Quy trình nhân giống dâu tây in vitro

Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro 1.2.1.Giới thiệu Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật tế b

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

2 Đặt vấn đề

Cây dâu tây còn có tên khoa học là Fragaria thuộc chi

Fragaria, trên thế giới có khoảng 20 loài Tại nước ta cây dâu tây chủ

yếu được trồng tại Đà Lạt (Lâm Đồng)

Cây dâu tây được coi như là cây trồng tiềm năng tại Đà Lạt.Dâu tây được trồng khá lâu ở Đà Lạt Tuy nhiên những năm gần đâydiện tích dâu tây giảm dần do thoái hóa giống, đồng thời thiếu nguồncung cấp giống dâu tây ổn định và sạch bệnh Do vậy cần phát triểnnhân giống cây dâu tây theo công nghệ là vấn đề bức thiết đặt ra

Việc áp dụng nghành công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vậtvào công nghệ nhân giống dâu tây, đã và đang được các nhà khoa học

áp dụng Mang lại những kết quả khả quan cho việc cải thiện diện tíchdâu tây ở Đà Lạt

3.Tình hình nghiên cứu

Cây dâu tây là cây có nhiều nguồn lợi kinh tế, chính vì nguồnlợi kinh tế đó mà việc đầu tư cho những nghiên cứu tại các Cơ quannghiên cứu nhiều tiêu biểu trong đó có Phân viện sinh học Tâynguyên, Trung tâm nghiên cứu Khoai tây rau và hoa, trung tâm nghiêncứu và ứng dụng nông nghiệp Lâm Đồng…

Dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống và cung cấp câygiống dâu tây sạch bệnh, số lượng lớn cho các vùng trồng dâu tâytrong tỉnh Lâm Đồng” do Viện Sinh học Tây Nguyên chủ trì đã đặt ra

mục tiêu: Hoàn thiện công nghệ nhân giống và trồng dâu tây, tạo racây giống dâu sạch bệnh có chất lượng tốt đồng thời, xây dựng một số

mô hình trong dân Do PGS.TS Dương Tấn Nhựt - Phó Viện trưởngViện Sinh học Tây Nguyên chủ nhiệm Qua dự án này dựa trên trêncông nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật làm nền tảng thu hút nhiềuquan tâm của các nhà khoa học tại đây Sau nhiều năm thực hiện dự ánviệc tạo giống dâu bằng mô tế bào đã thành công Không chỉ vậy, phânviện sinh học Tây Nguyên ngày càng phát triển qui mô nhân giống câydâu tây

Cũng như Phân viện sinh học Tây Nguyên việc áp dụng côngnghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào quá trình công nghệ sản xuấtgiống Nhằm cung ứng giống dâu tây sạch cho nông dân trong vùng.Ngoài ra dưới sự chỉ đạo của TS Phạm Xuân Tùng (Nguyên giám đốcTrung Tâm Nghiên cứu Khoai tây Rau và Hoa Đà Lạt) những năm2007-2008 dự án “Giữ quĩ gene giống dâu sạch bệnh tại Đà Lạt” tạiTrung Tâm nghiên cứu Khoai Tây, rau và Hoa (Trực thuộc Viện khoahọc kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam) Tại trung tâm, giống dâu tâyđược xem là nguồn giống quan trọng, trung tâm đã phát triển nhiềugiống dâu nhưng chủ yếu là các giống như: Mỹ đá, Langbiang, New

Zealand Biện pháp nhân giống in vitro được thực hiện cho thấy thu

lại hiệu quả không nhỏ những năm sau đó.Hiện tại Trung Tâm là địa

chỉ đáng tin cậy trong việc cung cấp giống dâu tây in vitro.

Cây dâu tây được xây dựng nhiều dự án tại trung tâm ứngdụng kỹ thuật nông nghiệp lâm đồng như các dự án “Xác lập qui trìnhnhân giống dâu tây mới ở Đà Lạt”, hay dự án “Nâng cao tỷ lệ sống cây

dâu tây giai đoạn sau ống nghiệm” dưới sự chỉ đạo của giám đốc TrầnThị Kim Duyên, và sự tham gia của các kỹ sư tại trung tâm Nghiêncứu Ứng dụng kỹ thuật nông nghiệp Lâm Đồng nhằm mục đích pháttriển nhân giống dâu tây nhằm chuyển giao công nghệ cho nông dântại Đà Lạt và Lạc Dương thuộc tỉnh Lâm Đồng.

