ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC Bộ MÔN CÔNG NGHỆ THựC PHẨM C5S CQ ỈO ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM YÀ ỨNG DỤNG SVTH : NGUYỄN BẢO Dư MSSV : 60700443 GYHD : TS TRẦN BÍCH LAM Đồ án mơn học TP Hồ Chí Minh, 6/2011 NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Chữ ký giáo viên /V 1~ Đồ án môn học LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Bích Lam tận tình hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đồ án Cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa TpHCM giảng dạy nhiệt tình truyền đạt kiến thức q báu giúp tơi hồn thành đồ án Xin cảm ơn tất bạn bè, người quan tâm, giúp đỡ tơi hồn thành đồ án Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011 Nguyễn Bảo Dư Đồ án môn học iii ~MỤC LỤC /V TRANG BÌA i NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH .vi DANH MỤC BẢNG .vi Chương 1: TỒNG QUAN 1.1 Lịch sử phát triển enzym cố định .1 1.2 Sơ lược enzym cố định 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Đặc điểm enzym cố định 1.2.3 Ưu nhược điểm enzym cố định 1.2.4 Các phương pháp cố định enzym 1.2.5 Vật liệu cố định 1.2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến cố định enzyme Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 2.1 ứng dụng công nghệ thực phẩm .9 2.1.1 Enzym ß-galactosidase 2.1.1.1 Giới thiệu enzym ß-galactosidase .9 2.1.1.2 Nguồn thu nhận enzym ß-galactosidase 2.1.1.3 Các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase 10 2.1.1.4 ứng dụng enzym ß-galactosidase cố định .13 2.1.1.4.1 Thủy phân lactose sữa lactoserum 13 2.1.1.4.2 Tổng họp Galacto-Ohgosaccharides (GOSs) 16 2.1.2 Enzym lipase 17 2.L2.1 Giới thiệu enzym hpase 17 2.L2.2 Nguồn thu nhận enzym lipase .17 2.1.2.3 Các phương pháp cố định enzym lipase 18 2.1.2.4 ứng dụng enzym lipase cố định công nghệ thực phẩm .20 2.1.2.4.1 ứng dụng lipase cố định tổng họp ester có hương trái .20 2.1.2.4.2 ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất Mên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ 21 2.1.3 Enzym a-galactosidase (raffinase) 23 /V ~ Đồ án mơn học 2.1.3.1 Giói thiệu enzym a-galactosidase .23 2.L3.2 Nguồn thu nhận enzym a-galactosidase 23 2.L3.3 Cách phương pháp cố định enzym a-galactosidase .23 2.L3.4 ứng dụng enzym riffinase cố định 26 2.2 ứng dụng phân tích 27 2.2.1 Tổng quan cảm biến sinh học (biosensor) 27 2.2.1.1 Giới thiệu cảm biến sinh học 27 2.2.1.2 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học .27 2.2.1.3 Phân loại 28 2.2.1.4 Các yếu tố sinh học 29 2.2.1.4 L .Enzym 29 2.2.1.4.2 Kháng thể 29 2.2.1.4.3 Vi sinh vật 30 2.2.1.5 Bộ chuyển đổi (transducer) .30 2.2.1.5.1 Chuyển đổi điện hóa 30 2.2.1.5.2 Chuyển đổi quang 30 2.2.1.5.3 Chuyển đổi nhiệt 30 2.2.1.5.4 Chuyển đổi tinh thể áp điện (piezoelectric) 30 2.2.2 Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate thực phẩm 31 2.2.2.1 Giới thiệu 31 2.2.2.2 Phương pháp thí nghiệm 31 2.2.2.2.1 Các hóa chất sử dụng 31 2.2.2.2.2 Sự cố định enzym .31 2.2.2.23 Điện cực 32 2.2.2.2A Thử nghiệm .32 2.2.2.2.5 Quá trinh phản ứng 33 2.2.2.2 Ó Cấu hình nhiệt độ pH 33 2.2.2.23 Xác định giá trị Km Vmax 34 2.2.2.2.8 Sự ổn định màng cố định 35 /V ~ Đồ án môn học TÀI LIỆU THAM KHẢO 36DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mơ hình biosensor 27 Hình 2.2: Mơ hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD-L-GLDH cố định 32 Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG cặp L-GLOD-LGLDH cố định cảm biến sinh học .33 Hình 2.4: pH nhiệt độ 25 ± °c có mặt 2mM NADPH lOmM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L ’ ’ 34 Hình 2.5: Nhiệt độ pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 34 Hình 2.6: Hoạt túứi enzym cố định cảm biến sinh học thời gian 60 ngày: LGLOD 25U-L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U-L-GLDH 35U; L-GLOD 25U 35 DANH MỤC BẢNG • Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm phưorng pháp cố định enzyme Bảng 2.1: Tóm tắt phưcmg pháp cố định enzym P-galactosidase 13 Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng kỹ thuật cố định khác .15 Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Bảng 2.3: Nguồn vsv thu nhận enzym lipase tứứi chất enzyme lipase 18 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử phát triển enzym cố định [1] - Năm 1916, Nelson Griffin quan sát cho thấy enzym invertase nấm men 2.6) hấp thụ vào than có khả thủy phân đường saccharose Sau ữên giới xuất nhiều báo cáo khả cố định enzym liên kết đồng hóa trị