2.2.1.1. Giới thiệu về cảm biến sinh học [18]
Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lƣợng hoặc bán định lƣợng đặc trƣng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi (International Union of Pure and Applied Chemistry).
Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các tác nhân sinh học nhƣ enzym, các kháng thể,... để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hoá chất. Do vậy cấu tạo của cảm biến sinh học bao gồm 3 thành phần cơ bản: thành phần hoá học, thành phần sinh học và thành phần vật lý.
Hình 2.1: Mô hình biosensor
2.2.1.2. Lịch sử phát triển cảm biến sinh học [18]
Giáo sƣ Leyland D.Clark đƣợc biết nhƣ là ngƣời đi tiên phong trong lĩnh vực cảm biến sinh học. Năm 1956, ông công bố bài báo đầu tiên về điện cực oxy hoá. Những năm tiếp theo ông tiếp tục thực hiện rất nhiều thí nghiệm nhằm cố gắng mở rộng khả năng hoạt động của cảm biến nhƣ phát hiện đƣợc thêm nhiều tác nhân, nâng cao độ chính xác của cảm biến. Vào năm 1962, tại hội nghị New York Academy of Science, ông đã thuyết trình một bài về cảm biến sinh học: “To make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or conductometric) more intelligent by adding enzyme transducers as membrane enclosed sandwiches”.
Cảm biến sinh học theo mô hình của D.Clark bao gồm điện cực oxy hóa, trên đó có màng giữ enzyme glucose oxidase cố định. Khi mật độ glucose trong môi trƣờng phản ứng
~ 28 ~
giảm thì mật độ chất oxi hóa trên bề mặt điện cực cũng giảm một cách tƣơng ứng. Dựa trên sự thay đổi đó, Clark đã phát hiện ra sự thay đổi của nồng độ glucose trong môi trƣờng cần kiểm tra.
Những năm tiếp theo, nhóm của Guilbault và Montalvo lần đầu tiên công bố chi tiết về chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa trên điện cực chứa enzyme đo điện thế, một cảm biến đo nồng độ urê bằng điện cực chọn lọc ion NH4+, có gắn màng cố định urease.
Urea HCO-3 + NH+4
Năm 1975, Lubber và Opitz đã mô tả một cảm biến sợi quang (fiber-optic sensor) gắn các chất chỉ thị dùng để đo nồng độ CO2 và O2. Cũng vào năm 1975, một số vi khuẩn cũng đã đƣợc sử dụng nhƣ những thành phần sinh học trên các điện cực vi sinh để đo nồng độ cồn.
Năm 1975, công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần đầu tiên biến ý tƣởng của Clark thành hiện thực thông qua việc thƣơng mại hóa các cảm biến sinh học. Sản phẩm đầu tiên là thiết bị phân tích glucose dựa trên hydrogen peroxide và đó cũng là cột mốc đầu tiên đánh dấu sự xuất hiện của các cảm biến sinh học trong đời sống.
β- D- Glucose + O2 D – Gluconic acid + H2O2
Vào năm 1982, Shichiri và các đồng nghiệp đã báo cáo và mô tả về cảm biến “glucose in vivo”, là loại cảm biến dạng kim đầu tiên cho các xét nghiệm dƣới da.
Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc biệt là các ngành công nghệ vật liệu nano và công nghệ thông tin, cảm biến sinh học cũng đạt đƣợc những tiến bộ vƣợt bậc, hứa hẹn đƣa ra những vi thiết bị nhằm xác định nhanh, chính xác các loại vi khuẩn, virus gây bệnh. Các thiết bị này cũng có thể dò tìm hay phân tích lƣợng mẫu rất nhỏ (cỡ vài nM) với độ tin cậy cao.
2.2.1.3. Phân loại [19]
Cảm biến sinh học có thể đƣợc phân loại dựa vào thành phần sinh học hoặc thành phần chuyển đổi của chúng. Thành phần sinh học của chúng bao gồm enzym, kháng thể, vi sinh vật, mô sinh học và bào quan.
