Đồ án môn học: Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng

Mời các bạn cùng tìm hiểu lịch sử phát triển của enzym cố định; sơ lược về enzym cố định; ứng dụng của enzym cố định;... được trình bày cụ thể trong Đồ án môn học: Công nghệ cố định Enzym và ứng dụng. Mời các bạn cùng tìm hiểu và tham khảo nội dung thông tin tài liệu.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC Bộ MƠN CƠNG NGHỆ THựC PHẨM C5S CQ ỈO ĐỒ ÁN MƠN HỌC CƠNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM  ỨNG DỤNG SVTH : NGUYỄN BẢO Dư MSSV : 60700443 GYHD : TS. TRẦN BÍCH LAM TP Hồ Chí Minh, 6/2011 NH? N X? T C? A GI? O VI? N H? ? NG D? N ?? ?n m ?n h?c Tp. H?  Ch?  Minh, th? ng  6 n? m 2011 Ch?  k?  c ? a g i? o  vi? n /V ~ /V ?? ?n m ?n h?c LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm  ơn TS. Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ  tơi   trong suốt thời gian thực hiện đồ án Cảm ơn q thầy cơ bộ mơn Cơng nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trường   Đại học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức q báu  của mình giúp tơi hồn thành đồ án Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã quan tâm, giúp đỡ tơi hồn thành đồ án Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011  Nguyễn Bảo Dư iii ~ ?? ?n m ?n h?c MỤC LỤC TRANG BÌA .i NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN .ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vi Chương 1: TỒNG QUAN 11.Lịch sử phát triển của enzym cố định 12.Sơ lược về enzym cố định 1.21.Định nghĩa  1.22.Đặc điểm của enzym cố định 1.23.Ưu nhược điểm của enzym cố định  1.24.Các phương pháp cố định enzym 1.25.Vật liệu cố định   5 1.26.Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme  Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 21.ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 2.11.Enzym ß­galactosidase .9 2.1.11.Giới thiệu về enzym ß­galactosidase  .9 2.1.12.Nguồn thu nhận enzym ß­galactosidase 2.1.13.Các phương pháp cố định enzym ß­galactosidase .10 2.1.14.ứng dụng của enzym ß­galactosidase cố định 13 2.1.1.41.Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum 13 2.1.1.42.Tổng họp Galacto­Ohgosaccharides (GOSs) 16 2.12.Enzym lipase 17 2.L2.1. Giới thiệu về enzym hpase 17 2.L2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase 17 2.1.23.Các phương pháp cố định enzym lipase 18 2.1.24.ứng dụng enzym lipase cố định trong cơng nghệ thực phẩm 20 2.1.2.41.ứng dụng lipase cố định tổng họp các ester có hương trái cây 20 /V ~ ?? ?n m ?n h?c ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất Mên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ  .  21 2.13.Enzym a­galactosidase (raffinase) 23 2.1.31.Giói thiệu về enzym a­galactosidase  23 2.L3.2 Nguồn thu nhận enzym a­galactosidase 23 2.L3.3 Cách phương pháp cố định enzym a­galactosidase .23 2.L3.4 ứng dụng của enzym riffinase cố định .26 22.ứng dụng trong phân tích 27 2.21.Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor) 27 2.2.11.Giới thiệu về cảm biến sinh học  .27 2.2.12.Lịch sử phát triển cảm biến sinh học  27 2.2.13.Phân loại 28 2.2.14.Các yếu tố sinh học 29 2.2.14.L Enzym  29 2.2.1.42.Kháng thể  29 2.2.1.43.Vi sinh vật  30 2.2.15.Bộ chuyển đổi (transducer) 30 2.2.1.51.Chuyển đổi điện hóa 30 2.2.1.52.Chuyển đổi quang 30 2.2.1.53.Chuyển đổi nhiệt .30 2.2.1.54.Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric)  30 2.22.Cảm biến sinh học sử dụng L­glutamate oxidase và L­glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm 31 2.2.21.Giới thiệu 31 2.2.22.Phương pháp thí nghiệm 31 2.2.2.21.Các hóa chất sử dụng  31 2.2.2.22.Sự cố định enzym  .31 2.2.223.Điện cực  32 2.2.2.2A Thử nghiệm  32 /V ~ ?? ?n m ?n h?c 2.2.2.25.Quá trinh phản ứng  33 2.2.22.Ĩ Cấu hình nhiệt độ và pH  .33 2.2.223.Xác định giá trị Km và Vmax .34 2.2.2.2.8 Sự ổn định của màng cố định 35 /V ~ ?? ?n m ?n h?c TÀI   LIỆU   THAM   KHẢO 36DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mơ hình biosensor 27 Hình 2.2: Mơ hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L­GLOD­L­GLDH cố định .32 Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L­GLOD­L­ GLDH cố định trong cảm biến sinh học 33 Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 °c có mặt 2mM NADPH và lOmM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L ’ ’ .34 Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL .34 Hình 2.6: Hoạt túứi của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: L­ GLOD 25U­L­GLDH 143.2U; L­GLOD 25U­L­GLDH 35U; L­GLOD 25U 35 DANH MỤC BẢNG • Bảng 1.1: Ưu ­ Nhược điểm của các phưorng pháp cố định enzyme Bảng 2.1: Tóm tắt các phưcmg pháp cố định enzym P­galactosidase .13 Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau 15 Bảng 2.3: Nguồn vsv thu nhận enzym lipase và tứứi chất enzyme lipase  .18 Ch??ng 1: T?ng quan Chương 1: ?? ?n m ?n h?c TỔNG QUAN 11.Lịch sử phát triển của enzym cố định [1] ­Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men (EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả  năng thủy phân đường  saccharose. Sau đó  ữên thế  giới xuất hiện nhiều báo cáo về  khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang. Trước năm 1953 chưa có một nghiên cửu nào về   enzym khơng hòa tan  được ứng dụng vào thực tế ­Năm 1953,  Grubhofer  và Schleith đã cố  định được một số  enzym  như  carboxy  peptidase, diastase, pepsin  và ribonuclease trên  polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cửu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mơ pilot ­Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng khi đưa enzym