Glutamate là một amino acid đƣợc xác định là một nguồn năng lƣợng và nguồn Nitơ quan trọng cho các tế bào nhân thật và tế bào các loài động vật có vú. Nó hoạt động nhƣ là một chất dẫn truyền các kích thích thần kinh trong hệ thống thần kinh trung ƣơng và đƣợc cho là chịu trách nhiệm cho một số quá trình nhƣ là học tập, trí nhớ, sự phát triển của hệ thần kinh. Việc tăng mức độ glutamate trong dịch não tủy đƣợc cho là nguyên nhân của các chứng rối loạn thần kinh nhƣ bệnh đột quỵ, bệnh Alzheimer‟s và bệnh Parkinson‟s. Ngoài ra, monosodium glutamate đƣợc sử dụng phổ biến làm chất tăng cƣờng hƣơng vi trong thực phẩm. Do đó, việc phát triển thiết bị đo lƣờng hàm lƣợng glutamate một cách nhanh chóng và đáng tin cậy là vấn đề quan trọng cần xem xét và nghiên cứu.
Một vài kỹ thuật nhƣ khối phổ, điện mao dẫn, microdialysis và cảm biến sinh học đã đƣợc phát triển để phân tích glutamate. Trong số các phƣơng pháp đó, cảm biến sinh học là phƣơng pháp đƣợc quan tâm và phát triển nhanh nhất. Một vài loại cảm biến sinh học sử dụng bộ chuyển đổi dòng điện đã đƣợc chế tạo để phát hiện glutamate trong các ứng dụng khác nhau nhƣ trong chế biến thực phẩm, trong tế bào đƣợc nuôi cấy, trong dịch não ngoại bào (extracellular brain fluid). Các cảm biến sinh học này có độ nhạy và khả năng chọn lọc cao, nhƣng cần có các bƣớc xây dựng và phức hợp để chuẩn bị các điện cực enzym. Không giống với các cảm biến sinh học dạng chuyển đổi dòng điện, cảm biến sinh học loại chuyển đổi quang học đƣợc chế tạo đơn giản hơn, dễ sử dụng và phát hiện tại chỗ.
2.2.2.2. Phƣơng pháp thí nghiệm 2.2.2.2.1. Các hóa chất sử dụng [20]
Enzym L-glutamate oxidase (L-GLOD) (EC 1.4.3.11, 63U/mg protein từ
Streptomuces sp.), enzym L-glutamate dehydrogenase (L-GLDH) ((EC 1.4.1.3, 452U/mg protein từ Proteus sp.), NADPH, màng polycarbonate (kích thƣớc lỗ 0.4 µm), dung dịch đệm và các loại dung dịch khác…
2.2.2.2.2. Sự cố định enzym [20]
Ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm phosphate saline (PBS, pH 7.0) có chứa đồng thời cả hai enzym. Enzym L-GLOD và L-GLDH đƣợc trộn và sau đó đƣợc tạo liên kết chéo với màng polycarbonate. 20µl dung dịch glutaraldehyde và 25µl bovine serum albumin (BSA) đƣợc sử dụng để nâng cao hiệu suất và sự ổn định cho cảm biến. Hỗn hợp enzym đƣợc chuẩn bị với những hàm lƣợng khác nhau với L-GLDH (35–143.2U) và L-GLOD đƣợc giữ cố định
~ 32 ~
ở giá trị 25U. Sau đó, 10 µl đƣợc sử dụng để cố định. Màng polycarbonate sau khi cố định đƣợc rửa sạch vài lần dung dịch PBS để loại glutaraldehyde dƣ thừa và các enzym không tạo liên kết với màng. Màng chứa enzym đƣợc bảo quản ở 4oC trong dung dịch PBS chứa trong các túi polypropylene kín khí.
