Đánh giá sự ức chế của chất kháng sinh họ quinolone đối với vi sinh vật trong môi trường nước mặt sông sài gòn 2

28 CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Nội dung nghiên cứu Trong luận văn, các nội dung đã được thực hiện gồm Nội dung 1 Đánh giá chất lượng nước sông Sài Gòn và mức độ ô nhiễm về chất kháng sinh Thu thập số liệu và lấy mẫu phân tích bổ sung và đánh giá về chất lượng nước sông Sài Gòn Đánh giá sự hiện diện của chất kháng sinh trong môi trường nước mặt sông Sài Gòn Nội dung 2 Đánh giá sự ức chế của chất kháng sinh tiêu biểu thuộc nhóm Quinolones đối với vi sinh vật trong nư.

CHƯƠNG 2.1 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu Trong luận văn, nội dung thực gồm: Nội dung 1: Đánh giá chất lượng nước sơng Sài Gịn mức đợ nhiễm chất kháng sinh - Thu thập số liệu lấy mẫu phân tích bổ sung đánh giá chất lượng nước sơng Sài Gịn - Đánh giá diện chất kháng sinh môi trường nước mặt sơng Sài Gịn Nợi dung 2: Đánh giá ức chế chất kháng sinh tiêu biểu thuộc nhóm Quinolones vi sinh vật nước mặt - Đánh giá ức chế E coli - Đánh giá ức chế vi sinh vật q trình phân hủy chất nhiễm hữu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu thập số liệu Trong luận văn, phương pháp thu thập số liệu thực sau: - Những tài liệu liên quan đến chất lượng nước sơng Sài Gịn phải có tính pháp lý; - Các tài liệu nghiên cứu liệu thứ cấp, thu thập trực tiếp từ sách, báo cáo khoa học, kết nghiên cứu công bố; - Các số liệu phục vụ cho trình thực luận văn phê duyệt, xác nhận quan quản lý liên quan Các tài liệu trích dẫn phần Tài liệu tham khảo Để thu thập tài liệu phục vụ cho nghiên cứu thực đề tài, bước tiến hành sau: 28 Bước 1: Xác định vấn đề liên quan đến nội dung cần nghiên cứu Bước 2: Xác định tài liệu, số liệu phục vụ cho đề tài phạm vi khơng gian, thời gian, quy mơ, tính tương đồng… Bước 3: Liên hệ quan quản lý trực tiếp tài liệu, số liệu để trích lục tham khảo Một số tài liệu, số liệu sử dụng nghiên cứu luận văn gồm: - Chương trình quan trắc mơi trường nước mặt khu vực Tp HCM (Trung tâm quan trắc tài nguyên môi trường Tp HCM) - Kết quan trắc môi trường Tp HCM tỉnh miền Tây Nam bộ (Bộ Tài ngun Mơi trường) - Các kết phân tích chất lượng nước sơng Sài Gịn (Viện Nhiệt đới mơi trường) - Các phương pháp phân tích, đánh giá chất lượng môi trường nước mặt (Bộ Tài nguyên Môi trường) 2.2.2 Phương pháp lấy mẫu Vị trí lấy mẫu thơng số phân tích Để đánh giá chất lượng nước sơng Sài Gịn, luận văn kết hợp với chương trình quan trắc chất lượng nước mặt sơng Sài Gịn tḥc Trung tâm Quan trắc Mơi trường Tp HCM năm 2018, lấy mẫu vị trí cho phân tích chất kháng sinh sơng Sài Gịn bao gồm: Hịa Phú, Rạch Tra, Bình Phước, Sài Gịn, Phú Mỹ Phân tích đồng thời thơng số có liên quan đến chất kháng sinh: TSS, Phosphat Số vị trí lấy mẫu: 10 vị trí, từ sau hồ Dầu Tiếng đến cầu Phú Mỹ, gồm: 29 Bảng 2.1 Vị trí lấy mẫu đánh giá chất lượng nước sơng Sài Gịn Stt Tên điểm quan trắc Ký hiệu Kiểu/loại điểm quan Kinh độ quan trắc trắc BC Nền 1.247.323,57 Vĩ độ Mô tả điểm quan trắc 566.074,70 Hạ lưu cửa xả hồ Dầu Tiếng Bến Củi Bến Súc BS Nền 1.233.701,74 576.646,02 Đầu nguồn sơng Sài Gịn Hịa Phú HP Cấp nước 1.214.985,52 595.005,55 Phú Cường PC Tác động 1.214.387,89 597.630,39 Rạch Tra Phú Long RT PL Tác động Tác động 1.207.599,12 1.205.288,14 598.260,87 603.208,75 Tại trạm bơm Hòa Phú, xã Hòa Phú Cầu Phú Cường - sơng Sài Gịn Sơng Rạch Tra Cầu Phú Long, quận 12 Bình Phước BP Tác đợng 1.201.227,72 605.708,92 Bình Lợi BL Tác đợng 1.197.227,82 604.989,55 Sài Gịn SG Tác đợng 1.194.265,49 606.858,08 10 Phú Mỹ PM Tác đợng 1.188.329,06 608.797,33 Cầu Bình Phước - sơng Sài Gịn Cầu Bình Lợi, quận Bình Thạnh Cầu Sài Gịn KTĐ Thủ Thiêm - Sơng Sài Gịn Cầu Phú Mỹ Cảng Rau Quả Tần suất: 01 tháng/Lần Thông số phân tích: pH, TSS, amoni, phosphate, oxy hịa tan, BOD, COD, tổng coliforms, Mn Fe Riêng khảo sát phân tích chất kháng sinh, cần khảo sát thêm nguồn thải đổ vào sơng Sài Gịn nên kết hợp với chương trình quan trắc nước mặt khu vực Tp HCM (Bộ TNMT), gồm 16 điểm lấy mẫu: Hóa An, Hịa Phú, Rạch Tra, Bình Phước, Vàm Thuật, Ba Son, Tân Thuận, Phú Mỹ, Phú Xuân, 10 Cát Lái, 11 Hãng Da, 12 Cần Giuộc, 13 kênh Xáng, 14 rạch Cây Khô, 15 kênh Thầy Cai, 16 KCN Hiệp Phước 30 Phương pháp lấy mẫu: - Tầng lấy mẫu: cách mặt nước 0,5m - Mặt cắt lấy mẫu: lấy dòng - Thiết bị lấy mẫu: sử dụng Barometer Wilco (Mỹ) 2.2.3 Phương pháp phân tích hóa lý Các phương pháp phân tích thực theo hướng dẫn quy chuẩn/tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) quốc tế (ISO) tương ứng công nhận, sau: Bảng 2.1 Phương pháp phân tích số STT Phương pháp phân tích Đo trường thiết bị TOA (Nhật pH Bản) Xác định phương pháp trọng lượng Tổng chất rắn lơ mg/L theo ISO/DIS 11923 lững (TSS) Xác định phương pháp trắc quang + Nessler theo tiêu chuẩn TCVN 6179 - 1996 Amoni (N-NH4 ) mg/L tương ứng ISO 7150:1986 Xác định phương pháp trắc quang theo Phosphat (P-PO43-) mg/L SMEWW 4500 - PO43-.E:2012 Xác định phương pháp áp kế với tủ BOD mg/L chuyên dùng Al - 214 Aqualytic (Đức) Xác định phương pháp oxy hóa K2Cr2O7 mơi trường axít theo TCVN COD mg/L 6491 - 1999 tương ứng ISO 6060:1989 Xác định phương pháp đếm nhiều ống Coliforms MPN/100mL theo tiêu chuẩn TCVN 6189:1996 tương ứng ISO 7899:1984 Xác định phương pháp AAS theo Sắt (Fe) mg/L TCVN 6193:1996 Xác định phương pháp AAS theo Mangan (Mn) mg/L TCVN 6193:1996 Thơng số Đơn vị 2.2.4 Phương pháp phân tích chất kháng sinh LC-MS Theo hướng dẫn Nhà sản xuất (Agilent) tài liệu kỹ thuật liên quan phương pháp phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC - MS), nguyên lý phương pháp LC - MS sử dụng