XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC 1 LOẠI BỆNH PHẨM – THỂ TÍCH BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN MẪU 2 13 Sep 181 ○Bệnh phẩm phải được đảm bảo về chất lượng và số lượng; được thu thập, vận chuyể[.]
XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN LAO VÀ LAO KHÁNG THUỐC LOẠI BỆNH PHẨM – T QUẢN VÀ VẬN CHUY 13-Sep181 ○Bệnh phẩm phải đảm bảo chất lượng số lượng; thu thập, vận chuyển xử lý cách ○Tùy theo thể loại bệnh lao mà loại bệnh phẩm thu thập khác nhau: Loại bệnh phẩm Thể tích Đàm 5-10ml (VN: 3-5ml) Dịch não tủy 10ml, nhiều tốt Dịch abces 10ml, nhiều tốt Dịch màng phổi, dịch màng tim, dịch màng bụng 10ml, nhiều tốt Dịch dày 5-10ml Hạch lympho phần hay toàn hạch Dịch rửa phế quản ≥ 5ml Nước tiểu 50ml, nhiều tốt Sinh thiết mô 1g Phân ≥1g Máu 10ml Xương, tủy xương 100mg, nhiều tốt 1-3ml bệnh phẩm chọc hút 13-Sep-182 THỂ TÍCH DỊCH NÃO TỦY - TỈ LỆ CẤY DƯƠNG 118 BN LMN/HIV âm 90 80 78 8070605040 57 62 40302010 00-1.9 2.0-3.9 4.0-5.9 6.0-7.9 >8 THỂ TÍCH DỊCH NÃO TỦY (ml) Thwaites, G E., T T Chau, and J J Farrar 2004 Improving the bacteriological diagnosis of tuberculous meningitis J Clin Microbiol 42:378-9 ➢ Các bệnh phẩm phải chuyển đến phịng xét nghiệm ➢ Nếu khơng có điều kiện chuyển mẫu (đàm), giữ mẫu 40C vòng 3-4 ngày 13-Sep-183 Advances in Diagnostic Assays for Tuberculosis Cold Spring Harb Perspect Med 2015;5:a017806 SỰ PHÁT TRIỂN CÁC TEST CHẨN ĐOÁN 13-Sep-184 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN MỚI ➢ Cần: Cho kết nhanh ➢ Cho kết xác: độ nhạy, đặc hiệu cao ➢ Test lưu trữ v nhiệt độ phòng ➢ Dễ thực hiện, đơn giản ➢ Không cần trang thiết bị đại, phức tạp ➢ Rẽ tiền ➢ rộng rãi nước có mật lao cao ➢ 10 13-Sep-185 XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐỐN LAO 11 PHƯƠNG PHÁP SOI TÌM AFB ➢Được áp dụng để chẩn đoán phát lao nước có gánh nặng lao với n chế ➢Dễ thực hiện, chi phí thấp ➢Cho kết xác nhanh, vịng vài g phân biệt vi khuẩn sống hay chết, vi khuẩn nhạy hay kháng thuốc, MTB hay NTM ➢Các phương pháp soi: ➢ Soi trực tiếp (áp dụng rộng rãi) ➢Soi (áp dụng hạn chế) 12 13-Sep-186 Rửa Fuchsin 0.3% - 05 phút nhẹ vòi nước NHUỘM ZIEHL Rửa nhẹ vòi nước NEELSEN Methylen 0.3% - phút Acid cồn 3% - 03 phút Rửa nhẹ vòi nước – Để khô tự nhiên 14 PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP (1) ➢ 10.000 vi khuẩn/ml đàm ➢ Độ nhạy: 50 – 80%, Độ đặc hiệu: 98 – 99% ➢ Thu thập mẫu đàm ngày, cách 13 13-Sep-187 PHƯƠNG PHÁP SOI TRỰC TIẾP NHUỘM ZN (2) Cách đọc ghi kết AFB/100 qt Âm tính – AFB/100pt Ghi số cụ thể 10 – 99 AFB/100qt 1+ – 10 AFB/qt 2+ >10 AFB/qt 3+ ➢ Tỉ lệ phát hiện: ▪ Đàm 1: 80 – 83% ▪ Đàm 2: Thêm khoảng 10% 15 ▪ Đàm 3: Thêm khoảng 5% Rửa nhẹ vòi nước Auramine 0.1% - 20 phút KMnORửa nhẹ vòi nước 0.5% - phút Acid cồn 0.3% - phút Rửa nhẹ vòi nước – Để khô tự nhiên NHUỘM HUỲNH QUANG 16 2011 13-Sep-188 SOI