Quy trình nhân giống dâu tây in vitro

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài 2. Đặt vấn đề Cây dâu tây còn có tên khoa học là Fragaria thuộc chi Fragaria, trên thế giới có khoảng 20 loài. Tại nước ta cây dâu tây chủ yếu được trồng tại Đà Lạt (Lâm Đồng). Cây dâu tây được coi như là cây trồng tiềm năng tại Đà Lạt. Dâu tây được trồng khá lâu ở Đà Lạt. Tuy nhiên những năm gần đây diện tích dâu tây giảm dần do thoái hóa giống, đồng thời thiếu nguồn cung cấp giống dâu tây ổn định và sạch bệnh. Do vậy cần phát triển nhân giống cây dâu tây theo công nghệ là vấn đề bức thiết đặt ra. Việc áp dụng nghành công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào công nghệ nhân giống dâu tây, đã và đang được các nhà khoa học áp dụng. Mang lại những kết quả khả quan cho việc cải thiện diện tích dâu tây ở Đà Lạt. 3.Tình hình nghiên cứu Cây dâu tây là cây có nhiều nguồn lợi kinh tế, chính vì nguồn lợi kinh tế đó mà việc đầu tư cho những nghiên cứu tại các Cơ quan nghiên cứu nhiều tiêu biểu trong đó có Phân viện sinh học Tây nguyên, Trung tâm nghiên cứu Khoai tây rau và hoa, trung tâm nghiên cứu và ứng dụng nông nghiệp Lâm Đồng… Dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống và cung cấp cây giống dâu tây sạch bệnh, số lượng lớn cho các vùng trồng dâu tây trong tỉnh Lâm Đồng” do Viện Sinh học Tây Nguyên chủ trì đã đặt ra -1- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng mục tiêu: Hoàn thiện công nghệ nhân giống và trồng dâu tây, tạo ra cây giống dâu sạch bệnh có chất lượng tốt đồng thời, xây dựng một số mô hình trong dân. Do PGS.TS Dương Tấn Nhựt - Phó Viện trưởng Viện Sinh học Tây Nguyên chủ nhiệm. Qua dự án này dựa trên trên công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật làm nền tảng thu hút nhiều quan tâm của các nhà khoa học tại đây. Sau nhiều năm thực hiện dự án việc tạo giống dâu bằng mô tế bào đã thành công. Không chỉ vậy, phân viện sinh học Tây Nguyên ngày càng phát triển qui mô nhân giống cây dâu tây. Cũng như Phân viện sinh học Tây Nguyên việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào quá trình công nghệ sản xuất giống. Nhằm cung ứng giống dâu tây sạch cho nông dân trong vùng. Ngoài ra dưới sự chỉ đạo của TS Phạm Xuân Tùng (Nguyên giám đốc Trung Tâm Nghiên cứu Khoai tây Rau và Hoa Đà Lạt) những năm 2007-2008 dự án “Giữ quĩ gene giống dâu sạch bệnh tại Đà Lạt” tại Trung Tâm nghiên cứu Khoai Tây, rau và Hoa (Trực thuộc Viện khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam). Tại trung tâm, giống dâu tây được xem là nguồn giống quan trọng, trung tâm đã phát triển nhiều giống dâu nhưng chủ yếu là các giống như: Mỹ đá, Langbiang, New Zealand Biện pháp nhân giống in vitro được thực hiện cho thấy thu lại hiệu quả không nhỏ những năm sau đó.Hiện tại Trung Tâm là địa chỉ đáng tin cậy trong việc cung cấp giống dâu tây in vitro. Cây dâu tây được xây dựng nhiều dự án tại trung tâm ứng dụng kỹ thuật nông nghiệp lâm đồng như các dự án “Xác lập qui trình nhân giống dâu tây mới ở Đà Lạt”, hay dự án “Nâng cao tỷ lệ sống cây -2- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng dâu tây giai đoạn sau ống nghiệm” dưới sự chỉ đạo của giám đốc Trần Thị Kim Duyên, và sự tham gia của các kỹ sư tại trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng kỹ thuật nông nghiệp Lâm Đồng nhằm mục đích phát triển nhân giống dâu tây nhằm chuyển giao công nghệ cho nông dân tại Đà Lạt và Lạc Dương thuộc tỉnh Lâm Đồng. 4. Mục đích nghiên cứu Tìm hiểu qui trình nhân giống cây dâu tây in vitro . Khảo sát điều kiện sinh trưởng của cây dâu tây trong qui trình trong phòng thí nghiệm. 5. Nội dung nghiên cứu: Tiến hành khảo sát các bước nhân giống in vitro cây dâu tây từ bước nhập mẫu cho đến lúc ra vườn ươm xuất giống. 6. Phương pháp nghiên cứu: Theo dõi tỷ lệ sống xót của cây ở nồng độ khử trùng và thời gian khác nhau. Khảo sát sự phát triển của chồi ở nồng độ BA khác nhau. Khảo sát khả năng ra rễ cây khi bổ sung NAA ở nồng độ khác nhau. 7. Kết quả đạt được: Theo dõi nồng độ và thời gian thích hợp để phát triển cây dâu tây. Chọn môi trường bổ sung chấ thích hợp quá trình nhân chồi và phát triển của cây. -3- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro 1.2.1.Giới thiệu Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho pháp tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến sinh học, sinh hóa học di truyền và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loại cây quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con người. 