chất mang Trước năm 1953 chưa có nghiên cửu enzym khơng hịa tan ứng dụng vào thực tế - Năm 1953, Grubhofer Schleith cố định số enzym carboxy peptidase, diastase, pepsin ribonuclease polyaminostyrene liên kết đồng hóa trị nghiên cửu bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot - Năm 1954, Chang tạo vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng đưa enzym vào thể - Năm 1963, Bemfeld Wan thí nghiệm thành cơng việc nhốt enzym amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide - Năm 1964, Quiociio Richards mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde Cũng năm Chang triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase - Năm 1969, Wilson xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose glucoamylase cố định - Năm 1969, Chibata người cộng tác công ty Tanabe Seiyaku - Nhật người thực thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp Theo phương pháp cố định enzym tác giả người Nhật, enzym aminoacylase nấm sợi gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion sử dụng chúng cho trình thủy phân - Năm 1970, Mosbach tiến hành cố định ba loại enzym: P-galactosidase, hexokinase, glucophosphatase hên kết cộng hóa trị với hạt sephadex - Năm 1971, Gregoriadis triển khai liposome có chứa amyloglucosidase - Năm 1973, Chibata cộng tác viên người thành công việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate gel acrylamid Tế bào E.coli chứa gel có hoạt tính aspartate cao - Đến năm 1987, công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, tiến hành sản xuất sữo fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp Cho đến cổ khoảng 4,5 triệu sừo fructose sản xuất theo phưong pháp enzym cố định - Ngoài sàn phẩm trên, enzym cố định cịn ứng dụng nhiều cơng nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trường y học 1.2 Sơ luợc enzym cố định 1.2.1 Định nghĩa [1] Enzym cố định hiểu theo nghĩa: - Nghĩa hẹp: enzym khơng hịa tan enzym đưa vào pha riêng rẽ, pha tách riêng vói mơi trường dung dịch phàn ứng Pha enzym khơng hịa tan nước gắn với polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn /V Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học - Nghĩa rộng: cắc chất xúc tác cố định enzym, tế bào, thể sống trạng thái cho phép sử dụng lại Như vậy, theo nghĩa rộng, enzym khơng hịa tan bao gồm enzym cố định vào chất mang, enzym có tế bào sống, chúng cố định bình phản ứng sinh học có gắn kết vào chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần - Enzym khơng hịa tan hay enzym cố định thường enzym hòa tan gắn vào chất mang nhiều kỹ thuật khác Nhờ quấ trình gắn mà enzym từ trạng thái hịa tan chuyển sang khơng hòa tan 1.2.2 Đặc điểm enzym cố định [1] Enzym cố định có đặc điểm sau: - Hoạt tính enzym cố định thường nhỏ hoạt tính enzym tự loại Sở dĩ có thay đổi hoạt tính riêng enzym cố định nguyên nhân sau: • Do ảnh hưởng điện tích chất mang: điện tích chất mang có khác biệt với điện tích enzym gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian enzym có thay đổi mức độ định Chính thay đổi cấu trúc mà kết họp enzym chất đi, dẫn đến hoạt tính chứng giảm • Do enzym bị nhốt vào mạng lưới bị liên kết chất mang khiến cho tiếp xúc enzym chất bị - Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis - Menten có số sai khác định: • Có thể xảy cạnh tranh chất với enzym chất mang • Xảy tượng cản trở khuếch tán chất sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng - Enzym cố định thường có tính bền nhiệt enzym tự nhờ có tác dụng che chở chất mang - Enzym cố định thường có pH tối ưu khơng trùng với enzym tự loại - Enzym cố định có chất mang che chắn nên bảo vệ tốt enzym tự - Enzym cố định tái sử dụng nhiều lần dễ dàng tách khỏi chất cách dễ dàng sau phản ứng độ bền enzym cố định cao enzym tự 1.2.3 Ưu nhược điểm enzym cố định [1] Ưu điểm: - Enzym cố định tái sử dụng nhiều lần thời gian dài - Enzym cố định không lẫn vào sàn phẩm cuối phản ứng enzym, khơng gây ảnh hường xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác khơng tốn chi phí cho việc tách enzym khỏi sản phẩm - Có thể ngừng phản ứng cần thiết cách tách hệ chất mang - enzym khỏi dung dịch chất - Enzym cố định tương đối bền với tác nhân vật lý hóa học enzym tự - Dễ dàng tiến hành trình sản xuất theo phương pháp liên tục Nhươc điểm: - Sự có mặt chất mang làm giảm hoạt tính enzym - Trong đa số trường họp, enzym bị giảm hoạt hoạt tính sau quấ trình cố định /V 2~ Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học - Tuy nhiên, hạn chế không