2.2.2.2.3. Điện cực [20]
Điện cực với đƣờng kính 1cm sử dụng dung dịch KCl là chất điện phân, điện cực dƣơng làm bằng bạc, điện cực âm làm bằng vàng. Điện cực oxy đƣợc phủ bởi một lớp polypropylene kị nƣớc (để bảo vệ điện cực trong nƣớc) chỉ cho khí thấm qua và một lớp enzym trên màng polycarbonate (kích thƣớc lỗ 0.4µm) đƣợc gắn trên điện cực bằng hệ thống “push cap”. Để phân tích, ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm bảo hòa không khí với nồng độ oxy 7–8 ppm ở 25oC. Dung dịch đệm đƣợc loại oxy bằng dung dịch sodium sulfite.
.
Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD–L-GLDH cố định
2.2.2.2.4. Thử nghiệm [20]
Đầu dò đƣợc phân cực trong khoảng 30-40 phút mỗi lần trƣớc khi sử dụng. Việc thử nghiệm bắt đầu bằng cách thêm MSG ở các nồng độ khác nhau. Lƣợng oxy tiêu thụ đƣợc đo sau mỗi 2 phút. Để khôi phục lại độ bảo hòa oxy 100%, màng cố định enzym đƣợc rửa vài lần với PBS trƣớc khi tiến hành lần thử nghiệm tiếp theo. Sự khuếch tán oxy từ không khí làm giảm hiệu quả của quá trình thử nghiệm khi thực hiện với enzym trong dung dịch, để khắc phục vấn đề này ngƣời ta tiến hành thử nghiệm trong thiết bị phản ứng kín khí bằng thủy tinh (12mL).
Ngƣời ta tiến hành thí nghiệm trong ba trƣờng hợp với các nồng độ MSG khác nhau: - : Không tái sinh cơ chất trong sự vắng mặt của 2mM NADPH và 10mM ammonium. - :Có tái sinh cơ chất trong sự có mặt của 2mM NADPH
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học
~ 33 ~
Ngƣời ta cũng đã tiến hành tối ƣu nồng độ của NADPH và ammonium và nhận thấy giá trị đáp ứng cho sự ổn định cao nhất là 2mM NADPH và 10mM ammonium.
Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD–L- GLDH cố định trong cảm biến sinh học
2.2.2.2.5. Quá trình phản ứng [20]
L-glutamate + H2O α-Ketoglutarate + NH3 (1)
Phản ứng (1) xảy ra khi có mặt của MSG, quá trình tái sinh cơ chất không xảy ra khi không có mặt của NADPH, do NADPH hoạt động nhƣ là cofactor của L-GLDH. 0.1mg/L là nồng độ giới hạn có thể phát hiện của phƣơng trình (1).
(2)
Với sự có mặt của 2mM NADPH và MSG thì cả hai enzym cùng hoạt động và MSG đƣợc tái sinh nhƣ trong phản ứng (2).
MSG đƣợc chuyển đổi thành α-ketoglutarate trong phản ứng thứ nhất và là cơ chất của phản ứng thứ (2). Việc bổ sung NADPH vào môi trƣờng phản ứng tạo điều kiện cho L- GLDH thực hiện phản ứng nghịch. Việc nhận biết L- glutamate cung cấp một sự khuếch đại và giới hạn phát hiện đƣợc xác định là 0.04mg/L. Sự khuếch đại tín hiệu cao hơn đƣợc nhận thấy khi có mặt của ammonium-một sản phẩm phụ của phản ứng (1) và giới hạn nồng độ phát hiện là 0.02mg/L.
2.2.2.2.6. Cấu hình nhiệt độ và pH [20]
Cảm biến có thể hoạt động tốt trong khoảng pH 4-10 (pH dung dịch đệm citrate- phosphate: 4, 5, 6; của sodium phosphate: 7,8; của glycine–NaOH: 9, 10) đƣợc đo khi nồng
~ 34 ~
độ của dung dịch MSG là 1.2mg/L với sự có mặt của 2mM NADPH và 10mM ammonium. pH tối ƣu của cảm biến là 7.0 ở nhiệt độ 25±2 oC, trong khi đó pH tối ƣu của GLDH khoảng 8.25 và pH tối ƣu của GLOD khoảng 8.0
Cảm biến cũng có thể hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ (13±2 đến 55±2 oC) đƣợc đo ở nồng độ MSG là 1.2mg/L. Cảm biến hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 25±2 o
C, sau giá trị này cảm biến bị mất hoạt tính do bị vô hoạt bởi nhiệt độ.
Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 ◦C có mặt 2mM NADPH và 10mM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L
Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL
2.2.2.2.7. Xác định giá trị Kmvà Vmax [20]
Giá trị Km xác định cho cặp L-GLOD-LGLDH cũng giống nhƣ cho một mình L- GLOD. Vận tốc ban đầu của phản ứng là hàm số của nồng độ cơ chất theo động học „Michaelis-Menten‟. Kmvà Vmaxđƣợc xác định theo phƣơng pháp Lineweaver-Burk.
Giá trị Km biểu kiến đƣợc xác định là 0.4451mM với sự có mặt của 2mM NADPH và 10mM ammonium. Vmax xác định đƣợc trong cùng điều kiện trên là 3.07mg/(L.min).
Giá trị Km và Vmax biểu kiến trong điều kiện không tái sinh cơ chất (chỉ có L-GLOD hoạt động) tƣơng ứng là 1.9222mM và 13.245mg/(Lmin) so với Km của L-GLOD ở dạng tự do là 0.21mM. Vì thế, khi cặp L-GLOD-LGLDH đƣợc sử dụng thì giá trị Km tăng xấp xỉ 2
Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học
~ 35 ~
lần, khi sử dụng chỉ một mình L-GLOD thì giá trị Km tăng hơn 9 lần. Giá trị Km cao hơn thu đƣợc khi cố định enzym là do ái lực của enzym với cơ chất giảm, cũng có thể là do sự cản trở trung tâm hoạt động của enzym trong quá trình cố định.
2.2.2.2.8. Sự ổn định của màng cố định [20]
Sự ổn định của màng đƣợc phân tích trong chu kì 60 ngày. Màng chứa enzym đƣợc bảo quản trong dung dịch đệm phosphate 0.2M, pH 7.0, nhiệt độ 4oC trong túi polypropylene kín khí. Quá trình phân tích đƣợc thực hiện mỗi 3 ngày một lần với 0.8mg/L MSG. Màng chứa cặp enzym L-GLOD–L-GLDH vẫn giữ đƣợc 80% hoạt tính ban đầu sau 30 ngày ứng với GLOD= 25U; GLDH= 35U và 39 ngày ứng với GLOD= 25U; GLDH= 143.2U với sự hiện diện của 2mM NADPH và 10mM ammonium. Trong khi đó, màng chỉ cố định enzym L- GLOD (25U) giữ đƣợc 80% hoạt tính ban đầu thậm chí sau 48 ngày
Hình 2.6: Hoạt tính của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: L- GLOD 25U–L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U–L-GLDH 35U; L-GLOD 25U
Trong những nghiên cứu gần đây, ngƣời ta nhận thấy rằng một lƣợng nhỏ GLDH không duy trì đƣợc hoạt tính của enzym, điều này có thể là sự vô hoạt hoặc rò rỉ enzym. Sự ổn định của biosensor trong quá trình bảo quản cao nhất khi hoạt độ của GLDH là 143.2U và của GLOD là 25U.
~ 36 ~
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Wolfgang Aehale, Enzymes in Industry, Copyright © 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGa, Weinheim.
2. Parmjit S. Panesar, Shweta Kumari, and Reeba Panesar, Potential Applications of Immobilized β-Galactosidase in Food Processing Industries, SAGE-Hindawi Access to Research, Enzyme Research, Volume 2010, Article ID 473137, 16 pages.
3. M.L. Foresti, M.L. Ferreira, Chitosan-immobilized lipases for the catalysis of fatty acid esterifications, Enzyme and Microbial Technology 40 (2007) 769–777.
