Đồ án môn học Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC Bộ MÔN CÔNG NGHỆ THựC PHẨM C5S CQ ỈO ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM YÀ ỨNG DỤNG SVTH : NGUYỄN BẢO Dư MSSV : 60700443 GYHD : TS TRẦN BÍCH LAM TP Hồ Chí Minh, 6/2011 Đồ án môn học NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Chữ ký giáo viên /V 11 ~ Đồ án môn học LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Bích Lam tận tình hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đồ án Cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa TpHCM giảng dạy nhiệt tình truyền đạt kiến thức quý báu giúp hoàn thành đồ án Xin cảm ơn tất bạn bè, người quan tâm, giúp đỡ hoàn thành đồ án Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011 Nguyễn Bảo Dư /V iii ~ Đồ án môn học MỤC LỤC TRANG BÌA i NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vi Chương 1: TỒNG QUAN 1.1 Lịch sử phát triển enzym cố định 1.2 Sơ lược enzym cố định 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Đặc điểm enzym cố định 1.2.3 Ưu nhược điểm enzym cố định 1.2.4 Các phương pháp cố định enzym 1.2.5 Vật liệu cố định 1.2.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến cố định enzyme Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 2.1 ứng dụng công nghệ thực phẩm 2.1.1 Enzym ß-galactosidase 2.1.1.1 Giới thiệu enzym ß-galactosidase 2.1.1.2 Nguồn thu nhận enzym ß-galactosidase 2.1.1.3 Các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase 10 2.1.1.4 ứng dụng enzym ß-galactosidase cố định 13 2.1.1.4.1 Thủy phân lactose sữa lactoserum .13 2.1.1.4.2 Tổng họp Galacto-Ohgosaccharides (GOSs) 16 2.1.2 Enzym lipase 17 2.L2.1 Giới thiệu enzym hpase 17 2.L2.2 Nguồn thu nhận enzym lipase 17 2.1.2.3 Các phương pháp cố định enzym lipase 18 2.1.2.4 ứng dụng enzym lipase cố định công nghệ thực phẩm .20 2.1.2.4.1 ứng dụng lipase cố định tổng họp ester có hương trái 20 2.1.2.4.2 ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất Mên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ 21 2.1.3 Enzym a-galactosidase (raffinase) .23 /V IV ~ Đồ án môn học 2.2 2.1.3.1 Giói thiệu enzym a-galactosidase 23 2.L3.2 Nguồn thu nhận enzym a-galactosidase 23 2.L3.3 Cách phương pháp cố định enzym a-galactosidase 23 2.L3.4 ứng dụng enzym riffinase cố định 26 ứng dụng phân tích 27 2.2.1 Tổng quan cảm biến sinh học (biosensor) .27 2.2.1.1 Giới thiệu cảm biến sinh học 27 2.2.1.2 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học 27 2.2.1.3 Phân loại 28 2.2.1.4 Các yếu tố sinh học 29 2.2.1.4 L .Enzym 29 2.2.1.4.2 Kháng thể 29 2.2.1.4.3 Vi sinh vật 30 2.2.1.5 Bộ chuyển đổi (transducer) 30 2.2.1.5.1 Chuyển đổi điện hóa 30 2.2.1.5.2 Chuyển đổi quang 30 2.2.1.5.3 Chuyển đổi nhiệt 30 2.2.1.5.4 Chuyển đổi tinh thể áp điện (piezoelectric) 30 2.2.2 Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate thực phẩm 31 2.2.2.1 Giới thiệu 31 2.2.2.2 Phương pháp thí nghiệm 31 2.2.2.2.1 Các hóa chất sử dụng 31 2.2.2.2.2 Sự cố định enzym 31 2.2.2.23 Điện cực 32 2.2.2.2A Thử nghiệm 32 2.2.2.2.5 Quá trinh phản ứng 33 2.2.2.2 Ó.Cấu hình nhiệt độ pH 33 2.2.2.23 Xác định giá trị Km Vmax 34 2.2.2.2.8 Sự ổn định màng cố định 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 /V V~ Đồ án môn học DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mô hình biosensor 27 Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD-L-GLDH cố định 32 Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG cặp L-GLOD-LGLDH cố định cảm biến sinh học 33 Hình 2.4: pH nhiệt độ 25 ± °c có mặt 2mM NADPH lOmM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L ’ ’ 34 Hình 2.5: Nhiệt độ pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 34 Hình 2.6: Hoạt túứi enzym cố định cảm biến sinh học thời gian 60 ngày: LGLOD 25U-L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U-L-GLDH 35U; L-GLOD 25U 35 DANH MỤC BẢNG • Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm phưorng pháp cố định enzyme Bảng 2.1: Tóm tắt phưcmg pháp cố định enzym P-galactosidase 13 Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng kỹ thuật cố định khác 15 Bảng 2.3: Nguồn vsv thu nhận enzym lipase tứứi chất enzyme lipase 18 Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Chương 1: 1.1 TỔNG QUAN Lịch sử phát triển enzym cố định [1] - Năm 1916, Nelson Griffin quan sát cho thấy enzym invertase nấm men (EC.3.2.1.2.6) hấp thụ vào than có khả thủy phân đường saccharose Sau ữên giới xuất nhiều báo cáo khả cố định enzym liên kết đồng hóa trị