đáng kể so với lợi ích mà enzym cố định mang lại Do vậy, ngày có nhiều nghiên cứu cố định enzym ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp 1.2.4 Các phương pháp cố định enzym [1] Các phương pháp cố định enzym chia thành nhóm: hóa học vật lý Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm phương pháp cổ định enzyme [1] Phương pháp hóa học Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Phương pháp gắn enzym lên chất Liên kết enzym chất mang làHoạt Mêntính kết enzym bị giảm mang liên kết cộng hóa bền, hạn chế tối đa mát biến đổi cấu trúc enzym trị enzym trình phản ứng trình cố định Phương pháp gắn phân Tạo tử enzym Mên kết bền trước tấc nhân Chi phí cao, thao tác thực hiên tương đối lại với liên kết pH, nhiệt độ cộng hóa trị phức tạp Thường dùng phối họp với phương Hoạt tính enzym bị giảm pháp khác biến đổi cấu trúc enzym quấ trình cố định Phương pháp vật lý Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Phương pháp gắn enzym lên chất tấc thực đơn giản mang tác nhânThao vật lý Do lực tương tác enzym chất Điều kiện tiến hành cố định enzym ơn hịa nên khơng làm hoạt tính enzym q trình cố định Có khả tái sử dụng chất mang /V mang yếu nên dễ xảy tượng nhả hấp phụ trình sử dụng enzym cố định khuấy trộn hay thay đổi nhiệt độ, pH môi trường Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Phương pháp nhốt enzym Chỉ thích họp cho phản ứng với chất có Thao tác đơn giản khối lượng phân tử nhỏ Khơng địi hỏi phải có nhóm tạo Mên kết nên phù họp với nhiều loại enzym Hiệu cố định enzym cao Có thể cố định đồng thịi nhiều enzym Phương pháp hóa hoc: - Gắn enzym lên chất mang liên kết cộng hóa trị - Gắn phân tử enzym lại với liên kết cộng hóa trị Phương pháp vât lý: - Hấp phụ enzym lên chất mang liên kết vật lý sau: lực mao quản, liên kết ion, lực Van der Walls - Phương pháp nhốt enzym khuôn gel màng bao vi thể liệu cố định [1] Vật liệu phương pháp cố định hai yếu tố có tính chất định đến hiệu q trình cố định enzym Trong đó, khơng có đặc điểm, tính chất vật liệu cố định thích họp cho tất loại enzym khơng có enzym thích họp với tất loại vật liệu cố định Vật liệu cố định enzym tế bào chia làm hai loại: vật liệu vơ vật liệu hữu Vât liêu vô cơ: - Đặc điểm: chất mang vô bền với tác động bên ngồi, khơng bị vi sinh vật ăn mịn, phân hủy, việc gắn với enzym thường khó khăn - Một số chất mang vô thông dụng như: thủy tinh xốp, cấc oxid kim loại oxid nhôm, oxid mangan, oxid magie, Silicagel Vât liêu hữu cơ: - Đặc điểm: chất mang hữu thường có nhóm hoạt động hóa học như: -NH 2, - COOH, -OH, -SH, nên dễ kết gắn với enzym độ bền với tác động môi trường không cao, đặc biệt polymer sinh học dễ bị vi sinh vật xâm nhập cơng • Các polymer tư nhiên: - Tinh bột vật liệu phong phú rẻ tiền Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột dùng làm chất mang cố định enzym lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase Nhược điểm tinh bột độ trương kém, thiếu nhóm chức nên khả cố định hoạt tính enzym cịn thấp Tinh bột thường ghép copolymer với vinyl monomer ưa nước acrylamide, acrylic acid để cải thiện tính chất lý, độ trương nở tạo nhóm chức bề mặt /V 4~ Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học Glutaraldehyde: hoạt chất mà sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: sử dụng tiền hoạt hóa chất mang diễn trình trao đổi ion enzym, hấp phụ enzym chất mang amin hóa xử lí thêm enzym hấp phụ với glutaraldehyde để tạo liên kết chéo enzym chất mang Trong cà hai trường họp, cuối enzym gắn chất mang nhóm Lys hầu hết bề mặt tích điện âm bước có trao đổi ion [17] Chất mang có chứa nhóm epoxy: chất mang phản ứng với nhiều nhóm khấc chất mang amino, thiol, hydroxyl, imidazole, carboxylic Tuy nhiên khả phản ứng enzym chất mang thấp nên chế quấ trình cố định thông qua bước: trước tiên hấp phụ enzym chất mang, sau phản ứng cộng hóa trị nhóm cấc chất mang nhóm epoxy chất mang hấp phụ enzym [17] Một lượng khoảng 10g chất mang khác (Sepabeads®-EC-EP, Sepabeads®aminoepoxy-ECHFA, glyoxyl-agarose, MANAE-agarose or MANAE-agarose preactivated with glutaraldehyde) dạng huyền phù 20ml dung dịch đệm potassium phosphate 25mM có pH 7.0 chứa IU/ml enzym a-galactosidase Trong trường họp Sepabeads®-EC- EP, enzym ủ dung dịch đệm sodium phosphate IM có pH 7.0 sử dụng chất mang glyoxyl trình thực dung dịch đệm sodium carbonate lOOmM có pH 10.05 Trong trường họp, hệ huyền phù khuấy nhẹ 25°c Các dẫn xuất ổn định hầu hết thu cách cố định enzyme glutaraldehyde- agarose, chế phẩm enzym có