vào cơ thể ­Năm 1963,  Bemfeld  và  Wan  đã thí nghiệm thành cơng việc nhốt các  enzym  như  amylase, trypsin, papain,  ribonuclease vào  gel polyacrylamide ­Năm 1964, Quiociio và Richards đã mơ tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong  năm này Chang đã triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase ­Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành cơng xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định ­Năm 1969, Chibata và những người cộng tác ở cơng ty Tanabe Seiyaku ­ Nhật đã là những người đầu tiên thực hiện thành cơng việc áp dụng enzym cố  định vào sản xuất cơng nghiệp. Theo phương pháp cố  định enzym của các tác giả  người Nhật, enzym aminoacylase của nấm sợi đã được gắn vào DEAE­sephadex thơng qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các q trình thủy phân ­Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại  enzym: P­galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng hên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex ­Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase ­Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thành cơng trong việc cố  định tế  bào vi sinh vật để  sản xuất L­aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamid. Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao ­Đến năm 1987, bằng cơng nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến hành sản xuất sữo  fructose từ glucose theo qui  mơ cơng nghiệp. Cho đến nay cổ khoảng 4,5 triệu tấn sừo fructose được sản xuất theo phưong pháp enzym cố định ­Ngồi sàn phẩm trên, enzym cố định còn được ứng dụng nhiều trong cơng nghệ lên men, chống ơ nhiễm mơi trường và cả trong y học 11.Sơ luợc về enzym cố định 1.21.Định nghĩa [1] Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa: ­Nghĩa hẹp: enzym khơng hòa tan là enzym được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này có thể tách riêng vói mơi trường dung dịch   phàn ứng. Pha enzym khơng hòa tan trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn ­Nghĩa rộng: cắc chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ờ trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghĩa /V ~ Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c rộng, enzym khơng hòa tan bao gồm cả  enzym được cố định vào một chất mang, cả  enzym có trong tế bào sống, chúng được cố  định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần ­Enzym khơng hòa tan hay enzym cố định thường là những enzym hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quấ trình gắn này mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang khơng hòa tan 1.22.Đặc điểm của enzym cố định [1] Enzym cố định có đặc điểm như sau: ­Hoạt tính của enzym  cố  định thường nhỏ  hơn hoạt tính của  enzym tự  do cùng loại. Sở  dĩ có sự  thay đổi hoạt tính riêng của enzym cố định là do những ngun nhân sau: •Do  ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự  khác biệt với điện tích của  enzym thì khi gắn enzym vào chất mang, cấu trúc khơng gian của enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết họp giữa enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chứng cùng giảm •Do enzym bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi ­Enzym cố định hồn tồn tn theo định luật Michaelis ­ Menten nhưng có một số sai khác nhất định: •Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang • Xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng ­Enzym cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở của chất mang ­Enzym cố định thường có pH tối ưu khơng trùng với enzym tự do cùng loại ­Enzym cố định do có chất mang che chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzym tự do ­Enzym cố  định có thể  tái sử  dụng nhiều lần và dễ  dàng tách ra khỏi cơ  chất một cách dễ  dàng sau phản  ứng và độ  bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do 1.23.Ưu nhược điểm của enzym cố định [1] Ưu điểm: ­Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài ­Enzym cố định khơng lẫn vào trong sàn phẩm cuối của phản  ứng enzym, do đó nó khơng gây  ảnh hường xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta khơng tốn chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm ­Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang ­ enzym ra khỏi dung dịch cơ chất ­Enzym cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do ­Dễ dàng tiến hành q trình sản xuất theo phương pháp liên tục Nhươc điểm: ­Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym ­Trong đa số trường họp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quấ trình cố định ­Tuy nhiên, những hạn chế trên là khơng đáng kể so với những lợi ích mà  enzym cố định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều /V Ch??ng 1: T?ng quan ?? ?n m ?n h?c nghiên cứu về cố định enzym cũng như ứng dụng enzym cố định vào sản xuất cơng nghiệp 1.24.Các phương pháp cố định enzym [1] Các phương pháp cố định enzym được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý /V ~ Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c hiệu suất trung bình đạt được là 14,01%, giảm nhẹ khi tăng thòi gian phàn ứng với. Còn  khi phản  ứng thực hiện trong thiết bị CSTR thì hiệu suất trung bình và năng suất tương  ứng là   14.34% và 1.07 X 10­2 g MAG/U.ngày 2.13.Enzym a­galactosidase (raffỵnase) 2.1.31.Giới thiệu về enzym a­galactosỉdase [15] a­D­Galactosidase (a­D­galactoside galactohydrolase EC 3.2.1.22) có mặt rộng rãi trong vsv, thực vật và động vật. Nhìn chung, a­galactosidase thủy phân và giải phóng galactose tự  do từ galactosyl­sucrose oligosaccharide trong