Đồ án môn học Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC C5S CQ ỈO Bộ MÔN CÔNG NGHỆ THựC PHẨM ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM YÀ ỨNG DỤNG SVTH : NGUYỄN BẢO Dư MSSV : 60700443 GYHD : TS TRẦN BÍCH LAM Đồ án môn học Đồ án môn học TP Hồ Chí Minh, 6/2011 Tp Hồ Chí /V ~ /V ~ NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Minh, tháng năm 2011 Chữ ký giáo viên Đồ án môn học Đồ án môn học LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Bích Lam tận tình hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đồ án Cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa TpHCM giảng dạy nhiệt tình truyền đạt kiến thức quý báu giúp hoàn thành đồ án án Xin cảm ơn tất bạn bè, người quan tâm, giúp đỡ hoàn thành đồ Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011 Nguyễn Bảo Dư Đồ án môn học Đồ án môn học /V Đồ án môn học Đồ án môn học iii ~MỤC LỤC /V5 ~ /V5 ~ Đồ án môn học Đồ án môn học DANH MỤC HÌNH Chương 1: Tổng quan Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Đồ án môn học Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử phát triển enzym cố định [1] - Năm 1916, Nelson Griffin quan sát cho thấy enzym invertase nấm men 1.2.6) hấp thụ vào than có khả thủy phân đường saccharose Sau ữên giới xuất nhiều báo cáo khả cố định enzym liên kết đồng hóa trị chất mang Trước năm 1953 chưa có nghiên cửu enzym không hòa tan ứng dụng vào thực tế - Năm 1953, Grubhofer Schleith cố định số enzym carboxy peptidase, diastase, pepsin ribonuclease polyaminostyrene liên kết đồng hóa trị nghiên cửu bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot - Năm 1954, Chang tạo vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng đưa enzym vào thể - Năm 1963, Bemfeld Wan thí nghiệm thành công việc nhốt enzym amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide - Năm 1964, Quiociio Richards mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde Cũng năm Chang triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase - Năm 1969, Wilson xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose glucoamylase cố định - Năm 1969, Chibata người cộng tác công ty Tanabe Seiyaku - Nhật người thực thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp Theo phương pháp cố định enzym tác giả người Nhật, enzym aminoacylase nấm sợi gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion sử dụng chúng cho trình thủy phân - Năm 1970, Mosbach tiến hành cố định ba loại enzym: P-galactosidase, hexokinase, glucophosphatase hên kết cộng hóa trị với hạt sephadex - Năm 1971, Gregoriadis triển khai liposome có chứa amyloglucosidase - Năm 1973, Chibata cộng tác viên người thành công việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate gel acrylamid Tế bào E.coli chứa gel có hoạt tính aspartate cao - Đến năm 1987, công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, tiến hành sản xuất sữo fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp Cho đến cổ khoảng 4,5 triệu sừo fructose sản xuất theo phưong pháp enzym cố định - Ngoài sàn phẩm trên, enzym cố định ứng dụng nhiều công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trường y học 1.2 Sơ luợc enzym cố định 1.2.1 Định nghĩa [1] Enzym cố định hiểu theo nghĩa: - Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan enzym đưa vào pha riêng rẽ, pha tách riêng vói môi trường /V 7~ /V Chương 1: Tổng quan Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Đồ án môn học dung dịch phàn ứng Pha enzym không hòa tan nước gắn với polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn - Nghĩa rộng: cắc chất xúc tác cố định enzym, tế bào, thể sống trạng thái cho phép sử dụng lại Như vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm enzym cố định vào chất mang, enzym có tế bào sống, chúng cố định bình phản ứng sinh học có gắn kết vào chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần - Enzym không hòa tan hay enzym cố định thường enzym hòa tan gắn vào chất mang nhiều kỹ thuật khác Nhờ quấ trình gắn mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan 1.2.2 Đặc điểm enzym cố định [1] Enzym cố định có đặc điểm sau: - Hoạt tính enzym cố định thường nhỏ hoạt tính enzym tự loại Sở dĩ có thay đổi hoạt tính riêng enzym cố định nguyên nhân sau: • Do ảnh hưởng điện tích chất mang: điện tích chất mang có khác biệt với điện tích enzym gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian enzym có thay đổi mức độ định Chính thay đổi cấu trúc mà kết họp enzym chất đi, dẫn đến hoạt tính chứng giảm • Do enzym bị nhốt vào mạng lưới bị liên kết chất mang khiến cho tiếp xúc enzym chất bị - Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis - Menten có số sai khác định: • Có thể xảy cạnh tranh chất với enzym chất mang • Xảy tượng cản trở khuếch tán chất sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng - Enzym cố định thường có tính bền nhiệt enzym tự nhờ có tác dụng che chở chất mang - Enzym cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzym tự loại - Enzym cố định có chất mang che chắn nên bảo vệ tốt enzym tự - Enzym cố định tái sử dụng nhiều lần dễ dàng tách khỏi chất cách dễ dàng sau phản ứng độ bền enzym cố định cao enzym tự Ưu nhược điểm enzym cố định [1] Ưu điểm: 1.2.3 - Enzym cố định tái sử dụng nhiều lần thời gian dài - Enzym cố định không lẫn vào sàn phẩm cuối phản ứng enzym, không gây ảnh hường xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác không tốn chi phí cho việc tách enzym khỏi sản phẩm - Có thể ngừng phản ứng cần thiết cách tách hệ chất mang - enzym khỏi dung dịch chất - Enzym cố định tương đối bền với tác nhân vật lý hóa học enzym tự - Dễ dàng tiến hành trình sản xuất theo phương pháp liên tục Nhươc điểm: /V 8~ /V Chương 1: Tổng quan Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Đồ án môn học - Sự có mặt chất mang làm giảm hoạt tính enzym - Trong đa số trường họp, enzym bị giảm hoạt hoạt tính sau quấ trình cố định - Tuy nhiên, hạn chế không đáng kể so với lợi ích mà enzym cố định mang lại Do vậy, ngày có nhiều nghiên cứu cố định enzym ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp 1.2.4 Các phương pháp cố định enzym [1] Các phương pháp cố định enzym chia thành nhóm: hóa học vật lý Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm phương pháp cổ định enzyme [1] pháp hóa học Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm pháp gắn enzym lên chấtkết enzym chất mang Liên Hoạt làtính enzym bị giảm mang liên kết Mên kết bền, hạn chế tối biến đổi cấu trúc cộng hóa trị đa mát enzym enzym trình trình phản ứng cố định pháp gắn phân Tạo tử Mên kết bền trước Chi tấc phí cao, thao tác thực hiên tương enzym lại với nhân pH, nhiệt độ đối phức tạp liên kết cộng hóa dùng phối họp với Thường Hoạt tính enzym bị giảm trị phương pháp khác biến đổi cấu trúc enzym quấ trình cố định Phương pháp vật lý Phương pháp Ưu điểm pháp gắn enzym lên chất Thao tấc thực đơn giản mang tác nhân vật lý Nhược điểm Do lực tương tác enzym chất Điều kiện tiến hành cố định enzym ôn hòa nên không làm hoạt tính enzym trình cố định Có khả tái sử dụng chất mang /V 9~ /V mang yếu nên dễ xảy tượng nhả hấp phụ trình sử