Đồ án môn học Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng

Sau đó ữên thế giớixuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang.Trước năm 1953 chưa có một nghiên cửu nào về enzym không hòa tan được ứng d

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành đồ ánnày.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011

Nguyễn Bảo Dư

iii ~

MỤC LỤC

TRANG BÌA i

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG vi

Chương 1: TỒNG QUAN 1

1.1 Lịch sử phát triển của enzym cố định 1

1.2 Sơ lược về enzym cố định 2

1.2.1 Định nghĩa 2

1.2.2 Đặc điểm của enzym cố định 2

1.2.3 Ưu nhược điểm của enzym cố định 3

1.2.4 Các phương pháp cố định enzym 3

1.2.5 Vật liệu cố định 5

1.2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme 7

Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 9

2.1 ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 9

2.1.1 Enzym ß-galactosidase 9

2.1.1.1 Giới thiệu về enzym ß-galactosidase 9

2.1.1.2 Nguồn thu nhận enzym ß-galactosidase 9

2.1.1.3 Các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase 10

2.1.1.4 ứng dụng của enzym ß-galactosidase cố định 13

2.1.1.4.1 Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum 13

2.1.1.4.2 Tổng họp Galacto-Ohgosaccharides (GOSs) 16

2.1.2 Enzym lipase 17

2.L2.1 Giới thiệu về enzym hpase 17

2.L2.2 Nguồn thu nhận enzym lipase 17

2.1.2.3 Các phương pháp cố định enzym lipase 18

2.1.2.4 ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm 20

2.1.2.4.1 ứng dụng lipase cố định tổng họp các ester có hương trái cây 20

2.1.2.4.2 ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất Mên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ 21

2.1.3 Enzym a-galactosidase (raffinase) 23

V ~

2.1.3.1 Giói thiệu về enzym a-galactosidase 23

2.L3.2 Nguồn thu nhận enzym a-galactosidase 23

2.L3.3 Cách phương pháp cố định enzym a-galactosidase 23

2.L3.4 ứng dụng của enzym riffinase cố định 26

2.2 ứng dụng trong phân tích 27

2.2.1 Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor) 27

2.2.1.1 Giới thiệu về cảm biến sinh học 27

2.2.1.2 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học 27

2.2.1.3 Phân loại 28

2.2.1.4 Các yếu tố sinh học 29

2.2.1.4 L Enzym 29 2.2.1.4.2 Kháng thể 29

2.2.1.4.3 Vi sinh vật 30

2.2.1.5 Bộ chuyển đổi (transducer) 30

2.2.1.5.1 Chuyển đổi điện hóa 30

2.2.1.5.2 Chuyển đổi quang 30

2.2.1.5.3 Chuyển đổi nhiệt 30

2.2.1.5.4 Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) 30

2.2.2 Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase và L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm 31

2.2.2.1 Giới thiệu 31

2.2.2.2 Phương pháp thí nghiệm 31

2.2.2.2.1 Các hóa chất sử dụng 31

2.2.2.2.2 Sự cố định enzym 31

2.2.2.23. Điện cực 32

2.2.2.2A Thử nghiệm 32

2.2.2.2.5 Quá trinh phản ứng 33

2.2.2.2 Ó.Cấu hình nhiệt độ và pH 33 2.2.2.23 Xác định giá trị Km và Vmax 34

2.2.2.2.8 Sự ổn định của màng cố định 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Mô hình biosensor 27

Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD-L-GLDH cố định 32

Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD-L-GLDH cố định trong cảm biến sinh học 33

Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 °c có mặt 2mM NADPH và lOmM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L ’ ’ 34

Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 34

Hình 2.6: Hoạt túứi của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: L-GLOD 25U-L-GLDH 143.2U; L-L-GLOD 25U-L-GLDH 35U; L-L-GLOD 25U 35

DANH MỤC BẢNG • Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm của các phưorng pháp cố định enzyme 4