chất mang Trước năm 1953 chưa có nghiên cửu enzym không hòa tan ứng dụng vào thực tế - Năm 1953, Grubhofer Schleith cố định số enzym carboxy peptidase, diastase, pepsin ribonuclease polyaminostyrene liên kết đồng hóa trị nghiên cửu bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot - Năm 1954, Chang tạo vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng đưa enzym vào thể - Năm 1963, Bemfeld Wan thí nghiệm thành công việc nhốt enzym amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide - Năm 1964, Quiociio Richards mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde Cũng năm Chang triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase - Năm 1969, Wilson xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose glucoamylase cố định - Năm 1969, Chibata người cộng tác công ty Tanabe Seiyaku - Nhật người thực thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp Theo phương pháp cố định enzym tác giả người Nhật, enzym aminoacylase nấm sợi gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion sử dụng chúng cho trình thủy phân - Năm 1970, Mosbach tiến hành cố định ba loại enzym: P-galactosidase, hexokinase, glucophosphatase hên kết cộng hóa trị với hạt sephadex - Năm 1971, Gregoriadis triển khai liposome có chứa amyloglucosidase - Năm 1973, Chibata cộng tác viên người thành công việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate gel acrylamid Tế bào E.coli chứa gel có hoạt tính aspartate cao - Đến năm 1987, công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, tiến hành sản xuất sữo fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp Cho đến cổ khoảng 4,5 triệu sừo fructose sản xuất theo phưong pháp enzym cố định - Ngoài sàn phẩm trên, enzym cố định ứng dụng nhiều công nghệ lên men, /V Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học chống ô nhiễm môi trường y học 1.2 Sơ luợc enzym cố định 1.2.1 Định nghĩa [1] Enzym cố định hiểu theo nghĩa: - Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan enzym đưa vào pha riêng rẽ, pha tách riêng vói môi trường dung dịch phàn ứng Pha enzym không hòa tan nước gắn với polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn - Nghĩa rộng: cắc chất xúc tác cố định enzym, tế bào, thể sống trạng thái cho phép sử dụng lại Như vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm enzym cố định vào chất mang, enzym có tế bào sống, chúng cố định bình phản ứng sinh học có gắn kết vào chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần - Enzym không hòa tan hay enzym cố định thường enzym hòa tan gắn vào chất mang nhiều kỹ thuật khác Nhờ quấ trình gắn mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan 1.2.2 Đặc điểm enzym cố định [1] Enzym cố định có đặc điểm sau: - Hoạt tính enzym cố định thường nhỏ hoạt tính enzym tự loại Sở dĩ có thay đổi hoạt tính riêng enzym cố định nguyên nhân sau: • Do ảnh hưởng điện tích chất mang: điện tích chất mang có khác biệt với điện tích enzym gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian enzym có thay đổi mức độ định Chính thay đổi cấu trúc mà kết họp enzym chất đi, dẫn đến hoạt tính chứng giảm • Do enzym bị nhốt vào mạng lưới bị liên kết chất mang khiến cho tiếp xúc enzym chất bị - Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis - Menten có số sai khác định: • Có thể xảy cạnh tranh chất với enzym chất mang • Xảy tượng cản trở khuếch tán chất sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng - Enzym cố định thường có tính bền nhiệt enzym tự nhờ có tác dụng che chở chất mang - Enzym cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzym tự loại - Enzym cố định có chất mang che chắn nên bảo vệ tốt enzym tự - Enzym cố định tái sử dụng nhiều lần dễ dàng tách khỏi chất cách dễ /V 2~ Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học hiệu suất trung bình đạt 14,01%, giảm nhẹ tăng thòi gian phàn ứng với Còn phản ứng thực thiết bị CSTR hiệu suất trung bình suất tương ứng 14.34% 1.07 X 10-2 g MAG/U.ngày 2.1.3 Enzym a-galactosidase (raffînase) 2.1.3.1 Giới thiệu enzym a-galactosỉdase [15] a-D-Galactosidase (a-D-galactoside galactohydrolase EC 3.2.1.22) có mặt rộng rãi vsv, thực vật động vật Nhìn chung, a-galactosidase thủy phân giải phóng galactose tự từ galactosyl-sucrose oligosaccharide tự nhiên raffinose stachyose agalactoside khác galactolipid galactoprotein Tuy nhiên, loài động vật người khả tổng họp đầy đủ a-DGalactosidase hệ thống đường ruột để thủy phân a-galactoside, cụ thể oligosaccharide thuộc