tự nhiên như  raffinose và stachyose cũng như các a­ galactoside khác như galactolipid và galactoprotein Tuy nhiên, các lồi động vật cũng như con người khơng có khả năng tổng họp đầy đủ  a­ D­Galactosidase     hệ   thống   đường   ruột   để   thủy   phân  a­galactoside,   cụ   thể       oligo­ saccharide thuộc họ Raffinose trong đậu nành cũng như các lồi đậu khác. Vì thế, khi vào đến ruột   già các galactose­oligosaccharide này sẽ bị các vi sinh vật tại đây lên men và gây ra chứng đầy hoi   Do đó, việc loại bỏ các oligosaccharide này trong đậu nành và các loại đậu khấc sẽ làm tăng giá   trị dinh dưỡng cũng như khả năng tiêu thụ các sản phẩm đậu 2.1.32.Nguồn thu nhận enzym a­galactosidase [15] Enzym a­galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong đó enzym thương mại thường được sản xuất từ hai nguồn: hạt   cà phê còn xanh (green coffee bean) và Aspergillus niger Ngồi ra, người ta cũng nghiên cửu thu nhận a­galactosidase từ các lồi vi sinh vật như:   Thermus  sp   T2,  Gibberella  fujikuroi,   Bacillus  stearothermophilus,   Streptomyces   grìseoloalbus,   Streptomyces griseoloalbus, Pénicillium sp., Talaromyces flavus, Thermomyces ỉanuginosus, 2.1.32.Cách phương pháp cố định enzym a­galactosidase Cố   đinh a­ealactosidase  bans     ph   ương pháp bao eói  Enzym  a­galactosidase  từ  Aspergillus   oryzae    cố   định   theo   phương   pháp   Ates   và  Mehmetoglu. 4 ml dung dịch sodium alginate (3.75%) được trộn với 1 ml dung dịch enzym để tạo  thành một dung dịch đồng nhất chửa 3% alginate. Hỗn họp sau đó được tạo giọt bằng cách nhỏ  giọt bằng kiêm tiêm vơ trùng vào dung dịch CaCỈ2 0,2M ở 4°c để tạo hạt. Các hạt này được làm  cứng trong dung dịch CaCỈ2 trong 2h. Các hạt hình cầu tạo thành được rửa sạch bằng nước cất và  được bảo quản trong dung dịch đệm acetate 0,2M (pH 4.8) ờ  4°c. Glutaraldehyde được sử dụng  làm tác nhân liên kết chéo để  cố  định  enzym  a­galactosidase. Hạt  calcium alginate  được xử   ư  trong 3 phút trong 5ml với 1% glutaraldehyde. Các hạt được lọc và rửa bằng nước vơ trùng sau đó   bảo qn  ở  4°c  cho đến khi đem ra sử  dụng   Enzym  a­ galactosidase được cố  định trong  gel  ~ Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c alginate 3% bị mất 54,5% hoạt tính so vói enzym tự do. Ä'max và Vmax của enzym cố định với cơ  chất là raffinose là 5.5mM và O.lSUml­1. Nhiệt độ tối ưu của enzym cố định là 57°c và pH tối ưu  là 4,5. Enzym hòa tan giữ được 92% và 88% hoạt tính sau 8h và 12h, trong khi đó  enzym cố đinh  giữ được 94% và 92% [15] Enzym a­galactosidase từ G. fujikuroi được cố định trong gel polyacrylamide theo phương  pháp của Thanunkul et al  712,5 mg acrylamide  và  37,5  mg N,N’­methylene­ bisacrylamide được  thêm vào 10ml dung dịch enzym a­galactosidase thơ. Sau đó, dưng dịch được bài khí chân khơng và  thêm 20 mg ammonium persulphate và 50 ml TEMED (NNN’N’­tetramethy­lethylene diamine). Sau  khi polymer hóa các hạt gel thu được có chứa enzym a­galactosidase được cho qua rây 1000 pm và  được rửa vài lần bằng nước sạch.  pH tối ưu của enzym a­galactosidase hòa tan là 5,8, trong khi đó  pH tối  ưu của enzym cố  định nằm trong khoảng 5,2­5,6. Trong khoảng pH 4,0 và 6,3 enzym cố  định và enzym hòa tan có hoạt tính là 90%. Hoạt tính của enzym tự do giảm về  zero ờ  nhiệt độ  65°c, nhưng ở nhiệt độ đó enzym cố định có hoạt tính là 50%. Nhiệt độ tối ưu của hầu hết  enzym  a­galactosidase trong khoảng 37°c và 40°c. Sau 24h, enzym tự do và enzym cố định giữ được 44%  và 36% hoạt tính, nhưng sau 3 ngày thì enzym tự do chi giữ được 6% hoạt tính ban đầu và enzym  cố định giữ được 17% hoạt tính ban đầu [16]  Cố đinh a­ealactosidase bằne phươne pháo liên kết  cone     hóa trì     Enzym hexameric a­galactosidase từ  Thermus sp. chủng T2 (khối lượng phân tử 320 kDa)   có hoạt tính cao trong một dãy điều kiện hoạt động rộng như   pH 5.0­10.0, nhiệt độ  tối  ưu xung  quanh giá trị 70°c ở pH 7.0, điểm đẳng điện là 5.5 và số lượng phân tử Lys trên một tiểu đơn vị là  10 [17] Liên kết cộng hóa trị đa điểm là kỹ thuật cố định đồng thời vị trí tương đối một vài nhóm  của enzym sử  dụng chất mang rắn có các nhóm hoạt hóa và sử dụng các tác nhân Hên kết chéo,   điều này sẽ tăng cường đáng kể  tính  ổn định của  enzym. Các cách thức cố định có thể  đáp ứng   cho u cầu tạo thành các Hên kết cộng hóa trị đa điểm: Glyoxyl agarose: được cho là một phương pháp hữu ích toong việc tạo các Hên kết cộng  hóa trị  đa điểm. Chất mang này sẽ  cố  định  protein trực tiếp bằng ít nhất 2 điểm do sự   ổn định   thấp của các dạng Hên kết imine giữa  aldehyde và amine. Theo phương pháp này, tốc độ cố định  phụ thuộc vào mật độ của aldehyde trên bề mặt chất mang và mật độ Lys trên bề mặt  enzym. Vì  thế các phân tử enzym được cố định bằng Hên kết cộng hóa trị đa điểm trước hết ở các khu vực   có mật độ Lys cao [17] Glutaraldehyde: là một hoạt chất mà có thể sử dụng trong nhiều phương pháp khác nhau:  sử  dụng tiền hoạt hóa chất mang và diễn ra q trình trao đổi ion của   enzym,  hoặc hấp phụ  enzym trên chất mang được amin hóa và xử lí thêm enzym đã được hấp phụ với glutaraldehyde để  /V Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c tạo liên kết chéo giữa enzym và chất mang. Trong cà hai trường họp, cuối cùng enzym sẽ được  gắn trên chất mang bởi nhóm Lys trên hầu hết các bề mặt được tích điện âm bởi vì bước đầu tiên  đã có sự trao đổi ion [17] Chất mang có chứa nhóm epoxy: những chất mang này có thể  phản  ứng với nhiều nhóm   khấc nhau trên chất mang như  amino, thiol, hydroxyl, imidazole, carboxylic  Tuy nhiên  do  khả  năng