Bảng 2.1: Tóm tắt các phưcmg pháp cố định enzym P-galactosidase 13

Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau 15

Bảng 2.3: Nguồn vsv thu nhận enzym lipase và tứứi chất enzyme lipase 18

1.1 Lịch sử phát triển của enzym cố định [1]

- Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men(EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose Sau đó ữên thế giớixuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang.Trước năm 1953 chưa có một nghiên cửu nào về enzym không hòa tan được ứng dụng vào thực tế

- Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số enzym như carboxy peptidase,diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiêncửu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot

- Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dịứng khi đưa enzym vào cơ thể

- Năm 1963, Bemfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzym như amylase,trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide

- Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxypeptidase A với glutaraldehyde Cũng trong năm này Chang đã triển khai phương pháp tạo vi nang

để nhốt enzym carbonic anhydrase

- Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằngglucoamylase cố định

- Năm 1969, Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku - Nhật đã là nhữngngười đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp Theophương pháp cố định enzym của các tác giả người Nhật, enzym aminoacylase của nấm sợi đã đượcgắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân

- Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzym: P-galactosidase, hexokinase,glucophosphatase bằng hên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex

- Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase

- Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thành công trongviệc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamid

Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao.

- Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến hành sảnxuất sữo fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp Cho đến nay cổ khoảng 4,5 triệu tấn sừofructose được sản xuất theo phưong pháp enzym cố định

- Ngoài sàn phẩm trên, enzym cố định còn được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men,

chống ô nhiễm môi trường và cả trong y học.

1.2 Sơ luợc về enzym cố định

1.2.1 Định nghĩa [1]

Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa:

- Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan là enzym được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này có

thể tách riêng vói môi trường dung dịch phàn ứng Pha enzym không hòa tan trong nước và đượcgắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

- Nghĩa rộng: cắc chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ờ trạng thái cho

phép sử dụng lại Như vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm cả enzym được cốđịnh vào một chất mang, cả enzym có trong tế bào sống, chúng được cố định trong các bình phảnứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần

- Enzym không hòa tan hay enzym cố định thường là những enzym hòa tan được gắn vàomột chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Nhờ quấ trình gắn này mà enzym từ trạng thái hòatan chuyển sang không hòa tan

1.2.2 Đặc điểm của enzym cố định [1]

Enzym cố định có đặc điểm như sau:

- Hoạt tính của enzym cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzym tự do cùng loại Sở dĩ có

sự thay đổi hoạt tính riêng của enzym cố định là do những nguyên nhân sau:

• Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự khác biệtvới điện tích của enzym thì khi gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian của enzym có sựthay đổi ở mức độ nhất định Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết họp giữa enzym và cơchất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chứng cùng giảm

• Do enzym bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúcgiữa enzym và cơ chất bị kém đi

- Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis - Menten nhưng có một số sai khácnhất định:

• Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang

• Xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng

- Enzym cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở củachất mang

- Enzym cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzym tự do cùng loại

- Enzym cố định do có chất mang che chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzym tự do

- Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách dễ

dàng sau phản ứng và độ bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do

1.2.3 Ưu nhược điểm của enzym cố định [1]

Ưu điểm:

- Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài

- Enzym cố định không lẫn vào trong sàn phẩm cuối của phản ứng enzym, do đó nó khônggây ảnh hường xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không tốn chi phí choviệc tách enzym ra khỏi sản phẩm

- Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang - enzym ra khỏi dungdịch cơ chất

- Enzym cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do

- Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục

Nhươc điểm:

- Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym

- Trong đa số trường họp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quấ trình cố định

- Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố địnhmang lại Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzym cũng như ứng dụng enzym cốđịnh vào sản xuất công nghiệp

1.2.4 Các phương pháp cố định enzym [1]

Các phương pháp cố định enzym được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý

Phương pháp hóa hoc:

Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm của các phương pháp cổ định enzyme [1]

Phương pháp hóa học

Phương pháp gắn enzym lên

chất mang bằng liên kết

cộng hóa trị

Liên kết giữa enzym và chất mang làMên kết bền, do đó hạn chế tối đa sựmất mát enzym trong quá trình phảnứng

Hoạt tính enzym có thể bị giảm

do những biến đổi về cấu trúccủa enzym trong quá trình cốđịnh

Hoạt tính enzym có thể bị giảm

do những biến đổi về cấu trúccủa enzym trong quấ trình cốđịnh

Phương pháp vật lý

Phương pháp gắn enzym lên

chất mang bằng tác nhân vật

lý

Thao tấc thực hiện đơn giản

Điều kiện tiến hành cố định enzym

ôn hòa nên không làm mất hoạt tínhcủa enzym trong quá trình cố định

Có khả năng tái sử dụng chất mang

Do lực tương tác giữa enzym vàchất mang yếu nên dễ xảy rahiện tượng nhả hấp phụ trongquá trình sử dụng enzym cố định

do khuấy trộn hay do thay đổinhiệt độ, pH của môi trường

Phương pháp nhốt enzym

Thao tác đơn giản

Không đòi hỏi phải có các nhóm tạoMên kết nên phù họp với nhiều loạienzym

Hiệu quả cố định enzym cao

Có thể cố định đồng thòi nhiềuenzym

Chỉ thích họp cho phản ứng với

cơ chất có khối lượng phân tửnhỏ

- Gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị

- Gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị

Vât liêu vô cơ:

- Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn mòn,

phân hủy, nhưng việc gắn với enzym thường khó khăn hơn

- Một sốchất mang vôcơthông dụng như: thủy tinhxốp, cấc oxid kim loại như oxid nhôm, oxid mangan, oxid magie, Silicagel

Vât liêu hữu cơ:

- Đặc điểm: chất mang hữu cơ thường có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH2, - COOH,-OH, -SH, nên dễ kết gắn với enzym nhưng độ bền với tác động của môi trường không cao, đặcbiệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công

• Các polymer tư nhiên:

- Tinh bột là vật liệu phong phú rẻ tiền Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột

đã được dùng làm chất mang cố định enzym như lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase Nhượcđiểm của tinh bột là độ trương kém, thiếu các nhóm chức năng nên khả năng cố định và hoạt tínhenzym còn thấp Tinh bột thường được ghép copolymer với các vinyl monomer ưa nước nhưacrylamide, acrylic acid để cải thiện tính chất cơ lý, độ trương nở và tạo các nhóm chức năng trên

- Chitin là họp chất được Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin từ năm

1823 Chitin là một polymer sinh học có nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng làm vậtliệu cố định enzym và tế bào Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứngsau cellulose.

- Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là một polymer của các gốc 2-acetoamide-2- ß-D-glucoza, Mên kết với nhau bởi Mên kết ß-l,4-glycoside Chitin có trong thành phần cấu trúc

deoxy-vỏ của côn trùng, deoxy-vỏ tôm cua, sò, vách tế bào sinh vật, Chitin là một vật Mệu có chứa nhóm chức-OH và cho Mên kết với enzym, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt, dễ tạo màng Chitin

có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các Mên kết hydro hình thành trong chuỗi mà còn

có giữa cấc lóp với nhau trong mạng tinh thể Chitin là một polymer kỵ nước, độ trương thấp, diệntích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học Gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzymtrên chitin, chủ yếu bằng phương pháp hấp thụ và Mên kết công hóa trị qua cầu nốiglutaraldehyde Chitin được tìm thấy trong thành tế bào của nấm sợi Nó là chất hữu cơ chiếmlượng lớn để hình thành nên lóp vỏ ngoài của động vật không xương sống (côn trùng, giáp xác )

về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tương tự như cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là

nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin được thay thế cho nhóm hydroxyl (-OH)

ờ ceUulose

- Chitosan là dẫn xuất của chitin khi được deacetyl hóa trong kiềm mạnh Chitosan dễ tạomàng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm - NH2 Chitosan có thể cố định enzym bằng phươngpháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt enzym trong gel chitosan Chitosan không tantrong nước, tan trong dung môi hữu cơ như acid formic, acid dipic, acid acetic Chitosan là mộtpolymer sinh học có trọng lượng phân tử cao, có các nhóm amin hoạt động, cấc nhóm hydroxyl cóthể tham gia phàn ứng hóa học