họ Raffinose đậu nành loài đậu khác Vì thế, vào đến ruột già galactose-oligosaccharide bị vi sinh vật lên men gây chứng đầy hoi Do đó, việc loại bỏ oligosaccharide đậu nành loại đậu khấc làm tăng giá trị dinh dưỡng khả tiêu thụ sản phẩm đậu 2.1.3.2 Nguồn thu nhận enzym a-galactosidase [15] Enzym a-galactosidase thu nhận từ nhiều nguồn khác động vật, thực vật vi sinh vật Trong enzym thương mại thường sản xuất từ hai nguồn: hạt cà phê xanh (green coffee bean) Aspergillus niger Ngoài ra, người ta nghiên cửu thu nhận a-galactosidase từ loài vi sinh vật như: Thermus sp T2, Gibberella fujikuroi, Bacillus stearothermophilus, Streptomyces grìseoloalbus, Streptomyces griseoloalbus, Pénicillium sp., Talaromyces flavus, Thermomyces ỉanuginosus, 2.1.3.3 Cách phương pháp cố định enzym a-galactosidase Cố đinh a-ealactosidase bans phương pháp bao eói Enzym a-galactosidase từ Aspergillus oryzae cố định theo phương pháp Ates Mehmetoglu ml dung dịch sodium alginate (3.75%) trộn với ml dung dịch enzym để tạo thành dung dịch đồng chửa 3% alginate Hỗn họp sau tạo giọt cách nhỏ giọt kiêm tiêm vô trùng vào dung dịch CaCỈ2 0,2M 4°c để tạo hạt Các hạt làm cứng dung dịch CaCỈ2 2h Các hạt hình cầu tạo thành rửa nước cất bảo quản dung dịch đệm acetate 0,2M (pH 4.8) 4°c Glutaraldehyde sử dụng làm tác nhân liên kết chéo để cố định enzym a-galactosidase Hạt calcium alginate xử phút 5ml với 1% glutaraldehyde Các hạt lọc rửa nước vô trùng sau bảo quàn 4°c đem sử dụng Enzym a- galactosidase cố định gel alginate 3% bị ~ 23 Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học 54,5% hoạt tính so vói enzym tự Ä'max Vmax enzym cố định với chất raffinose 5.5mM O.lSUml-1 Nhiệt độ tối ưu enzym cố định 57°c pH tối ưu 4,5 Enzym hòa tan giữ 92% 88% hoạt tính sau 8h 12h, enzym cố đinh giữ 94% 92% [15] Enzym a-galactosidase từ G fujikuroi cố định gel polyacrylamide theo phương pháp Thanunkul et al 712,5 mg acrylamide 37,5 mg N,N’-methylene- bisacrylamide thêm vào 10ml dung dịch enzym a-galactosidase thô Sau đó, dưng dịch khí chân không thêm 20 mg ammonium persulphate 50 ml TEMED (NNN’N’-tetramethy-lethylene diamine) Sau polymer hóa hạt gel thu có chứa enzym a-galactosidase cho qua rây 1000 pm rửa vài lần nước pH tối ưu enzym a-galactosidase hòa tan 5,8, pH tối ưu enzym cố định nằm khoảng 5,2-5,6 Trong khoảng pH 4,0 6,3 enzym cố định enzym hòa tan có hoạt tính 90% Hoạt tính enzym tự giảm zero nhiệt độ 65°c, nhiệt độ enzym cố định có hoạt tính 50% Nhiệt độ tối ưu hầu hết enzym agalactosidase khoảng 37°c 40°c Sau 24h, enzym tự enzym cố định giữ 44% 36% hoạt tính, sau ngày enzym tự chi giữ 6% hoạt tính ban đầu enzym cố định giữ 17% hoạt tính ban đầu [16] Cố đinh a-ealactosidase bằne phươne pháo liên kết cone hóa trì Enzym hexameric a-galactosidase từ Thermus sp chủng T2 (khối lượng phân tử 320 kDa) có hoạt tính cao dãy điều kiện hoạt động rộng pH 5.0-10.0, nhiệt độ tối ưu xung quanh giá trị 70°c pH 7.0, điểm đẳng điện 5.5 số lượng phân tử Lys tiểu đơn vị 10 [17] Liên kết cộng hóa trị đa điểm kỹ thuật cố định đồng thời vị trí tương đối vài nhóm enzym sử dụng chất mang rắn có nhóm hoạt hóa sử dụng tác nhân Hên kết chéo, điều tăng cường đáng kể tính ổn định enzym Các cách thức cố định đáp ứng cho yêu cầu tạo thành Hên kết cộng hóa trị đa điểm: Glyoxyl agarose: cho phương pháp hữu ích toong việc tạo Hên kết cộng hóa trị đa điểm Chất mang cố định protein trực tiếp điểm ổn định thấp dạng Hên kết imine aldehyde amine Theo phương pháp này, tốc độ cố định phụ thuộc vào mật độ aldehyde bề mặt chất mang mật độ Lys bề mặt enzym Vì phân tử enzym cố định Hên kết cộng hóa trị đa điểm trước hết khu vực có mật độ Lys cao [17] Glutaraldehyde: hoạt chất mà sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: sử dụng tiền hoạt hóa chất mang diễn trình trao đổi ion enzym, hấp phụ enzym chất mang amin hóa xử lí thêm enzym hấp phụ với glutaraldehyde để tạo liên kết chéo enzym chất mang Trong cà hai trường họp, cuối enzym gắn chất /V 24 ~ Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học mang nhóm Lys hầu hết bề mặt tích điện âm bước có trao đổi ion [17] Chất mang có chứa nhóm epoxy: chất mang phản ứng với nhiều nhóm khấc chất mang amino, thiol, hydroxyl, imidazole, carboxylic Tuy nhiên khả phản ứng enzym chất mang thấp nên chế quấ trình cố định thông qua bước: trước tiên hấp phụ enzym chất mang, sau phản ứng cộng hóa trị nhóm cấc chất mang nhóm epoxy chất mang hấp phụ enzym [17] Một lượng khoảng 10g chất mang khác (Sepabeads®-EC-EP, Sepabeads®aminoepoxy-ECHFA, glyoxyl-agarose, MANAE-agarose or MANAE-agarose preactivated with glutaraldehyde) dạng huyền phù 20ml dung dịch đệm potassium phosphate 25mM có pH 7.0 chứa IU/ml enzym a-galactosidase Trong trường họp Sepabeads®-EC- EP, enzym ủ dung dịch đệm sodium phosphate IM có pH 7.0 sử dụng chất mang glyoxyl trình thực dung dịch đệm sodium carbonate lOOmM có pH 10.05 Trong trường họp, hệ huyền phù khuấy nhẹ 25°c Các dẫn xuất ổn định hầu hết thu cách cố định enzyme glutaraldehyde- agarose, chế phẩm enzym có hoạt tính cao (95%) Trong đó, dẫn xuất thu cách sử dụng amino-epoxide-Sepabead có hoạt tính thấp 10% [17] Việc cố định a-galactosidase sử dụng glutaraldehyde chất mang amin hóa xảy theo hai cách Cách thứ sử dụng chất mang amin hóa tiền hoạt hóa với glutaraldehyde Cách thứ hai, trước hết hấp phụ enzym lên chất mang amin hóa sau xử lí với glutaraldehyde Với cách thứ nhất, enzym trao đổi ion với chất mang, cuối xử lí với glutaraldehyde 0.5% (v/v) độ ổn định thu cao phương pháp thứ hai Trong đó, phương pháp thứ hai, trình hấp phụ diễn nhanh giữ 90% hoạt tính, việc xử lí với glutaraldehyde 0.5% không ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme [17] Nhiệt độ tối ưu enzym tự 65°c pH 7.0, nhiệt độ tối ưu enzym cố định 70°c Ở 80°c, chế phẩm tối ưu có hoạt tính lại gấp lần hoạt tính cồn lại enzym hòa tan (72% so với 40%) Điều cho thấy độ ổn định nhiệt enzym cố /V 25 Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học định cao hom enzym hòa tan Mặt khác, pH tối ưu enzym không thay đổi sau cố định, pH tối ưu 25°c 4-5 [17] 2.I.3.4 ứng dụng enzym rifflnase cố định Các loại đậu đóng vai trò quan trọng chế độ ăn truyền thống nhiều vùng giới thực tế chúng có chất béo nguồn protein, xơ vi chất dinh dưỡng tuyệt vời Nguồn isoflavone đậu nành nhận ý với vai trò tiềm việc điều trị ung thư loãng xương Hơn nữa, sữa đậu nành xem nguồn thay chi phí thấp cho sữa bò nước phát ữiển bổ sung chất dinh dưỡng không dung nạp lactose cho trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Tuy nhiên, cấc sản phẩm thực phẩm làm từ đậu có chứa nhiều yếu tố kháng dinh dưỡng, số họ đường Raffmose oligosaccharide Niêm mạc người dày loài động vật thiếu enzym a- galactosidase cần thiết cho thủy phân oligosaccharide Vì thế, vào đến già oligo-saccharide bị vi sinh vật lên men gây chứng đầy Do đó, việc loại bỏ oligo-saccharide từ thực phẩm làm từ đậu nành yếu tố quan trọng việc cải thiện giá trị dinh dưỡng chúng Việc thủy phân họ đường raffinose tiến hành thiết bị phản ứng gián đoạn hay hên tục [15] Trong thiết bị phản ứng gián đoạn, người ta tiến hành ủ enzym a-galactosidase cố định từ Aspergillus oryzae chất mang calcium alginate sữa đậu nành thời gian khác 2, 4, 12h, cho kết thủy phân oligo-saccharide tương ứng 74%, 78%, 79% 81% Với kết ta thấy hiệu suất thủy phân 2h 74% việc kéo dài thời gian không làm tăng đáng kể hiệu suất [15] Quấ trình loại bỏ oligo-saccharide liên tục tiến hành thiết bị “fluidized bed reactor” Ở 50°c, hiệu suất thủy phân oligo-saccharide 90%, 78%, 74%, 52% 35% tương ứng vói tốc độ dòng chảy 40, 80, 120, 160 200ml.1T1 Những kết cho thấy với tốc độ dòng 40ml.1T1 hiệu suất thủy phân đạt cao 90% Qua cho thấy tốc độ dòng chảy tối ưu thông số quan trọng ảnh hưởng đến hiệu hoạt động thiết bị “fluidized bed reactor” [15] Ngoài ra, enzym a-galactosidase thu nhận từ G fujikuroi M vinacea cố định gel polyacrylamide cho việc loại bỏ oligo-saccharide từ đậu nành pH sửa đậu nành 6.2-Ó.4 pH tối ưu a-galactosidase cố định từ G fujikuroi 5.2-5.6 giữ 90% hoạt tính pH 6.4 Trong pH tối ưu a-galactosidase cố định từ M vinacea 4.0-4.5, phải hạ thấp pH tiến hành phản ứng, pH thấp /V 26 ~ Chương 2: ứng dụng Đồ án môn học làm cho protein sữa đậu nành bị kết tủa làm cho sữa cố vị chua Do đỗ, a- galactosidase cổ định từ G fujikuroi lựa chọn tốt việc xử lí sữa đậu nành [16] 2.2 ứng dụng phân tích 2.2.1 Tổng quan cảm biến sinh học (biosensor) 2.2.1.1, Giới thiệu cảm biến sinh học [18] Cảm biến sinh học (biosensor) thiết bị tích hợp cố khả cung cấp thông tin phân tích định lượng bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bỉoreceptor) kết hợp trực tiếp với phần tử chuyển đổi (International Union of Pure and Applied Chemistry) Cảm biến sinh học thiết bị sử dụng tác nhân sình học enzym, kháng thể, để phát hiện, đo đạc phân tích hoá Sample chất Do cấu tạo cảm biến analyte sinh học bao gồm thành phần bản: thành phần hoá học, thành Bioreceptors phần sình học thành phần vật lý Transducer ImimobitìSệci enzymes, Microorganisms n Signal Flectrocliemical Paten t iữmet ry amperometry Optical: Absorption, Microelectronics Flu óresceriee, reflection Imanunõacie n1s DNA, whole cells Piöi2TÖölöCtfiO Data processing Hình 2.1: Mô hình biosensor 2.2.I.2 Lịch sử phát triển căm biến sinh học [18] Giáo sư Leyland D.Clark biết người tiẽn phong lĩnh vực cảm biến sinh học Năm 1956, ông công bố báo điện cực oxy hoá Những năm ông tiếp tục thực nhiều thí nghiệm nhằm cổ gắng mở rộng khả hoạt động cảm biến phát thêm nhiều tác nhân, nâng cao độ xác cảm biến Vào năm 1962, hội nghị New York Academy of Science, ông thuyết trình cảm biến sinh học: ‘Tớ make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or conductometricị more intelligent by adding enzyme transducers as membrane enclosed sandwiches” Cảm biến sình học theo mô hình D.Clark bao gồm điện cực oxy hóa, có màng giữ enzyme glucose oxidase cổ định Khỉ mật độ glucose môi trường phản ứng 27 Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học giảm mật độ chất oxi hóa bề mặt điện cực giảm cách tương ứng Dựa thay đổi đó, Clark phát thay đổi nồng độ glucose môi trường cần kiểm tra Những năm tiếp theo, nhóm Guilbault Montalvo lần công bố chi tiết chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa điện cực chứa enzyme đo điện thế, cảm biến đo nồng độ urê điện cực chọn lọc ion NH4+, có gắn màng cố định urease TT_ Urease T T _ _ _ ,.TTT+ Urea -— ► HCO3 + NH Năm 1975, Lubber Opitz mô tả cảm biến sợi quang (fiber-optic sensor) gắn chất thị dùng để đo nồng độ CO2 O2 Cũng vào năm 1975, số vi khuẩn sử dụng thành phần sinh học fren điện cực vi sinh để đo nồng độ cồn Năm 1975, công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần biến ý tưởng Clark thành thực thông qua việc thương mại hóa cảm biến sinh học Sản phẩm thiết bị phân tích glucose dựa hydrogen peroxide cột mốc đánh dấu xuất cảm biến sinh học đời sống _ Glucose oxidase ß- D- Glucose + O2 ► D - Gluconic acid + H2O2 Yào năm 1982, Shichiri đồng nghiệp báo cáo mô tả cảm biến “glucose in vivo”, loại cảm biến dạng kim cho xét nghiệm da Cùng với phát triển nhanh chóng khoa học công nghệ, đặc biệt cấc ngành công nghệ vật liệu nano công nghệ thông tin, cảm biến sinh học đạt tiến vượt bậc, hứa hẹn đưa vi thiết bị nhằm xác định nhanh, xác loại vi khuẩn, virus gây bệnh Các thiết bị dò tìm hay phân tích lượng mẫu nhỏ (cỡ vài nM) vói độ tin cậy cao 2.2.I.3 Phân loại [19] Cảm biến sinh học phân loại dựa vào thành phần sinh học thành phần chuyển đổi chúng Thành phần sinh học chúng bao gồm enzym, kháng thể, vi sinh vật, mô sinh học bào quan - Khi liên kết yếu tố cảm biến chất cần phân tích biến cố phất (detected event) gọi cảm biến lực (affinity sensor) - Khi có tương tác yếu tố sinh học chất cần phân tích kèm theo sau thay đổi nồng độ chất sản phẩm gọi cảm biến trao đổi chất (metabolism sensor) /V 28 Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học - Khi tính hiệu tạo sau liên kết chất cần phân tích yếu tố sinh học thay đổi hóa học yếu tố sinh học cảm biến gọi cảm biến xúc tác (catalytic sensor) 2.2.I.4 Các yếu tố sinh học 2.2.1.4.1 Enzym [19] Như biết enzym protein có hoạt tính xúc tác cao đặc hiệu cao chất Chúng sử dụng để kiểm soát phân tích nồng độ nhiều chất cần phân tích khấc Các chế phẩm enzym có sẵn thị trường với độ tinh khiết cao điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất cảm biến sinh học dùng enzym cố định Bên cạnh đó, hạn chế enzyme pH, lực ion, chất kìm hãm, nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính enzym Hầu hết enzym hoạt tính nhiệt độ 60°c Cấc enzym sử dụng để chế tạo biosensor enzym oxy hóa, sử dụng oxy hòa tan sản xuất hydrogen peroxide Enzym cố định chuyển đổi (transducer) phương pháp hấp phụ, liên kết cộng hóa trị, phương pháp bao gói khuôn gel, polymer phát sinh điện hóa (electrochemically generated polymer), màng lipid kép (bilipid membrane) dung dịch bên màng chọn lọc Enzym thường ghép thành đôi với chuyển đổi điện hóa chuyển đổi sợi quang học 2.2.1.4.2 Kháng thể [19] Kháng thể có chất cấc glycoprotein, tế bào lympho B tương bào (biệt hổa từ lympho B) tiết để hệ miễn dịch nhận biết vô hiệu hóa tấc nhân lạ, chẳng hạn vi khuẩn virus Mỗi kháng thể nhận diện epitope kháng nguyên Nhiều kháng thể thương mại hóa sử dụng rộng rãi xét nghiệm miễn dịch Các kháng thể cố định bề mặt chuyển đổi theo phương pháp liên kết cộng hóa trị sử dụng nhóm chức amino, carboxyl, aldehyde