nghiên cứu phân tích chất kháng sinh học Quinolon sau: 31 2.2.4.1 Nguyên lý chung Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry - MS) phương pháp nghiên cứu chất cách đo, phân tích xác khối lượng phân tử chất dựa chuyển đợng ion nguyên tử hay ion phân tử một điện trường từ trường nhất định Tỉ số khối lượng điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn chuyển động ion Nếu biết điện tích ion ta dễ dàng xác định khối lượng ion Trong phân tích ghép khối phổ, kỹ thuật ion hóa áp suất khí (Atmospheric Pressure Ionization - API) sử dụng phổ biến Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API LC/MS: - Ion hóa tia điện (electrospray ionization - ESI) - Ion hóa hóa học áp suất khí (atmospheric pressure chemical ionization - APCI) - Ion hóa photon áp śt khí (Atmospheric Pressure Photoionization - APPI) - Trong đó, hai kỹ thuật APCI ESI, đặc biệt ESI sử dụng nhiều phương pháp phân tích chất kháng sinh luận văn sử dụng kỹ thuật ESI 2.2.4.2 Ion hóa tia điện (ESI) ESI mợt kỹ thuật ion hóa ứng dụng cho hợp chất khơng bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn ESI có khả tạo thành ion đa điện tích (dương âm, tùy tḥc vào áp cực điện thế), xem kỹ thuật ion hóa êm dịu APCI, thích hợp cho phân tích hợp chất sinh học protein, peptide, nucleotide… polyme công nghiệp polyethylen glycol Trong ESI, ion hình thành sau: 32 Hình 2.1 Sơ đồ tạo ion dương nguồn ESI Được bắt nguồn từ hệ thống sắc ký lỏng, đầu ống dẫn mao quản, ảnh hưởng điện cao hỗ trợ khí mang, mẫu phun thành hạt sương nhỏ mang tích điện bề mặt Khí xung quanh giọt tạo nhiệt làm bay dung môi khỏi giọt sương, đó, mật đợ điện tích bề mặt hạt sương gia tăng Mật đợ điện tích tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để từ hạt sương phân chia thành hạt nhỏ lực đẩy lúc lớn sức căng bề mặt Quá trình lặp lại nhiều lần để hình thành hạt rất nhỏ Từ hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, ion phân tích chuyển thành thể khí lực đẩy tĩnh điện sau vào bợ phân tích khối Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải biến thành chất điện ly, tan dung dịch dùng để phun sương Điều phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa chất điện ly pH dung dịch Các dung môi phù hợp để phun sương là: methanol, acetonitrile, ethanol… 2.2.4.3 Một số kỹ thuật ghi phổ đầu dò khối phổ Scan: Khi thao tác với chế đợ scan, đầu dị nhận tất mảnh ion khối phổ toàn ion tất chất suốt trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích chất phân tích có nồng đợ đủ lớn Đối với đầu dị khối phổ ba tứ cực, chế đợ SCAN thường lựa chọn để khảo sát ion mẹ 33 Selected Ion Monitoring (SIM): Trong chế độ SIM, đầu dị MS ghi nhận tín hiệu mợt số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM cho tín hiệu ion lựa chọn trước đó, khơng thể dùng để nhận danh hay so sánh với thư viện có sẵn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường lựa chọn để khảo sát lượng phân mảnh biết ion mẹ 2.2.4.4 Quy trình phân tích a) Ngun tắc: mẫu tinh khiết SPE với cột chiết Oasis HLB (hydrophilic – lipophilic - balance) (60 mg, mL, Waters) với trợ giúp hệ thống SPE vacuum manifold 12 pos (Waters) Đầu tiên, trước phân tích dung dịch hồn nguyên lọc qua lọc sợi thủy tinh (0,2 µm, Whatman) Sau thực bước xử lý mẫu sau: - Bước 1: cợt chiết hoạt hóa với mL MeOH sau mL nước tinh khiết - Bước 2: mẫu cho chảy qua cột chiết với lưu lượng từ - mL/phút - Bước 3: rửa cột với mL hỗn hợp Up - water/MeOH (tỷ lệ thể tích 95/5) nhằm loại bỏ tiếp tục tạp chất lại - Bước 4: Sau cợt làm khơ cách hút chân không 10 phút nhằm loại bỏ hết nước, trước rửa giải với mL MeOH - Bước 5: Cho 0,5 mL hỗn hợp ACN với 0,1% axit formic H2O, tỷ lệ 15: 85 tương ứng với tỷ lệ ban đầu pha động sử dụng phân tích LC-MS Cho vào vial 1,5 mL phân tích LC - MS 34 Hình 2.2 Cợt SPE sử dụng nghiên cứu Hình 2.3 Hệ thống hút chân khơng cho chiết pha rắn Hình 2.4 Bơm hút chân khơng cho chiết pha rắn Hình 2.5 Vial để đựng chất kháng sinh Ciprofloxacin cho phân tích LCMS b) Test máy: Để kiểm tra đợ xác LC - MS, máy test Tune gốc Kết cho thấy giá trị m/z đạt yêu cầu kỹ thuật 35 Hình 2.6 Phổ test dung dịch Tune gốc 2.2.4.5 Phân tích Ciprofloxacin Ofloxacin LC - MS Agilent 1200 Phân tích chất kháng sinh tiêu biểu (Ciprofloxacin Ofloxacin) HPLC LC/MS Agilent 1200, thông số sắc ký lựa chọn sau: 36 - Cợt C18 ( µm, 4,6 x 150 mm), cợt có khả tách tốt, thời gian lưu ngắn; - Chương trình pha đợng: dựa vào tài liệu tham khảo, qua khảo sát, sinh viên lựa chọn pha đợng gồm có dung mơi ACN có 0,1% acid formic H2O (nước cất lần) có 0,1% acid formic Với tỷ lệ (15/85); - Tốc đợ dịng : 0,7 mL; - Nguồn ion hóa phun điện tử ESI Hình 2.7 Phổ phân tích chuẩn chất kháng sinh Ciprofloxacin 37 2.2.5 Phương pháp đánh giá chất lượng nước 2.2.5.1 Phương pháp so sánh Áp dụng phương pháp đánh giá, so sánh với QCVN đánh giá chất nước mặt QCVN 08-MT:2105/BTNMT - Phương pháp liệt kê: Lập bảng liệt kê mô tả nguồn tác động đối tượng bị tác động chất kháng sinh lưu vực sông Sài Gòn - Phương pháp ma trận: Phối hợp liệt kê đồng thời yêu tố liên quan đến ô nhiễm chất kháng sinh lưu vực sơng Sài Gịn - Phương pháp so sánh: Đánh giá chất lượng môi trường nước sơng Sài Gịn với quy chuẩn, quy chuẩn/tiêu chuẩn môi trường liên quan - Đánh giá thị ô nhiễm theo QCVN 08-MT:2015/BTNMT 2.2.5.2 Phương pháp số chất lượng nước (VN_WQI) Chỉ số chất lượng nước WQI (Water Quality Index) tính tốn cho thông số BOD5, COD, N-NH4+, P-PO43-, theo công thức sau: 𝑊𝑄𝐼𝑆𝐼 = 𝑞𝑖 − 𝑞𝑖+1 𝐵𝑃𝑖+1 −𝐵𝑃𝑖 (𝐵𝑃𝑖+1 − 𝐶𝑝 ) + 𝑞𝑖+1 (2-1) Trong đó: - BPi: Nồng độ giới hạn giá trị thông số quan trắc quy định bảng tương ứng với mức i - BPi+1: Nồng độ giới hạn giá trị thông số quan trắc quy định bảng tương ứng với mức i+1 - qi: Giá trị WQI mức i cho bảng tương ứng với giá trị BPi - qi+1: Giá trị WQI mức i+1 cho bảng tương ứng với giá trị BPi+1 - Cp: Giá trị thông số quan trắc đưa vào tính tốn - Các bước xây dựng số chất lượng môi trường nước WQI (Water Quality Index) theo hướng dẫn Quyết định số 1460/QĐ-TCMT Tổng cục môi trường, thông số xây dựng số pH, DO, BOD5, COD, N-NH4+, P-PO43- 38 2.2.6 Phương pháp định lượng E coli phương pháp MPN (most probable number) 2.2.6.1 Hóa chất Thuốc thử Kovac’s, Methyl Red, dung dịch α – naphthol, KOH 40%, cồn 960, 700 nước cất 2.2.6.2 Môi trường - Môi trường Lauryl Sulphate Broth (canh LSB) - Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL) - Môi trường EC Broth (canh EC) - Môi trường Eosin Methylene Blue Lactose agar (EMB) - Môi trường canh Trypton (Tryptophane) Borth 1% - Môi trường MR - VP Broth - Môi trường Simmon Citrate Agar - Môi trường MC 39 2.2.6.3 Quy trình thí nghiệm Chuẩn bị dịch đồng nhất pha lỗng mẫu để có đợ lỗng 10-1, 10-2, 10-3 Chuyển mL dung dịch pha loãng vào ống 10 mL LSB, ủ 370C, 48 (mỗi ống lặp lại lần) Cấy ống LSB (+) vào canh EC, ủ 44 - 450C 24 Cấy ống EC (+) vào môi trường thạch EMB, ủ 370C 24 Chọn khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch MC (MacConkey Agar) Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào Trypton, MRVP, SC Citrate, ủ 44-450C, 24 Thử nghiệm kháng sinh khuẩn lạc phương pháp giấy kháng sinh khuếch tán Thử nghiệm IMViC Tra bảng MPN để xác định mật đợ E coli Hình 2.1 Quy trình bố trí thí nghiệm phân tích E coli Các bước tiến hành thí nghiệm thực theo hướng dẫn TCVN 61872:1996 (ISO 9308-2:1990) [21] 40 2.2.7 Phương pháp đánh giá ức chế chất kháng sinh vi khuẩn E coli 2.2.7.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Khái niệm: Qui trình Kỹ thuật xây dựng dựa thường qui chuẩn thức Việt Nam dựa qui trình thao tác chuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng Xét nghiệm Mỹ (Clinical and Laboratory Standard Institute) [22] Qui trình đánh giá phịng thí nghiệm Kháng sinh - Khoa Vi khuẩn -Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Nếu thực qui trình mợt cách xác, thu kết mà qua dự báo mợt cách chắn kháng sinh có tác dụng lâm sàng Nguyên lý: Kháng sinh khoanh giấy khuếch tán vào thạch Meuler-hinton có chứa chủng vi khuẩn thử nghiệm mức độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh biểu đường kính vịng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh 41 Phân lập Cấy chuyển vào môi trường không chọn lọc Tạo huyền dịch vi khuẩn nước muối sinh lý (nồng độ 108 vi khuẩn/mL) Điều chỉnh độ đục vi khuẩn (nồng độ 106 vi khuẩn/mL) Cấy vi khuẩn lên đĩa thạch Mueller Hinton Đặt khoanh giấy kháng sinh Khô mặt thạch 370C/qua đêm Đo vịng vơ khuẩn