phản ứng của enzym trên những chất mang này thấp nên cơ chế của quấ trình cố định thơng   qua 2 bước: trước tiên là sự  hấp phụ  enzym trên chất mang, sau đó là sự  phản  ứng cộng hóa trị  giữa các nhóm trên cấc chất mang và các nhóm epoxy trên chất mang được hấp phụ enzym [17] Một   lượng   khoảng  10g  chất   mang   khác     (Sepabeads®­EC­EP,   Sepabeads®­  aminoepoxy­ECHFA,  glyoxyl­agarose,  MANAE­agarose  or  MANAE­agarose  preactivated   with  glutaraldehyde)   dạng huyền phù trong 20ml dung dịch đệm potassium phosphate 25mM có pH  7.0 chứa 3 IU/ml  enzym  a­galactosidase. Trong trường họp Sepabeads®­EC­ EP,  enzym  được  ủ  trong dung dịch đệm sodium phosphate IM có pH 7.0 và khi sử dụng chất mang glyoxyl q trình  được thực hiện trong dung dịch đệm sodium carbonate lOOmM có pH 10.05. Trong mọi trường  họp, hệ huyền phù được khuấy nhẹ    25°c. Các dẫn xuất  ổn định hầu hết thu được bằng cách  cố định enzyme trên glutaraldehyde­ agarose, và các chế phẩm enzym có hoạt tính rất cao (95%).  Trong khi đó, các dẫn xuất thu được bằng cách sử dụng amino­epoxide­Sepabead thì có hoạt tính   thấp hơn 10% [17] Việc cố định a­galactosidase sử dụng glutaraldehyde và chất mang được amin hóa có thể  xảy ra theo hai cách. Cách thứ  nhất là sử  dụng chất mang được amin hóa và đã được tiền hoạt  hóa với glutaraldehyde. Cách thứ  hai, trước hết là hấp phụ   enzym  lên chất mang đã được amin  hóa và sau đó xử lí với glutaraldehyde. Với cách thứ nhất,  enzym chỉ trao đổi ion với chất mang,  cuối cùng sẽ  được xử  lí với glutaraldehyde 0.5% (v/v) thì độ  ổn định thu được cao hơn phương   pháp thứ hai. Trong khi đó, ở phương pháp thứ hai, q trình hấp phụ diễn ra nhanh và giữ được  90% hoạt tính, nhưng việc xử lí với glutaraldehyde 0.5% sẽ khơng ảnh hưởng đến hoạt tính của   enzyme [17] Nhiệt độ tối ưu của enzym tự do là 65°c ở pH 7.0, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzym  cố  định là 70°c. Ở  80°c, chế  phẩm tối  ưu có hoạt tính còn lại gấp 2 lần hoạt tính cồn lại của  enzym hòa tan (72% so với 40%). Điều này cho thấy độ ổn định nhiệt của enzym cố  ~ Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c định cao hom enzym hòa tan. Mặt khác, pH tối ưu của enzym hầu như khơng thay đổi sau  khi cố định, pH tối ưu ở 25°c là 4­5 [17] 2.I.34.ứng dụng của enzym rifflnase cố định Các loại đậu đóng vai trò quan trọng trong chế độ ăn truyền thống của nhiều vùng trên thế giới do thực tế chúng có ít chất béo và là nguồn  protein, xơ và các vi chất dinh dưỡng tuyệt   vời. Nguồn isoflavone trong đậu nành cũng nhận được sự  chú ý với vai trò tiềm năng trong việc   điều trị ung thư và lỗng xương. Hơn nữa, sữa đậu nành được xem là nguồn thay thế chi phí thấp   cho sữa bò   các nước đang phát  ữiển như  là sự  bổ  sung các chất dinh dưỡng khơng dung nạp   lactose cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Tuy nhiên, cấc sản phẩm thực phẩm làm từ đậu có chứa nhiều  yếu tố kháng dinh dưỡng, một trong số đó là họ đường  Raffmose oligosaccharide. Niêm mạc một  của con người và dạ dày của các lồi động vật thiếu enzym a­ galactosidase cần thiết cho sự thủy   phân các oligo­saccharide này. Vì thế, khi vào đến một già các oligo­saccharide này sẽ  bị  các vi   sinh vật ở đây lên men và gây ra chứng đầy hơi. Do đó, việc loại bỏ các oligo­saccharide từ thực   phẩm làm từ  đậu nành là một yếu tố  quan trọng trong việc cải thiện giá trị  dinh dưỡng của  chúng. Việc thủy phân họ  đường  raffinose  có thể  được tiến hành trong thiết bị  phản  ứng gián  đoạn hay hên tục [15] Trong thiết bị phản ứng gián đoạn, người ta tiến hành ủ  enzym a­galactosidase cố định từ  Aspergillus oryzae trên chất mang calcium alginate và sữa đậu nành trong thời gian khác nhau là 2,   4, 8 và 12h, cho kết quả thủy phân oligo­saccharide tương ứng là 74%, 78%, 79% và 81%. Với kết   quả đó ta thấy hiệu suất thủy phân trong 2h là 74% trong khi đó việc kéo dài thời gian khơng làm   tăng đáng kể hiệu suất [15] Quấ  trình loại bỏ  oligo­saccharide liên tục được tiến hành trong thiết bị   “fluidized bed  reactor”. Ở 50°c, hiệu suất thủy phân oligo­saccharide là 90%, 78%, 74%, 52% và 35% tương ứng  vói tốc độ dòng chảy là 40, 80, 120, 160 và 200ml.1T1. Những kết quả này cho thấy rằng với tốc  độ  dòng là 40ml.1T1 thì hiệu suất thủy phân đạt cao nhất là 90%. Qua đó cho thấy tốc độ  dòng   chảy tối  ưu là một trong những thơng số  quan trọng  ảnh hưởng đến hiệu quả  hoạt động của   thiết bị “fluidized bed reactor” [15] Ngồi ra, enzym a­galactosidase còn được thu nhận từ  G. fujikuroi và M. vinacea và được  cố  định trên  gel polyacrylamide  cho việc loại bỏ  các oligo­saccharide từ  đậu nành  pH  của sửa  đậu nành là 6.2­Ó.4. pH tối  ưu của a­galactosidase cố định từ  G. fujikuroi là 5.2­5.6 và giữ được  90% hoạt tính ở  pH 6.4. Trong khi đó pH tối ưu của a­galactosidase cố định từ  M. vinacea là 4.0­ 4.5, vì thế phải hạ thấp pH khi tiến hành phản ứng, nhưng khi ờ pH thấp thì /V ~ S ample analyte Bioreceptors Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c Transducer n Signal làm cho protein trong sữa đậu nành bị kết tủa và làm cho sữa cố vị chua. Do đỗ, a­ galactosidase   cổ định từ G. fujikuroi là sMicroelectronics ự lựa chọn tốt hơn trong việc xử lí sữa đậu nành [16] 22.ứng dụng trong phân tích 2.21.Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor) 2.2.11,Giới thiệu về cảm biến sinh học [18] Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp cố khả năng cung cấp thơng tin phân  tích định  lượng  hoặc  bán định  lượng   đặc  trưng,  bao gồm   phần  tử  nhận biết   sinh  học   (bỉoreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần t  chuyển  đổi   (International Union of Pure and  Applied Chemistry) Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các tác nhân sình học như   enzym, các kháng thể,   để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hố chất. Do vậy cấu tạo của cảm biến sinh học bao gồm 3   thành phần cơ bản: thành phần hố học, thành phần sình học và thành phần vật lý ImimobitìSệci enzymes, Microorganisms Imanunõacie n1s DNA, whole cells Flectrocliemical Paten t iữmet ry. amperometry Optical: Absorption, Flu óresceriee, reflection Piưi2TƯưlưCtfiO Data processing Hình 2.1: Mơ hình biosensor 2.2.I2.Lịch sử phát triển căm biến sinh học [18] Giáo sư Leyland D.Clark được biết như là người đi tiẽn phong trong lĩnh vực cảm biến sinh học. Năm 1956, ơng cơng bố bài báo đầu tiên về điện cực oxy hố. Những năm tiếp theo  ơng tiếp tục thực hiện rất nhiều thí nghiệm nhằm cổ  gắng mở  rộng khả  năng hoạt động của   cảm biến như phát hiện được thêm nhiều tác nhân, nâng cao độ chính xác của cảm biến. Vào năm  1962, tại hội nghị  New York Academy of Science, ơng đã thuyết trình một bài về cảm biến sinh  học: ‘Tớ make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or conductometric ị more   intelligent by adding enzyme transducers as membrane enclosed sandwiches” Cảm biến sình học theo mơ hình của D.Clark bao gồm điện cực oxy hóa, trên đó có màng  giữ enzyme glucose oxidase cổ định. Khỉ mật độ glucose trong mơi trường phản ứng /V Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c giảm thì mật độ chất oxi hóa trên bề mặt điện cực cũng giảm một cách tương ứng. Dựa   trên sự thay đổi đó, Clark đã phát hiện ra sự thay đổi của nồng độ  glucose trong mơi trường cần  kiểm tra Những năm tiếp theo, nhóm của Guilbault và Montalvo lần đầu tiên cơng bố  chi tiết về  chế tạo thành cơng cảm biến sinh học dựa trên điện cực chứa  enzyme đo điện thế, một cảm biến  đo nồng độ urê bằng điện cực chọn lọc ion NH4+, có gắn màng cố định urease TT_ Urea  Urease T T _ _ _  ,.TTT+ — ► HCO3 + NH 4 Năm 1975, Lubber và Opitz đã mô tả một cảm biến sợi quang (fiber­optic sensor) gắn các  chất chỉ thị dùng để  đo nồng độ  CO2 và O2. Cũng vào năm 1975, một số vi khuẩn cũng đã được   sử dụng như những thành phần sinh học fren các điện cực vi sinh để đo nồng độ cồn Năm 1975, cơng ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần đầu tiên biến ý tưởng của Clark   thành hiện thực thơng qua việc thương mại hóa các cảm biến sinh học. Sản phẩm đầu tiên là   thiết bị phân tích glucose dựa trên hydrogen peroxide và đó cũng là cột mốc đầu tiên đánh dấu sự  xuất hiện của các cảm biến sinh học trong đời sống _ ß­ D­ Glucose + O2  Glucose oxidase ► D ­ Gluconic acid + H2O2 o năm 1982, Shichiri và các đồng nghiệp đã báo cáo và mơ tả về cảm biến “glucose in  vivo”, là loại cảm biến dạng kim đầu tiên cho các xét nghiệm dưới da Cùng với sự  phát triển nhanh chóng của khoa học và cơng nghệ, đặc biệt là cấc ngành   cơng nghệ vật liệu nano và cơng nghệ thơng tin, cảm biến sinh học cũng đạt được những tiến bộ  vượt bậc, hứa hẹn đưa ra những vi thiết bị  nhằm xác định nhanh, chính xác các loại vi khuẩn,   virus gây bệnh. Các thiết bị này cũng có thể dò tìm hay phân tích lượng mẫu rất nhỏ (cỡ vài nM)   vói độ tin cậy cao 2.2.I2.Phân loại [19] Cảm biến sinh học có thể được phân loại dựa vào thành phần sinh học hoặc thà nh phần  chuyển đổi của chúng. Thành phần sinh học của chúng bao gồm  enzym, kháng thể, vi sinh vật,  mơ sinh học và bào quan ­Khi sự  liên kết giữa yếu tố  cảm biến và chất cần phân tích là biến cố  được phất hiện   (detected event) thì được gọi là cảm biến ái lực (affinity sensor) ­Khi có sự tương tác giữa yếu tố sinh học và chất cần phân tích và đi kèm hoặc theo sau đó là   thay đổi nồng độ  của cơ  chất hoặc sản phẩm thì được gọi là cảm biến trao đổi chất   (metabolism sensor) /V ~ Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c ­ Khi tính hiệu được tạo ra sau sự liên kết của chất cần phân tích và yếu tố sinh học nhưng   khơng có sự thay đổi hóa học của yếu tố sinh học thì cảm biến đó được gọi là cảm biến xúc tác   (catalytic sensor) 2.2.I.4. Các yếu tố sinh học 2.2.1.41.Enzym [19] Như  đã biết  enzym  là  protein có hoạt tính xúc tác cao và đặc hiệu cao đối với cơ  chất.  Chúng được sử dụng để kiểm sốt và phân tích nồng độ của nhiều chất cần phân tích khấc nhau.  Các chế phẩm enzym có sẵn trên thị trường với độ tinh khiết cao là điều kiện thuận lợi cho việc   sản xuất các cảm biến sinh học dùng enzym cố định. Bên cạnh đó, hạn chế chính của các enzyme  là pH, lực ion, các chất kìm hãm, nhiệt độ sẽ  ảnh hưởng đến hoạt tính của  enzym. Hầu hết các  enzym sẽ mất hoạt tính khi nhiệt độ trên 60°c Cấc enzym sử  dụng để  chế  tạo biosensor là các enzym oxy hóa, sử dụng oxy hòa tan và  sản   xuất    hydrogen   peroxide    Enzym  được   cố   định       chuyển   đổi  (transducer)  bằng  phương pháp hấp phụ, liên kết cộng hóa trị, phương pháp bao gói trong khn gel, trong các  polymer  phát sinh điện hóa (electrochemically  generated polymer),  trong màng  lipid  kép  (bilipid  membrane) hoặc dung dịch bên trong màng chọn lọc. Enzym thường được ghép thành đơi với bộ  chuyển đổi điện hóa hoặc bộ chuyển đổi sợi quang học 2.2.1.42.Kháng thể [19] Kháng thể  có bản chất là cấc glycoprotein, do các tế  bào lympho B cũng như  các tương  bào (biệt hổa từ  lympho B) tiết ra để  hệ  miễn dịch nhận biết và vơ hiệu hóa các tấc nhân lạ,   chẳng hạn các vi khuẩn hoặc  virus  Mỗi kháng thể  chỉ  có thể  nhận diện một  epitope  kháng  nguyên