1.1.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào -4- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công. Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống của việc nuôi cấy tế bào cà chua. Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hoàn chỉnh. Sau đó có rất nhiều nhà khoa học đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được nuôi cấy. Năm 1951, Skoog và Miler đã phát hiện ra hợp chất để điều khiển sự nhân chồi. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay. Năm 1960- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy điỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên thương mại hóa.Từ đó dến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều và được ứng dụng thương mại hóa. -5- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Hình 1.1. Cây lan mô trong phòng thí nghiệm 1.1.3. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp thực tiễn sản xuất và đời sống. 1.1.3.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản. Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, ta có thể so sánh đặc tính cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra những tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho pháp tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh chồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa là mô sẹo, từu mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ưu thế mà các nhà khoa học sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việc của mình. -6- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các qui luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể nghiên cứu mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ. Như vậy rõ ràng nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó tìm ra những cơ chế miễn dịch của thực vật giúp cho việc phòng bệnh cây tốt hơn và đỡ tốn kém hơn. 1.1.3.2. Về mặt thực tiễn sản xuất Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để đảm bảo và nhân nhanh các cây quí, có kinh tế giá trị cao. Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trong công tac cây giống cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cây mô, trong thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối lớn có họat chất: sinh khối tạo ra vẫn giữ nguyên thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid. Glycosid dùng trong y học, chất dinh dưỡng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh truởng của các vi sinh vật trong nông nghiệp. -7- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Hình 1.2. Qui trình nhân giống cây chuối trong ống nghiệm 1.2. Các thiết bị cơ bản trong phòng nuôi cấy in vitro 1.2.1. Phòng rửa và cất nước - Máy cất nước một lần. - Máy cất nước 2 lần. 1.2.2. Phòng hấp sấy - Nồi hấp Autoclave. - Tủ sấy: 60 o C-200 o C. 1.2.3. Phòng chuẩn bị môi trường - Cân phân tích (chính xác đến 0.0001). - Cân kỹ thuật (chính xác 0.001). - Máy đo pH. - Tủ lạnh. -8- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng - Lò vi sóng. 1.2.4. Phòng thí nghiệm và nuôi cấy - Tủ cấy vô trùng. - Quạt thông gió. - Đèn tử ngọai treo trên tường. Hình 1.3. Phòng nuôi cấy mô (Phòng này để phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền). - Kính hiển vi hai mắt (độ phóng đại 1000 lần). - Kính lúp hai mắt (độ phóng đại 75 lần). - Hệ thống đèn chiếu. - Máy phổ kế… 1.2.5. Phòng chứa mẫu - Kệ chất mẫu. - Bóng đèn, ổn áp… -9- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Hằng Hình 1.4. Phòng chất cây 1.3. Nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh 1.3.1. Nuôi cấy nốt đơn thân 1.3.1.1. Phương pháp Sử dụng chồi ngọn hoặc chồi mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ được kích thích tăng trưởng thành cây nguyên vẹn. Chồi được thu từ chồi ngọn hoặc ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trường dinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng. Chồi mới tăng trưởng mang nhiều lá và tiếp tụ nhân nhanh để đạt đến số lượng cần thiết. Chồi sẽ được cảm ứng cho ra rễ để thành cây hoàn chỉnh và được chuyển ra đất trồng. 