- Anginate, carrageenan, cả hai vật Mệu này tạo gel trong dung dịch CaCỈ2dùng để nhốt tếbào, enzym

- Chất mang protein thường là gelatin, keratin, albumin, thường có khả năng dễ tạo màng,tạo hạt, nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde; nhược điểm củanhóm này là thường kém bền, dễ bị nhiễm khuẩn

• Các polymer tone hơp:

- Cấc polymer tổng họp được sử dụng làm chất mang cố định enzym như polyacrylamide,polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxyethylacrylate,polystyrene,

- Ưu điểm chung của các polymer tổng họp này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ

với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh kích thước siêu lỗ.

- Nhược điểm là một số polymer có giá thành cao, khả năng tương họp sinh học kém,không thể phân hủy trong môi trường tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trường

1.2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme [1]

Ảnh hưởne của chất mans

- Cấc tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ hóa, diện tích, tính háonước và kỵ nước, đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzym được liên kết, đến tính bền vàhoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzym không tan

- Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzym

và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng

- Sự định vị enzym giúp cho dẫn xuất enzym không tan có tính bền nhiệt cao hơn enzymtan

- Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung môi, làm đứt nốiliên kết hydro và liên kết kỵ nước

Ảnh hưởns của vH

- Khi lực ion thấp thì nồng độ H+gần chất mang tích điện âm cao hơn, còn gần chất mangtích điện dương cao hơn trong dung dịch Kết quả là pH tối ưu của enzym liên kết đồng hóa trịvới chất mang tích điện âm sẽ chuyển dịch sang pH kiềm so với enzym hòa tan, trái lại nếuenzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện dương thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch sangphía pH acid

- Khi lực ion lớn thì điện tích của chất mang được trung hòa bởi các ion trái dấu và pH tối

ưu của enzym cố định gần giống enzym hòa tan

Ảnh hưởne của enzyme

Theo Poltorak, một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ của enzym cố định là sựtương tác protein-protein giữa các phân tử enzym đã được liên kết

Trong mọi trường họp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự tănglượng enzym được kết họp trên một đơn vị diện tích chất mang

/N/'J/%/

Ảnh hưởne của phươns pháp cố đinh

- Khi cố định bằng phương pháp hấp phụ vật lí, các enzym ít bị thay đổi cấu trúc không gian

do đó ft ảnh hường đến hoạt tính Nhưng do phương pháp này sử dụng các liên kết yếu như liên kết

kị nước, liên kết hydro, nên enzym dễ bị giải hấp phụ

- Khi cố định bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị sẽ có độ ổn định cao khi sử dụng dưóicác điều kiện như nhiệt độ, pH, có khả năng chống chịu cao đối với sự ảnh hường của các dung môihữu cơ và các tác nhân vật lí khác Tuy nhiên, liên kết cộng hổa trị sẽ làm thay đổi mạnh mẽ cấu trúckhông gian của enzym nên hoạt tính của enzym cố định thường bị giảm đi đáng kể

- Khi cố định bằng phương pháp bao gói, quá trình hoạt động của enzym phụ thuộc vào haiyếu tố chính là kích thước chất mang polyme và trọng lượng của phân tử cơ chất Hai yếu tố này sẽlàm giảm tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác Hơn nữa, cùng với hoạt tính xúctác cao của enzym sẽ làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản phẩm của dung dịch và chấtmang chứa enzym cố định Điều này làm cho các thông số công nghệ thay đổi, đó là điều cần để ýkhi thiết lập quy mô của quá trình

Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 2.1 ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

2.1.1 Enzym p-galactosidase

2.1.1.1 Giói thiệu về enzym Ịỉ-galactosỉdase [2]

Enzym P-galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đường lactose thành

các monomer là glucose và galactose Việc sử dụng P-galactosidase để thủy phân lactose trong sữa

và whey là một trong những ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và các sànphẩm từ sữa Enzym này có thể được sử dụng dưới dạng hòa tan hoặc dạng cố định nhưng dạng hòatan chỉ có thể sử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng cố định có lợi thế hon là có thể sửdụng tốt cho cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục

Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân lactose với enzym tự do, nhưng việc

sử dụng enzym P-galactosidase cố định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm năng của nó

2.1.1.2 Nguồn thu nhận enzym p-galactosỉdase [2]

Enzym P-galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi sinh

vật, thực vật, và động vật Tuy nhiên, tính chất của enzym được thu nhận từ các nguồn khấc nhau có

sự khác nhau rõ rệt Enzym thu nhận từ nguồn thực vật và động vật có giá trị kinh tế thấp, nhưng thunhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ưu thế như dễ dàng xử lí thu nhận, tốc độ nhân giống vi sinhvật cao, năng suất thu nhận sản phẩm cao Một số vi sinh vật được xem là nguồn thu nhận tiềm năngcủa loại enzym này

Bacteria: Alicyclobacỉllus acidocaldarìus subsp, Rittmannii Arthrobacter sp,_Bacittus acidocaldarỉus, B circulans, B coagulans, B subtilis, B megaterum, B stearothermophỉlus, Bacteriodes polypragmatus, Bifidobacterium bifidum, B infantis, Clostridium acetobutylicum, c.thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans,E cloaceae, Escherichia coll, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L bulgaricus,L helviticus, L kefiranofaciens, L lactis, L sporogenes, L themophilus, L delbrueckii, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilactỉ, p pento, Propioionibacterium shermanii, Pseudomonas fluorescens, Pseudoalteromonas haloplanktis

Streptococcus cremoris, s. lactis, s. thermophius, Sulfolobus solfatarius, Thermoanaerobacter sp.,Thermus rubus, T aquaticus, Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris.

Fungí: Alternaría alternate, A palmi, Aspergillus foelidis, A fonsecaeus, A fonsecaeus, A Carbonarius, A Oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis, Fusarium monilliforme,

F oxysporum, Mucor meihei, M pusillus, Neurospora crassa, Penicillum canescens, p chrysogenum, p expansum, Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp, Streptomyces violaceus.

Yeast: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis,s. lactis, S.fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K.fragüis, K lactis, K.marxianus.

2.1.1.3 Các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase [2]

Phươns pháp hấữ phu vât lý

Cấc chất vô cơ như nhôm, silic, thủy tinh xốp, đất sét, bentonite, chất hữu cơ nhưcellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi ion, được sử dụng làm chất mang hấp phụ trong cốđịnh enzym Hơn nữa có thể xử lí thêm với glutaraldehyde để tăng sự ổn định

Enzym ß-galactosidase từ K fragilis và K lactis được cố định trên chitosan có hoạt độ riêng 0.9-2.2 u/mg trọng lượng khô của tế bào Hoạt tính của enzym được cố định từ K fragilis thì cao hơn nhưng độ ổn định của enzym cố định từ A oryzae thì cao hơn 5-14 lần tùy thuộc vào phương pháp

cố định Khi dùng phương pháp hấp phụ người ta nhận thấy hoạt tính cao nhất thu được khi dùngenzym từ nấm men với chất mang là Ostsorb-DEAE Hơn nữa, sự cố định tối đa đạt được ở pH 5.5

và kết quả tối ưu thu được khi có mặt dung dịch đệm citrate/phosphate trong suốt quá trình cố định

/?-galactosidase từ E coli bằng phương pháp hấp phụ vật lí trên chromosorb-W Một thiết bị phản ứng mới chứa /?-galactosidase từ B circulans được cố định trên màng có gờ làm từ PVC và silica được sử dụng để thủy phân lactose trong sữa gầy Việc cố định yổ-galactosidase từ Bullera singularis trên hạt Chitopearl BCW 3510 (970 GƯ/g nhựa) bằng phương pháp hấp phụ đơn giản

cũng được thực hiện

Các nghiên cứu về động học của enzym ß-galactosidase từ Kluyveromces marxianus

(Saccharomyces) lactis được cố định trên những chất mang khác nhau như nhôm và silica đã cho

thấy rằng hoạt tính của enzym cố định phụ vào bản chất hóa học tự nhiên và cấu trúc vật lí của chấtmang Khi kích thước lỗ của các hạt chất mang tăng thì hoạt tính của enzym giảm mạnh Sự cố định