duy nhất. Nhiều kháng thể đã được thương mại hóa và được sử  dụng rộng rãi trong xét   nghiệm miễn dịch. Các kháng thể được cố định trên bề mặt bộ chuyển đổi theo phương pháp liên  kết cộng hóa trị sử dụng các nhóm chức như amino, carboxyl, aldehyde hoặc sulfhydryl Cấc mặt hạn chế  khi sử dụng kháng thể  cũng giống như  khi sử  dụng enzym. Hơn nữa  muốn tái tạo và phục hồi bề mặt bộ chuyển đổi cần phải có các điều kiện như  pH thấp, lực ion  lớn, chất làm sạch,  Ưu điểm của các cảm biến kháng thể  là khả  năng phân tích nhanh hơn các  xét nghiệm miễn dịch truyền thống. Cảm biến miễn dịch th ường sử dụng bộ chuyển đổi quang  học hay âm học 2.2.I.43.Vi sinh vật [19] Việc sử dụng vi sinh vật như là yếu tố sinh học trong thiết bị cảm biến sinh học dựa trên   /V ~ Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c q trình trao đổi chất của chúng. Trong hầu hết trường hợp, người ta sẽ đo sự thay đổi điện hóa   học khi tế bào sử dụng oxy hoặc CO2 Tế bào vi sinh vật có lợi thế rẻ hơn so với  enzym và kháng thể, có thể ổn định hơn và có  thể  được sử  dụng trong các phản  ứng phức hợp có sự  tham gia của enzym và các cofactor. Tuy  nhiên, phương pháp này có tính chọn lọc kém hơn so với phương pháp sử   dung enzym, có thời  gian đáp ứng, thời gian phục hồi dài hơn và đòi hỏi phải thường xun tiến hành hiệu chỉnh. Chất   mang thường dùng để cố định là nylon, màng cellulose nitrate, hoặc acetyl cellulose 2.2.I5.Bộ chuyển đổi (transducer) 2.2.1.51.Chuyển đổi điện hóa [19] Bộ  chuyển đổi dòng điện và bộ  chuyển đổi điện áp được dùng phổ  biến trong thiết bị  cảm biển sinh học kiểu điện hóa. Hầu hết, các điện cực được làm bằng kim loại như bạch kim,  vàng, bạc, thép khơng gỉ và các vật liệu bằng  carbon. Những vật liệu này phải trơ ờ điện thế mà  phản ứng điện hóa xảy ra 2.2.1.52.Chuyển đổi quang [19] Chuyển đổi quang là chuyển đổi hoạt động dựa trên cấc hiệu ứng như: hấp thụ ánh sáng   nhìn thấy và tia UV; phát xạ huỳnh quang và lân quang; bio­luminiscence; chemi­ luminiscence Bộ  chuyển đổi quang học là loại đầu dò mà trên đỉnh được cố  định  enzym và một chất  màu (thường là huỳnh quang). Những loại đầu dò này chứa ít nhất hai sợi quang. Một sợi được   nối với một nguồn sáng có thể  phất ra một dãy các bước sóng khác nhau, một sợi được nối với   một diot quang để phát hiện sự thay đổi mật độ quang ở một bước sóng thích họp 2.2.1.53.Chuyển đổi nhiệt [19] Hoạt động dựa trên hiện tượng thay đổi entanpi khi hình thành hoặc phá vỡ  các liên kết  hóa học trong các phản ứng của enzyme. Bộ chuyển đổi này có ưu điểm hoạt động tốt với tất cả  cấc phản ứng. Tuy nhiên, dạng chuyển đổi này có tính chọn lọc thấp 2.2.1.54.Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) [19] Chuyển đổi hoạt động dựa trên ngun lý: tinh thể sẽ thay đổi tần số dao động khi lực tác dụng lên nó thay đổi. Chuyển đổi dạng này có ưu điểm là độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian   phản ứng nhanh, khả năng cơ động cao, có thể sử dụng đo đạc trong mơi trường lỏng và khí 2.21.Cảm biến sinh học sử dụng L­glutamate oxidase và L­glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm /V Ch??ng 2: ?ngd?ng ?? ?n m ?n h?c 2.2.21.Giới thiệu [20] Glutamate là một amino acid được xác định là một nguồn năng lượng và nguồn Nitơ quan  trọng cho các tế bào nhân thật và tế  bào các lồi động vật có vú. Nó hoạt động như  là một chất   dẫn truyền các kích thích thần kinh trong hệ thống thần kinh trung ương và được cho là chịu trách   nhiệm cho một số q trình như là học tập, trí nhớ, sự phát triển của hệ thần kinh. Việc tăng mức  độ  glutamate trong dịch não tủy được cho là ngun nhân của các chứng rối loạn thần kinh như  bệnh đột quỵ, bệnh Alzheimer’s và bệnh Parkinson’s. Ngồi ra, monosodium glutamate được sử  dụng phổ biến làm chất tăng cường hương vi trong thực phẩm. Do đó, việc phát triển thiết bị đo   lường hàm lượng glutamate một cách nhanh chóng và đáng tin cậy là vấn đề quan trọng cần xem   xét và nghiên cứu Một vài kỹ  thuật như  khối phổ, điện mao dẫn, microdialysis và cảm biến sinh học đã   được phất triển để  phân tích  glutamate  Trong số  các phương pháp đó, cảm biến sinh học là  phương pháp được quan tâm và phất triển nhanh nhất. Một vài loại cảm biến sinh học sử dụng   bộ chuyển đổi dòng điện đã được chế  tạo để phát hiện  glutamate trong các ứng dụng khác nhau  như trong chế biến thực phẩm, trong tế bào được ni cấy, trong dịch não ngoại bào (extracellular  brain fluid). Cấc cảm biến sinh học này có độ nhạy và khả năng chọn lọc cao, nhưng cần có các  bước xây dựng và phức họp để  chuẩn bị  các điện cực  enzym  Khơng giống với cấc cảm biến  sinh học dạng chuyển đổi dòng điện, cảm biến sinh học loại chuyển đổi quang học được chế  tạo đơn giản hơn, dễ sử dụng và phất hiện tại chỗ 2.2.22.Phương pháp thí nghiệm 2.2.2.21.Các hóa chất sử dụng [20] Enzym L­glutamate oxidase (L­GLOD) (EC 1.4.3.11, 63Ư/mg protein từ  Streptomuces sp.),  enzym  L­glutamate  dehydrogenase  (L­GLDH)  ((EC  1.4.1.3,   452U/mg  protein  từ  Proteus  sp.),  NADPH, màng polycarbonate (kích thước lỗ 0.4 pm), dung dịch đệm và cấc loại dung dịch khác 2.2.2.22.Sự cố định enzym [20] Người ta sử dụng dung dịch đệm phosphate saline (PBS, pH 7.0) cổ chứa đồng thời cả hai  enzym   Enzym  L­GLOD     L­GLDH     trộn    sau      tạo  liên  kết   chéo  với   màng   polycarbonate. 