hoạt tính cao (95%) Trong đó, dẫn xuất thu cách sử dụng amino-epoxide-Sepabead có hoạt tính thấp 10% [17] Việc cố định a-galactosidase sử dụng glutaraldehyde chất mang amin hóa xảy theo hai cách Cách thứ sử dụng chất mang amin hóa tiền hoạt hóa với glutaraldehyde Cách thứ hai, trước hết hấp phụ enzym lên chất mang amin hóa sau xử lí với glutaraldehyde Với cách thứ nhất, enzym trao đổi ion với chất mang, cuối xử lí với glutaraldehyde 0.5% (v/v) độ ổn định thu cao phương pháp thứ hai Trong đó, phương pháp thứ hai, trình hấp phụ diễn nhanh giữ 90% hoạt tính, việc xử lí với glutaraldehyde 0.5% khơng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme [17] /V 18 ~ Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học Nhiệt độ tối ưu enzym tự 65°c pH 7.0, nhiệt độ tối ưu enzym cố định 70°c Ở 80°c, chế phẩm tối ưu có hoạt tính cịn lại gấp lần hoạt tính cồn lại enzym hòa tan (72% so với 40%) Điều cho thấy độ ổn định nhiệt enzym cố định cao hom enzym hòa tan Mặt khác, pH tối ưu enzym không thay đổi sau cố định, pH tối ưu 25°c 4-5 [17] 2.I.3.4 ứng dụng enzym rifflnase cố định Các loại đậu đóng vai trò quan trọng chế độ ăn truyền thống nhiều vùng giới thực tế chúng có chất béo nguồn protein, xơ vi chất dinh dưỡng tuyệt vời Nguồn isoflavone đậu nành nhận ý với vai trò tiềm việc điều trị ung thư loãng xương Hơn nữa, sữa đậu nành xem nguồn thay chi phí thấp cho sữa bị nước phát ữiển bổ sung chất dinh dưỡng không dung nạp lactose cho trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Tuy nhiên, cấc sản phẩm thực phẩm làm từ đậu có chứa nhiều yếu tố kháng dinh dưỡng, số họ đường Raffmose oligosaccharide Niêm mạc người dày loài động vật thiếu enzym a- galactosidase cần thiết cho thủy phân oligo-saccharide Vì thế, vào đến già oligo-saccharide bị vi sinh vật lên men gây chứng đầy Do đó, việc loại bỏ oligo-saccharide từ thực phẩm làm từ đậu nành yếu tố quan trọng việc cải thiện giá trị dinh dưỡng chúng Việc thủy phân họ đường raffinose tiến hành thiết bị phản ứng gián đoạn hay hên tục [15] Trong thiết bị phản ứng gián đoạn, người ta tiến hành ủ enzym a-galactosidase cố định từ Aspergillus oryzae chất mang calcium alginate sữa đậu nành thời gian khác 2, 4, 12h, cho kết thủy phân oligo-saccharide tương ứng 74%, 78%, 79% 81% Với kết ta thấy hiệu suất thủy phân 2h 74% việc kéo dài thời gian không làm tăng đáng kể hiệu suất [15] Quấ trình loại bỏ oligo-saccharide liên tục tiến hành thiết bị “fluidized bed reactor” Ở 50°c, hiệu suất thủy phân oligo-saccharide 90%, 78%, 74%, 52% 35% tương ứng vói tốc độ dịng chảy 40, 80, 120, 160 200ml.1T1 Những kết cho thấy với tốc độ dịng 40ml.1T1 hiệu suất thủy phân đạt cao 90% Qua cho thấy tốc độ dòng chảy tối ưu thông số quan trọng ảnh hưởng đến hiệu hoạt động thiết bị “fluidized bed reactor” [15] Ngoài ra, enzym a-galactosidase thu nhận từ G fujikuroi M vinacea cố định gel polyacrylamide cho việc loại bỏ oligo-saccharide từ đậu nành pH sửa đậu nành 6.2-Ó.4 pH tối ưu a-galactosidase cố định từ G fujikuroi 5.2-5.6 giữ 90% hoạt tính pH 6.4 Trong pH tối ưu a-galactosidase cố định từ M vinacea 4.0-4.5, phải hạ thấp pH tiến hành phản ứng, pH thấp /V 19 ~ Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học làm cho protein sữa đậu nành bị kết tủa làm cho sữa cố vị chua Do đỗ, a- galactosidase cổ định từ G fujikuroi lựa chọn tốt việc xử lí sữa đậu nành [16] 2.2 ứng dụng phân tích 2.2.1 Tổng quan cảm biến sinh học (biosensor) 2.2.1.1, Giới thiệu cảm biến sinh học [18] Cảm biến sinh học (biosensor) thiết bị tích hợp cố khả cung cấp thơng tin phân tích định lượng bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bỉoreceptor) kết hợp trực tiếp với phần tử chuyển đổi (International Union of Pure and Applied Chemistry) Cảm biến sinh học thiết bị sử dụng tác nhân sình học enzym, kháng thể, để phát hiện, đo đạc phân tích hố chất Sample analyte Do cấu tạo cảm biến sinh học bao gồm thành phần bản: thành phần hoá học, thành phần sình học thành phần vật lý ImimobitìSệci enzymes, Microorganisms Bioreceptors Imanunõacie n1s DNA, whole cells Transducer n Signal Flectrocliemical Paten t iữmet ry amperometry Optical: Absorption, Flu óresceriee, reflection Piưi2TƯưlưCtfiO Microelectro nics Data processing Hình 2.1: Mơ hình biosensor 2.2.I.2 Lịch sử phát triển căm biến sinh học [18] Giáo sư Leyland D.Clark biết người tiẽn phong lĩnh vực cảm biến sinh học Năm 1956, ông công bố báo điện cực oxy hố Những năm ơng tiếp tục thực nhiều thí nghiệm nhằm cổ gắng mở rộng khả hoạt động