ß- galactosidase từ Thermus sp diễn ra rất nhanh trên PEI-Sepabeads và DEAE-Agarose Tuy nhiên,

độ mạnh hấp phụ thì cao hơn trong trường họp của PEI- Sepabeads

Enzym ß-galactosidase từ B stearothermophilus chịu nhiệt được cố định trên chitosan sử

dụng Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng để thủy phân đường lactosetrong sữa Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính của enzym ß-galactosidase được cố định

~ 11

trên THP thì vượt trội hơn so với enzym tự do và enzym được cố định bằng glutaraldehyde.Enzym ß-galactosidase được cố định trên THP cho thấy hoạt tính cao hơn enzym tự do khi có mặtion Ca2+và ổn định trong suốt thời gian bảo quản ờ 4°c trong 6 tuần, trong khi enzym tự do bị mất

31% hoạt tính trong cùng điều kiện Hai phương pháp quy hoạch thực nghiệm là phương pháp

“Response surfacemethodology” (RSM) và “Centre composite design” (CCD) được dùng để tối ưu

sự cố định enzym ß-galactosidase từ Pisum sativum trên hai vật liệu khung mạng: Sephadex G-75 và

hạt chitosan Hiệu suất cố định đạt được 75.66% và 75.19% tương ứng với Sephadex G-75 vàchitosan

Enzym ß-galactosidase từ A oryzae được cố định trên một chất mang rẻ tiền concanavalin

A-cellulose Chế phẩm ß-galactosidase được hấp phụ và hên kết chéo bằng Concanavalin A-cellulose,

giúp giữ lại 78% hoạt tính ban đầu Nhiệt độ tối ưu của enzym cố định tăng từ 50°c lên 60°c Enzym

cố định bằng phương pháp hấp phụ và liên kết chéo giữ được 93% hoạt tính sau 1 tháng bảo quảntrong khi enzym tự nhiên chỉ giữ được 63% hoạt tính

Phươns pháp bao eói

Khung mạng sử dựng để cố định thường được làm từ các nguyên liệu như Ca-alginate, agar,k-carragenin, polyacrylamide và collagen Tuy nhiên, một vài khung mạng rắn như than hoạt tính,ceramic, cũng có thể dùng để cố định Các loại màng dùng để nhốt enzym được sử dụng phổ biến

là nylon, cellulose, polysulfone, và polyacrylmide

Enzym ß-galactosidase từ nấm sợi được cố định trong gel polyvinyl alcohol có tính chịu

nhiệt cao hơn enzym tự do, giữ được 70% hoạt tính sau 24h ở 50°c Các tế bào K bulgarìcus có chứa

enzym ß-galactosidase được xử lí với glutaraldehyde được nhốt trong alginate sử dụng dung dịchBaCỈ2 Cấc hạt alginate thu được sau khi xử lí tiếp theo với polyethyleneimine thì đạt được độ ổn

định cao Enzym ß-galactosidase của E coli cũng được cố định trong gel polyacrylamide thông qua

việc chuẩn bị các dẫn xuất hên kết chéo của enzym với bisimidoesters

Tế bào K marxianus có chứa lactase hoạt động được nhốt toong gel calcium pectate (CPG)

và toong gel calcium alginate (CAG) được làm cứng bằng polyethyleneimine và glutaraldehyde Các

tế bào được cố định trong CPG đã thủy phân hơn 80% lactose trong quá trình liên tục và bán hên tục

So sánh các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase từ Thermus aquaticus cho thấy rằng

việc cố định bằng hên kết chéo sau đó nhốt enzym toong hạt agarose có thể cho hiệu suất hoạt động

tốt hơn Việc nhốt enzym ß-galactosidase từ A oryzae trong gel polyvinyl alcohol lạnh xốp sẽ tăng

cường độ ổn định với nhiệt độ, pH, lực ion hơn so với enzym tự do Khung dạng sợi được làm từalginate và gelatin được bổ sung chất làm cứng là glutaraldehyde cổ thể giữ được 56% hoạt tính củaenzym trong 35 ngày mà không có bất kì sự giảm hoạt tính

Người ta nhận thấy rằng chế phẩm ß-galactosidase được liên kết chéo bằng canavalin A có

thể thủy phân lactose vượt trội trong hàng loạt quá trình so với các chế phẩm khác vì chúng vẫn giữđược hoạt tính cao, cụ thể là giữ được 95% hoạt tính sau 7 lần sử dụng, và giữ được 93% hoạt tính

sau 2 ngày bảo quản ở 4°c.

