Khóa luận tốt nghiệp : Công nghệ cố định enzyme và ứng dụng

~ i ~ ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM    BK TP HCM ĐỒ ÁN MÔN HỌC TRANG BÌA CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM VÀ ỨNG DỤNG SVTH : NGUYỄN BẢO DƢ MSSV : 60700443 GVHD : TS. TRẦN BÍCH LAM TRANG BÌA TP Hồ Chí Minh, 6/2011 Đồ án môn học ~ ii ~ NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2011 Chữ ký của giáo viên Đồ án môn học ~ iii ~ LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Bích Lam đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án. Cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trƣờng Đại học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức quý báu của mình giúp tôi hoàn thành đồ án. Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những ngƣời đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011 Nguyễn Bảo Dƣ Đồ án môn học ~ iv ~ MỤC LỤC TRANG BÌA i NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vi Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1 1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định 1 1.2. Sơ lƣợc về enzym cố định 2 1.2.1. Định nghĩa 2 1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định 2 1.2.3. Ƣu nhƣợc điểm của enzym cố định 3 1.2.4. Các phƣơng pháp cố định enzym 3 1.2.5. Vật liệu cố định 5 1.2.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự cố định enzyme 7 Chƣơng 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 9 2.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 9 2.1.1. Enzym β-galactosidase 9 2.1.1.1. Giới thiệu về enzym β-galactosidase 9 2.1.1.2. Nguồn thu nhận enzym β-galactosidase 9 2.1.1.3. Các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase 10 2.1.1.4. Ứng dụng của enzym β-galactosidase cố định 13 2.1.1.4.1. Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum 13 2.1.1.4.2. Tổng hợp Galacto-Oligosaccharides (GOSs) 16 2.1.2. Enzym lipase 17 2.1.2.1. Giới thiệu về enzym lipase 17 2.1.2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase 17 2.1.2.3. Các phƣơng pháp cố định enzym lipase 18 2.1.2.4. Ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm 20 2.1.2.4.1. Ứng dụng lipase cố định tổng hợp các ester có hƣơng trái cây 20 2.1.2.4.2. Ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất liên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ 21 2.1.3. Enzym α-galactosidase (raffinase) 23 Đồ án môn học ~ v ~ 2.1.3.1. Giới thiệu về enzym α-galactosidase 23 2.1.3.2. Nguồn thu nhận enzym α-galactosidase 23 2.1.3.3. Cách phƣơng pháp cố định enzym α-galactosidase 23 2.1.3.4. Ứng dụng của enzym riffinase cố định 26 2.2. Ứng dụng trong phân tích 27 2.2.1. Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor) 27 2.2.1.1. Giới thiệu về cảm biến sinh học 27 2.2.1.2. Lịch sử phát triển cảm biến sinh học 27 2.2.1.3. Phân loại 28 2.2.1.4. Các yếu tố sinh học 29 2.2.1.4.1. Enzym 29 2.2.1.4.2. Kháng thể 29 2.2.1.4.3. Vi sinh vật 30 2.2.1.5. Bộ chuyển đổi (transducer) 30 2.2.1.5.1. Chuyển đổi điện hóa 30 2.2.1.5.2. Chuyển đổi quang 30 2.2.1.5.3. Chuyển đổi nhiệt 30 2.2.1.5.4. Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) 30 2.2.2. Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase và L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm 31 2.2.2.1. Giới thiệu 31 2.2.2.2. Phƣơng pháp thí nghiệm 31 2.2.2.2.1. Các hóa chất sử dụng 31 2.2.2.2.2. Sự cố định enzym 31 2.2.2.2.3. Điện cực 32 2.2.2.2.4. Thử nghiệm 32 2.2.2.2.5. Quá trình phản ứng 33 2.2.2.2.6. Cấu hình nhiệt độ và pH 33 2.2.2.2.7. Xác định giá trị K m và V max 34 2.2.2.2.8. Sự ổn định của màng cố định 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 Đồ án môn học ~ vi ~ DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mô hình biosensor 27 Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD–L-GLDH cố định 32 Hình 2.3: Đƣờng hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD–L- GLDH cố định trong cảm biến sinh học 33 Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 ◦C có mặt 2mM NADPH và 10mM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L 34 Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 34 Hình 2.6: Hoạt tính của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: L- GLOD 25U–L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U–L-GLDH 35U; L-GLOD 25U 35 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ƣu – Nhƣợc điểm của các phƣơng pháp cố định enzyme 4 Bảng 2.1: Tóm tắt các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase 13 Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau 15 Bảng 2.3: Nguồn VSV thu nhận enzym lipase và tính chất enzyme lipase 18 Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 1 ~ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định [1] - Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men (EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đƣờng saccharose. Sau đó trên thế giới xuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang. Trƣớc năm 1953 chƣa có một nghiên cứu nào về enzym không hòa tan đƣợc ứng dụng vào thực tế. - Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định đƣợc một số enzym nhƣ carboxy peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cứu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot. - Năm 1954, Chang đã tạo ra đƣợc các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng khi đƣa enzym vào cơ thể. - Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzym nhƣ amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide. - Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phƣơng pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong năm này Chang đã triển khai phƣơng pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase. - Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xƣởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định. - Năm 1969, Chibata và những ngƣời cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku – Nhật đã là những ngƣời đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. Theo phƣơng pháp cố định enzym của các tác giả ngƣời Nhật, enzym aminoacylase của nấm sợi đã đƣợc gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân. - Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzym: -galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex. - Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase. - Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những ngƣời đầu tiên thành công trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamid. Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 2 ~ - Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến hành sản xuất siro fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp. Cho đến nay có khoảng 4,5 triệu tấn siro fructose đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp enzym cố định. - Ngoài sản phẩm trên, enzym cố định còn đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trƣờng và cả trong y học. 1.2. Sơ lƣợc về enzym cố định 1.2.1. Định nghĩa [1] Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa: - Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan là enzym đƣợc đƣa vào những pha riêng rẽ, pha này có thể tách riêng với môi trƣờng dung dịch phản ứng. Pha enzym không hòa tan trong nƣớc và đƣợc gắn với các polymer ƣa nƣớc có trọng lƣợng phân tử lớn. - Nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại. Nhƣ vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm cả enzym đƣợc cố định vào một chất mang, cả enzym có trong tế bào sống, chúng đƣợc cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần. - Enzym không hòa tan hay enzym cố định thƣờng là những enzym hòa tan đƣợc gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan. 1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định [1] Enzym cố định có đặc điểm nhƣ sau: - Hoạt tính của enzym cố định thƣờng nhỏ hơn hoạt tính của enzym tự do cùng loại. Sở dĩ có sự thay đổi hoạt tính riêng của enzym cố định là do những nguyên nhân sau:  Do ảnh hƣởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự khác biệt với điện tích của enzym thì khi gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian của enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết hợp giữa enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cùng giảm.  Do enzym bị nhốt vào mạng lƣới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi. - Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhƣng có một số sai khác nhất định:  Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 3 ~  Xảy ra hiện tƣợng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng. - Enzym cố định thƣờng có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở của chất mang. - Enzym cố định thƣờng có pH tối ƣu không trùng với enzym tự do cùng loại. - Enzym cố định do có chất mang che chắn nên đƣợc bảo vệ tốt hơn enzym tự do. - Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do. 1.2.3. Ƣu nhƣợc điểm của enzym cố định [1] Ưu điểm: - Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài. - Enzym cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzym, do đó nó không gây ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không tốn chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm. - Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang – enzym ra khỏi dung dịch cơ chất. - Enzym cố định tƣơng đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do. - Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phƣơng pháp liên tục. Nhược điểm: - Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym. - Trong đa số trƣờng hợp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quá trình cố định. - Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzym cũng nhƣ ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. 1.2.4. Các phƣơng pháp cố định enzym [1] Các phƣơng pháp cố định enzym đƣợc chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 4 ~ Bảng 1.1: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme [1] Phƣơng pháp hóa học Phƣơng pháp Ƣu điểm Nhƣợc điểm Phƣơng pháp gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị Liên kết giữa enzym và chất mang là liên kết bền, do đó hạn chế tối đa sự mất mát enzym trong quá trình phản ứng. Hoạt tính enzym có thể bị giảm do những biến đổi về cấu trúc của enzym trong quá trình cố định. Phƣơng pháp gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị Tạo đƣợc liên kết rất bền trƣớc các tác nhân pH, nhiệt độ… Thƣờng đƣợc dùng phối hợp với các phƣơng pháp khác. Chi phí cao, thao tác thực hiên tƣơng đối phức tạp. Hoạt tính enzym có thể bị giảm do những biến đổi về cấu trúc của enzym trong quá trình cố định. Phƣơng pháp vật lý Phƣơng pháp Ƣu điểm Nhƣợc điểm Phƣơng pháp gắn enzym lên chất mang bằng tác nhân vật lý Thao tác thực hiện đơn giản. Điều kiện tiến hành cố định enzym ôn hòa nên không làm mất hoạt tính của enzym trong quá trình cố định. Có khả năng tái sử dụng chất mang. Do lực tƣơng tác giữa enzym và chất mang yếu nên dễ xảy ra hiện tƣợng nhả hấp phụ trong quá trình sử dụng enzym cố định do khuấy trộn hay do thay đổi nhiệt độ, pH của môi trƣờng. Phƣơng pháp nhốt enzym Thao tác đơn giản. Không đòi hỏi phải có các nhóm tạo liên kết nên phù hợp với nhiều loại enzym. Hiệu quả cố định enzym cao. Có thể cố định đồng thời nhiều enzym. Chỉ thích hợp cho phản ứng với cơ chất có khối lƣợng phân tử nhỏ. [...]... Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học Hiện nay, những bất lợi của việc sử dụng lipase để ứng dụng trong công nghệ thực phẩm là giá cả của enzyme Để vƣợt qua vấn đề này, lipase đƣợc sử dụng ở dạng cố định, vì phƣơng pháp này cho phép tái sử dụng enzyme Bằng cách cố định enzyme, qua trình sản xuất liên tục cũng đƣợc thực hiện dễ dàng hơn Phƣơng pháp cố định enzyme có thể đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp cố định. .. chất, sản phẩm và các chất khác Hơn nữa, cùng với hoạt tính xúc tác cao của enzym sẽ làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản phẩm của dung dịch và chất mang chứa enzym cố định Điều này làm cho các thông số công nghệ thay đổi, đó là điều cần để ý khi thiết lập quy mô của quá trình ~8~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học Chƣơng 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 2.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm... nhiều đến tỉ lệ enzym đƣợc cố định và hoạt độ riêng của enzym hơn sự ảnh hƣởng của nồng độ CaCl2, do đó nồng độ alginate cần đƣợc tối ƣu hóa để hiệu suất cố định enzym đạt cao nhất [12] 2.1.2.4 Ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm 2.1.2.4.1 Ứng dụng lipase cố định tổng hợp các ester có hƣơng trái cây [13] Các ester có cấu tạo acid béo chuỗi ngắn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc tạo... phƣơng pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả của quá trình cố định enzym Trong đó, không có đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định nào thích hợp cho tất cả các loại enzym và cũng không có enzym nào thích hợp với tất cả các loại vật liệu cố định Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu hữu cơ Vật liệu vô c : - Đặc điểm: chất mang... monomer là glucose và galactose Việc sử dụng β-galactosidase để thủy phân lactose trong sữa và whey là một trong những ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và các sản phẩm từ sữa Enzym này có thể đƣợc sử dụng dƣới dạng hòa tan hoặc dạng cố định nhƣng dạng hòa tan chỉ có thể sử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng cố định có lợi thế hơn là có thể sử dụng tốt cho cả hai qui... tƣơng ứng là 1209U/g gel và 2716U/g gel sau 5h cố định Sự ổn định nhiệt tăng đáng kể khi so sánh với enzym hòa tan, gấp 20 lần khi sử dụng agaroseglyoxyl và gấp 18 lần khi sử dụng chitosan-glutaraldehyde và gấp 21 lần khi sử dụng agarose-glutaraldehyde Dẫn xuất tốt nhất có độ ổn định gấp 58 lần so với enzym tự do, thu đƣợc khi cố định trên chitosan đƣợc hoạt hóa qua 2 bƣớc, sử dụng glycidol và glutaraldehyde,... sử dụng Enzym αgalactosidase đƣợc cố định trong gel alginate 3% bị mất 54,5% hoạt tính so với enzym tự do Kmax và Vmax của enzym cố định với cơ chất là raffinose là 5.5mM và 0.15Uml−1 Nhiệt độ tối ƣu của enzym cố định là 57oC và pH tối ƣu là 4,5 Enzym hòa tan giữ đƣợc 92% và 88% hoạt tính sau 8h và 12h, trong khi đó enzym cố đinh giữ đƣợc 94% và 92% [15] Enzym α-galactosidase từ G fujikuroi đƣợc cố định. .. stearothermophilus chịu nhiệt đƣợc cố định trên chitosan sử dụng Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng để thủy phân đƣờng lactose trong sữa Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính của enzym β-galactosidase đƣợc cố định ~ 10 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học trên THP thì vƣợt trội hơn so với enzym tự do và enzym đƣợc cố định bằng glutaraldehyde Enzym β-galactosidase đƣợc cố định trên THP cho thấy... acetate và n-propyl acetate tƣơng ứng là 50% và 56% đạt đƣợc sau 24h ở nhiệt độ ở 30oC với nồng độ enzym là 25%(w/v) Enzym lipase cố định có thể đƣợc sử dụng trong 3 chu kỳ mà vẫn giữ đƣợc 100% hiệu suất tổng hợp ester Giá tri Km và Vmax đƣợc xác định là 227mM và 322 µmol/(g.h) đối với n-butyl acetate và 222mM và 385 µmol/(g.h) đối với n-propyl acetate ~ 20 ~ Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học Trong phản ứng. .. phản ứng tăng, qua giá trị 50oC thì tốc độ phản ứng giảm xuống Với n-butyl acetate tốc độ phản ứng tăng từ 217 đến 410 µmol/(g.h) và tăng từ 298 đến 529 µmol/(g.h) 2.1.2.4.2 Ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất liên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ [14] Monoacylglycerols (MAG) đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ là chất nhũ hóa trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm, mỹ phẩm Trong công nghiệp . cố định enzym lipase 18 2.1.2.4. Ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm 20 2.1.2.4.1. Ứng dụng lipase cố định tổng hợp các ester có hƣơng trái cây 20 2.1.2.4.2. Ứng dụng enzyme. cứu về cố định enzym cũng nhƣ ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. 1.2.4. Các phƣơng pháp cố định enzym [1] Các phƣơng pháp cố định enzym đƣợc chia thành 2 nhóm: hóa học và vật. triển của enzym cố định 1 1.2. Sơ lƣợc về enzym cố định 2 1.2.1. Định nghĩa 2 1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định 2 1.2.3. Ƣu nhƣợc điểm của enzym cố định 3 1.2.4. Các phƣơng pháp cố định enzym