dụng enzym cố định khuấy trộn hay thay đổi nhiệt độ, pH môi trường Chương 1: Tổng quan Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Đồ án môn học pháp nhốt enzym Thao tác đơn giản Chỉ thích họp cho phản ứng với chất có khối lượng phân tử Không đòi hỏi phải có nhóm tạo nhỏ Mên kết nên phù họp với nhiều loại enzym Hiệu cố định enzym cao Có thể cố định đồng thòi nhiều enzym Phương pháp hóa hoc: - Gắn enzym lên chất mang liên kết cộng hóa trị - Gắn phân tử enzym lại với liên kết cộng hóa trị Phương pháp vât lý: - Hấp phụ enzym lên chất mang liên kết vật lý sau: lực mao quản, liên kết ion, lực Van der Walls - Phương pháp nhốt enzym khuôn gel màng bao vi thể liệu cố định [1] Vật liệu phương pháp cố định hai yếu tố có tính chất định đến hiệu t rình cố định enzym Trong đó, đặc điểm, tính chất vật liệu cố định thích họp cho tất loại enzym enzym thích họp với tất loại vật liệu cố định Vật liệu cố định enzym tế bào chia làm hai loại: vật liệu vô vật liệu hữu Vât liêu vô cơ: - Đặc điểm: chất mang vô bền với tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn mòn, phân hủy, việc gắn với enzym thường khó khăn - Một số chất mang vô thông dụng như: thủy tinh xốp, cấc oxid kim loại oxid nhôm, oxid mangan, oxid magie, Silicagel Vât liêu hữu cơ: - Đặc điểm: chất mang hữu thường có nhóm hoạt động hóa học như: -NH2, - COOH, -OH, -SH, nên dễ kết gắn với enzym độ bền với tác động môi trường không cao, đặc biệt polymer sinh học dễ bị vi sinh vật xâm nhập công • Các polymer tư nhiên: - Tinh bột vật liệu phong phú rẻ tiền Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột dùng làm chất /V 10~ /V 10 Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học giảm mật độ chất oxi hóa bề mặt điện cực giảm cách tương ứng Dựa thay đổi đó, Clark phát thay đổi nồng độ glucose môi trường cần kiểm tra Những năm tiếp theo, nhóm Guilbault Montalvo lần công bố chi tiết chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa điện cực chứa enzyme đo điện thế, cảm biến đo nồng độ urê điện cực chọn lọc ion NH4+, có gắn màng cố định urease TT_ Urease T T _ _ _ ,.TTT+ Urea — -► HCO3 + NH Năm 1975, Lubber Opitz mô tả cảm biến sợi quang (fiber-optic sensor) gắn chất thị dùng để đo nồng độ CO2 O2 Cũng vào năm 1975, số vi khuẩn sử dụng thành phần sinh học fren điện cực vi sinh để đo nồng độ cồn Năm 1975, công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần biến ý tưởng Clark thành thực thông qua việc thương mại hóa cảm biến sinh học Sản phẩm thiết bị phân tích glucose dựa hydrogen peroxide cột mốc đánh dấu xuất cảm biến sinh học đời sống _ Glucose oxidase ß- D- Glucose + O2 -► D - Gluconic acid + H2O2 Yào năm 1982, Shichiri đồng nghiệp báo cáo mô tả cảm biến “glucose in vivo”, loại cảm biến dạng kim cho xét nghiệm da Cùng với phát triển nhanh chóng khoa học công nghệ, đặc biệt cấc ngành công nghệ vật liệu nano công nghệ thông tin, cảm biến sinh học đạt tiến vượt bậc, hứa hẹn đưa vi thiết bị nhằm xác định nhanh, xác loại vi khuẩn, virus gây bệnh Các thiết bị dò tìm hay phân tích lượng mẫu nhỏ (cỡ vài nM) vói độ tin cậy cao 2.2.I.3 Phân loại [19] Cảm biến sinh học phân loại dựa vào thành phần sinh học thành phần chuyển đổi chúng Thành phần sinh học chúng bao gồm enzym, kháng thể, vi sinh vật, mô sinh học bào quan - Khi liên kết yếu tố cảm biến chất cần phân tích biến cố phất /V39 ~ Chương 2: ửngdụng (detected event) gọi cảm biến lực (affinity sensor) /V40 ~ Đồ án môn học Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học Khi có tương tác yếu tố sinh học chất cần phân tích kèm theo sau thay đổi nồng độ chất sản phẩm gọi cảm biến trao đổi chất (metabolism sensor).