cảm biến phát thêm nhiều tác nhân, nâng cao độ xác cảm biến Vào năm 1962, hội nghị New York Academy of Science, ơng thuyết trình cảm biến sinh học: ‘Tớ make /V 20 Chương 2: ứng dụng Đồ án môn học electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or conductometricị more intelligent by adding enzyme transducers as membrane enclosed sandwiches” Cảm biến sình học theo mơ hình D.Clark bao gồm điện cực oxy hóa, có màng giữ enzyme glucose oxidase cổ định Khỉ mật độ glucose môi trường phản ứng 21 Chương 2: ửngdụng Đồ án mơn học giảm mật độ chất oxi hóa bề mặt điện cực giảm cách tương ứng Dựa thay đổi đó, Clark phát thay đổi nồng độ glucose môi trường cần kiểm tra Những năm tiếp theo, nhóm Guilbault Montalvo lần công bố chi tiết chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa điện cực chứa enzyme đo điện thế, cảm biến đo nồng độ urê điện cực chọn lọc ion NH4+, có gắn màng cố định urease T T_ Urease T T _ _ _ ,.TTT+ Urea — ► HCO3 + NH Năm 1975, Lubber Opitz mô tả cảm biến sợi quang (fiber-optic sensor) gắn chất thị dùng để đo nồng độ CO O2 Cũng vào năm 1975, số vi khuẩn sử dụng thành phần sinh học fren điện cực vi sinh để đo nồng độ cồn Năm 1975, công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần biến ý tưởng Clark thành thực thông qua việc thương mại hóa cảm biến sinh học Sản phẩm thiết bị phân tích glucose dựa hydrogen peroxide cột mốc đánh dấu xuất cảm biến sinh học đời sống _ Glucose oxidase ß- D- Glucose + O2 -► D - Gluconic acid + H2O2 Yào năm 1982, Shichiri đồng nghiệp báo cáo mô tả cảm biến “glucose in vivo”, loại cảm biến dạng kim cho xét nghiệm da Cùng với phát triển nhanh chóng khoa học công nghệ, đặc biệt cấc ngành công nghệ vật liệu nano công nghệ thông tin, cảm biến sinh học đạt tiến vượt bậc, hứa hẹn đưa vi thiết bị nhằm xác định nhanh, xác loại vi khuẩn, virus gây bệnh Các thiết bị dị tìm hay phân tích lượng mẫu nhỏ (cỡ vài nM) vói độ tin cậy cao 2.2.I.3 Phân loại [19] Cảm biến sinh học phân loại dựa vào thành phần sinh học nh phần chuyển đổi chúng Thành phần sinh học chúng bao gồm enzym, kháng thể, vi sinh vật, mô sinh học bào quan - Khi liên kết yếu tố cảm biến chất cần phân tích biến cố phất (detected event) gọi cảm biến lực (affinity sensor) /V 22 Chương 2: ửngdụng Đồ án mơn học Khi có tương tác yếu tố sinh học chất cần phân tích kèm theo sau thay đổi nồng độ chất sản phẩm gọi cảm biến trao đổi chất (metabolism sensor).- Khi tính hiệu tạo sau liên kết chất cần phân tích yếu tố sinh học khơng có thay đổi hóa học yếu tố sinh học cảm biến gọi cảm biến xúc tác (catalytic sensor) 2.2.I.4 Các yếu tố sinh học 2.2.1.4.1 Enzym [19] Như biết enzym protein có hoạt tính xúc tác cao đặc hiệu cao chất Chúng sử dụng để kiểm sốt phân tích nồng độ nhiều chất cần phân tích khấc Các chế phẩm enzym có sẵn thị trường với độ tinh khiết cao điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất cảm biến sinh học dùng enzym cố định Bên cạnh đó, hạn chế enzyme pH, lực ion, chất kìm hãm, nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính enzym Hầu hết enzym hoạt tính nhiệt độ 60°c Cấc enzym sử dụng để chế tạo biosensor enzym oxy hóa, sử dụng oxy hịa tan sản xuất hydrogen peroxide Enzym cố định chuyển đổi (transducer) phương pháp hấp phụ, liên kết cộng hóa trị, phương pháp bao gói khn gel, polymer phát sinh điện hóa (electrochemically generated polymer), màng lipid kép (bilipid membrane) dung dịch bên màng chọn lọc Enzym thường ghép thành đôi với chuyển đổi điện hóa chuyển đổi sợi quang học 2.2.1.4.2 Kháng thể [19] Kháng thể có chất cấc glycoprotein, tế bào lympho B tương bào (biệt hổa từ lympho B) tiết để hệ miễn dịch nhận biết vơ hiệu hóa tấc nhân lạ, chẳng hạn vi khuẩn virus Mỗi kháng thể nhận diện epitope kháng nguyên Nhiều kháng thể thương mại hóa sử dụng rộng rãi xét nghiệm miễn dịch Các kháng thể cố định bề mặt chuyển đổi theo phương pháp liên kết cộng hóa trị sử dụng nhóm chức amino, carboxyl, aldehyde sulfhydryl Cấc mặt hạn chế sử dụng kháng thể giống sử dụng enzym Hơn muốn tái tạo phục hồi bề mặt chuyển đổi cần phải có điều kiện pH thấp, lực ion lớn, chất làm sạch, Ưu điểm cảm biến kháng thể khả phân tích nhanh xét nghiệm miễn dịch truyền thống Cảm biến miễn dịch thường sử dụng chuyển đổi quang học hay âm học 2.2.I.4.3 Vi sinh vật [19] Việc sử dụng vi sinh vật yếu tố sinh học thiết bị cảm biến sinh học dựa trình trao đổi chất chúng Trong hầu hết trường hợp, người ta đo thay đổi điện hóa học tế bào sử dụng oxy CO2 /V 23 ~ Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học