced by a marine bacterium, J Antibiot, 46, 1834- 1841 37 Shoda, M (2000) Review: Bacterial control of plant diseases Journal of Bioscience and Bioengineering 89: 515-521 38 Silo-suh, L.A., Lethbridge, B.J., Raffel, S.J., He, H., Clardy, J and Handelsman, J (1994) Biological activites of two fungistatic antibiotics produced by Bacillus cereus UW85 Microbiology 60: 2023-2030 254 Applied and Environmental 39 Slininger, p and M.A Shea-Wilbur, (1995) Liquid culture pH, temperature and carbon (not nitrogen) source regulate phenazine productivity of teke-all biocontrol agent Pseudomonas fluorescens, p 2-79 Appl Microbiol Biotechnol., 43: 794-800 40 Strobel G A (2003) “Endophytes as sources of bioactive products,” Microbes and Infection, vol 5, no 6, pp 535-544 41 Tayung, K and Jha, D K (2007) Antimicrobial activity of a compound produced by Aspergillus sp.DEF 505, an endophyte on Taxus baccata J Microbial World 9: 287-292 42 Thakur, D., Bora, T c., Bordoloi, G N and Mazumdar, s (2009) Influence of nutrition and culturing conditions for optimum growth and antimicrobial metabolite production by Strcptomyccs sp.201 J Med Mycol 19:161-167 43 Wang H.M., J.L Pan, C.Y Chen, c.c Chiu, M.H Yang, H.w Chang, Ct al (2010) Identification of anti-lung cancer extract from Chlorella vulgaris C-C by antioxidant property using supercritical carbon dioxide extraction Process Biochemistry 45: 1865-1872 44 Wang, J., Huang, Y., Fang, M., Zhang, Y., Zheng, z., Zhao, Y and Su, w (2002) Brcfcldin A, a cytotoxin produced by Paccilomyccs sp and Aspergillus clavatus isolated from Taxus mairei and Torreya grandis FEMS Immunol Med Microbiol 34:51-57 45 Wang, S.L., Shih, I.L., Wang, C.H., Tseng, K.C., Chang, W.T., Twu, Y.K., Ro, J.J and Wang, C.L (2002) Production of antifungal compounds from chitin by Bacillus subtilis Enzyme Microbial Technology 31:321-328 46 Wicklow, D.T., B.K Joshi and W.R Gamble, (1998) Antifungal metabolites (Monorden, Monocillin IV, and Cerebrosides) from Humicola fuscoatra Traaen NRRL 22980, a mycoparasite of Aspergillus flavus sclerotia Appl Environ Microbiol., 64: 4482-4484 255 47 Wilcox MH (2003) Clostridium difficile infection and pseudomembranous colitis Best Practise and Research 17(3): 475-493 48 Yang, s s.; Cragg, G M.; Newman, D J.; Bader, J p (2001), Natural product-based anti-HIV drug discovery and development facilitated by the NCI developmental therapeutics program J Nat Prod., 64: 265-277 49 Zhang L., An R., Wang J et al., (2005), “Exploring novel bioactive compounds from marine microbes,’’Current Opinion in Microbiology, vol 8, no 3,pp 276-281 50 Zhou, F., Guo, H., Liu, Y., Jiang, Y., (2007) Chemometric data analysis of marine water quality and source identification in Southern Hong Kong Marine Pollution Bulletin 54, 745-756 Thư viện Trường Đại học Mở Hà Nội 256 MỤC LỤC MỜ ĐẦU CHƯƠNG HOẠT CHÁT KHÁNG VI SINH VẬT I Hoạt chất kháng khuẩn 1.1 Xác định kháng sinh biết 10 1.2 Các chất ức che tống hợp thành tế bào vi khuẩn 10 1.3 Sản xuất kháng sinh P-lactam từ xạ khuân 14 1.4 Sàng lọc kháng sinh glycopeptide .25 1.5 Sàng lọc kháng