- Khi sự liên kết giữa yếu tố cảm biến và chất cần phân tích là biến cố đƣợc phát hiện (detected event) thì đƣợc gọi là cảm biến ái lực (affinity sensor).
- Khi có sự tƣơng tác giữa yếu tố sinh học và chất cần phân tích và đi kèm hoặc theo sau đó là sự thay đổi nồng độ của cơ chất hoặc sản phẩm thì đƣợc gọi là cảm biến trao đổi chất (metabolism sensor).
Glucose oxidase Urease
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học
~ 29 ~
- Khi tính hiệu đƣợc tạo ra sau sự liên kết của chất cần phân tích và yếu tố sinh học nhƣng không có sự thay đổi hóa học của yếu tố sinh học thì cảm biến đó đƣợc gọi là cảm biến xúc tác (catalytic sensor).
2.2.1.4. Các yếu tố sinh học 2.2.1.4.1. Enzym [19] 2.2.1.4.1. Enzym [19]
Nhƣ đã biết enzym là protein có hoạt tính xúc tác cao và đặc hiệu cao đối với cơ chất. Chúng đƣợc sử dụng để kiểm soát và phân tích nồng độ của nhiều chất cần phân tích khác nhau. Các chế phẩm enzym có sẵn trên thị trƣờng với độ tinh khiết cao là điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất các cảm biến sinh học dùng enzym cố định. Bên cạnh đó, hạn chế chính của các enzyme là pH, lực ion, các chất kìm hãm, nhiệt độ sẽ ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzym. Hầu hết các enzym sẽ mất hoạt tính khi nhiệt độ trên 60oC.
Các enzym sử dụng để chế tạo biosensor là các enzym oxy hóa, sử dụng oxy hòa tan và sản xuất ra hydrogen peroxide . Enzym đƣợc cố định trên bộ chuyển đổi (transducer) bằng phƣơng pháp hấp phụ, liên kết cộng hóa trị, phƣơng pháp bao gói trong khuôn gel, trong các polymer phát sinh điện hóa (electrochemically generated polymer), trong màng lipid kép (bilipid membrane) hoặc dung dịch bên trong màng chọn lọc. Enzym thƣờng đƣợc ghép thành đôi với bộ chuyển đổi điện hóa hoặc bộ chuyển đổi sợi quang học.
2.2.1.4.2. Kháng thể [19]
Kháng thể có bản chất là các glycoprotein, do các tế bào lympho B cũng nhƣ các tƣơng bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus. Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất. Nhiều kháng thể đã đƣợc thƣơng mại hóa và đƣợc sử dụng rộng rãi trong xét nghiệm miễn dịch. Các kháng thể đƣợc cố định trên bề mặt bộ chuyển đổi theo phƣơng pháp liên kết cộng hóa trị sử dụng các nhóm chức nhƣ amino, carboxyl, aldehyde hoặc sulfhydryl.
Các mặt hạn chế khi sử dụng kháng thể cũng giống nhƣ khi sử dụng enzym. Hơn nữa
muốn tái tạo và phục hồi bề mặt bộ chuyển đổi cần phải có các điều kiện nhƣ pH thấp, lực
ion lớn, chất làm sạch,… Ƣu điểm của các cảm biến kháng thể là khả năng phân tích nhanh
hơn các xét nghiệm miễn dịch truyền thống. Cảm biến miễn dịch thƣờng sử dụng bộ chuyển
đổi quang học hay âm học.
~ 30 ~
2.2.1.4.3. Vi sinh vật [19]
Việc sử dụng vi sinh vật nhƣ là yếu tố sinh học trong thiết bị cảm biến sinh học dựa trên quá trình trao đổi chất của chúng. Trong hầu hết trƣờng hợp, ngƣời ta sẽ đo sự thay đổi điện hóa học khi tế bào sử dụng oxy hoặc CO2.