Hình 2.1 Qui trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán theo tiêu chuẩn CLSI, 2011 2.2.7.2 Các bước tiến hành - Chuẩn bị đĩa thạch Mueller - Hinton Sử dụng thạch Mueller - Hinton có sẵn Khi sử dụng, mặt thạch ướt phơi đĩa thạch tủ ấm (35 - 370C) khoảng 15 - 30 phút Không mở nắp đĩa thạch phơi để tránh bị nhiễm Kiểm tra pH môi trường trước đổ đĩa, pH phải nằm khoảng 7,2 - 7,4 Sử dụng chủng chuẩn E coli ATCC 25922 - Chuẩn bị chủng vi khuẩn Pha hỗn dịch vi khuẩn - Láng vi khuẩn lên đĩa thạch 42 - Đặt khoanh giấy kháng sinh - Đọc phân tích kết Sau ủ ấm lấy đĩa thạch khỏi tủ ấm Đo ghi lại kích thước vịng vơ khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau đĩa không mở nắp) chủng chuẩn So sánh kết chủng chuẩn với bảng chuẩn Nếu phù hợp nghĩa qui trình thực đúng, tiếp tục đọc kết vịng vơ khuẩn chủng thử nghiệm So sánh kích thước vịng vơ khuẩn chủng thử nghiệm với vịng ức chế chuẩn loại kháng sinh thử nghiệm là: nhạy cảm (S), trung tính (I) kháng (R) Hình 2.2 Ví dụ dĩa đọc đường kính vùng ức chế dạng nhỏ [22] Bảng 2.1 Tiêu chuẩn đọc kết đường kính vùng ức chế nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) [22] Hàm lượng Giới hạn đường kính vùng ức chế (mm) Giới hạn nồng độ ức chế tối thiểu (μg/mL) S I R S I R Ciprofloxacin μg ≥ 21 16 - 20 ≤ 15 ≤1 ≥4 Ofloxacin μg ≥ 16 13 - 15 ≤ 12 ≤2 ≥8 Ghi chú: S: nhạy cảm (Susceptible), I: trung tính (Intermediate), R: kháng (Resistant) 43 2.2.8 Đánh giá giảm khả phân hủy chất hữu Sử dụng thị đánh giá ô nhiễm hữu cơ: giá trị BOD5 Giá trị BOD5 xác định khoảng < 150 mg/L Hiệu suất giảm khả phân hủy chất hữu cơ: H%  BOD  BOD cip x100% BOD (2-2) Trong đó: BOD0: giá trị BOD ban đầu BODcip: giá trị BOD cho chất kháng sinh Ciprofloxacin 2.2.9 Phương pháp tính tốn số ức chế tăng trưởng kháng sinh Thực kỹ thuật đánh giá phân hủy chất hữu thị BOD BOD dựa vào nồng độ BOD chuẩn (glutamid) nước thải sinh hoạt Phương trình tính tốn ức chế theo cơng thức [23]: I Bc  Bn x100 Bc  Bo (2-3) Trong đó: I: tỷ lệ ức chế tăng trưởng theo tỷ lệ % Bc: giá trị trung bình điều khiển cuối thử nghiệm Bn: giá trị trung bình phương pháp thử nghiệm B0: giá trị ban đầu thí nghiệm thời điểm (chưa ức chế Ciprofloxacin) 44 ... sánh: Đánh giá chất lượng mơi trường nước sơng Sài Gịn với quy chuẩn, quy chuẩn/tiêu chuẩn môi trường liên quan - Đánh giá thị ô nhiễm theo QCVN 08-MT :20 15/BTNMT 2. 2.5 .2 Phương pháp số chất lượng... x100% BOD (2- 2) Trong đó: BOD0: giá trị BOD ban đầu BODcip: giá trị BOD cho chất kháng sinh Ciprofloxacin 2. 2.9 Phương pháp tính tốn số ức chế tăng trưởng kháng sinh Thực kỹ thuật đánh giá phân... phân tích chất lượng nước sơng Sài Gịn (Vi? ??n Nhiệt đới mơi trường) - Các phương pháp phân tích, đánh giá chất lượng môi trường nước mặt (Bộ Tài nguyên Mơi trường) 2. 2 .2 Phương pháp lấy mẫu