TÌM AFB BẰNG KHV HUỲNH QUANG (3) NC phân tích tổng hợp Độ nhạy (%) Độ đặc hiệu (%) Bệnh phẩm không xử lý KHV thường 32 - 94 94 - 100 KHV HQ 52 - 97 94 - 100 Bệnh phẩm xử lý KHV thường 52 - 94 94 - 100 KHV HQ 63 - 97 94 - 100 17 Lancet Infect Dis, 2006.6(9):p.570-81 SOI TÌM AFB BẰNG KHV HUỲNH QUANG (4)KHV HUỲNH QUANG LED Sử ánh dụng sáng đèn thường LED thành cực sáng ánh sáng huỳnh nguồn quang sáng phản chiếu, chuyển ➢ Khơng thay bóng đèn ➢ Khơng tạo nhiệt q trình sử dụng ➢ Giảm lượng tiêu thu ➢ Có thể sử dụng pin ➢ Giảm giá thành ➢ 10.000 ➢ Có Rhod/KMnO4; thể sử dụng ➢ Au/MethBlue) nhiều loại thuốc nhuộm (Au/KMnO4; Au18 13-Sep-189 KHV HQ LED TCYTTG khuyến cáo sử dụng vào năm 2009 để phát hi lao cao Chuẩn vàng Độ nhạy LED-FM Độ đặc hiệu LED-FM Cấy 93% (85% - 97%) 99% (98% - 99%) Soi trực tiếp (ZN) Tăng 6% (0.1% - 13%) Không thay đổi 13-Sep-1810 Soi huỳnh quang cổ điển PHƯƠNG PHÁP CẤY ➢ >100 - 1000 vi khuẩn/ml đàm ➢ Vi khuẩn lao tăng sinh tốt môi trường trứng chứa glycerol a môi trường lỏng chứa serum albumin bò ➢ Tăng tỉ lệ phát khoảng 30 – 50% so với phương pháp soi ➢ Cho kết chậm thời gian n (18-24 giờ): ▪ Phương ▪ Phương pháp cấy đặc: tuần – tháng pháp cấy lỏng: – tuần ➢ Các chủng cấy dương dùng để thực : ▪ Các xét nghiệm định danh ▪ Kháng ▪ Xét sinh đồ nghiệm sinh học phân tử 20 ăng 5% (0 – 11%) Tăng 1% (-0.7% - 3%) 19 Giảm thời gian đọc tiêu 50% so với ZN 13-Sep-1810 13-Sep-1810 PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (1) ➢ Được TCYTTG công nhận chuẩn vàng chẩn đốn lao ➢ Các loại mơi trường: ▪ Lưwenstein-Jensen (LJ): mơi ▪ Mơi trường OGAWA trường trứng chứa Glycerol Asparagine : môi trường trứng chứa Glycerol sodium glutamate ▪ Middlebrook 7H10 agar ➢ Qui trình cấy: 13-Sep-1811 ▪ Trả kết âm tính sau tuần ➢ Tỉ lệ ngoại nhiễm chấp nhận: 2-3% 22 13-Sep-1811 13-Sep-1811 ▪ Bệnh phẩm ▪ Cặn lắng xử lý với NALC-NaOH NaOH 2-4% (ngoại trừ dịch thể vô trùng dịc bệnh phẩm xử lý cấy môi trường LJ, ủ 35-37 0C thấy khóm 21 PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MƠI TRƯỜNG ĐẶC (2) ➢ Đọc phân tích kết quả: ▪ Đọc kết hàng tuần ▪ Thường có kết cấy dương sau 3-4 tuần : ▪ Khóm trùng có màu kem, sần sùi bơng cải súp lơ ▪ Khi hịa tan khóm trùng nước muối sinh lý thấy diện hạt nhỏ ▪ Quan sát KHV: hình ảnh dây thừng với chiều dài khác ▪ Nếu có kết cấy dương vịng tuần: Nhóm vi khuẩn mọc nhanh (Mycobacterium Other Than Tuberculosis – MOTT hay Nontubercul NTM) ▪ 13-Sep-1811 13-Sep-1811 PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (4) ➢ Ưu điểm ▪ Môi trường dễ pha chế ▪ Rẽ tiền ▪ Vi khuẩn lao mọc tốt mơi trường ▪ Sau pha chế, sử dụng vài tuần (giữ 4-80C) ▪ Môi trường có chứa malachite green dùng để ức chế phát triển tạp khu 13-Sep-1812 thể 20-100 khóm trùng Dương tính: 1+ 100-200 khóm trùng Dương tính: 2+ 200-500 khóm trùng Dương tính: 3+ >500 khóm trùng Dương tính: 