Tế bào vi sinh vật có lợi rẻ so với enzym kháng thể, ổn định sử dụng phản ứng phức hợp có tham gia enzym cofactor Tuy nhiên, phương pháp có tính chọn lọc so với phương pháp sử dung enzym, có thời gian đáp ứng, thời gian phục hồi dài đòi hỏi phải thường xuyên tiến hành hiệu chỉnh Chất mang thường dùng để cố định nylon, màng cellulose nitrate, acetyl cellulose 2.2.I.5 Bộ chuyển đổi (transducer) 2.2.1.5.1 Chuyển đổi điện hóa [19] Bộ chuyển đổi dịng điện chuyển đổi điện áp dùng phổ biến thiết bị cảm biển sinh học kiểu điện hóa Hầu hết, điện cực làm kim loại bạch kim, vàng, bạc, thép không gỉ vật liệu carbon Những vật liệu phải trơ điện mà phản ứng điện hóa xảy 2.2.1.5.2 Chuyển đổi quang [19] Chuyển đổi quang chuyển đổi hoạt động dựa cấc hiệu ứng như: hấp thụ ánh sáng nhìn thấy tia UV; phát xạ huỳnh quang lân quang; bio-luminiscence; chemi- luminiscence Bộ chuyển đổi quang học loại đầu dò mà đỉnh cố định enzym chất màu (thường huỳnh quang) Những loại đầu dị chứa hai sợi quang Một sợi nối với nguồn sáng phất dãy bước sóng khác nhau, sợi nối với diot quang để phát thay đổi mật độ quang bước sóng thích họp 2.2.1.5.3 Chuyển đổi nhiệt [19] Hoạt động dựa tượng thay đổi entanpi hình thành phá vỡ liên kết hóa học phản ứng enzyme Bộ chuyển đổi có ưu điểm hoạt động tốt với tất cấc phản ứng Tuy nhiên, dạng chuyển đổi có tính chọn lọc thấp 2.2.1.5.4 Chuyển đổi tinh thể áp điện (piezoelectric) [19] Chuyển đổi hoạt động dựa nguyên lý: tinh thể thay đổi tần số dao động lực tác dụng lên thay đổi Chuyển đổi dạng có ưu điểm độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian phản ứng nhanh, khả động cao, sử dụng đo đạc mơi trường lỏng khí 2.2.2 Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate thực phẩm 2.2.2.1 Giới thiệu [20] Glutamate amino acid xác định nguồn lượng nguồn Nitơ quan trọng cho tế bào nhân thật tế bào loài động vật có vú Nó hoạt động chất dẫn truyền kích thích thần kinh hệ thống thần kinh trung ương cho chịu trách nhiệm cho số trình học tập, trí nhớ, phát triển hệ thần kinh Việc tăng mức độ /V 24 ~ Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học glutamate dịch não tủy cho nguyên nhân chứng rối loạn thần kinh bệnh đột quỵ, bệnh Alzheimer’s bệnh Parkinson’s Ngoài ra, monosodium glutamate sử dụng phổ biến làm chất tăng cường hương vi thực phẩm Do đó, việc phát triển thiết bị đo lường hàm lượng glutamate cách nhanh chóng đáng tin cậy vấn đề quan trọng cần xem xét nghiên cứu Một vài kỹ thuật khối phổ, điện mao dẫn, microdialysis cảm biến sinh học phất triển để phân tích glutamate Trong số phương pháp đó, cảm biến sinh học phương pháp quan tâm phất triển nhanh Một vài loại cảm biến sinh học sử dụng chuyển đổi dòng điện chế tạo để phát glutamate ứng dụng khác chế biến thực phẩm, tế bào nuôi cấy, dịch não ngoại bào (extracellular brain fluid) Cấc cảm biến sinh học có độ nhạy khả chọn lọc cao, cần có bước xây dựng phức họp để chuẩn bị điện cực enzym Không giống với cấc cảm biến sinh học dạng chuyển đổi dòng điện, cảm biến sinh học loại chuyển đổi quang học chế tạo đơn giản hơn, dễ sử dụng phất chỗ 2.2.2.2 Phương pháp thí nghiệm 2.2.2.2.1 Các hóa chất sử dụng [20] Enzym L-glutamate oxidase (L-GLOD) (EC 1.4.3.11, 63Ư/mg protein từ Streptomuces sp.), enzym L-glutamate dehydrogenase (L-GLDH) ((EC 1.4.1.3, 452U/mg protein từ Proteus sp.), NADPH, màng polycarbonate (kích thước lỗ 0.4 pm), dung dịch đệm cấc loại dung dịch khác 2.2.2.2.2 Sự cố định enzym [20] /V 25 Chương 2: ửng dụng Đô án môn học \ Người ta sử dụng dung dịch đệm phosphate saline (PBS, pH 7.0) cổ chứa đồng thời hai enzym Enzym L-GLOD L-GLDH trộn sau tạo liên kết chéo với màng polycarbonate 20pl dung dịch glutaraldehyde 25pl bovine serum albumin (BSA) sử dụng để nâng cao hiệu suất ổn định cho cảm biến Hỗn họp enzym chuẩn bị vói hàm lượng khác vói L-GLDH (35-143.2U) L-GLOD giữ cố định giá trị 25U Sau đó, 10 J0.1 sử dụng để cố định Màng polycarbonate sau cố định rửa vài lần dung dịch PBS L-GLOD + L-GLDH để loại glutaraldehyde dư thừa enzym không tạo liên kết với màng Màng chứa enzym bảo quản 4°c dung dịch PBS chửa túi polypropylene kín khí 2.2.2.2.3 Điện cực [20] Điện cực vói đường kính lcm sử dụng dung dịch KC1 chất điện phân, điện cực dưong làm bạc, điện cực âm làm vàng Điện cực oxy phủ lớp polypropylene kị nước (để bảo vệ điện cực nước) cho khí thấm qua lớp enzym màng polycarbonate (kích thước lỗ 0.4|im) gắn điện cực hệ thống “push cap” Để phân tích, người ta sử dụng dung dịch đệm bảo