4 Mục đích nghiên cứu

Tìm hiểu qui trình nhân giống cây dâu tây in vitro

Khảo sát điều kiện sinh trưởng của cây dâu tây trong qui trìnhtrong phòng thí nghiệm

5 Nội dung nghiên cứu:

Tiến hành khảo sát các bước nhân giống in vitro cây dâu tây từ

bước nhập mẫu cho đến lúc ra vườn ươm xuất giống

6 Phương pháp nghiên cứu:

Theo dõi tỷ lệ sống xót của cây ở nồng độ khử trùng và thờigian khác nhau

Khảo sát sự phát triển của chồi ở nồng độ BA khác nhau

Khảo sát khả năng ra rễ cây khi bổ sung NAA ở nồng độ khácnhau

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro

1.2.1.Giới thiệu

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro

đều là thuật ngữ mô tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn,

mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường chất dinh dưỡngthích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinhtrưởng thực vật trong điều kiện vô trùng

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho pháp tái sinh chồihoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng.Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính

cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởngcủa các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy Hiệnnay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật đểnghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến sinh học, sinh hóa học ditruyền và cấu trúc thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mởrộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loại cây quan trọng, cógiá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của conngười

1.1.2 Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào

Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ýtưởng nuôi cấy mô của sinh vật ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bàoquá chuyên biệt nên không thành công.

Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sựsống của việc nuôi cấy tế bào cà chua

Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôicấy ngọn Ông đã thành công trong việc chuyển cây sen cạn từ môitrường nuôi cấy tối thiểu Tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hoànchỉnh Sau đó có rất nhiều nhà khoa học đã khám phá ra những thànhphần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào đượcnuôi cấy

Năm 1951, Skoog và Miler đã phát hiện ra hợp chất để điềukhiển sự nhân chồi

Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôicấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trườngcủa họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫncòn được sử dụng rộng rãi cho đến nay

Năm 1960- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tínhlan bằng nuôi cấy điỉnh sinh trưởng Từ kết quả đó, lan được xem làcây nuôi cấy mô đầu tiên thương mại hóa.Từ đó dến nay, công nghệnuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trênnhiều và được ứng dụng thương mại hóa

Hình 1.1 Cây lan mô trong phòng thí nghiệm

1.1.3 Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vôcùng to lớn với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thờiđóng góp trực tiếp thực tiễn sản xuất và đời sống

1.1.3.1 Về mặt lý luận sinh học cơ bản.

Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâusắc bản chất của sự sống Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, ta có thể

so sánh đặc tính cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi

cơ thể, từ đó rút ra những tương quan giữa các bộ phận trong cây.Thực tế đã cho pháp tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh chồi từ

đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa là mô sẹo, từu mô sẹo có thểkích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh Đây là ưu thế mà các nhà khoahọc sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việccủa mình

Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn mộtcách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể Phươngpháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo

ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt Điềunày tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các qui luật sinh trưởng,phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài Từ đó có thểtìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướngmong muốn Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể nghiêncứu mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ Như vậy rõ ràng nhiều vấn đề

về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản Từ đó tìm ra những cơchế miễn dịch của thực vật giúp cho việc phòng bệnh cây tốt hơn và đỡtốn kém hơn

1.1.3.2 Về mặt thực tiễn sản xuất

Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để đảm bảo và nhânnhanh các cây quí, có kinh tế giá trị cao Hiện nay, phương pháp nàyngày càng phổ biến trong công tac cây giống cây trồng Bằng phươngpháp nuôi cây mô, trong thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khốilớn có họat chất: sinh khối tạo ra vẫn giữ nguyên thuộc tính, nghĩa làvẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid Glycosiddùng trong y học, chất dinh dưỡng trong công nghiệp thực phẩm,những chất kìm hãm sinh truởng của các vi sinh vật trong nông nghiệp

Hình 1.2 Qui trình nhân giống cây chuối trong ống nghiệm

1.2 Các thiết bị cơ bản trong phòng nuôi cấy in vitro

- Lò vi sóng.