Phương pháp liên kấ cone hóa tri

Các phân tử enzym liên kết với chất mang thông qua cấc nhóm chức năng không nằm trongtrung tâm hoạt động của enzym như amino, carboxyl, hydroxyl, và sulfydryl Các nhóm chức năngtrên chất mang thường được hoạt hóa bằng cách sử dụng các chất hóa học như cyanogen bromide,carbodimide, và glutaraldehyde

Enzym từ A oryzae được cố định trên bột nylon-6 và zeolite Zeolite thì không lý tưởng vì

lượng liên kết tạo thành ft trong khi đó nylon-6 tạo ra được khung mạng ổn định Các dẫn xuất thuđược hoạt hóa bằng diazo hoặc bằng carbodiimide cho thấy hoạt tính cao nhất trong suốt quá trình cốđịnh enzym trên thủy tinh xốp có phủ lóp glycophase

Enzym ß-galactosidase từ E coli được cố định trên gelatin sử dụng chất hoạt hóa là

chromium (III) acetate và glutaraldehyde vẫn giữ được tương ứng 25% và 22% hoạt tính Enzymđược cố định trên silica-alumina ổn định hơn enzym tự do ở pH acid

Các dẫn xuất ß-galactosidase cố định cho thấy nhiều sự cải thiện nhưng hoạt tính khấc nhausau khi được tạo điều kiện cho liên kết cộng hóa trị đa điểm bằng cách ủ trong dung dịch kiềm mộtthời gian dài, enzym được cố định trên Sepabeads-epoxy-boronic được xem là ổn định nhất Dan

xuất tốt nhất rất hoạt động trong việc thủy phân lactose thậm chí ờ 70°c.

Gần đây sự liên kết ngang của ß-galactosidase trên các hạt từ tính có nguồn gốc khác nhauđược thực hiện với sự có mặt của glutaraldehyde Ket quả là hoạt tính của enzym cố định được tănglên

Khi cố định ß-galactosidase chịu nhiệt trên Sepabeads để thủy phân lactose người ta nhậnthấy sự ức chế enzym do sản phẩm tạo ra giảm, điều này hữu dụng trong việc cải thiện hiệu suất hoạtđộng của enzym trong công nghiệp

2.1.1.4 ứng dụng của enzym p-galactosidase cố định

2.1.1.4.1 Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum [2]

Sữa được thủy phân lactose được sử dụng cho việc chế biến hưcrag liệu sữa, phômai, và sữa chua Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thực phẩm cũng ngănngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sàn phẩm sữa cô đặc Hơn nữa việc sử dụng sữa đãthủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm tăng quá trình acid hóa, bởi vì thủy phânlactose thường là bước làm chậm tốc độ của quá trình, làm giảm thòi gian đông đặc của sữa chua

và tăng tốc độ phất triển cấu trúc và hương vị cho phó mat Chất lượng của sữa đông lạnh và kemlàm từ sữa cũng được cải thiện đáng kể khi thêm enzym lactase Nó chống

lại sự kết tinh đường lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose và làm giảm cấu trúc

Bàng 2.1: Tóm tắt các phương pháp cố định enzym ịỉ-galactosỉdase

Phương pháp cố định Nguồn P-galactosidase Tác nhân cố định

K fragilis and K lactis Chitosan

A oryzae Phenol-formaldehyde resin

Hấp phụ vật lý B circulans Polyvinyl chloride, Silica gel

B stearothermophilus Chitosan

A niger Porous ceramic monolith

K fragilis Chitosan beads

K lactỉs CPC-silica, agarose

K bulgaricus Alginate using BaCỈ3

E coli Polyacrylamide gel

Bao gói

A oryzae Nylon-6 and zeolite

Thermus aquaticus YT-1 Agarose bead

Pénicillium expansum F3 Calcium alginate

K lactis Poly(vinylalcohol) hydrogel

L bulgarìcus Egg shells

s. anamensỉs Calcium alginate

A nỉger

Magnetic polysiloxane- polyvinylalcohol

cát sạn.