sulfhydryl Cấc mặt hạn chế sử dụng kháng thể giống sử dụng enzym Hơn muốn tái tạo phục hồi bề mặt chuyển đổi cần phải có điều kiện pH thấp, lực ion lớn, chất làm sạch, Ưu điểm cảm biến kháng thể khả phân tích nhanh xét nghiệm miễn dịch truyền thống Cảm biến miễn dịch thường sử dụng chuyển đổi quang học hay âm học 2.2.I.4.3 Vi sinh vật [19] Việc sử dụng vi sinh vật yếu tố sinh học thiết bị cảm biến sinh học dựa trình trao đổi chất chúng Trong hầu hết trường hợp, người ta đo thay đổi điện hóa học tế bào sử dụng oxy CO2 Tế bào vi sinh vật có lợi rẻ so với enzym kháng thể, ổn định sử dụng phản ứng phức hợp có tham gia enzym cofactor Tuy nhiên, /V 29 ~ Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học phương pháp có tính chọn lọc so với phương pháp sử dung enzym, có thời gian đáp ứng, thời gian phục hồi dài đòi hỏi phải thường xuyên tiến hành hiệu chỉnh Chất mang thường dùng để cố định nylon, màng cellulose nitrate, acetyl cellulose 2.2.I.5 Bộ chuyển đổi (transducer) 2.2.1.5.1 Chuyển đổi điện hóa [19] Bộ chuyển đổi dòng điện chuyển đổi điện áp dùng phổ biến thiết bị cảm biển sinh học kiểu điện hóa Hầu hết, điện cực làm kim loại bạch kim, vàng, bạc, thép không gỉ vật liệu carbon Những vật liệu phải trơ điện mà phản ứng điện hóa xảy 2.2.1.5.2 Chuyển đổi quang [19] Chuyển đổi quang chuyển đổi hoạt động dựa cấc hiệu ứng như: hấp thụ ánh sáng nhìn thấy tia UV; phát xạ huỳnh quang lân quang; bio-luminiscence; chemi- luminiscence Bộ chuyển đổi quang học loại đầu dò mà đỉnh cố định enzym chất màu (thường huỳnh quang) Những loại đầu dò chứa hai sợi quang Một sợi nối với nguồn sáng phất dãy bước sóng khác nhau, sợi nối với diot quang để phát thay đổi mật độ quang bước sóng thích họp 2.2.1.5.3 Chuyển đổi nhiệt [19] Hoạt động dựa tượng thay đổi entanpi hình thành phá vỡ liên kết hóa học phản ứng enzyme Bộ chuyển đổi có ưu điểm hoạt động tốt với tất cấc phản ứng Tuy nhiên, dạng chuyển đổi có tính chọn lọc thấp 2.2.1.5.4 Chuyển đổi tinh thể áp điện (piezoelectric) [19] Chuyển đổi hoạt động dựa nguyên lý: tinh thể thay đổi tần số dao động lực tác dụng lên thay đổi Chuyển đổi dạng có ưu điểm độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian phản ứng nhanh, khả động cao, sử dụng đo đạc môi trường lỏng khí 2.2.2 Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate thực phẩm 2.2.2.1 Giới thiệu [20] Glutamate amino acid xác định nguồn lượng nguồn Nitơ quan trọng cho tế bào nhân thật tế bào loài động vật có vú Nó hoạt động chất dẫn truyền kích thích thần kinh hệ thống thần kinh trung ương cho chịu trách nhiệm cho số trình học tập, trí nhớ, phát triển hệ thần kinh Việc tăng mức độ glutamate dịch não tủy cho nguyên nhân chứng rối loạn thần kinh bệnh đột quỵ, bệnh Alzheimer’s bệnh Parkinson’s Ngoài ra, monosodium glutamate sử dụng phổ /V 30 ~ Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học biến làm chất tăng cường hương vi thực phẩm Do đó, việc phát triển thiết bị đo lường hàm lượng glutamate cách nhanh chóng đáng tin cậy vấn đề quan trọng cần xem xét nghiên cứu Một vài kỹ thuật khối phổ, điện mao dẫn, microdialysis cảm biến sinh học phất triển để phân tích glutamate Trong số phương pháp đó, cảm biến sinh học phương pháp quan tâm phất triển nhanh Một vài loại cảm biến sinh học sử dụng chuyển đổi dòng điện chế tạo để phát glutamate ứng dụng khác chế biến thực phẩm, tế bào nuôi cấy, dịch não ngoại bào (extracellular brain fluid) Cấc cảm biến sinh học có độ nhạy khả chọn lọc cao, cần có bước xây dựng phức họp để chuẩn bị điện cực enzym Không giống với cấc cảm biến sinh học dạng chuyển đổi dòng điện, cảm biến sinh học loại chuyển đổi quang học chế tạo đơn giản hơn, dễ sử dụng phất chỗ 2.2.2.2 Phương pháp thí nghiệm 2.2.2.2.1 Các hóa chất sử dụng [20] Enzym L-glutamate oxidase (L-GLOD) (EC 1.4.3.11, 63Ư/mg protein từ Streptomuces sp.), enzym L-glutamate dehydrogenase (L-GLDH) ((EC 1.4.1.3, 452U/mg protein từ Proteus sp.), NADPH, màng polycarbonate (kích thước lỗ 0.4 pm), dung dịch đệm cấc loại dung dịch khác 2.2.2.2.2 Sự cố định enzym [20] Người ta sử dụng dung dịch đệm phosphate saline (PBS, pH 7.0) cổ chứa đồng thời hai enzym Enzym L-GLOD L-GLDH trộn sau tạo liên kết chéo với màng polycarbonate 20pl dung dịch glutaraldehyde 25pl bovine serum albumin (BSA) sử dụng để nâng cao hiệu suất ổn định cho cảm biến Hỗn họp enzym chuẩn bị vói hàm lượng khác vói L-GLDH (35-143.2U) L-GLOD giữ cố định /V 31 Chương 2: ửng dụng Đô án môn học \ giá trị 25U Sau đó, 10 