1.2.4 Phòng thí nghiệm và nuôi cấy

- Tủ cấy vô trùng

- Quạt thông gió

- Đèn tử ngọai treo trên tường

Hình 1.3 Phòng nuôi cấy mô

(Phòng này để phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền)

- Kính hiển vi hai mắt (độ phóng đại 1000 lần)

Hình 1.4 Phòng chất cây 1.3 Nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh

1.3.1 Nuôi cấy nốt đơn thân

số lượng cần thiết Chồi sẽ được cảm ứng cho ra rễ để thành cây hoànchỉnh và được chuyển ra đất trồng

1.3.1.2 Những điểm chú ý trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân

- Phương pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp nhưhoa hồng (như cúc đồng tiền) và khi mẫu cấy có khả năng nhiễm cao.Đối với những cây này phải sử dụng phương pháp nhân chồi đỉnh

- Để giảm khả năng nhiễm, nên chọn những ngọn còn khép kín Nềncây bị nhiễm từ bên trong thì tốt nhất là sử dụng phương pháp nuôi cấyđỉnh sinh trưởng.

- Tốc độ nhân giống phụ thuộc vào sồ lượng chồi có sẵn Chồi tăngtrưởng tạo ra càng nhiều lá thì số lượng chồi bên càng nhiều dẫn đến

sự tăng tốc độ nhân giống

- Các chồi được trẻ hóa, đặc biệt là các chồi thân gỗ, tăng trưởngnhiều hơn so với chồi trưởng thành

- Sự tạo rễ trên các chồi trưởng thành khó thực hiện vì vậy cần trẻhóa chồi để cảm ứng sự ra rễ

Phương pháp này đã thực hiện thành công trên một số đối tượng: câymăng tây, khoai tây,lê, cà chua,dưa chuột

1.3.2 Nuôi cấy chồi bên

Về nguyên tắc phương pháp tương tự nuôi cấy nốt đơn thân.Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sựkéo dài chồi thông thường là cytokinin là yếu tố phát triển

Trong phương pháp nhân nhanh chồi bên, chồi được cô lậptrong môi trường dinh dưỡng và các chồi bên của lá nách phát triểndưới ảnh hưởng của cytokynin với nồng độ cao Vai trò của cytokininlúc này là hạn chế ưu tính ngọn đề cho các chồi bên phát triển Cácchồi bên này tiếp tục chuyển sang môi trường mới chứa cytokinin thìcác chồi bên mới lại tiếp tục tạo ra Sau đó các chồi được đưa ra môitrường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi rễ đã dược hoànchỉnh

Thực tế, cả hai phương pháp này thường được áp dụng chung:Đầu tiên chồi tăng trưởng bình thường, sau đó bổ sung cytokinin vàomôi trường nuôi cấy kích thích chồi bên.

Phương pháp nhân giống chồi bên được tiến hành đầu tiên trên cẩmchướng, dâu tây, cúc đồng tiền Hiện nay, phương pháp này được ápdụng nhiều loài thực vật phổ biến là cây ăn trái

1.3.3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nhiễm virus là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởnglớn đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Đặc biệt, viruschuyển sang cac thế hệ kế tiếp trong quá trình thực vật sinh sản hữu

tính và ngay cả vô tính in vitro.

Trong đỉnh sinh trưởng của mô thực vật có dự cạnh tranh giữa

sự sinh sản của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo tếbào con Ở vùng mô phân sinh trong suốt quá trình phân chia tế bào,khả năng sinh tổng hợp nucletic acid được tận dụng để phân chia tếbào sẽ gây bất lợi cho quá trình tăng sinh của virus

Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch virus làm nguồn mẫu

cho nuôi cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau

đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này Nếu đỉnh sinh trưởng

cô lập đang ở trạng thái hoạt động thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn.Nếu như đỉnh sinh trưởng được cô lập có kích thước lớn thì cơ hội thuđược cây sạch bệnh thấp

Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng nhữngcây trồng cây trồng quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily Một số

cây thân gỗ như anh đào, mâm xôi, nho cũng được nuôi cấy đỉnhsinh trưởng để nuôi cấy sạch bệnh.