sinh nhóm aminoglycoside 26 Hoạt chất kháng nấm 30 2.1 Phương pháp sàng lọc đìa giấy 32 ức chế tống hợp thành tế bào 34 2.2 3.1 3.2 Hoạt chất kháng virus " Ap FA- : x-4-A.: 42 TIlir vieri TitfolTg Đại hộc Mơ Ha Nội" ■ Các phương pháp sàng lọc hợp chất kháng virus phòng thí nghiệm 45 Các phương pháp sàng lọc chất kháng HIV 53 Hoạt chất kháng ký sinh trùng 58 4.1 Sàng lọc loại hoạt chat chống lại sinh vật nguyên sinh 61 4.2 Sàng lọc thuốc kháng sinh tấy giun sán 67 CHƯƠNG 2_HOẠT CHẤT CHỐNG KHỐI u 72 Các hoạt chất chống khối u 72 I I Phương pháp sàng lọc dựa trẽn mơ hình khối u động vật 77 1.2 Phương pháp vi khuẩn 82 1.3 Phương pháp sàng lọc in vitro chất chống khối u kháng ung thư liên quan đến biến đôi nguyên bào sợi cùa phôi gà bị nhiễm virus Rous sarcoma 83 1.4 Phương pháp sàng lọc chất chống khối u hệ phương pháp khơng có tế bào 83 Chất cảm ứng biệt hoá tế bào 86 2.1 Te bào bạch cầu phương pháp sàng lọc chung 87 CHƯƠNG JIOAT CHẤT ức CHẾ ENZYME 99 Enzyme chuyển hoá angiotensin 100 257 Enzyme hydroxymetylglutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase) 105 Glucosyltransferase 106 Enzyme aldose reductase 108 Aminopeptidase B 110 Enzyme adenosine deaminase 113 Protein kinase c 115 Protein kinase đặc hiệu với tyrosine 119 Chiến lược đế tìm kiếm chất ức chế enzyme 122 CHƯƠNG 4JMỘT SỐ HỢP CHẦT CÓ HOẠT TÍNH DƯỢC LÝ KHÁC 128 I Chất điều hoà miễn dịch 128 1.1 Các phương pháp sàng lọc in vitro 134 1.2 Phương pháp in vivo 139 1.3 Một số phương pháp sàng lọc đặc trưng chất điều hòa miền dịch 141 Hoạt chất kháng bổ thể 147 Hoạt chất có hoạt tính vận mạch .150 3.1 Phương pháp sàng lọc in vitro in vivo với chất ức che kết tụ tiếu cầu 151 3.2 Phương pháp siêu dung hợp., — , Tmivien Ị rương, Đại hoc.MaHà Nội 3.3 Thừ nghiệm phân giãi cục máu đông băng euglobulin 3.4 Thử nghiệm phương pháp đo huyết áp động mạch nhịp tim 160 CHƯƠNG 5^HOÁ CHẤT ÚNG DỤNG TRONG NÒNG NGHIỆP 162 Hoạt chất diệt nấm kháng khuẩn 162 Hoạt chất diệt cỏ 172 2.1 Hợp chất có hoạt tính diệt có từ vi sinh vật 173 2.2 Phương pháp sàng lọc 178 Hợp chất có hoạt tính diệt trùng, trừ sâu bệnh, kháng cầu trùng 184 3.1 Thuốc diệt côn trùng tống hợp 187 3.2 Các loại thuốc trừ trùng, sâu bệnh có nguồn gốc từ chất chuyến hóa vi sinh vậtl88 3.2 Hoạt chất kháng cầu trùng 202 CHƯƠNG 7,NGUON PHÂN LẬP, LÊN MEN VÀ CẢI TIÉN TRONG SÀN XUẤT KHÁNG SINH TỪ VI SINH VẬT 209 I Lựa chọn nguồn vi sinh vật tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học 209 1.1 Mơi trường song cùa Actinomyces 209 1.2 Phương pháp phân lập Actinomyces 210 258 1.3 1.4 Quy trinh phân lập chọn lọc Actinomyces 213 Quy trình lên men trình sàng lọc chất có hoạt tính sinh học 216 Các ycu tố ánh hường đến sinh tổng hợp kháng sinh 217 Kiểm soát điều kiện lên men 227 Cải tiến trình sàn xuất kháng sinh kỹ thuật di truyền 233 Một số phương pháp sàng lọc hoạt chất từ vi sinh vật 237 5.1 Sàng lọc thuốc thử màu 240 5.2 Sàng lọc băng thuốc thử alkaloid điền hình 244 5.3 Sàng lọc thuốc thử ehrlich tetrazolium 245 5.4 Các phương pháp sàng lọc hoá học khác 248 TÀI LIỆU THAM KHAO 251 Thư viện Trường Đại học Mở Hà Nội 259