- Khi tính hiệu tạo sau liên kết chất cần phân tích yếu tố sinh học thay đổi hóa học yếu tố sinh học cảm biến gọi cảm biến xúc tác (catalytic sensor) 2.2.I.4 Các yếu tố sinh học 2.2.1.4.1 Enzym [19] Như biết enzym protein có hoạt tính xúc tác cao đặc hiệu cao chất Chúng sử dụng để kiểm soát phân tích nồng độ nhiều chất cần phân tích khấc Các chế phẩm enzym có sẵn thị trường với độ tinh khiết cao điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất cảm biến sinh học dùng enzym cố định Bên cạnh đó, hạn chế enzyme pH, lực ion, chất kìm hãm, nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính enzym Hầu hết enzym hoạt tính nhiệt độ 60°c Cấc enzym sử dụng để chế tạo biosensor enzym oxy hóa, sử dụng oxy hòa tan sản xuất hydrogen peroxide Enzym cố định chuyển đổi (transducer) phương pháp hấp phụ, liên kết cộng hóa trị, phương pháp bao gói khuôn gel, polymer phát sinh điện hóa (electrochemically generated polymer), màng lipid kép (bilipid membrane) dung dịch bên màng chọn lọc Enzym thường ghép thành đôi với chuyển đổi điện hóa chuyển đổi sợi quang học 2.2.1.4.2 Kháng thể [19] Kháng thể có chất cấc glycoprotein, tế bào lympho B tương bào (biệt hổa từ lympho B) tiết để hệ miễn dịch nhận biết vô hiệu hóa tấc nhân lạ, chẳng hạn vi khuẩn virus Mỗi kháng thể nhận diện epitope kháng nguyên Nhiều kháng thể thương mại hóa sử dụng rộng rãi xét nghiệm miễn dịch Các kháng thể cố định bề mặt chuyển đổi theo phương pháp liên kết cộng hóa trị sử dụng nhóm chức amino, carboxyl, aldehyde sulfhydryl Cấc mặt hạn chế sử dụng kháng thể giống sử dụng enzym Hơn muốn tái tạo phục hồi bề mặt chuyển đổi cần phải có điều kiện pH thấp, lực ion lớn, chất làm sạch, Ưu điểm cảm biến kháng thể khả phân tích nhanh xét nghiệm miễn dịch truyền thống Cảm biến miễn dịch thường sử dụng chuyển /V41 ~ Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học đổi quang học hay âm học 2.2.I.4.3 Vi sinh vật [19] Việc sử dụng vi sinh vật yếu tố sinh học thiết bị cảm biến sinh học dựa trình trao đổi chất chúng Trong hầu hết trường hợp, người ta đo thay đổi điện hóa học tế bào sử dụng oxy CO2 Tế bào vi sinh vật có lợi rẻ so với enzym kháng thể, ổn định sử dụng phản ứng phức hợp có tham gia enzym cofactor Tuy nhiên, phương pháp có tính chọn lọc so với phương pháp sử dung enzym, có thời gian đáp ứng, thời gian phục hồi dài đòi hỏi phải thường xuyên tiến hành hiệu chỉnh Chất mang thường dùng để cố định nylon, màng cellulose nitrate, acetyl cellulose 2.2.I.5 Bộ chuyển đổi (transducer) 2.2.1.5.1 Chuyển đổi điện hóa [19] Bộ chuyển đổi dòng điện chuyển đổi điện áp dùng phổ biến thiết bị cảm biển sinh học kiểu điện hóa Hầu hết, điện cực làm kim loại bạch kim, vàng, bạc, thép không gỉ vật liệu carbon Những vật liệu phải trơ điện mà phản ứng điện hóa xảy 2.2.1.5.2 Chuyển đổi quang [19] Chuyển đổi quang chuyển đổi hoạt động dựa cấc hiệu ứng như: hấp thụ ánh sáng nhìn thấy tia UV; phát xạ huỳnh quang lân quang; bio-luminiscence; chemiluminiscence Bộ chuyển đổi quang học loại đầu dò mà đỉnh cố định enzym chất màu (thường huỳnh quang) Những loại đầu dò chứa hai sợi quang Một sợi nối với nguồn sáng phất dãy bước sóng khác nhau, sợi nối với diot quang để phát thay đổi mật độ quang bước sóng thích họp 2.2.1.5.3 Chuyển đổi nhiệt [19] Hoạt động dựa tượng thay đổi entanpi hình thành phá vỡ liên /V42 ~ Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học kết hóa học phản ứng enzyme Bộ chuyển đổi có ưu điểm hoạt động tốt với tất cấc phản ứng Tuy