1.3.4 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật tạo cây đơnbội kép (DH, double haploid) Phương pháp tạo cây đơn bội kép vàchọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất caođặc biệt là nếu được kết hợp với các biện pháp tạo biến dị di truyềnkhác như lai hữu tính gây đột biến nhân tạo Đây là kỹ thuật khôngphức tạp nhưng có hiệu quả trong chọn lọc cây trồng, nhất là với câytrồng có hạt như lúa Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đượcphát triển thành phương pháp chọn tạo giống đơn bội Sử dụng phươngpháp này các nhà chọn tạo giống lúa đã rút ngắn thời gian và cũnggiảm bớt chi phí về lao động, không cần thiết tạo ra các dòng thuần

1.4 Một số hệ thống nuôi cấy mới

1.4.1 Nuôi cấy lỏng sục khí- Bioreactor

Hiện nay, hầu hết các hệ thống vi nhân giống được thực hiệntrên những hệ thống bình nuôi cấy khác nhau nhưng đều có điểmchung mẫu cấy phát triển trên môi trường đặc

Nuôi cấy trên môi trường đặc chủ yếu trên những thiết bị nuôicấy có kích thước nhỏ nên môi trường không đủ đáp ứng cho sự pháttriển lâu dài của mẫu cấy Hơn nữa nuôi cấy trên môi trường đông đặc,môi trường bị lãng phí do cây không hấp thu hết các chất dinh dưỡng ởđáy bình nuôi cấy

Các hệ thống nuôi cấy trong môi trường lỏng trên máy lắc banđầu dựa trên mô hình cấy vi sinh và tế bào động vật nhằm phục vụ chonghiên cứu nuôi cấy và thu nhận các hợp chất thứ cấp.

Mẫu cấy trong môi trường lỏng có khả năng tăng trưởng nhanhhơn môi trường đông đặc Có thể do mẫu cấy tiếp xúc hoàn toàn trongmôi trường

Ngày nay, hệ thống bioreactor với cấu trúc của các bình lênmen và các cánh khuấy bằng kim loại được thay bằng silicon sục khí,

có thể điều khiển được tốc độ dòng khí để hạn chế những tương tác bấtlợi của mẫu cấy, hạn chế sự tổn thương của mẫu Vì thế, hệ thốngbioreactor được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như:nuôi cấy chồi và phôi thực vật, chồi hoa thu hải đường, nhân củ khoai

tây in vitro, hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc cấy thu nhận các hợp

chất có hoạt tính sinh học như nuôi cấy rễ nhân sâm

1.4.2 Nuôi cấy quang tự dưỡng

Nuôi cấy quang tự dưỡng Đã được giáo sư Kozai và các cộng

sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90 Từ đó đến nay có rấtnhiều nghiên cứu thành công trong ứng dụng phương pháp vi nhângiống quang tự dưỡng vào sản xuất cây trồng

Phương pháp vi nhân quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn so

với phương pháp truyền thống Nó thúc đẩy sự tăng trưởng cây in

vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và đồng thời làm hạ giá thành cây in vitro.

Phương pháp này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môitrường nuôi cấy (ion, sự khuyếch tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh

hưởng đến sự phát triển của cây con trong bình cấy (cường độ ánhsáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, độ ẩm, nhiệt độ vàtốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy, ) thay vì chỉnghiên cứu thành phần hóa học của môi trường cấy như độ đường,muối khoáng, vitamin hay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật màcác nhà nuôi cấy quan tâm Trong vi nhân giống quang tự dưỡng,đường không sử dụng trong môi trường nuôi cấy Nói đúng hơn sửdụng chất hữu cơ bao gồm cả chất điều hòa sinh trưởng thực vật,vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào môitrường Điều này dựa trên cơ sở tự nhiên tất cả các cây xanh chứa diệplục tố đều có khả năng quang hợp để tồn tại và phát triển Tất cả các cơquan dùng trong môi trường nuôi cấy mô có diệp lục tố đều có khảnăng quang hợp Chúng đều có thể nhận CO2 không khí làm nguồntrong carbon trong quá trình quang hợp mà không cần đường vàvitamin trong quá trình nuôi cấy.

Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đacho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khílàm nguồn carbon cho chính quá trình tăng trưởng và phát triển củacây Sự loại bỏ đường trong môi trường nuôi cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễmnấm, khuẩn trong quá trình nuôi cấy giảm Điều này đem lại ý nghĩarất lớn trong sản xuất vì chi phí công lao động sẽ giảm đáng kể songsong với việc giảm nguyên vật liệu

Theo khái niệm về nuôi cấy mô quang tự dưỡng thì hộp chứacây cấy được xem như là nhà kính thu nhỏ Với phương pháp này sự

tăng trưởng phát triển của cây in vitro phần lớn chịu ảnh hưởng của

các tác nhân vật lý trong môi trường nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ,