J0.1 sử dụng để cố định Màng polycarbonate sau cố định rửa vài lần dung dịch PBS để loại glutaraldehyde dư thừa enzym không tạo liên kết L-GLOD + L-GLDH với màng Màng chứa enzym bảo quản 4°c dung dịch PBS chửa túi polypropylene kín khí 2.2.2.2.3 Điện cực [20] Điện cực vói đường kính lcm sử dụng dung dịch KC1 chất điện phân, điện cực dưong làm bạc, điện cực âm làm vàng Điện cực oxy phủ lớp polypropylene kị nước (để bảo vệ điện cực nước) cho khí thấm qua lớp enzym màng polycarbonate (kích thước lỗ 0.4|im) gắn điện cực hệ thống “push cap” Để phân tích, người ta sử dụng dung dịch đệm bảo hòa không khí với nồng độ oxy 7-8 ppm 25°c Dung dịch đệm loại oxy dung dịch sodium sulfite Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD—L-GLDH cổ định 2.2.2.2A Thử nghiệm [20] Đầu dò phân cực khoảng 30-40 phút lần trước sử dụng Việc thử nghiệm bắt đầu cách thêm MSG nồng độ khác Lượng oxy tiêu thụ đo sau phút Để khôi phục lại độ bảo hòa oxy 100%, màng cố định enzym rửa vài lần với PBS trước tiến hành lần thử nghiệm Sự khuếch tán oxy từ không khí làm giảm hiệu quấ trình thử nghiệm thực với enzym dung dịch, để khắc phục vấn đề người ta tiến hành thử nghiệm thiết bị phản ứng kín khí thủy tinh (12mL) Người ta tiến hành thí nghiệm ba trường họp với nồng độ MSG khác nhau: - • : Không tái sinh chất vắng mặt 2mM NADPH lOmM ammonium - A :CÓ tái sinh chất có mặt 2mM NADPH - ♦ :CÓ tái sinh chất có mặt 2mM NADPH lOmM ammonium ~ 32 ~ Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học Người ta tiến hành tối ưu nồng độ NADPH ammonium nhận thấy giá trị đáp ứng cho ổn định cao 2mM NADPH lOmM ammonium Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG cặp L-GLOD-LGLDH cổ định cảm biến sinh học 2.2.2.2.5 Quá trình phản ứng [20] L-glutamate + H2O ^ ^"^»ả-Ketoglutarate + NH3 (1) Phản ứng (1) xảy có mặt MSG, trình tái sinh chất không xảy mặt NADPH, NADPH hoạt động cofactor L-GLDH 0.1mg/L nồng độ giới hạn phát phương trình (1) NADP NADPH Với có mặt 2mM NADPH MSG hai enzym hoạt động MSG tái sinh phản ứng (2) MSG chuyển đổi thành a-ketoglutarate phản ứng thứ chất phản ứng thử (2) Việc bổ sung NADPH vào môi trường phản ứng tạo điều kiện cho L- GLDH thực phản ứng nghịch Việc nhận biết L- glutamate cung cấp khuếch đại giới hạn phát xác định 0.04mg/L Sự khuếch đại túi hiệu cao nhận thấy có mặt ammonium-một sản phẩm phụ phản ứng (1) giói hạn nồng độ phất 0.02mg/L 2.2.2.2.Ổ Cấu hình nhiệt độ pH [20] Cảm biến hoạt động tốt khoảng pH 4-10 (pH dung dịch đệm citrate- phosphate: 4, 5, 6; sodium phosphate: 7,8; glycine-NaOH: 9, 10) đo nồng />/ 33 Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học độ dung dịch MSG 1.2mg/L với cổ mặt 2mM NADPH lOmM ammonium pH tối ưu cảm biến 7.0 nhiệt độ 25±2 °c, pH tối ưu GLDH khoảng 8.25 pH tối ưu GLOD khoảng 8.0 Cảm biến hoạt động tốt khoảng nhiệt độ (13±2 đến 55±2 °C) đo nồng độ MSG 1.2mg/L Cảm biến hoạt động tốt nhiệt độ 25±2 °c, sau giá trị cảm biến bị hoạt tính bị vô hoạt bời nhiệt độ Hình 2.4: pH nhiệt độ 25 ±2 °c có mặt 2mM NADPH lOmM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L Hình 2.5: Nhiệt độ pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 2.22.2.1 Xác định giá trị Km Y max [20] Giá trị Km xác định cho cặp L-GLOD-LGLDH giống cho LGLOD Vận tốc ban đầu phản ứng hàm số nồng độ chất theo động học ‘MichaelisMenten’ Km Vmax xác định theo phương pháp Lineweaver-Burk Giá trị Km biểu kiến xác định 0.445 lmM với có mặt 2mM NADPH lOmM ammonium vmaxxảc định điều kiện 3.07mg/(L.min) Giấ trị Km Vmax biểu kiến điều kiện không tái sinh chất (chỉ có L-GLOD hoạt động) tương ứng 1.9222mM 13.245mg/(Lmin) so với Km L-GLOD dạng tự 0.21 mM Vì thế, cặp L-GLOD-LGLDH sử dụng giá trị Km tăng xấp xỉ />/ 34 ~ Chương 2: ứng dụng Đồ án môn học lần, khỉ sử dụng chì L-GLOD giá trị K,n tăng hom lần Giá trị Km cao hom thu khỉ cố định enzym lực enzym với chất giảm, cỗ thể ttở trung tâm hoạt động enzym trình cổ định 2.2.2.2.8 Sự ổn định màng cế định [20] Sự ổn định củã màng phẫn tích chu kì 60 ngày Màng chứa enzym bảo quản dung dịch đệm phosphate 0.2M, pH 7.0, nhiệt độ 4°c tui polypropylene km khí Quá trình phân tich thực mễi ngày lần với 0.8mg/L MSG Màng chứa cặp enzym LGLOD-L-GLDH giữ 80% hoạt tính ban đầu sau 30 ngày ứng với GLOD= 25U; GLDH= 35Ư 39 ngày ứng với GLOD= 25Ư; GLDH= 143.2Ư với diện 2mM NADPH lOmM ammonium Trong khỉ đỗ, màng chì cố định enzym L- GLOD (25U) giữ 80% hoạt tính ban đầu chí sau 48 ngày Hình 2.6: Hoạt tính enzym cổ định cảm biến sinh học thời gian 60 ngày: A L- GLOD 25U-L-GLDH143 2U; m L-GLOD 25U-L-GLĐH 35U; ÌL-GLOD 25U Trong nghiên cứu gần đây, người tã nhận thấy lượng nhỏ GLDH không trì hoạt tính enzym, điều cố thể vô hoạt rò rỉ enzym Sự ổn định biosensor trình bảo quăn cao khỉ hoạt độ GLDH 143.2U GLOD 25Ư 35 Tài liệu tham khảo Đồ án môn học TÀI LIỆU THAM KHẢO Wolfgang Aehale, Enzymes in Industry, Copyright © 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGa, Weinheim Parmjit s Panesar, Shweta Kumari, and Reeba Panesar, Potential Applications of Immobilized p-Galactosidase in Food Processing Industries, SAGE-Hindawi Access to Research, Enzyme Research, Volume 2010, Article ID 473137, 16 pages M.L Foresti, M.L Ferreha, Chito san-immobilized lipases for the catalysis of fatty acid esterifications, Enzyme and Microbial Technology 40 (2007) 769-777 Yin Hoon Chew, Lee Suan Chua, Kian Kai Cheng, Mohamad Roji Sarmidi, Ramlan Abdul Aziz, Chew Tin Lee, Kinetic study on the hydrolysis of palm olein using immobilized lipase, Biochemical Engineering Journal 39 (2008) 516-520 K.N Kilcawley, M.G Wilkinson,P.F.Fox, Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations from microbial or animal sources, Enzyme and Microbial Technology 31 (2002) 310-320 G.D Haki, S.K Rakshit, Developments in industrially important thermostable enzymes: a review, Bioresource Technology 89 (2003) 17-34 V Ramachandra Murty*, Jayadev Bhat, and P K A Muniswaran , Hydrolysis of Oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: A Review, Biotechno Bioprocess Eng 2002, 7: 57-66 José M Palomo, Gloria Munoz, Gloria Fernandez-Lorente, Cesar Mateo, Roberto Fernândez-Laiuente*, José M Guisấnl, Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl-Sepabeads) immobilization, hyperactivation and stabilization of the open form of lipases, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 19-20 (2002) 279-286 S.-W Chang, J.-F Shaw, K.-H Yang, S.-F Chang, C.-J Shieh, Studies of optimum conditions for covalent immobilization of Candida rugosa lipase on poly(c-glutamic acid) by RSM, Bioresource Technology 99 (2008) 2800-2805 10 Dasciana s Rodrigues, Adriano A Mendes, Wellington s Adriano, Luciana R.B Goncalves,Raquel L.c Giordano, Multipoint covalent immobilization of microbial Upas on chitosan and agarose activated by different methods, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 51 (2008) 100-109 /V 36 ~ Do an mon hoc Tài liệu tham khảo ll.Seema S.Betigeri, Steven H.Neau, Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads, Biomaterials 23 (2002) 3627-3636 12 Keehoon Won, Sangbum Kim, Kwang-Je Kim, Hong Woo Park, Sang-Jin Moon, Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads, Process Biochemistry 40 (2005) 2149-2154 13 Paramita Mahapatra, Annapurna Kumari, Vijay Kumar Garlapati, Rintu Banerjee, Ahindra Nag, Enzymatic synthesis offruit flavor esters by immobilized lipase from Rhizopus oligosporus optimized with response surface methodology, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 14 Wiphum Kaewthong, Sarote Sirisansaneeyakul, Poonsuk Prasertsan, Aran H-Kittikun, Continuous production of monoacylglycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase, Process Biochemistry 40 (2005) 1525-1530 15 S.J Prashanth, V.H Mulimani, Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzae-galactosidase immobilized in calcium alginate, Process Biochemistry 40 (2005) 11991205 16 S Thippeswamy, V.H Mulimani, Enzymic degradation of raffinose family oligosaccharides in soymilk by immobilized a-galactosidase from Gibberella fujikuroi, Process Biochemistry 38 (2002) 635/640 17 Miguel Filho, Benevides C Pessela, Cesar Mateo, Alfonso V Carrascosa, Roberto Fernandez-Lafuente, Jose M Guis' an, Immobilization—stabilization of an -galactosidase from Thermus sp strain T2 by covalent immobilization on highly activated supports: Selection of the optimal immobilization strategy, Enzyme and Microbial Technology 42 (2008) 265-271 18 Saraju P.Mohanty and Elias Kougianos ,Biosensors: A tutorial review 19 Jose " I Reyes De Corcuera, Ralph P Cavalieri, Biosensors, Washington State University, Pullman, Washington, U.S.A 20 Anjan Kumar Basu, Parimal Chattopadhyay, Utpal Roychudhuri, Runu Chakraborty, Glutamate optical biosensor based on the immobilization of glutamate dehydrogenase in titanium dioxide sol-gel matrix, , Department of Food Technology and Biochemical Engineering, Jadavpur University, Kolkata 700032, India /V 37