Tế bào vi sinh vật có lợi thế rẻ hơn so với enzym và kháng thể, có thể ổn định hơn và có thể đƣợc sử dụng trong các phản ứng phức hợp có sự tham gia của enzym và các cofactor. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có tính chọn lọc kém hơn so với phƣơng pháp sử dung enzym, có thời gian đáp ứng, thời gian phục hồi dài hơn và đòi hỏi phải thƣờng xuyên tiến hành hiệu chỉnh. Chất mang thƣờng dùng để cố định là nylon, màng cellulose nitrate, hoặc acetyl cellulose.
2.2.1.5. Bộ chuyển đổi (transducer) 2.2.1.5.1. Chuyển đổi điện hóa [19] 2.2.1.5.1. Chuyển đổi điện hóa [19]
Bộ chuyển đổi dòng điện và bộ chuyển đổi điện áp đƣợc dùng phổ biến trong thiết bị cảm biển sinh học kiểu điện hóa. Hầu hết, các điện cực đƣợc làm bằng kim loại nhƣ bạch kim, vàng, bạc, thép không gỉ và các vật liệu bằng carbon. Những vật liệu này phải trơ ở điện thế mà phản ứng điện hóa xảy ra.
2.2.1.5.2. Chuyển đổi quang [19]
Chuyển đổi quang là chuyển đổi hoạt động dựa trên các hiệu ứng nhƣ: hấp thụ ánh sáng nhìn thấy và tia UV; phát xạ huỳnh quang và lân quang; bio–luminiscence; chemi– luminiscence…
Bộ chuyển đổi quang học là loại đầu dò mà trên đỉnh đƣợc cố định enzym và một chất màu (thƣờng là huỳnh quang). Những loại đầu dò này chứa ít nhất hai sợi quang. Một sợi đƣợc nối với một nguồn sáng có thể phát ra một dãy các bƣớc sóng khác nhau, một sợi đƣợc nối với một diot quang để phát hiện sự thay đổi mật độ quang ở một bƣớc sóng thích hợp.
2.2.1.5.3. Chuyển đổi nhiệt [19]
Hoạt động dựa trên hiện tƣợng thay đổi entanpi khi hình thành hoặc phá vỡ các liên kết hóa học trong các phản ứng của enzyme. Bộ chuyển đổi này có ƣu điểm hoạt động tốt với tất cả các phản ứng. Tuy nhiên, dạng chuyển đổi này có tính chọn lọc thấp.
2.2.1.5.4. Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) [19]
Chuyển đổi hoạt động dựa trên nguyên lý: tinh thể sẽ thay đổi tần số dao động khi lực tác dụng lên nó thay đổi. Chuyển đổi dạng này có ƣu điểm là độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian phản ứng nhanh, khả năng cơ động cao, có thể sử dụng đo đạc trong môi trƣờng lỏng và khí.
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học
~ 31 ~
2.2.2. Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase và L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm
2.2.2.1. Giới thiệu [20]
Glutamate là một amino acid đƣợc xác định là một nguồn năng lƣợng và nguồn Nitơ quan trọng cho các tế bào nhân thật và tế bào các loài động vật có vú. Nó hoạt động nhƣ là một chất dẫn truyền các kích thích thần kinh trong hệ thống thần kinh trung ƣơng và đƣợc cho là chịu trách nhiệm cho một số quá trình nhƣ là học tập, trí nhớ, sự phát triển của hệ thần kinh. Việc tăng mức độ glutamate trong dịch não tủy đƣợc cho là nguyên nhân của các chứng rối loạn thần kinh nhƣ bệnh đột quỵ, bệnh Alzheimer‟s và bệnh Parkinson‟s. Ngoài ra, monosodium glutamate đƣợc sử dụng phổ biến làm chất tăng cƣờng hƣơng vi trong thực phẩm. Do đó, việc phát triển thiết bị đo lƣờng hàm lƣợng glutamate một cách nhanh chóng và đáng tin cậy là vấn đề quan trọng cần xem xét và nghiên cứu.