nhiên, dạng chuyển đổi có tính chọn lọc thấp 2.2.1.5.4 Chuyển đổi tinh thể áp điện (piezoelectric) [19] Chuyển đổi hoạt động dựa nguyên lý: tinh thể thay đổi tần số dao động lực tác dụng lên thay đổi Chuyển đổi dạng có ưu điểm độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian phản ứng nhanh, khả động cao, sử dụng đo đạc môi trường lỏng khí Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate thực phẩm 2.2.2 2.2.2.1 Giới thiệu [20] Glutamate amino acid xác định nguồn lượng nguồn Nitơ quan trọng cho tế bào nhân thật tế bào loài động vật có vú Nó hoạt động chất dẫn truyền kích thích thần kinh hệ thống thần kinh trung ương cho chịu trách nhiệm cho số trình học tập, trí nhớ, phát triển hệ thần kinh Việc tăng mức độ glutamate dịch não tủy cho nguyên nhân chứng rối loạn thần kinh bệnh đột quỵ, bệnh Alzheimer’s bệnh Parkinson’s Ngoài ra, monosodium glutamate sử dụng phổ biến làm chất tăng cường hương vi thực phẩm Do đó, việc phát triển thiết bị đo lường hàm lượng glutamate cách nhanh chóng đáng tin cậy vấn đề quan trọng cần xem xét nghiên cứu Một vài kỹ thuật khối phổ, điện mao dẫn, microdialysis cảm biến sinh học phất triển để phân tích glutamate Trong số phương pháp đó, cảm biến sinh học phương pháp quan tâm phất triển nhanh Một vài loại cảm biến sinh học sử dụng chuyển đổi dòng điện chế tạo để phát glutamate ứng dụng khác chế biến thực phẩm, tế bào nuôi cấy, dịch não ngoại bào (extracellular brain fluid) Cấc cảm biến sinh học có độ nhạy khả chọn lọc cao, cần có bước xây dựng phức họp để chuẩn bị điện cực enzym Không giống với cấc cảm biến sinh học dạng chuyển đổi dòng điện, cảm biến sinh học loại chuyển đổi quang học chế tạo đơn giản hơn, dễ sử dụng phất chỗ /V43 ~ Chương 2: ửngdụng 2.2.2.2 Phương pháp thí nghiệm 2.2.2.2.1 Các hóa chất sử dụng [20] Đồ án môn học Enzym L-glutamate oxidase (L-GLOD) (EC 1.4.3.11, 63Ư/mg protein từ Streptomuces sp.), enzym L-glutamate dehydrogenase (L-GLDH) ((EC 1.4.1.3, 452U/mg protein từ Proteus sp.), NADPH, màng polycarbonate (kích thước lỗ 0.4 pm), dung dịch đệm cấc loại dung dịch khác 2.2.2.2.2 /V44 ~ Sự cố định enzym [20] Chương 2: ửng dụng Đô án môn học \ Người ta sử dụng dung dịch đệm phosphate saline (PBS, pH 7.0) cổ chứa đồng thời hai enzym Enzym L-GLOD L-GLDH trộn sau tạo liên kết chéo với màng polycarbonate 20pl dung dịch glutaraldehyde 25pl bovine serum albumin (BSA) sử dụng để nâng cao hiệu suất ổn định cho cảm biến Hỗn họp enzym chuẩn bị vói hàm lượng khác vói L-GLDH (35-143.2U) L-GLOD giữ cố định giá trị 25U Sau đó, 10 J0.1 sử dụng để cố định Màng polycarbonate sau cố định rửa vài lần dung dịch PBS để loại glutaraldehyde dư thừa enzym không tạo liên kết với màng Màng chứa enzym bảo quản 4°c dung dịch PBS chửa túi polypropylene kín khí 2.2.2.2.3 Điện cực [20] Điện cực vói đường kính lcm sử dụng dung dịch KC1 chất điện phân, điện cực dưong làm bạc, điện cực âm làm vàng Điện cực oxy phủ lớp polypropylene kị nước (để bảo vệ điện cực nước) cho khí thấm qua lớp enzym màng polycarbonate (kích thước lỗ 0.4|im) gắn điện cực hệ thống “push cap” Để phân tích, người ta sử dụng dung dịch đệm bảo hòa không khí với nồng độ oxy 7-8 ppm 25°c Dung dịch đệm loại oxy dung dịch sodium sulfite L-GLOD + L-GLDH Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD—L-GLDH cổ định 2.2.2.2A Thử nghiệm [20] Đầu dò phân cực khoảng 30-40 phút lần trước sử dụng Việc thử nghiệm bắt đầu cách thêm MSG nồng độ khác Lượng oxy tiêu thụ đo sau phút Để khôi phục lại độ bảo hòa oxy 100%, màng cố định enzym rửa vài ~ 45 ~ Chương 2: ửng dụng Đô án môn