độ ẩm, nồng độ CO2 sự trao đổi khí

Nồng độ CO2 và ánh sáng là hai nhân tố chính quan trọng nhấttrong nuôi cấy quang tự dưỡng cùng với cơ quan có diệp lục tố, sự giatăng khác biệt giữa nồng độ CO2 bên trong và bên ngoài hộp cấy và sựgia tăng của ánh sáng làm cho hiệu quả quang hợp tăng lên

1.5 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hệ số nhân giống cao: Từ một mẫu vật sạch bệnh ban đầu,bằng con đường nuôi cấy mô có thể nhân nhanh và cung cấp mộtlượng giống lớn trong thời gian ngắn trên một quy mô mặt bằng hạnchế Đối với khoai tây chẳng hạn, từ một cây sạch bệnh trong ống

nghiệm (in vitro) trong vòng một năm có thể nhân lên hàng ngàn cây

trong phòng thí nghiệm

Chất lượng giống tốt: Mẫu cây ban đầu (có thể sạch hoặc

không sạch bệnh) được nhập in vitro và nhân nhanh Khi đạt một số

lượng nhất định cần thiết, mẫu được kiểm tra bệnh virus bằng cácphương pháp huyết thanh (ELISA, ngưng kết antigene – antibody),hoặc cây chỉ thị Mẫu không nhiễm tiếp tục được nhân nhanh cho mụcđích sử dụng (sản xuất giống hoặc phục vụ các nghiên cứu lai tạogiống) Mẫu đồng nhất về mặt di truyền, dòng cây mong muốn, có khảnăng ra hoa và tạo quả sớm

Khả năng chủ động trong nhân giống: Trong điều kiện phòngthí nghiệm có kiểm soát, kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép nhân giốngquanh năm Vì vậy, hoàn toàn có thể chủ động trong việc lập kế hoạchsản xuất, cung cấp giống

1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trinh nuôi cấy mô tế bào thực vật

Các nhân tố trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có 3 nhân tố chính:

- Đảm bảo điều kiện vô trùng

- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị đúng cách

- Chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp với trước và sau khi cấy

- Do tế bào nấm và vi khuẩn hơn nhiều so với tế bào thực vật nên chỉcần nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn, thì chúng nhanh chóngphủ đầy trên toàn bề mặt môi trường, bề mặt mô tế bào thực vật Các

vi sinh vật lấn áp tế bào nuôi cấy mô thực vật sẽ làm cho mô thực vậtphát triển chậm lại và chết dần

1.6.2 Kỹ thuật vô trùng

1.6.2.1 Vô trùng thuỷ tinh, nút đậy, môi trường

Dụng cụ thuỷ tinh: thông thường dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các

phòng thí nghiệm bằng dung dịch sulfocromate một lần trước khi đưavào sử dụng, về sau chỉ cần rửa sạch để ráo trước khi sử dụng

Trong trường hợp các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm nuôicấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi phải vô trùng, có thể khử trùng bằngcách đưa vào tủ sấy sấy trong nhiều giờ dụng cụ phải được gói tronggiấy nhôm hoặc cất trong hộp kim loại để tránh bị nhiễm trơ lại sau khikhử trùng

Bảng 1.1 Thời gian khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng nhiệt độ và nhiệt

độ khử trùng

Nút đậy: thường là nút đậy không thấm nước Nút đậy phải chặt để

bụi đi qua được đồng thời nước ở môi trường cũng không bốc hơi dễdàng trong quá trình nuôi cấy Bông thấm nước là một loại chất đơngiản nhất nhưng có những nhược điểm sau:

- Nếu khi nút bông bị ướt hoạc dính môi trường thì sẽ bị nấm

nhất là đối với những thí nghiệm lâu dài

- Thao tác nút bông chậm không thể sản xuất trên qui mô lớn

- Chỉ dùng vài lần rồi bỏ

Nhiệt độ khử trùng ( o C)

Thời gian khử trùng (Phút)

160 45

170 20

180 10

190 7,5

Môi trường : Môi trường nuôi vấy thường được hấp khử trùng trong nồi autoclave, khử trùng bằng áp suất hơi bão hòa Thời gian thường

15 -30 phút ở áp suất 1atm nhiệt độ 121oC

Bảng 1.2: bảng thể tích và thời gian hấp khử trùng( Autoclave)

Thể tích môi trường (ml) Thời gian hấp khử trùng (phút)

Các chất này thường được khử bằng cách lọc qua màng lọcpolyethylen hoặc sợi cellulose Các lỗ màng này có thể giữ lại các visinh vật