Một vài kỹ thuật nhƣ khối phổ, điện mao dẫn, microdialysis và cảm biến sinh học đã đƣợc phát triển để phân tích glutamate. Trong số các phƣơng pháp đó, cảm biến sinh học là phƣơng pháp đƣợc quan tâm và phát triển nhanh nhất. Một vài loại cảm biến sinh học sử dụng bộ chuyển đổi dòng điện đã đƣợc chế tạo để phát hiện glutamate trong các ứng dụng khác nhau nhƣ trong chế biến thực phẩm, trong tế bào đƣợc nuôi cấy, trong dịch não ngoại bào (extracellular brain fluid). Các cảm biến sinh học này có độ nhạy và khả năng chọn lọc cao, nhƣng cần có các bƣớc xây dựng và phức hợp để chuẩn bị các điện cực enzym. Không giống với các cảm biến sinh học dạng chuyển đổi dòng điện, cảm biến sinh học loại chuyển đổi quang học đƣợc chế tạo đơn giản hơn, dễ sử dụng và phát hiện tại chỗ.
2.2.2.2. Phƣơng pháp thí nghiệm 2.2.2.2.1. Các hóa chất sử dụng [20]
Enzym L-glutamate oxidase (L-GLOD) (EC 1.4.3.11, 63U/mg protein từ
Streptomuces sp.), enzym L-glutamate dehydrogenase (L-GLDH) ((EC 1.4.1.3, 452U/mg protein từ Proteus sp.), NADPH, màng polycarbonate (kích thƣớc lỗ 0.4 µm), dung dịch đệm và các loại dung dịch khác…
2.2.2.2.2. Sự cố định enzym [20]
Ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm phosphate saline (PBS, pH 7.0) có chứa đồng thời cả hai enzym. Enzym L-GLOD và L-GLDH đƣợc trộn và sau đó đƣợc tạo liên kết chéo với màng polycarbonate. 20µl dung dịch glutaraldehyde và 25µl bovine serum albumin (BSA) đƣợc sử dụng để nâng cao hiệu suất và sự ổn định cho cảm biến. Hỗn hợp enzym đƣợc chuẩn bị với những hàm lƣợng khác nhau với L-GLDH (35–143.2U) và L-GLOD đƣợc giữ cố định
~ 32 ~
ở giá trị 25U. Sau đó, 10 µl đƣợc sử dụng để cố định. Màng polycarbonate sau khi cố định đƣợc rửa sạch vài lần dung dịch PBS để loại glutaraldehyde dƣ thừa và các enzym không tạo liên kết với màng. Màng chứa enzym đƣợc bảo quản ở 4oC trong dung dịch PBS chứa trong các túi polypropylene kín khí.
2.2.2.2.3. Điện cực [20]
Điện cực với đƣờng kính 1cm sử dụng dung dịch KCl là chất điện phân, điện cực dƣơng làm bằng bạc, điện cực âm làm bằng vàng. Điện cực oxy đƣợc phủ bởi một lớp polypropylene kị nƣớc (để bảo vệ điện cực trong nƣớc) chỉ cho khí thấm qua và một lớp enzym trên màng polycarbonate (kích thƣớc lỗ 0.4µm) đƣợc gắn trên điện cực bằng hệ thống “push cap”. Để phân tích, ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm bảo hòa không khí với nồng độ oxy 7–8 ppm ở 25oC. Dung dịch đệm đƣợc loại oxy bằng dung dịch sodium sulfite.
.
Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD–L-GLDH cố định
2.2.2.2.4. Thử nghiệm [20]
Đầu dò đƣợc phân cực trong khoảng 30-40 phút mỗi lần trƣớc khi sử dụng. Việc thử nghiệm bắt đầu bằng cách thêm MSG ở các nồng độ khác nhau. Lƣợng oxy tiêu thụ đƣợc đo sau mỗi 2 phút. Để khôi phục lại độ bảo hòa oxy 100%, màng cố định enzym đƣợc rửa vài lần với PBS trƣớc khi tiến hành lần thử nghiệm tiếp theo. Sự khuếch tán oxy từ không khí làm giảm hiệu quả của quá trình thử nghiệm khi thực hiện với enzym trong dung dịch, để khắc phục vấn đề này ngƣời ta tiến hành thử nghiệm trong thiết bị phản ứng kín khí bằng thủy tinh (12mL).
Ngƣời ta tiến hành thí nghiệm trong ba trƣờng hợp với các nồng độ MSG khác nhau: - : Không tái sinh cơ chất trong sự vắng mặt của 2mM NADPH và 10mM ammonium. - :Có tái sinh cơ chất trong sự có mặt của 2mM NADPH
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học
~ 33 ~
Ngƣời ta cũng đã tiến hành tối ƣu nồng độ của NADPH và ammonium và nhận thấy giá trị đáp ứng cho sự ổn định cao nhất là 2mM NADPH và 10mM ammonium.
Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD–L- GLDH cố định trong cảm biến sinh học
2.2.2.2.5. Quá trình phản ứng [20]
L-glutamate + H2O α-Ketoglutarate + NH3 (1)
Phản ứng (1) xảy ra khi có mặt của MSG, quá trình tái sinh cơ chất không xảy ra khi không có mặt của NADPH, do NADPH hoạt động nhƣ là cofactor của L-GLDH. 0.1mg/L là nồng độ giới hạn có thể phát hiện của phƣơng trình (1).
(2)
Với sự có mặt của 2mM NADPH và MSG thì cả hai enzym cùng hoạt động và MSG đƣợc tái sinh nhƣ trong phản ứng (2).
MSG đƣợc chuyển đổi thành α-ketoglutarate trong phản ứng thứ nhất và là cơ chất của phản ứng thứ (2). Việc bổ sung NADPH vào môi trƣờng phản ứng tạo điều kiện cho L- GLDH thực hiện phản ứng nghịch. Việc nhận biết L- glutamate cung cấp một sự khuếch đại và giới hạn phát hiện đƣợc xác định là 0.04mg/L. Sự khuếch đại tín hiệu cao hơn đƣợc nhận thấy khi có mặt của ammonium-một sản phẩm phụ của phản ứng (1) và giới hạn nồng độ phát hiện là 0.02mg/L.
2.2.2.2.6. Cấu hình nhiệt độ và pH [20]
Cảm biến có thể hoạt động tốt trong khoảng pH 4-10 (pH dung dịch đệm citrate- phosphate: 4, 5, 6; của sodium phosphate: 7,8; của glycine–NaOH: 9, 10) đƣợc đo khi nồng
~ 34 ~
độ của dung dịch MSG là 1.2mg/L với sự có mặt của 2mM NADPH và 10mM ammonium. pH tối ƣu của cảm biến là 7.0 ở nhiệt độ 25±2 oC, trong khi đó pH tối ƣu của GLDH khoảng 8.25 và pH tối ƣu của GLOD khoảng 8.0
Cảm biến cũng có thể hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ (13±2 đến 55±2 oC) đƣợc đo ở nồng độ MSG là 1.2mg/L. Cảm biến hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 25±2 o
C, sau giá trị này cảm biến bị mất hoạt tính do bị vô hoạt bởi nhiệt độ.
Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 ◦C có mặt 2mM NADPH và 10mM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L
Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL
2.2.2.2.7. Xác định giá trị Kmvà Vmax [20]
Giá trị Km xác định cho cặp L-GLOD-LGLDH cũng giống nhƣ cho một mình L-