Thủy phân lactose trong whey là một ứng dụng quan trọng khác của ß-galactosidasetrong ngành công nghiệp chế biến sữa Whey thủy phân và cô đặc hay whey thu được qua lọcmàng có thể được sử dụng như chất tạo ngọt trong sản xuất sữo rau quả đóng họp và nước giảikhất

yổ-galactosidase từ nấm (Miles Chemie) được cố định trong gel polyvinyl alcohol

được nhận thấy là bền nhiệt hon so với enzym tự do, giữ được 70% hoạt tính sau 24h ở 50°c và 5% hoạt tính ở 60 °c Thủy phân được 75% lactose trong 5-6h và mức độ chuyển đổi giảm 50% sau 30 lần sử dụng Các nghiên cứu về thủy phân lactose sử dụng enzym cố định ß- galactosidase

(Aspergillus niger) trên nhựa phenol formaldehyde cho thấy nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào thờigian thực hiện quá trình nhưng không phụ thuộc vào nồng độ và sự chuyển đổi lactose Enzym

/?-galactosidase từ A niger thủy phân được 70% lactose trong sữa gầy ở 40°c trong 10 phút.

Enzym ^-galactosidase có nguồn gốc từ nấm cố định trên hydrogel được dùng để thủy phân

whey, sau 7h thủy phân được 70-75% whey Sự cố định enzym yổ-galactosidase từ A niger trên

silica gel đã được kích hoạt, kết quả là hầu hết các chế phẩm enzym cố định sử dụng silica gelđược kích hoạt bằng TÌCI3và FeCỈ3sẽ thủy phân được 81% đến 84% trong dung dịch chứa 4%lactose

Enzym ß-galactosidase từ K lactis được cố định trên CPC-silica (đã được silan hóa và

kích hoạt với glutaraldehyde) và agarose (được kích hoạt bằng tác nhân cyanua) chuyển đổi được90% lactose trong thiết bị phản ứng “packed bed minireactor” yể-galactosidase được nhốt trong

gel đồng polymer hóa N-isopropylacrylamide và acrylamide có hiệu quả trong quấ trình thủy

phân lactose ờ 5°ccho quấ trình sản xuất sửa nghèo lactose Mô hình động học sử dụng cho

enzym yổ-galactosidase từ K lactis cũng được khảo sất Enzym cố định có thể hoạt động ở nhiệt

độ thấp và áp dựng được cho sản xuất các sản phẩm sữa đông lạnh, ngăn chặn sự kết tinh của

lactose, tăng khả năng tiêu hóa và tạo hưcmg vi cho sản phẩm sữa Enzym ß- galactosidase từ K lactỉs cố định trên vải cotton sử dụng glutaraldehyde làm tác nhân liên kết chéo được dùng để

thủy phân lactose toong sữa nguyên kem và chuyển đổi được 95% lactose trong2h toong thiết bịphản ứng gián đoạn, và khi được cố định bằng hên kết cộng hóa trị với polysiloxane-polyvinylalcohol, sử dụng glutaraldehyde như là tác nhân liên kết chéo cho thấy độ hoạt động cao hon và

độ ổn định nhiệt cao hon so với enzym hòa tan Vì thế enzym này được sử dụng có hiệu quả

trong thủy phân lactose từ sữa yổ-galactosidases từ K lactìs cũng được cố định trên viên nang

LentiKats polyvinylalcohol hydrogel dạng thấu kính được

dụng để sản xuất D-galactose từ lactose (200 g L_1) trong một quá trình gián đoạn vừa đường hóavừa lên men đồng thời