1.6.2.2 Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy

Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơivào dụng cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nútbông để thao tác cấy Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau đểchống lại nguồn nhiễm tạp này Phòng cấy thường là buồng có diệntích hẹp, rộng từ 10-15m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyểnđộng từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào Sàn và tường lát gạch men để

có thể lau chùi thường xuyên

Vô trùng phòng cấy:

Trước khi đưa vào sử dụng hoặc cứ sau 2-3 tháng, phòng cấyphải được xử lý hơi formalin bằng cách rót formol 40% ra một số đĩapetri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do, đóng kín cửaphòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formalin đi và khử hơi formalin thừabằng dung dịch amoniac 25% cũng để rải rác trong phòng 24h

Để đảm bảo mức độ vô trùng cao, trong phòng cấy ngoài đèn tửngoại trong box cần có 4 đèn tử ngoại 40W trên trần Chỉ cho các đèn

tử ngoại làm việc khi không có người làm việc trong box cấy Nên bậtđèn tử ngoại 30 phút và tắt trước 30 phút trước khi làm việc hoặc bậtsau khi đã ngưng làm việc Cần hạn chế chuyển động không khí trongphòng cấy đến mức tối thiểu Các dụng cụ làm việc phải chuẩn bị đầy

đủ, bố trí hợp lý, thuận tiện để làm việc và hạn chế đi lại khi cấy, ravào buồng cấy, đóng cửa cẩn thận

Phòng nuôi cũng phải được khử trùng trước là bằng xà bôngbột, sau đó lau bằng dung dịch calcium hypochlorite loãng hoặc cồn70% Tất cả trần, sàn đều phải được lau như vậy mỗi tuần Khôngđược khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh phát tán bào tử

Khử trùng các dụng cụ kim loại và môi trường khoáng:

Các dụng cụ kim loại được khử trùng bằng không khí nóng(130o – 170oC) Các dụng cụ này phải được gói kín trước khi khửtrùng, nên gói trong giấy nhôm là tốt nhất Không nên hấp khử trùngdụng cụ kim loại vì điều kiện nóng ẩm sẽ làm kim loại bị rỉ sét và bị ănmòn

Autoclave là phương pháp khử trùng bằng hơi nước dưới một

áp suất nhất định nút gòn, khăn vải, các vật dụng phòng thí nghiệmbằng thủy tinh, các bình nuôi cấy bằng plastic, nút cao su, các bộ lọc,nước, môi trường khoáng đều có thể khử trùng bằng nồi hấp Gần nhưtất cả vi sinh vật đều bị tiêu diệt bởi hơi nước trong nồi hấp thời gian

từ 10 - 30 phút ở nhiệt độ 121o, 1,5 atm

Môi trường sau khi pha chế có thể chuyển vào bình cấy vớilượng cần thiết trước khi hấp tiệt trùng, cũng có thể hấp trước với khốilượng lớn và rót chuyển vào bình cấy trong box cấy Thời gian hấp tiệttrùng phụ thuộc dung tích môi trường trong dụng cụ đựng khi hấp ởnhiệt độ 121o, 1,5atm

Thời gian tối thiểu này gồm cả thời gian cần thiết để nhiệt độnồi hấp đạt đến 121oC và 15 phút tiệt trùng

Đối với môi trường khoáng, áp suất không nên cao quá 1atm vì

áp suất cao sẽ làm phân hủy carbohydrate và các phức hợp nhạy cảmvới nhiệt độ

Sau khi tiệt trùng, môi trường được chuyển ngay sang phòngcấy để làm nguội và sử dụng theo yêu cầu Nếu là môi trường thạchhấp với khối lượng lớn trước khi chia vào bình cấy, thì chuyển ngayvào box cấy đã được vô trùng để tránh nhiễm

Trên bàn thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy vàcốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc Các dụng cụ khác

để cấy như bình môi trường, ống nghiệm, bình đựng mẫu cấychuyền… Đều được xử lý khử trùng bề mặt bằng cách lau bằng cồn 70

% trước khi đưa vào trong box cấy

1.6.3 Yếu tố môi trường

Một trong nghững yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng

và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy làthành phần môi trường Thành phẩn này thay đổi tùy theo loài và bộphận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thínghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi Tuy nhiên tất cả cácmôi trường nuôi cấy thành phần dinh dưỡng bao gồm 5 phần: khoáng

đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chấtđiều hòa sinh trưởng thực vật

Có một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếutrong nuôi cấy mô tế bào thực vậtnhư môi trường MS (Murashige vàskoog), B5 (Ganborg và cộng sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) cóhàm lượng cao và một số môi trường khác mô tả bởi White, Gautheret,Nitach Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp

1.6.3.1.Khoáng đa lượng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào tách rời không khác nhiều sovới cây trồng trong tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cungcấp N, P, K, Ca, Mg và Fe

1.6.3.2 Khoáng vi lượng

Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là

lĩnh vực còn ít được nghiên cứu Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mômới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vàomôi trường nuôi cấy Các thí nghiệm thành công do argar và hóa chấtdùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố

vi lượng cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy cung cấp phần

nào cho môi trường nuôi cấy Các nguyên tố vi lượng cần cung cấpcho tế bào là: Zn, Cu, B, Mn, Co, Mo

1.6.3.3.Carbon và nguồn năng lượng

Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực

vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khốikhông phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sungvào môi trường dưới dạng đường Hai dạng đường thường hay gặpnhất là glucose và surcose Các nguồn carbonhydrate khác cũng đượctiến hành thử nghiệm như: Lactose, galactose, rafinose, maltose và tinhbột nhưng nguồn carbohydrate này có hiệu quả kém hơn so vớiglucose và sucrose Sucruse là nguồn carbon quan trọng đối với mô tếbào nuôi cấy Nồng độ sucrose ban đầu có thể ảnh hưởng đến một sốtham số nuôi cấy như tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấptrong nuôi cấy tế bào thực vật

1.6.3.4.Vitamin

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sựtăng trưởng và phát triển của chúng Chúng cần vitamin để xúc tácnhiều quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy

in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển

của chúng.các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy

mô là thiamin (B1), acid nicotinic, piridorxite (B6) và mio- inositol

1.6.3.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Trong nuôi cấy mô thực vật có 5 nhóm chất điều hòa quan trọngtrong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid

và ethylen Miller là người đầu tiên nhận thấy tỉ lệ auxin và cytokinin

bổ sung vào môi trường để kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệphytohormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay sự tạo rễ khônggiống nhau.

Auxin: Tự nhiên là hợp chất tương đối dơn giản:

indol-3-acetic acid (IAA) Các chất có cấu trúc gần giống như IAA và có cùngvai trò với IAA trong cơ quan đều được gọ là auxin (như: IBA, NAA.2,4-D, 2,4,5- t và phenoxyacetic acid) auxin phối hợp với cytokiningiúp sự tăng trưởng chồi non và khôi phục tạo mới mô phân sinh chồi

từ nhu mô Tuy nhiên, ở nồng độ cao auxin cản trở sự phát triển củacác phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ởtrạng thái tiềm sinh), auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khỏi rễ(phát thể non của rễ) nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơkhởi này Trong sự tạo rễ auxin cần phối hợp với các vitamine (nhưthiamine mà rễ không tạo được), amino acid (như arginin), và nhất làcác hợp chất othordiphenollic (như cafeic acid, chlorogenic acid)

Cytokinin: là một loại chất sinh trưởng thực vật thực vật kích

thích tế bào phân chia Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin,một trong cac base của DNA và hợp chất cytokinin đầu tiên đượckhám phá ra là kinetine, tiếp theo là zeatin một chất có trong phần lớnthực vật và một vài vi khuẩn cấu trúc gần giống kinetine nhưng hoạttính cao hơn gấp 10 lần Sau zeatin hơn 30 cytokinin khác nhau được

cô lập Ngày nay, cytokinin để chỉ một hợp chất tự nhiên hay nhân tạo,

có đặc tính sinh lí giống kinetin Nhiều hợp chất có hoạt tínhcytokinin, chúng đều là apminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6, ví dụnhư BA Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có

auxin và cytokinin tác động trên cả 2 bước của sự phân chia tế bào:phân nhân và phân bào Trong nuôi cấy mô nghèo cytokinin (mô lõithuốc lá, vỏ rễ đậu) auxin kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậmchí là tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách: sự phân váchchỉ xảy ra khi cytokinin ngoại sinh Cytokinin giúp đỡ sự gia tăng kíchthước tế bào và sinh tổng hợp protein Trong thân và rễ, cytokinin cảntrở sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng lá tế bào lá trưởng thành.Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ auxin/cytokinin(A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao sự tao rễ, A/C thấp sự tạochồi, vậy cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thờinhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin( giúp tạo rễ) vàcytokinin giúp tạo chồi Sự cân bằng giữa 2 phytohormone này là mộttrong những yếu tố kiểm soát phát triển.