4. Yin Hoon Chew, Lee Suan Chua, Kian Kai Cheng, Mohamad Roji Sarmidi, Ramlan Abdul Aziz, Chew Tin Lee, Kinetic study on the hydrolysis of palm olein using immobilized lipase, Biochemical Engineering Journal 39 (2008) 516–520.
5. K.N. Kilcawley, M.G. Wilkinson,P.F.Fox, Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations from microbial or animal sources, Enzyme and Microbial Technology 31 (2002) 310–320.
6. G.D. Haki, S.K. Rakshit, Developments in industrially important thermostable enzymes: a review, Bioresource Technology 89 (2003) 17–34.
7. V . Ramachandra Murty*, Jayadev Bhat, and P. K. A. Muniswaran , Hydrolysis of Oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: A Review, Biotechnol. Bioprocess Eng. 2002, 7: 57-66.
8. José M. Palomo, Gloria Muñoz, Gloria Fernández-Lorente, Cesar Mateo, Roberto Fernández-Lafuente∗, José M. Guisán1, Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl–Sepabeads) immobilization, hyperactivation and stabilization of the open form of lipases, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 19–20 (2002) 279–286.
9. S.-W. Chang, J.-F. Shaw, K.-H. Yang, S.-F. Chang, C.-J. Shieh, Studies of optimum conditions for covalent immobilization of Candida rugosa lipase on poly(c-glutamic acid) by RSM, Bioresource Technology 99 (2008) 2800–2805.
10. Dasciana S. Rodrigues, Adriano A. Mendes, Wellington S. Adriano, Luciana R.B. Goncalves,Raquel. L.C. Giordano, Multipoint covalent immobilization of microbial lipas on chitosan and agarose activated by different methods, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 51 (2008) 100–109.
Tài liệu tham khảo Đồ án môn học
~ 37 ~
11. Seema S.Betigeri, Steven H.Neau, Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads, Biomaterials 23 (2002) 3627–3636.
12. Keehoon Won, Sangbum Kim, Kwang-Je Kim, Hong Woo Park, Sang-Jin Moon, Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads, Process Biochemistry 40 (2005) 2149–2154.
13. Paramita Mahapatra, Annapurna Kumari, Vijay Kumar Garlapati, Rintu Banerjee, Ahindra Nag, Enzymatic synthesis of fruit flavor esters by immobilized lipase from Rhizopus oligosporus optimized with response surface methodology, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.
14. Wiphum Kaewthong, Sarote Sirisansaneeyakul, Poonsuk Prasertsan, Aran H-Kittikun, Continuous production of monoacylglycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase, Process Biochemistry 40 (2005) 1525–1530.
15. S.J. Prashanth, V.H. Mulimani, Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzae-galactosidase immobilized in calcium alginate, Process Biochemistry 40 (2005) 1199–1205.
16. S. Thippeswamy, V.H. Mulimani, Enzymic degradation of raffinose family oligosaccharides in soymilk by immobilized a-galactosidase from Gibberella fujikuroi,
Process Biochemistry 38 (2002) 635/640.
17. Miguel Filho, Benevides C. Pessela, Cesar Mateo, Alfonso V. Carrascosa, Roberto Fernandez-Lafuente, Jose M. Guis´ an, Immobilization–stabilization of an -galactosidase from Thermus sp. strain T2 by covalent immobilization on highly activated supports: Selection of the optimal immobilization strategy, Enzyme and Microbial Technology 42 (2008) 265–271.
18. Saraju P.Mohanty and Elias Kougianos ,Biosensors: A tutorial review.
19. Jose ´ I. Reyes De Corcuera, Ralph P. Cavalieri, Biosensors, Washington State University, Pullman, Washington, U.S.A.
20. Anjan Kumar Basu, Parimal Chattopadhyay, Utpal Roychudhuri, Runu Chakraborty,
Glutamate optical biosensor based on the immobilization of glutamate dehydrogenase in titanium dioxide sol–gel matrix, , Department of Food Technology and Biochemical Engineering, Jadavpur University, Kolkata 700032, India.