1.3.1.2 . Những điểm chú ý trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân - Phương pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp như hoa hồng (như cúc đồng tiền) và khi mẫu cấy có khả năng nhiễm cao. Đối với những cây này phải sử dụng phương pháp nhân chồi đỉnh. -10- [...]... thể nhân giống in vitro: Mẫu cấy trên môi trường để tạo thể nhân giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác Nhân giống in vitro: Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân. .. giống sạch bệnh và trẻ hóa được giống cây 1.7.2.2 Các bước nhân giống dâu tây in vitro Trước khi đi sâu vào qui trình nhân giống cây dâu tây, ta sẽ đi tổng quát các bước nhân giống in vitro Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy: Mẫu cấy là mảnh mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy Để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm... Nguyễn Thị Thu Hằng có đặc tính sinh lí giống kinetin Nhiều hợp chất có hoạt tính cytokinin, chúng đều là apminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6, ví dụ như BA Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin và cytokinin tác động trên cả 2 bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào Trong nuôi cấy mô nghèo cytokinin (mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu) auxin kích thích sự phân đôi nhiễm... hợp chất này xuất phát từ purine adenin, một trong cac base của DNA và hợp chất cytokinin đầu tiên được khám phá ra là kinetine, tiếp theo là zeatin một chất có trong phần lớn thực vật và một vài vi khuẩn cấu trúc gần giống kinetine nhưng hoạt tính cao hơn gấp 10 lần Sau zeatin hơn 30 cytokinin khác nhau được cô lập Ngày nay, cytokinin để chỉ một hợp chất tự nhiên hay nhân tạo, -24- Khóa luận tốt nghiệp... nhiễm sắc thể, thậm chí là tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách: sự phân vách chỉ xảy ra khi cytokinin ngoại sinh Cytokinin giúp đỡ sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Trong thân và rễ, cytokinin cản trở sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng lá tế bào lá trưởng thành Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C... pháp nhân giống dâu tây 1.7.2.1 Phương pháp truyền thống Cắt cành từ cây mẹ Phương pháp này hệ số nhân giống thấp cây dễ bị hoái hóa, đồng thời rễ cây yếu Phương pháp này không đảm bảo sạch bệnh cây bị tryền bệnh từ đời này sang đời khác Phương pháp nhân giống in vitro: Sử dụng chồi cây tiến hành nhân giống trong phòng thí nghiệm, lúc này cây sẽ được nuôi cấy một cách hoàn chỉnh nhanh chóng, ta được giống. .. từng loại mẫu) cấy chuyễn những mẫu sạch sang môi trường nhân nhanh 1.7.Giới thiệu và phân loại dâu tây 1.7.1 Nguồn gốc và phân loại dâu tây Dâu tây có tên khoa học là Fragaria hay còn gọi là dâu đất là một loài thuộc họ hoa hồng Xuất sứ từ châu Mỹ và được các nhà làm vườn châu Âu lai tạo thế kỷ 18 và tạo ra giống dâu ngày nay Hình thái quả dâu tây là một loại quả giả, nghĩa là phần thịt không bắt nguồn... kế tiếp trong quá trình thực vật sinh sản hữu tính và ngay cả vô tính in vitro Trong đỉnh sinh trưởng của mô thực vật có dự cạnh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo tế bào con Ở vùng mô phân sinh trong suốt quá trình phân chia tế bào, khả năng sinh tổng hợp nucletic acid được tận dụng để phân chia tế bào sẽ gây bất lợi cho quá trình tăng sinh của virus Để... trọng trong nhân giống bằng cách tạo cụm từ chồi mô sẹo Trong môi trường nhân giống giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thuờng là môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài... 1.6.3.4.Vitamin Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Chúng cần vitamin để xúc tác nhiều quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng.các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamin (B1), acid nicotinic, piridorxite (B6) và mio- inositol . tin cậy trong việc cung cấp giống dâu tây in vitro. Cây dâu tây được xây dựng nhiều dự án tại trung tâm ứng dụng kỹ thuật nông nghiệp lâm đồng như các dự án “Xác lập qui trình nhân giống dâu. phát triển nhân giống dâu tây nhằm chuyển giao công nghệ cho nông dân tại Đà Lạt và Lạc Dương thuộc tỉnh Lâm Đồng. 4. Mục đích nghiên cứu Tìm hiểu qui trình nhân giống cây dâu tây in vitro . . viện sinh học Tây nguyên, Trung tâm nghiên cứu Khoai tây rau và hoa, trung tâm nghiên cứu và ứng dụng nông nghiệp Lâm Đồng… Dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống và cung cấp cây giống dâu tây