học \ lần với PBS trước tiến hành lần thử nghiệm Sự khuếch tán oxy từ không khí làm giảm hiệu quấ trình thử nghiệm thực với enzym dung dịch, để khắc phục vấn đề người ta tiến hành thử nghiệm thiết bị phản ứng kín khí thủy tinh (12mL) Người ta tiến hành thí nghiệm ba trường họp với nồng độ MSG khác nhau: - • : Không tái sinh chất vắng mặt 2mM NADPH lOmM ammonium - A :CÓ tái sinh chất có mặt 2mM NADPH - ♦ :CÓ tái sinh chất có mặt 2mM NADPH lOmM ammonium ~ 46 ~ Chương 2: ửng dụng Đô án môn học \ Người ta tiến hành tối ưu nồng độ NADPH ammonium nhận thấy giá trị đáp ứng cho ổn định cao 2mM NADPH lOmM ammonium Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG cặp L-GLOD-LGLDH cổ định cảm biến sinh học 2.2.2.2.5 NADP NADPH Quá trình phản ứng [20] L-glutamate + H2O ^ ^"^»ả-Ketoglutarate + NH3 (1) Phản ứng (1) xảy có mặt MSG, trình tái sinh chất không xảy mặt NADPH, NADPH hoạt động cofactor L-GLDH 0.1mg/L nồng độ giới hạn phát phương trình (1) Với có mặt MSG tái sinh 2mM NADPH MSG hai enzym hoạt động phản ứng (2) MSG chuyển đổi thành a-ketoglutarate phản ứng thứ chất phản ứng thử (2) Việc bổ sung NADPH vào môi trường phản ứng tạo điều kiện cho LGLDH thực phản ứng nghịch Việc nhận biết L- glutamate cung cấp khuếch đại giới hạn phát xác định 0.04mg/L Sự khuếch đại túi hiệu cao nhận thấy có mặt ammonium-một sản phẩm phụ phản ứng (1) giói hạn nồng độ phất 0.02mg/L 2.2.2.2.Ổ Cấu hình nhiệt độ pH [20] Cảm biến hoạt động tốt khoảng pH 4-10 (pH dung dịch đệm citratephosphate: 4, 5, 6; sodium phosphate: 7,8; glycine-NaOH: 9, 10) đo nồng ~ 47 ~ Chương 2: ửng dụng Đô án môn học \ độ dung dịch MSG 1.2mg/L với cổ mặt 2mM NADPH lOmM ammonium pH tối ưu cảm biến 7.0 nhiệt độ 25±2 °c, pH tối ưu GLDH khoảng 8.25 pH tối ưu GLOD khoảng 8.0 Cảm biến hoạt động tốt khoảng nhiệt độ (13±2 đến 55±2 °C) đo nồng độ MSG 1.2mg/L Cảm biến hoạt động tốt nhiệt độ 25±2 °c, sau giá trị cảm biến bị hoạt tính bị vô hoạt bời nhiệt độ Hình 2.4: pH mặt 2mM NADPH với nồng độ nhiệt độ 25 ±2 °c có lOmM ammonium MSG 1.2mg/L 2.22.2.1 Km Y Giá trị Km L-GLODgiống Xác định giá trị max [20] xác định cho cặp LGLDH cho L- GLOD Vận tốc ban đầu phản ứng hàm số nồng độ chất theo động ‘Michaelis- học Menten’ Km vàHình 2.5: Nhiệt độ pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL Vmax xác định theo phương pháp Lineweaver-Burk Giá trị Km biểu kiến xác định 0.445 lmM với có mặt 2mM NADPH lOmM ammonium vmaxxảc định điều kiện 3.07mg/(L.min) ~ 48 ~ Chương 2: ứng dụng Đồ án môn học Giấ trị Km Vmax biểu kiến điều kiện không tái sinh chất (chỉ có L-GLOD hoạt động) tương ứng 1.9222mM 13.245mg/(Lmin) so với Km L-GLOD dạng tự 0.21 mM Vì thế, cặp L-GLOD-LGLDH sử dụng giá trị Km tăng xấp xỉ lần, khỉ sử dụng chì L-GLOD giá trị K,n tăng hom lần Giá trị Km cao hom thu khỉ cố định enzym lực enzym với chất giảm, cỗ thể ttở trung tâm hoạt động enzym trình cổ định 2.2.2.2.8 Sự ổn định màng cế định [20] Sự ổn định củã màng phẫn tích chu kì 60 ngày Màng chứa enzym bảo quản dung dịch đệm phosphate 0.2M, pH 7.0, nhiệt độ 4°c tui polypropylene km khí Quá trình phân tich thực mễi ngày lần với 0.8mg/L MSG Màng chứa cặp enzym L-GLOD-L-GLDH giữ 80% hoạt tính ban đầu sau 30 ngày ứng với GLOD= 25U; GLDH= 35Ư 39 ngày ứng với GLOD= 25Ư; GLDH= 143.2Ư với diện 2mM NADPH lOmM ammonium Trong khỉ đỗ, màng chì cố định enzym LGLOD (25U) giữ 80% hoạt tính ban đầu chí sau 48 ngày Hình 2.6: Hoạt tính cảm biến sinh 60 ngày: A LGLDH143 2U; m LGLĐH 35U; ÌLnhững nghiên cứu nhận thấy enzym cổ định học thời gian GLOD 25U-LGLOD 25U-LGLOD 25U Trong gần đây, người