4+ Ngoại nhiễm Ngoại nhiễm Khóm trùng vi khuẩn lao mẫu cấy dương Mẫu cấy LJ dương 13-Sep-1812 13-Sep-1812 ➢ Khuyết điểm 24 ▪ Thời gian cho kết Đọc kết Giải thích lâu (4-8 tuần) Khơng mọc Âm tính 1-19 khóm trùng Dương tính: số cụ 13-Sep-1812 13-Sep-1812 PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (1) ➢ Hệ thống BACTECTM MGITTM 960 (Becton Dickinson, Sparks, 23 MD) ➢ Ưu điểm: Vi khuẩn lao mọc phát triển môi trường lỏng nhanh môi trường đặc Độ nhạy cao phương pháp cấy đặc khoảng 10% Đọc kết máy Thời gian cho kết nhanh (10-14 ngày) ➢ Khuyết điểm Đắt tiền Tỉ lệ ngoại nhiễm cao (5-10%) Năm 2007, TCYTTG khuyến cáo sử dụng phương pháp cấy lỏng để tăng tỉ lệ phát 25 PHƯƠNG PHÁP CẤY LỎNG TỰ ĐỘNG (2) MGIT: Mycobacteria Growth Indicator Tube ➢ Tube MGIT chứa Middlebrook 7H9, OADC PANTA ➢ Đáy tube phủ lớp silicon chứa muối ruthenium (ruthenium salt) đóng vai trị chất phát huỳnh quang ➢ Bình thường, oxy diện mơi trường cấy che lấp phát quang muối ruthenium ➢ Khi vi khuẩn sử dụng oxy để chuyển hóa tăng sinh môi trường nuôi cấy, lượng oxy môi trường giảm, phát quang đáy tube nhìn thấy xem đèn UV ➢ Cần xác định diện AFB mẫu cấy ➢ 26 13-Sep-1813 ĐỊNH DANH VI KHUẨN LAO (1) Định danh vi khuẩn lao chủ yếu dựa vào tính chất sau: khuẩn sinh trưởng chậm Nhiệt độ sinh trưởng 35 – 370C Không sinh sắc tố Niacin dương tính Phản ứng Nitrate dương tính Phản ứng catalase dương tính Khơng mọc mơi trường LJ có chứa 500mg/L p Vi nitrobenzoic acid Mọc mơi trường có chứa thiophen-2-carboxylic 13-Sep-1814 acid hydrazide (2μg/ml TCH) 27 TEST ĐỊNH DANH MTB COMPLEX Phát protein MPT 64 (kháng nguyên) M.tb complex tiết môi trường cấy lỏng 28 JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Dec 2011, p 4343–4346 13-Sep-1814 13-Sep-1814 XÉT NGHIỆM VI SINH 29 CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜN ➢ Phương pháp kháng sinh đồ cổ điển: phương pháp tỉ lệ kháng (proportional DST method) ▪ Là phương pháp kháng sinh đồ gián tiếp ▪ Được công nhận chuẩn vàng chẩn đốn lao kháng thuốc ▪ Tính chất kháng thuốc xác định dựa tỉ lệ % số khóm trùng đếm ống m ống môi trường không thuốc ▪ Được khuyến cáo thực bệnh nhân lao/nghi lao kháng thuốc: BN bỏ trị, thất bại HIV ▪ Rẽ tiền 13-Sep-1815 ▪ Thời gian có kết từ 28 – 42 ngày kể từ có kết cấy dương tính 30 13-Sep-1815 13-Sep-1815 PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (1) Thuốc kháng lao hàng Thuốc kháng lao hàng INH Ofloxacin Streptomycin Amikacin Rifamp Ethambutol Kanamycin PAS Capreomycin PZA: Phương pháp Wayne: positive: nhạy (có pyrazinamidase) pyrazinamidase/MTB (pncA gene) PZA (prodrug) Pyrazinoic acid (POA) 13-Sep-1816 dạng hoạt động PZA, diệt MTB 31 Jonmalung et al BMC Microbiology 2010, 10:223 PHƯƠNG PHÁP KHÁNG SINH ĐỒ TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC (3) ➢ Giải thích kết quả: vd: với tỉ lệ kháng 1% ▪ Nếu ▪ Nếu tỉ lệ