20pl dung dịch glutaraldehyde và 25pl bovine serum albumin (BSA) được sử dụng  để  nâng cao hiệu suất và sự   ổn định cho cảm biến. Hỗn họp   enzym  được chuẩn bị  vói những  hàm lượng khác nhau vói L­GLDH (35­143.2U) và L­GLOD được giữ cố định  /V ~ Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c }  giá trị  25U. Sau đó, 10 J0.1 được sử  dụng để  cố  định. Màng polycarbonate  sau khi cố  L-GLOD +L-GLDH định được rửa sạch vài lần dung dịch PBS để loại glutaraldehyde dư thừa và các  enzym khơng tạo  liên kết với màng. Màng chứa enzym được bảo quản ở 4°c trong dung dịch PBS chửa trong các túi  polypropylene kín khí 2.2.2.22.Điện cực [20] Điện cực vói đường kính lcm sử dụng dung dịch KC1 là chất điện phân, điện cực dưong   làm bằng bạc, điện cực âm làm bằng vàng. Điện cực oxy được phủ bởi một lớp  polypropylene kị  nước  (để   bảo  vệ   điện  cực  trong  nước)     cho  khí   thấm   qua       lớp  enzym  trên  màng  polycarbonate (kích thước lỗ 0.4|im) được gắn trên điện cực bằng hệ thống  “push cap”. Để phân  tích, người ta sử dụng dung dịch đệm bảo hòa khơng khí với nồng độ  oxy 7­8 ppm ở  25°c. Dung  dịch đệm được loại oxy bằng dung dịch sodium sulfite Hình 2.2: Mơ hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L­GLOD—L­GLDH cổ định 2.2.2.2A. Thử nghiệm [20] Đầu dò được phân cực trong khoảng 30­40 phút mỗi lần trước khi sử  dụng. Việc thử  nghiệm bắt đầu bằng cách thêm MSG ở các nồng độ khác nhau. Lượng oxy tiêu thụ được đo sau   mỗi 2 phút. Để  khơi phục lại độ  bảo hòa oxy 100%, màng cố  định enzym được rửa vài lần với  PBS trước khi tiến hành lần thử nghiệm tiếp theo. Sự khuếch tán oxy từ khơng khí làm giảm hiệu   quả của quấ trình thử nghiệm khi thực hiện với enzym trong dung dịch, để khắc phục vấn đề này   người ta tiến hành thử nghiệm trong thiết bị phản ứng kín khí bằng thủy tinh (12mL) Người ta tiến hành thí nghiệm trong ba trường họp với các nồng độ MSG khác nhau: ­• : Khơng tái sinh cơ chất trong sự vắng mặt của 2mM NADPH và lOmM ammonium ­A :CĨ tái sinh cơ chất trong sự có mặt của 2mM NADPH ­♦ :CĨ tái sinh cơ chất trong sự có mặt của 2mM NADPH và lOmM ammonium ~~ Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c NADP ­ Người ta cũng đã tiến hành tối ưu nồng độ của NADPH và ammonium và nhận thấy giá trị đáp  ứng cho sự ổn định cao nhất là 2mM NADPH và lOmM ammonium NADPHường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L­GLOD­L­ Hình 2.3: Đ GLDH cổ định trong cảm biến sinh học 2.2.2.25.Quá trình phản ứng [20] L­glutamate + H2O ^ ^"^»ả­Ketoglutarate + NH3 (1) Phản ứng (1) xảy ra khi có mặt của MSG, q trình tái sinh cơ chất khơng xảy ra khi khơng có  mặt của NADPH, do NADPH hoạt động như là cofactor của L­GLDH. 0.1mg/L là nồng độ giới  hạn có thể phát hiện của phương trình (1) Với sự có mặt của 2mM NADPH và MSG thì cả hai enzym cùng hoạt động và MSG được   tái sinh như trong phản ứng (2) MSG được chuyển đổi thành a­ketoglutarate trong phản  ứng thứ nhất và là cơ  chất của  phản  ứng thử (2). Việc bổ sung NADPH vào mơi trường phản  ứng tạo điều kiện cho L­ GLDH   thực hiện phản ứng nghịch. Việc nhận biết L­ glutamate cung cấp một sự khuếch đại và giới hạn   phát hiện được xác định là 0.04mg/L. Sự khuếch đại túi hiệu cao hơn được nhận thấy khi có mặt   của ammonium­một sản phẩm phụ của phản ứng (1) và giói hạn nồng độ phất hiện là 0.02mg/L 2.2.2.2.Ổ. Cấu hình nhiệt độ và pH [20] Cảm   biến   có   thể   hoạt   động   tốt     khoảng   pH   4­10   (pH   dung   dịch   đệm   citrate­   phosphate: 4, 5, 6; của sodium phosphate: 7,8; của glycine­NaOH: 9, 10) được đo khi nồng /> / ~ Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c } độ của dung dịch MSG là 1.2mg/L với sự cổ mặt của 2mM NADPH và lOmM ammonium.  pH tối ưu của cảm biến là 7.0 ở nhiệt độ 25±2 °c, trong khi đó pH tối ưu của GLDH khoảng 8.25  và pH tối ưu của GLOD khoảng 8.0 Cảm biến cũng có thể hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ (13±2 đến 55±2 °C) được đo   ở nồng độ MSG là 1.2mg/L. Cảm biến hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 25±2 °c, sau giá trị này cảm  biến bị mất hoạt tính do bị vơ hoạt bời nhiệt độ Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ±2 °c có mặt 2mM NADPH và lOmM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 2.22.21.Xác định giá trị Km và Y max [20] Giá trị Km xác định cho cặp L­GLOD­LGLDH cũng giống như cho một mình L­ GLOD. Vận tốc ban đầu của phản ứng là hàm số của nồng độ cơ chất theo động học ‘Michaelis­ Menten’. Km và Vmax được xác định theo phương pháp Lineweaver­Burk Giá trị  Km  biểu kiến được xác định là 0.445 lmM với sự  có mặt của 2mM NADPH và  lOmM ammonium. vmaxxảc định được trong cùng điều kiện trên là 3.07mg/(L.min) Giấ  trị  Km   Vmax  biểu kiến trong điều kiện khơng tái sinh cơ  chất (chỉ  có L­GLOD   hoạt động) tương ứng là 1.9222mM và 13.245mg/(Lmin) so với Km của L­GLOD ờ dạng tự do là  0.21 mM. Vì thế, khi cặp L­GLOD­LGLDH được sử dụng thì giá trị Km tăng xấp xỉ 2  ~~ Ch??ng 2: ?ng d?ng ?? ?n m ?n h?c lần, khỉ sử dụng chì một mình L­GLOD thì giá trị K,n tăng hom 9 lần. Giá trị Km cao hom  thu được khỉ cố định enzym là do ái lực của enzym với cơ chất giảm, cũng cỗ thể là do sự căn ttở  trung tâm hoạt động của enzym trong q trình cổ định 2.2.2.2.8. Sự ổn định của màng cế định [20] Sự ổn định củã màng được phẫn tích trong chu kì 60 ngày. Màng chứa enzym được bảo quản trong dung dịch đệm phosphate 0.2M, pH 7.0, nhiệt độ  4°c trong tui polypropylene km  khí. Q trình phân tich được thực hiện mễi 3 ngày một lần với 0.8mg/L MSG. Màng chứa cặp   enzym  L­GLOD­L­GLDH vẫn giữ  được 80% hoạt tính ban đầu sau 30 ngày  ứng với GLOD=   25U; GLDH= 35Ư và 39 ngày ứng với GLOD= 25Ư; GLDH= 143.2Ư với sự hiện diện của 2mM   NADPH và lOmM ammonium. Trong khỉ đỗ, màng chì cố  định enzym L­ GLOD (25U) giữ được  