hịa khơng khí với nồng độ oxy 7-8 ppm 25°c Dung dịch đệm loại oxy dung dịch sodium sulfite Hình 2.2: Mơ hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD—L-GLDH cổ định 2.2.2.2A Thử nghiệm [20] Đầu dò phân cực khoảng 30-40 phút lần trước sử dụng Việc thử nghiệm bắt đầu cách thêm MSG nồng độ khác Lượng oxy tiêu thụ đo sau phút Để khơi phục lại độ bảo hịa oxy 100%, màng cố định enzym rửa vài lần với PBS trước tiến hành lần thử nghiệm Sự khuếch tán oxy từ khơng khí làm giảm hiệu quấ trình thử nghiệm thực với enzym dung dịch, để khắc phục vấn đề người ta tiến hành thử nghiệm thiết bị phản ứng kín khí thủy tinh (12mL) Người ta tiến hành thí nghiệm ba trường họp với nồng độ MSG khác nhau: ~ 26 ~ Chương 2: ửng dụng Đồ án mơn học - • : Khơng tái sinh chất vắng mặt 2mM NADPH lOmM ammonium - A :CÓ tái sinh chất có mặt 2mM NADPH - ♦ :CĨ tái sinh chất có mặt 2mM NADPH lOmM ammonium />/ 27 Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học Người ta tiến hành tối ưu nồng độ NADPH ammonium nhận thấy giá trị đáp ứng cho ổn định cao 2mM NADPH lOmM ammonium Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG cặp L-GLOD-LGLDH cổ định cảm biến sinh học 2.2.2.2.5 Quá trình phản ứng [20] L-glutamate + H2O ^ ^"^»ả-Ketoglutarate + NH3 (1) Phản ứng (1) xảy có mặt MSG, q trình tái sinh chất khơng xảy khơng có mặt NADPH, NADPH hoạt động cofactor L-GLDH 0.1mg/L nồng độ giới hạn phát phương trình (1) NADP NADPH Với có mặt 2mM NADPH MSG hai enzym hoạt động MSG tái sinh phản ứng (2) MSG chuyển đổi thành a-ketoglutarate phản ứng thứ chất phản ứng thử (2) Việc bổ sung NADPH vào môi trường phản ứng tạo điều kiện cho L- GLDH thực phản ứng nghịch Việc nhận biết L- glutamate cung cấp khuếch đại giới hạn phát xác định 0.04mg/L Sự khuếch đại túi hiệu cao nhận thấy có mặt ammonium-một sản phẩm phụ phản ứng (1) giói hạn nồng độ phất 0.02mg/L 2.2.2.2.Ổ Cấu hình nhiệt độ pH [20] Cảm biến hoạt động tốt khoảng pH 4-10 (pH dung dịch đệm citrate- phosphate: 4, 5, 6; sodium phosphate: 7,8; glycine-NaOH: 9, 10) đo nồng />/ 28 ~ Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học độ dung dịch MSG 1.2mg/L với cổ mặt 2mM NADPH lOmM ammonium pH tối ưu cảm biến 7.0 nhiệt độ 25±2 °c, pH tối ưu GLDH khoảng 8.25 pH tối ưu GLOD khoảng 8.0 Cảm biến hoạt động tốt khoảng nhiệt độ (13±2 đến 55±2 °C) đo nồng độ MSG 1.2mg/L Cảm biến hoạt động tốt nhiệt độ 25±2 °c, sau giá trị cảm biến bị hoạt tính bị vơ hoạt bời nhiệt độ Hình 2.4: pH nhiệt độ 25 ±2 °c có mặt 2mM NADPH lOmM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L Hình 2.5: Nhiệt độ pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 2.22.2.1 Xác định giá trị Km Y max [20] Giá trị Km xác định cho cặp L-GLOD-LGLDH giống cho LGLOD Vận tốc ban đầu phản ứng hàm số nồng độ chất theo động học ‘Michaelis-Menten’ Km Vmax xác định theo phương pháp Lineweaver-Burk Giá trị Km biểu kiến xác định 0.445 lmM với có mặt 2mM NADPH lOmM ammonium vmaxxảc định điều kiện 3.07mg/(L.min) />/ 29 Chương 2: ứng dụng Đồ án môn học Giấ trị Km Vmax biểu kiến điều kiện khơng tái sinh chất (chỉ có L-GLOD hoạt động) tương ứng 1.9222mM 13.245mg/(Lmin) so với Km L-GLOD dạng tự 0.21 mM Vì thế, cặp L-GLOD-LGLDH sử dụng giá trị Km tăng xấp xỉ lần, khỉ sử dụng chì L-GLOD giá trị K,n tăng hom lần Giá trị Km cao hom thu khỉ cố định enzym lực enzym với chất giảm, cỗ thể ttở trung tâm hoạt động enzym trình cổ định 2.2.2.2.8 Sự ổn định màng cế định [20] Sự ổn định củã màng phẫn tích chu kì 60 ngày Màng chứa enzym bảo quản dung dịch đệm phosphate 0.2M, pH 7.0, nhiệt độ 4°c tui polypropylene km khí Q trình phân tich thực mễi ngày lần với 0.8mg/L MSG Màng chứa cặp enzym L-GLOD-LGLDH giữ 80% hoạt tính ban đầu sau 30 ngày ứng với GLOD= 25U; GLDH= 35Ư 39 ngày ứng với GLOD= 25Ư; GLDH= 143.2Ư với diện 2mM NADPH lOmM ammonium Trong khỉ đỗ, màng chì cố định enzym L- GLOD (25U) giữ 80% hoạt tính ban đầu chí sau 48 ngày Hình 2.6: Hoạt tính enzym cổ định cảm biến sinh học thời gian 60 ngày: A L- GLOD 25U-L-GLDH143 2U; m L-GLOD 25U-L-GLĐH 35U; ÌL-GLOD 25U Trong nghiên cứu gần đây, người tã nhận thấy lượng nhỏ GLDH không trì hoạt tính enzym, điều cố thể vơ hoạt rị rỉ enzym Sự ổn định biosensor trình bảo quăn cao khỉ hoạt độ GLDH 143.2U GLOD 25Ư TÀI LIỆU THAM KHẢO Wolfgang Aehale, Enzymes in Industry, Copyright © 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGa, Weinheim Parmjit s Panesar, Shweta Kumari, and Reeba Panesar, Potential Applications of Immobilized p-Galactosidase in Food Processing Industries, SAGE-Hindawi Access to Research, Enzyme Research, Volume 2010, Article ID 473137, 16 pages M.L Foresti, M.L Ferreha, Chito san-immobilized lipases for the catalysis of fatty acid esterifications, Enzyme and Microbial Technology 40 (2007) 769-777 Yin Hoon Chew, Lee Suan Chua, Kian Kai Cheng, Mohamad Roji Sarmidi, Ramlan Abdul Aziz, Chew Tin Lee, Kinetic study on the hydrolysis of palm olein using immobilized lipase, Biochemical Engineering Journal 39 (2008) 516-520 K.N Kilcawley, M.G Wilkinson,P.F.Fox, Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations from microbial or animal sources, Enzyme and Microbial Technology 31 (2002) 310-320 G.D Haki, S.K Rakshit, Developments in industrially important thermostable enzymes: a review, Bioresource Technology 89 (2003) 17-34 V Ramachandra Murty*, Jayadev Bhat, and P K A Muniswaran , Hydrolysis of Oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: A Review, Biotechno Bioprocess Eng 2002, 7: 57-66 José M Palomo, Gloria Munoz, Gloria Fernandez-Lorente, Cesar Mateo, Roberto Fernândez-Laiuente*, José M Guisấnl, Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl-Sepabeads) immobilization, hyperactivation and stabilization of the open form of lipases, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 19-20 (2002) 279-286 S.-W Chang, J.-F Shaw, K.-H Yang, S.-F Chang, C.-J Shieh, Studies of optimum conditions for covalent immobilization of Candida rugosa lipase on poly(c-glutamic acid) by RSM, Bioresource Technology 99 (2008) 2800-2805 Dasciana s Rodrigues, Adriano A Mendes, Wellington s Adriano, Luciana R.B Goncalves,Raquel L.c Giordano, Multipoint covalent immobilization of microbial Upas on chitosan and agarose activated by different methods, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 51 (2008) 100-109 10 Tài liệu tham khảo Do an mon hoc ll.Seema S.Betigeri, Steven H.Neau, Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads, Biomaterials 23 (2002) 3627-3636 12 Keehoon Won, Sangbum Kim, Kwang-Je Kim, Hong Woo Park, Sang-Jin Moon, Optimization of lipase entrapment in Caalginate gel beads, Process Biochemistry 40 (2005) 2149-2154 13 Paramita Mahapatra, Annapurna Kumari, Vijay Kumar Garlapati, Rintu Banerjee, Ahindra Nag, Enzymatic synthesis offruit flavor esters by immobilized lipase from Rhizopus oligosporus optimized with response surface methodology, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 14 Wiphum Kaewthong, Sarote Sirisansaneeyakul, Poonsuk Prasertsan, Aran H-Kittikun, Continuous production of monoacylglycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase, Process Biochemistry 40 (2005) 1525-1530 15 S.J Prashanth, V.H Mulimani, Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzae-galactosidase immobilized in calcium alginate, Process Biochemistry 40 (2005) 1199-1205 16 S Thippeswamy, V.H Mulimani, Enzymic degradation of raffinose family oligosaccharides in soymilk by immobilized agalactosidase from Gibberella fujikuroi, Process Biochemistry 38 (2002) 635/640 17 Miguel Filho, Benevides C Pessela, Cesar Mateo, Alfonso V Carrascosa, Roberto Fernandez-Lafuente, Jose M Guis' an, Immobilization—stabilization of an -galactosidase from Thermus sp strain T2 by covalent immobilization on highly activated supports: Selection of the optimal immobilization strategy, Enzyme and Microbial Technology 42 (2008) 265-271 18 Saraju P.Mohanty and Elias Kougianos ,Biosensors: A tutorial review 19 Jose " I Reyes De Corcuera, Ralph P Cavalieri, Biosensors, Washington State University, Pullman, Washington, U.S.A 20 Anjan Kumar Basu, Parimal Chattopadhyay, Utpal Roychudhuri, Runu Chakraborty, Glutamate optical biosensor based on the immobilization of glutamate dehydrogenase in titanium dioxide sol-gel matrix, , Department of Food Technology and Biochemical Engineering, Jadavpur University, Kolkata 700032, India ... phương pháp cố định enzym 1.2.5 Vật liệu cố định 1.2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến cố định enzyme Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 2.1 ứng dụng công nghệ thực... tốt enzym tự - Enzym cố định tái sử dụng nhiều lần dễ dàng tách khỏi chất cách dễ dàng sau phản ứng độ bền enzym cố định cao enzym tự 1.2.3 Ưu nhược điểm enzym cố định [1] Ưu điểm: - Enzym cố định. .. Do vậy, ngày có nhiều nghiên cứu cố định enzym ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp 1.2.4 Các phương pháp cố định enzym [1] Các phương pháp cố định enzym chia thành nhóm: hóa học vật