tã lượng nhỏ GLDH không trì hoạt tính enzym, điều cố thể vô hoạt rò rỉ enzym Sự ổn định biosensor trình bảo quăn cao khỉ hoạt độ GLDH 143.2U 49 Tài liệu tham khảo GLOD 25Ư /V50 ~ /V 50 Đồ án môn học Tài liệu tham khảo Đồ án môn học TÀI LIỆU THAM KHẢO Wolfgang Aehale, Enzymes in Industry, Copyright © 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGa, Weinheim Parmjit s Panesar, Shweta Kumari, and Reeba Panesar, Potential Applications of Immobilized p-Galactosidase in Food Processing Industries, SAGE-Hindawi Access to Research, Enzyme Research, Volume 2010, Article ID 473137, 16 pages M.L Foresti, M.L Ferreha, Chito san-immobilized lipases for the catalysis of fatty acid esterifications, Enzyme and Microbial Technology 40 (2007) 769-777 Yin Hoon Chew, Lee Suan Chua, Kian Kai Cheng, Mohamad Roji Sarmidi, Ramlan Abdul Aziz, Chew Tin Lee, Kinetic study on the hydrolysis of palm olein using immobilized lipase, Biochemical Engineering Journal 39 (2008) 516-520 K.N Kilcawley, M.G Wilkinson,P.F.Fox, Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations from microbial or animal sources, Enzyme and Microbial Technology 31 (2002) 310-320 G.D Haki, S.K Rakshit, Developments in industrially important thermostable enzymes: a review, Bioresource Technology 89 (2003) 17-34 V Ramachandra Murty*, Jayadev Bhat, and P K A Muniswaran , Hydrolysis of Oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: A Review, Biotechno Bioprocess Eng 2002, 7: 57-66 José M Palomo, Gloria Munoz, Gloria Fernandez-Lorente, Cesar Mateo, Roberto Fernândez-Laiuente*, José M Guisấnl, Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl-Sepabeads) immobilization, hyperactivation and stabilization of the open form of lipases, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 19-20 (2002) 279-286 S.-W Chang, J.-F Shaw, K.-H Yang, S.-F Chang, C.-J Shieh, Studies of optimum conditions for covalent immobilization of Candida rugosa lipase on poly(cglutamic acid) by RSM, Bioresource Technology 99 (2008) 2800-2805 /V51 ~ /V 51 Tài liệu tham khảo Đồ án môn học Dasciana s Rodrigues, Adriano A Mendes, Wellington s Adriano, Luciana R.B Goncalves,Raquel L.c Giordano, Multipoint covalent immobilization of microbial Upas on chitosan and agarose activated by different methods, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 51 (2008) 100-109 Tài liệu tham khảo Do an mon hoc ll.Seema S.Betigeri, Steven H.Neau, Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads, Biomaterials 23 (2002) 3627-3636 12 Keehoon Won, Sangbum Kim, Kwang-Je Kim, Hong Woo Park, Sang-Jin Moon, Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads, Process Biochemistry 40 (2005) 2149-2154 13 Paramita Mahapatra, Annapurna Kumari, Vijay Kumar Garlapati, Rintu Banerjee, Ahindra Nag, Enzymatic synthesis offruit flavor esters by immobilized lipase from Rhizopus oligosporus optimized with response surface methodology, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 14 Wiphum Kaewthong, Sarote Sirisansaneeyakul, Poonsuk Prasertsan, Aran H- Kittikun, Continuous production of monoacylglycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase, Process Biochemistry 40 (2005) 1525-1530 15 S.J Prashanth, V.H Mulimani, Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzae-galactosidase immobilized in calcium alginate, Process Biochemistry 40 (2005) 1199-1205 16 S Thippeswamy, V.H Mulimani, Enzymic degradation of raffinose family oligosaccharides in soymilk by immobilized a-galactosidase from Gibberella fujikuroi, Process Biochemistry 38 (2002) 635/640 17 Miguel Filho, Benevides C Pessela, Cesar Mateo, Alfonso V Carrascosa, Roberto Fernandez-Lafuente, Jose M Guis' an, Immobilization—stabilization of an -galactosidase from Thermus sp strain T2 by covalent immobilization on highly activated supports: Selection of the optimal immobilization strategy, Enzyme and Microbial Technology 42 (2008) 265-271 /V52 ~ /V 52 Tài liệu tham khảo Đồ án môn học 18 Saraju P.Mohanty and Elias Kougianos ,Biosensors: A tutorial review 19 Jose " I Reyes De Corcuera, Ralph P Cavalieri, Biosensors, Washington State University, Pullman, Washington, U.S.A 20 Anjan Kumar Basu, Parimal Chattopadhyay, Utpal Roychudhuri, Runu Chakraborty, Glutamate optical biosensor based on the immobilization of glutamate dehydrogenase in titanium dioxide sol-gel matrix, , Department of Food Technology and Biochemical Engineering, Jadavpur University, Kolkata 700032, India /V53 ~ /V 53 [...]... dụng Enzym agalactosidase được cố định trong gel alginate 3% bị mất 54,5% hoạt tính so vói enzym tự do Ä'max và Vmax của enzym cố định với cơ chất là raffinose là 5.5mM và O.lSUml-1 Nhiệt độ tối ưu của enzym cố định là 57°c và pH tối ưu là 4,5 Enzym hòa tan giữ được 92% và 88% hoạt tính sau 8h và 12h, trong khi đó enzym cố đinh giữ được 94% và 92% [15] Enzym a-galactosidase từ G fujikuroi được cố định. .. độ alginate thì hoạt độ riêng của enzym cố định sẽ giảm Nồng độ của alginate có ảnh hưởng nhiều đến tỉ lệ enzym được cố định và hoạt độ riêng của enzym hơn sự ảnh hưởng của nồng độ CaCỈ2, do đó nồng độ alginate cần được tối ưu hóa để hiệu suất cố định enzym đạt cao nhất [12] 2.I.2.4 ứng dụng enzym Upase cố định trong công nghệ thực phẩm 2.I.2.4.I ứng dụng Upase cố định tổng họp các ester có hương trái... của enzym cố định nằm trong khoảng 5,2-5,6 Trong khoảng pH 4,0 và 6,3 enzym cố định và enzym hòa tan có hoạt tính là 90% Hoạt tính của enzym tự do giảm về zero ờ nhiệt độ 65°c, nhưng ở nhiệt độ đó enzym cố định có hoạt tính là 50% Nhiệt độ tối ưu của hầu hết enzym a-galactosidase trong khoảng 37°c và 40°c Sau 24h, enzym tự do và enzym cố định giữ được 44% và 36% hoạt tính, nhưng sau 3 ngày thì enzym. .. sau 72h cố định Khi sử dung chất mang là agarose và chitosan với chất hoạt hóa là glutaraldehyde thì hoạt tính cao nhất đạt được tương ứng là 1209U/g gel và 2716U/g gel sau 5h cố định Sự ổn định nhiệt tăng đáng kể khi so sánh với enzym hòa tan, gấp 20 lần khi sử dụng agarose/V26 ~ Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học glyoxyl và gấp 18 lần khi sử dụng chitosan-glutaraldehyde và gấp 21 lần khi sử dụng agarose-glutaraldehyde... 90% enzym bị hoạt hóa Hệ thống enzym tự do và enzym cố định tương đương cho thấy quá trình sản xuất GOS rất giống nhau, xấp xỉ 22% (w/v) và 20% (w/v) trong thời gian khoảng 15 - 17 phút, và chuyển đổi được 50% lactose ~ 23 Chương 2: ửng dụng Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học Đồ án môn học P-galactosidase tinh khiết từ Buttera singularis ATCC 24193 được cố định trên hạt Chitopearl BCW 3510 được sử dụng. .. dịch và chất mang chứa enzym cố định Điều này làm cho các thông số công nghệ thay đổi, đó là điều cần để ý khi thiết lập quy mô của quá trình Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 2.1 ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 2.1.1 Enzym p-galactosidase 2.1.1.1 Giói thiệu về enzym Ịỉ-galactosỉdase [2] Enzym P-galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đường lactose thành các monomer là glucose và galactose... ửngdụng Đồ án môn học EP100 (