(2,4- diclorophenoxy) acetic acid Napthalene acetic acid

Kinetin 6- Benzyl adeninHình 3.1 Công thức một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Ngoài 5 thành phẩn cơ bản trên người ta còn bổ sung một sốchất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, ETDA ) và một sốchất có thành phần không xác định như nước dừa Dịch chiết nấmmen vào môi trường nuôi cấy

1.6.3.6 Các chất hữu cơ không xác định

Bổ xung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào môi trường nuôicấy mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng mô Chất bổ sung là:protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúamạch, chuối, nước cam, cà chua Tuy nhiên chỉ có nước dừa và proteinhydrolysate là được được sử dụng rộng rãi

1.6.3.7 Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

Mặc dù tế bào cáo khả năng tổng hợp các amino acid cần thiếtnhưng sự bổ sung amino acid vào môi trường nuôi cấy là kích thích sựtăng trưởng của tế bào Amino acid cung cấp cho nguồn tế bào thựcvật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitơnày được tế bào hấp thu nhanh hơn so với nitơ vô cơ Các nguồn nitơ

thường được sử dụng là nguồn amino acid như casein hydrolysate, glutamine, L- asparine và adenine.

L-1.6.3.8 Than hoạt tính

Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tácdụng khử độc Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp các chất cản,hút các chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng và làm đen môitrường Tác dụng càng tăng trưởng của mô trong môi trường có thanhoạt tính là do nó hút các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trườngnhư: NAA, kinetin, BAP, IAA và 2ip Khả năng kích thích tăng trưởng

là do than hoạt tính kết hợp với chất phenol độc do mô tiết ra trongsuốt quá trình nuôi cấy

1.6.3.9 Yếu tố làm đặc môi trường

Argar là chất thường được sử dụng để tạo môi trường đặc haymôi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật Khi argar được trộnchung với nước thì tạo ra ở dạng gel và tan ở nhiệt độ từ 600 – 1000C,đặc lại khi nhiệt độ xuống còn 450 vì vậy argar ổn định trong tất cả cácđiều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thựcvật Hơn nữa argar không bị phản ứng với các chất trong môi trường

Độ ứng của argar quyết định bởi số argar sử dụng và pH môi trường

1.6.4 Khử trùng mô thực vật

Các mô thực vật hầu như là các bộ phận của cây Các mẫu trướckhi nhập mẫu đòi hỏi phải tiến hành khử trùng bề mặt mẫu tránh tạpnhiễm

Các bước để xử lý khử trùng gây bề mặt mẫu vật:

- Chọn lựa mẫu cấy tốt nhất, rửa kỹ mẫu bằng nước máy (trongdòng chảy) cho sạch bụi bẩn

- Ngâm rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng trong ba phút (lắc nhẹliên tục trong quá trình ngâm)

- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy (trong dòng chảy)

Chuyển vào box đã được xử lý, vô trùng từ trước, mọi thao tác từ đâyđều phải áp dụng các biện pháp vô trùng

- Dùng panh vô trùng gắp chuyển mẫu sang dung dịch khử trùng(panh này không dùng lại nữa nếu không khử trùng lại), ngâm (lắcnhẹ) mẫu trong dung dịch khử trùng trong thời gian ấn định

 Chú ý: Hiệu quả xử lí các chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ, và

khả năng xâm nhập vào các khe của tế bào, và khả năng đẩy hết bọtkhí trên bề mặt các mô cấy Để tăng tính linh động và khả năng hoạtđộng của các chất khử trùng trước tiên nguời ta thường ngâm tế bào

mô thực vật trong cồn 70o sau đó mới xử lí dung dịch diệt khuẩn.Đồngthời người ta có thể cho thêm vào các chất giảm sức căng bề mặtnhư tween 80, Fotoflo, teepol vào dung dịch diệt khuẩn

Bảng 1.3 Thời gian và nồng độ các chất khử trùng( Street (1974)

Tác nhân vô trùng Nồng độ % Thời gian xử lý Hiệu quả

(phút)

Calci hypochlorit 9 – 10 5 – 30 Rất tốtNatri hypochlorit 2 5 – 30 Rất tốt