80% hoạt tính ban đầu thậm chí sau 48 ngày Hình 2.6: Hoạt tính của enzym cổ định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: A L­  GLOD 25U­L­GLDH143 2U; m L­GLOD 25U­L­GLĐH 35U; ÌL­GLOD 25U Trong những nghiên  cứu gần đây, người tã nhận thấy rằng một lượng nhỏ GLDH khơng duy trì được hoạt tính của enzym, điều này cố thể là sự vơ hoạt hoặc rò rỉ enzym. Sự ổn định của biosensor trong q trình bảo quăn cao nhất khỉ hoạt độ của GLDH là 143.2U và của GLOD là 25Ư TÀI LIỆU THAM KHẢO   1.Wolfgang Aehale, Enzymes in Industry, Copyright © 2004 WILEY­VCH Verlag GmbH & Co.KGa, Weinheim 2.Parmjit s. Panesar, Shweta Kumari, and Reeba Panesar, Potential Applications of Immobilized p­Galactosidase in Food Processing Industries, SAGE­Hindawi Access to Research, Enzyme Research, Volume 2010, Article ID 473137, 16 pages 3.M.L. Foresti, M.L. Ferreha,  Chito san­immobilized lipases for the catalysis of fatty acid esterifications,  Enzyme and Microbial Technology 40 (2007) 769­777 4.Yin Hoon Chew, Lee Suan Chua, Kian Kai Cheng, Mohamad Roji Sarmidi, Ramlan Abdul Aziz, Chew Tin Lee,  Kinetic study on the hydrolysis of palm olein using immobilized lipase, Biochemical Engineering Journal 39 (2008) 516­520 5.K.N. Kilcawley, M.G. Wilkinson,P.F.Fox, Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations from microbial or animal sources, Enzyme and Microbial Technology 31 (2002) 310­320 6.G.D. Haki, S.K. Rakshit,  Developments in industrially important thermostable enzymes: a review,  Bioresource Technology 89 (2003) 17­34 7.V . Ramachandra Murty*, Jayadev Bhat, and P. K. A. Muniswaran , Hydrolysis of Oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: A Review, Biotechno 1. Bioprocess Eng. 2002, 7: 57­66 8.José  M   Palomo,   Gloria   Munoz,   Gloria   Fernandez­Lorente,   Cesar   Mateo,   Roberto  Fernândez­Laiuente*,  José  M  Guisấnl,  Interfacial   adsorption   of   lipases   on   very   hydrophobic   support   (octadecyl­Sepabeads)   immobilization,   hyperactivation   and stabilization of the open form of lipases, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 19­20 (2002) 279­286 9.S.­W. Chang, J.­F. Shaw, K.­H. Yang, S.­F. Chang, C.­J. Shieh,  Studies of optimum conditions for covalent immobilization of Candida rugosa lipase on poly(c­glutamic acid) by RSM, Bioresource Technology 99 (2008) 2800­2805 10.Dasciana s. Rodrigues, Adriano A. Mendes, Wellington  s. Adriano, Luciana R.B. Goncalves,Raquel.  L.c. Giordano, Multipoint   covalent immobilization of microbial Upas on chitosan and agarose activated by different methods, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 51 (2008) 100­109 /V Do an m on hoc ?? ?n m ?n h?c T?i li?u tham  kh?o 11 Tài liệu tham khảo ll.Seema S.Betigeri, Steven H.Neau, Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads, Biomaterials 23 (2002) 3627­3636 12.Keehoon Won,  Sangbum  Kim, Kwang­Je Kim, Hong Woo Park, Sang­Jin Moon,  Optimization of  lipase entrapment  in Ca­ alginate gel beads, Process Biochemistry 40 (2005) 2149­2154 13.Paramita Mahapatra, Annapurna Kumari, Vijay Kumar Garlapati, Rintu Banerjee, Ahindra Nag, Enzymatic synthesis offruit flavor esters by immobilized lipase from Rhizopus oligosporus optimized with response surface methodology, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 14.Wiphum   Kaewthong,   Sarote   Sirisansaneeyakul,   Poonsuk   Prasertsan,   Aran   H­Kittikun,  Continuous   production   of monoacylglycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase, Process Biochemistry 40 (2005) 1525­1530 15.S.J. Prashanth, V.H. Mulimani, Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzae­galactosidase immobilized in calcium alginate, Process Biochemistry 40 (2005) 1199­1205 16.S   Thippeswamy,   V.H   Mulimani,  Enzymic   degradation   of   raffinose   family   oligosaccharides   in   soymilk   by   immobilized   a­ galactosidase from Gibberella fujikuroi, Process Biochemistry 38 (2002) 635/640 17.Miguel   Filho,   Benevides   C   Pessela,   Cesar   Mateo,   Alfonso   V   Carrascosa,   Roberto   Fernandez­Lafuente,   Jose   M   Guis'   an, Immobilization—stabilization   of   an   ­galactosidase   from   Thermus   sp   strain   T2   by   covalent   immobilization   on   highly   activated supports: Selection of the optimal immobilization strategy, Enzyme and Microbial Technology 42 (2008) 265­271 18.Saraju P.Mohanty and Elias Kougianos ,Biosensors: A tutorial review 19.Jose " I. Reyes De Corcuera, Ralph P. Cavalieri, Biosensors, Washington State University, Pullman, Washington, U.S.A 20.Anjan Kumar Basu, Parimal Chattopadhyay, Utpal Roychudhuri, Runu Chakraborty,  Glutamate optical biosensor based on the immobilization of glutamate dehydrogenase in titanium dioxide sol­gel matrix, , Department of Food Technology and Biochemical Engineering, Jadavpur University, Kolkata 700032, India /V ~ ... 1.24.Các phương pháp cố định enzym 1.25.Vật liệu cố định   5 1.26.Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme  Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 21 .ứng dụng trong công nghệ thực phẩm...  dàng sau phản  ứng và độ  bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do 1.23.Ưu nhược điểm của enzym cố định [1] Ưu điểm: Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài Enzym cố định khơng lẫn vào trong sàn phẩm cuối của phản ... nghiên cứu về cố định enzym cũng như ứng dụng enzym cố định vào sản xuất cơng nghiệp 1.24.Các phương pháp cố định enzym [1] Các phương pháp cố định enzym được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý