Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây gừng bản địa ở Bắc Kạn (Gừng đá)

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Họ Gừng (Zingiberaceae) là một họ thảo mộc sống lâu năm, bao gồm 45 chi và khoảng trên 1300 loài, phân bố ở các vùng nhiệt Ďới. Ở Việt Nam, họ Gừng có khảng 21 chi với trên 100 loài [6]. Trong số các nguồn gen gừng thu thập từ mọi miền trên toàn quốc, một số nguồn gen có giá trị dinh dưỡng cao, thích nghi tốt, có tiềm năng phát triển mở rộng sản xuất. Cây gừng bản Ďịa ở Bắc Kạn (Gừng Ďá) Ďược xếp vào nhóm cây quý hiếm cần Ďược bảo tồn theo Quyết Ďịnh số 80/2005/QĐ-BNN ngày 05/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Gừng Ďá là loài bản Ďịa mang tính chất Ďặc sản của tỉnh Bắc Kạn, chúng Ďược phân bố nhiều ở các xã Liêm Thủy, Xuân Dương thuộc huyện Na Rì, tỉnh Bắc Kạn. Gừng Ďá Ďược Ďồng bào dân tộc (Tày, Nùng, Dao...) trồng từ lâu Ďời trên các nương rẫy, rừng núi Ďất Ďá xen kẽ v.v. Dưới tác Ďộng của các yếu tố tự nhiên (thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu...) của Ďịa phương nên Gừng Ďá có hương vị Ďặc biệt. Ruột củ màu vàng, có mùi thơm Ďặc trưng, khi giã củ vắt lấy nước làm phụ gia bảo quản thực phẩm Ďược tươi lâu, Ďặc biệt là trong việc chế biến lạp xường, một món ăn truyền thống và là Ďặc sản của vùng Bắc Kạn. Ngoài ra, Gừng Ďá còn Ďược người dân Ďịa phương sử dụng như là một loại dược liệu rất quý. Trong những năm gần Ďây, nhu cầu sử dụng Gừng Ďá của người dân Ďịa phương và du khách khi Ďến Bắc Kạn tăng cao, Ďặc biệt vào các dịp lễ tết, giá thành thường dao Ďộng từ 600 nghìn Ďến một triệu Ďồng/ 1kg tươi. Điều này dẫn Ďến việc khai thác ngày càng cạn kiệt nguồn gen Gừng Ďá mọc tự nhiên. Mặc dù hiệu quả kinh tế cao, nhưng hiện nay Gừng Ďá Ďược trồng chủ yếu theo kinh nghiệm, diện tích manh mún, nhỏ lẻ nên sản phẩm chưa mang tính hàng hóa, chưa có lượng giống Ďủ lớn Ďể phát triển thành vùng trồng tập trung. Việc nhân và giữ giống vẫn theo kinh nghiệm của người dân, do vậy củ giống không Ďảm bảo về chất lượng, nhiễm bệnh nhiều và dần thoái hóa. Hơn nữa, hiện nay tên khoa học của loài này chưa Ďược xác Ďịnh cụ thể. Do Ďặc Ďiểm hình thái của cây có nhiều Ďặc Ďiểm giống với cây gừng thường (Zingiber officinarum Roscoe) nên hiện Ďược xếp vào chi Gừng (Zingiber), tên khoa học trong Quyết Ďịnh số 80/2005/QĐ-BNN là “Zingiber sp.”. Vì vậy, việc Ďịnh danh chính xác tên khoa học, vị trí phân loại của nguồn gen gừng Bắc Kạn là cần thiết nhằm tạo cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen thực vật quý này. Đồng thời, việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây gừng Bắc Kạn có thể tạo ra số lượng cây giống lớn, chất lượng Ďồng Ďều, sạch bệnh, và là tiền Ďề Ďể phát triển cây gừng Bắc Kạn theo hướng hàng hóa Ďặc sản vùng miền, mang lại lợi ích kinh tế thực sự và lâu bền cho người dân nhằm phát triển kinh tế vùng, kinh tế Ďịa phương. Xuất phát từ lý luận và thực tiễn nêu trên, nhằm tạo cơ sở dữ liệu về Ďặc Ďiểm sinh học phục vụ cho công tác Ďịnh danh, bước Ďầu xác Ďịnh thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu Ďược từ cây gừng bản Ďịa ở Bắc Kạn, Ďồng thời xây dựng quy trình nhân nhanh từ lát cắt chồi, áp dụng vào việc tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho người dân, chúng tôi lựa chọn Ďề tài: “Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây gừng bản địa ở Bắc Kạn (Gừng đá) ”.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ XUÂN DƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC, QUY TRÌNH NHÂN GỐNG IN VITRO VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY GỪNG BẢN ĐỊA Ở BẮC KẠN (GỪNG ĐÁ)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2019

MỤC LỤC

Lời cam Ďoan i

Lời cảm ơn ii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng viii

Danh mục hình x

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của Ďề tài 1

2 Mục tiêu của luận án 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của Ďề tài 3

4 Những Ďóng góp mới của luận án 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Khái quát chung về họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.) 4

1.1.1 Vị trí phân loại 4

1.1.2 Đặc Ďiểm hình thái của cây Họ Gừng 4

1.2 Giới thiệu về cây gừng Bắc Kạn 11

1.3 Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học và phân loại cây họ Gừng 13

1.3.1 Trên thế giới 13

1.3.2 Ở Việt Nam 15

1.4 Nghiên cứu về phân loại thực vật dựa trên trình tự gen 17

1.4.1 Giới thiệu về vùng ITS-rDNA (Internal transcribed spacer) 17

1.4.2 Giới thiệu về vùng matK (maturaseK) 18

1.4.3 Một số nghiên cứu phân loại thực vật dựa trên trình tự gen 18

1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro cây họ Gừng 25

1.5.1 Trên thế giới 25

1.5.2 Ở Việt Nam 29

1.6 Một số nghiên cứu về tinh dầu cây họ Gừng 33

1.6.1 Trên thế giới 33

1.6.2 Ở Việt Nam 34

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 36

2.2 Vật liệu nghiên cứu 36

2.3 Nội dung nghiên cứu 37

2.4 Phương pháp nghiên cứu 38

2.4.1 Phương pháp phân loại dựa vào Ďặc Ďiểm hình thái 38

2.4.2 Phương pháp phân loại thực vật dựa trên trình tự gen 38

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy mô 43

2.4.4 Đặc Ďiểm sinh trưởng phát triển cây có nguồn gốc in vitro 49

2.4.5 Phương pháp phân tích sinh hóa 50

2.4.6 Phương pháp phân tích hoạt tính kháng vi sinh vật 52

2.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 54

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55

3.1 Vị trí phân loại cây gừng Bắc Kạn 55

3.1.1 Đặc Ďiểm sinh học của cây gừng Bắc Kạn 55

3.1.2 Phân loại dựa vào Ďặc Ďiểm hình thái 57

3.1.3 Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự gen ITS và gen matK 62

3.2 Nhân giống gừng Bắc Kạn bằng công nghệ nuôi cấy lớp mỏng 72

3.2.1 Tạo mẫu sạch in vitro 72

3.2.2 Tạo callus từ lát cắt chồi 75

3.2.3 Tái sinh chồi từ callus 76

3.2.4 Nhân chồi in vitro 78

3.2.5 Tái sinh rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro 83

3.2.6 Giai Ďoạn ra ngôi 86

3.2.7 Quy trình nhân nhanh gừng Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng 94

3.3 Đặc điểm nông sinh học cây gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô 98

3.3.1 Động thái tăng trưởng chiều cao cây 98

3.3.2 Động thái ra lá 100

3.3.3 Động thái Ďẻ nhánh 101

3.3.4 Một số yếu tố cấu thành năng suất giống gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô 102

3.4 Thành phần hóa học tinh dầu cây gừng Bắc Kạn 106

3.4.1 Kết quả tách chiết tinh dầu 106

3.4.2 Thành phần hóa học tinh dầu 107

3.5 Khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu chiết xuất từ cây gừng Bắc Kạn 111

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 115

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 117

TÀI LIỆU THAM KHẢO 118

PHỤ LỤC 133

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

ABI Applied biosystems incorporated

AFLP Amplified fragment length polymorphism

BLAST Basic local alignment search tool

CTAB Cetyltrimethyl ammoium bromide

EDTA Ethylenediamine tetraacetate

GC-MS Gas chromatography mass spectometry

(Phương pháp sắc ký ghép khối phổ)

ITS Internal transcribed spacer

µM Micromol (nồng Ďộ phần triệu mol/l)

NAA 1-Naphthaleneacetic acid (Axit 1-Naphthaleneaxetic) NCBI National center for biotechnology information

ORF Open reading frame (khung Ďọc mở)

RAPD Random amplified polymorphic DNA

rbcL Ribulose-bisphosphate carboxylase

RFLP Restriction fragment length polymorphism

SSR Simple Sequence Repeates

Kạn (mẫu GD01LT) và một số loài trong chi Alpinia 65

Bảng 3.5 Hiệu quả khử trùng của các công thức sử dụng NaOCl 2,5% 73 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tổ hợp TDZ và 2,4D Ďến khả năng tái sinh tạo

callus của lát cắt chồi (sau 8 tuần nuôi cấy) 75

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tổ hợp chất Ďiều hòa sinh trưởng BAP và

Vitamin B1 Ďến khả năng tái sinh chồi từ callus (sau 8 tuần nuôi cấy) 77 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin Ďến khả năng nhân

nhanh chồi gừng Bắc Kạn (sau 4 tuần nuôi cấy) 79 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa Ďến hiệu quả nhân chồi

(sau 4 tuần nuôi cấy) 81 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của môi trường MS và α-NAA Ďến khả năng tái

sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh (sau 6 tuần nuôi cấy) 83 Bảng 3.11 Sinh trưởng và phát triển của cây con (sau 30 ngày ra ngôi)

trên các công thức giá thể 86

Bảng 3.12 Hàm lượng nước và hàm lượng chất khô trong mô thân, lá

cây gừng Bắc Kạn thời kì ra ngôi 89

Bảng 3.13 Động thái tăng trưởng chiều cao cây gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô 99

Bảng 3.14 Động thái ra lá của cây 100

Bảng 3.15 Động thái Ďẻ nhánh của cây gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô 102

Bảng 3.16 Một số yếu tố cấu thành năng suất giống gừng Bắc Kạn 103

Bảng 3.17 Lượng tinh dầu thu Ďược từ cây nuôi cấy mô 01 năm tuổi 106

Bảng 3.18 Thành phần hóa học của tinh dầu các mẫu nghiên cứu 108

Bảng 3.19 Hàm lượng các chất chính có trong tinh dầu các mẫu nghiên cứu 110

Bảng 3.20 Khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của tinh dầu gừng Bắc Kạn nguồn gốc nuôi cấy mô 112

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đặc Ďiểm hình thái cây Riềng (Alpinia officinarum) 7

Hình 1.2 Đặc Ďiểm hình thái cây Gừng (Zingiber officinarum) 9

Hình 1.3 Cây gừng Bắc Kạn trong Ďiều kiện tự nhiên 11

Hình 1.4 Sơ Ďồ vùng rDNA- ITS 17

Hình 1.5 Cây phát sinh chi Alpinia Ďược dựng bằng phương pháp ML từ khối dữ liệu kết hợp của matK và ITS 22

Hình 2.1 Chồi mới tái sinh từ cây mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh Ďược sử dụng làm vật liệu ban Ďầu 37

Hình 2.2 Sơ Ďồ chưng cất thu tinh dầu 51

Hình 3.1 Đặc Ďiểm hình thái loài gừng Bắc Kạn (Gừng Ďá) 56

Hình 3.2 Đặc Ďiểm phân loại loài gừng Bắc Kạn Alpinia coriandriodora 58

Hình 3.3 Bản Ďồ phân bố loài Alpinia coriandriodora D.Fang 59

Hình 3.4 Tiêu bản loài A bambusifolia và A coriandriodora 61

Hình 3.5 Sản phẩm PCR với cặp mồi matK-F/R và ITS-F/R 63

Hình 3.6 Kết quả alignment gen ITS 64

Hình 3.7 Sơ Ďồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa loài A coriandriodora và các loài trong chi Alpinia dựa trên khối dữ liệu kết hợp của vùng gen ITS 67

Hình 3.8 Kết quả alignment gen matK 68

Hình 3.9 Sơ Ďồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa loài A coriandriodora và các loài trong chi Alpinia dựa trên khối dữ liệu kết hợp của vùng gen matK 70

Hình 3.10 Sơ Ďồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa loài A coriandriodora và các loài trong chi Alpinia dựa trên khối dữ liệu kết hợp của matK và ITS (A), và vị trí phát sinh loài của Alpinia coriandriodora trong chi Alpinia (B) 71

Hình 3.11 Callus hình thành từ lát cắt chồi non trên môi trường MS có

bổ sung 0,5mg/l TDZ và 1mg/l 2,4D (A), 3mg/l 2,4D (B), 4mg/l 2,4D (C), sau 8 tuần nuôi cấy 76 Hình 3.12 Chồi tái sinh từ callus của gừng Bắc Kạn sau 8 tuần nuôi cấy 77 Hình 3.13 Hình thái chồi trên môi trường khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy 82 Hình 3.14 Hình thái rễ trên các môi trường thí nghiệm sau 6 tuần nuôi cấy 84 Hình 3.15 Hình thái cây hoàn chỉnh sau 6 tuần nuôi cấy 85 Hình 3.16 Hình thái chồi gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô giai Ďoạn sau 30

ngày ra ngôi tại Phú Thọ 88 Hình 3.17 Hàm lượng sắc tố quang hợp trong mô lá cây gừng Bắc Kạn

thời kì ra ngôi 91

Hình 3.18 Huỳnh quang diệp lục lá cây gừng Bắc Kạn thời kì ra ngôi ex vitro 92

Hình 3.19 Hoạt Ďộ catalase cây gừng Bắc Kạn thời kì ra ngôi 94

Hình 3.20 Quy trình nhân giống loài gừng Bắc Kạn (A coriandriodora)

bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng 95 Hình 3.21 Mô hình trồng gừng nuôi cấy mô (01 năm tuổi) tại Tp Việt Trì,

tỉnh Phú Thọ 104 Hình 3.22 Mô hình trồng gừng nuôi cấy mô (02 năm tuổi) tại Tp Việt Trì,

tỉnh Phú Thọ 105

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Họ Gừng (Zingiberaceae) là một họ thảo mộc sống lâu năm, bao gồm 45 chi và khoảng trên 1300 loài, phân bố ở các vùng nhiệt Ďới Ở Việt Nam, họ Gừng có khảng 21 chi với trên 100 loài [6] Trong số các nguồn gen gừng thu thập từ mọi miền trên toàn quốc, một số nguồn gen có giá trị dinh dưỡng cao, thích nghi tốt, có tiềm năng phát triển mở rộng sản xuất

Cây gừng bản Ďịa ở Bắc Kạn (Gừng Ďá) Ďược xếp vào nhóm cây quý hiếm cần Ďược bảo tồn theo Quyết Ďịnh số 80/2005/QĐ-BNN ngày 05/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Gừng Ďá là loài bản Ďịa mang tính chất Ďặc sản của tỉnh Bắc Kạn, chúng Ďược phân bố nhiều ở các

xã Liêm Thủy, Xuân Dương thuộc huyện Na Rì, tỉnh Bắc Kạn Gừng Ďá Ďược Ďồng bào dân tộc (Tày, Nùng, Dao ) trồng từ lâu Ďời trên các nương rẫy, rừng núi Ďất Ďá xen kẽ v.v Dưới tác Ďộng của các yếu tố tự nhiên (thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu ) của Ďịa phương nên Gừng Ďá có hương vị Ďặc biệt Ruột củ màu vàng, có mùi thơm Ďặc trưng, khi giã củ vắt lấy nước làm phụ gia bảo quản thực phẩm Ďược tươi lâu, Ďặc biệt là trong việc chế biến lạp xường, một món ăn truyền thống và là Ďặc sản của vùng Bắc Kạn Ngoài ra, Gừng Ďá còn Ďược người dân Ďịa phương sử dụng như là một loại dược liệu rất quý Trong những năm gần Ďây, nhu cầu sử dụng Gừng Ďá của người dân Ďịa phương và du khách khi Ďến Bắc Kạn tăng cao, Ďặc biệt vào các dịp lễ tết, giá thành thường dao Ďộng từ 600 nghìn Ďến một triệu Ďồng/ 1kg tươi Điều này dẫn Ďến việc khai thác ngày càng cạn kiệt nguồn gen Gừng Ďá mọc tự nhiên

Mặc dù hiệu quả kinh tế cao, nhưng hiện nay Gừng Ďá Ďược trồng chủ yếu theo kinh nghiệm, diện tích manh mún, nhỏ lẻ nên sản phẩm chưa mang tính hàng hóa, chưa có lượng giống Ďủ lớn Ďể phát triển thành vùng trồng tập

trung Việc nhân và giữ giống vẫn theo kinh nghiệm của người dân, do vậy củ giống không Ďảm bảo về chất lượng, nhiễm bệnh nhiều và dần thoái hóa Hơn nữa, hiện nay tên khoa học của loài này chưa Ďược xác Ďịnh cụ thể

Do Ďặc Ďiểm hình thái của cây có nhiều Ďặc Ďiểm giống với cây gừng thường

(Zingiber officinarum Roscoe) nên hiện Ďược xếp vào chi Gừng (Zingiber), tên

khoa học trong Quyết Ďịnh số 80/2005/QĐ-BNN là “Zingiber sp.” Vì vậy, việc

Ďịnh danh chính xác tên khoa học, vị trí phân loại của nguồn gen gừng Bắc Kạn

là cần thiết nhằm tạo cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen thực vật quý này Đồng thời, việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây gừng Bắc Kạn có thể tạo ra số lượng cây giống lớn, chất lượng Ďồng Ďều, sạch bệnh, và là tiền Ďề Ďể phát triển cây gừng Bắc Kạn theo hướng hàng hóa Ďặc sản vùng miền, mang lại lợi ích kinh tế thực sự và lâu bền cho người dân nhằm phát triển kinh tế vùng, kinh tế Ďịa phương

Xuất phát từ lý luận và thực tiễn nêu trên, nhằm tạo cơ sở dữ liệu về Ďặc Ďiểm sinh học phục vụ cho công tác Ďịnh danh, bước Ďầu xác Ďịnh thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu Ďược từ cây gừng bản Ďịa ở Bắc Kạn, Ďồng thời xây dựng quy trình nhân nhanh từ lát cắt chồi, áp dụng vào việc tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho người dân, chúng tôi lựa chọn Ďề tài:

“Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây gừng bản địa ở Bắc Kạn (Gừng đá) ”.

2 Mục tiêu của luận án

Xác Ďịnh tên khoa học loài gừng bản Ďịa ở Bắc Kạn, xây dựng quy trình nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô từ lát cắt chồi, bước Ďầu xác Ďịnh thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu Ďược từ cây có nguồn gốc tự nhiên và cây nuôi cấy mô, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen gừng bản Ďịa Bắc Kạn

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp các dẫn liệu khoa học về Ďặc Ďiểm hình thái, tên khoa học, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu Ďược từ cây gừng Bắc Kạn có nguồn gốc tự nhiên và cây nuôi cấy mô;

Cung cấp dẫn liệu khoa học về khả năng nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô từ lát cắt chồi loài gừng Bắc Kạn, là cơ sở Ďể bảo tồn và khai thác nguồn gen có giá trị

4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình Ďầu tiên nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống

về tên khoa học và vị trí phân loại loài gừng bản Ďịa ở Bắc Kạn dựa vào Ďặc

Ďiểm hình thái và trình tự Ďoạn gen Ďặc trưng ITS (Internal Transcribed Spacer)

và gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) Xây dựng Ďược quy trình nhân

giống nguồn gen gừng Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng, góp phần tạo

ra số lượng lớn cây giống Ďồng Ďều, sạch bệnh Kết quả luận án Ďã bước Ďầu xác Ďịnh Ďược thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu Ďược

từ cây gừng Bắc Kạn có nguồn gốc tự nhiên và cây nuôi cấy mô

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát chung về họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.)

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại của J Kress et al, 2002 [78] và Nguyễn Quốc

Bình, 2011 [6], vị trí phân loại cây họ Gừng (Zingiberaceae) trong giới thực

vật như sau:

Giới Thực vật (Plante)

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Loa kèn (Liliopsida)

Phân lớp Loa kèn (Liliidae)

Bộ Gừng (Zingiberales)

Họ Gừng (Zingiberaceae)

Hiện nay trên thế giới họ Gừng (Zingiberaceae) có 45 chi, 1300 loài,

phân bố ở vùng nhiệt Ďới Tại Việt Nam hiện có 21 chi với trên 100 loài

(Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, 2017)

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây Họ Gừng

1.1.2.1 Đặc điểm chung cây Họ Gừng

Theo Nguyễn Quốc Bình (2011), cây Họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.)

có một số Ďặc Ďiểm chung như sau: [6]

Dạng sống: Họ Gừng (Zingiberaceae) gồm những cây thân thảo sống

nhiều năm Mọc nơi Ďất ẩm, nơi sáng, dưới tán rừng hay vách Ďá ẩm, hiếm

khi phụ sinh (Cautleya gracilis, Hedychium poilanii) Thân cây do các bẹ lá

ôm chặt lấy nhau tạo thành thân giả Thân giả to, cao 1-3-4(-5) m hay mảnh,

cao dưới 1m hoặc rất ngắn hay không có do các bẹ lá rời Ďến gốc

(Distichochlamys, Kaempferia…), thân giả không phân nhánh Rễ nhỏ, hình sợi, Ďôi khi Ďầu rễ phình to lên thành dạng củ (Curcuma, Kaempferia,

Stahlianthus…) Cây thường có mùi thơm, Ďôi khi có mùi hắc như một số loài

trong chi Zingiber, Alpinia,

Lá: Lá của các loài cây thuộc họ Gừng là lá Ďơn, mọc cách, xếp thành

hai hàng, thường hướng lên trên Kích thước và hình dạng lá biến Ďổi, Ďôi khi phiến lá tiêu giảm thành bẹ lá dạng vảy Lá gồm các phần: bẹ lá, cuống lá, lưỡi lá, phiến lá: Bẹ lá mở Ďến gốc và ôm chặt lấy nhau thành thân giả (hay còn gọi là thân khí sinh) Cuống lá là phần giữa bẹ lá và phiến lá, có tiết diện ngang hình lòng máng nông hoặc sâu Lá không cuống hay có cuống ngắn Ďến dài (từ 0,2-0,3 mm Ďến 15-20 cm, Ďôi khi Ďến 25 cm) Lưỡi lá là phần từ

bẹ lá kéo dài lên Lưỡi dày hay mỏng dạng màng, phía Ďầu nguyên, cụt ngang hay xẻ thành 2 thùy; Ďầu lưỡi hay Ďầu các thùy lưỡi nhọn hay tù; lưỡi dài 1-2 mm hay tới vài cm Phiến lá hình trứng, hình bầu dục, hình bầu dục dài, hình mũi

mác, ít khi gần tròn (Kaempferia elegans); gốc nhọn, hình nêm hay gần tròn;

Ďầu thường nhọn, Ďôi khi thót nhỏ thành dạng Ďuôi, hiếm khi tròn

Lá bắc, lá bắc con

- Lá bắc: Lá bắc hình trứng, hình trứng rộng, hình mũi mác, bao lấy lá

bắc con và hoa, Ďôi khi bao lấy truyền thể (bulbil) (Globba) Các lá bắc dính với nhau ở nửa phía dưới làm thành dạng túi (Curcuma), hay dạng chuông (Stahlianthus) hoặc xếp lợp lên nhau (Hedychium, Zingiber, ) Đặc biệt trong chi Curcuma, các lá bắc bất thụ (không chứa hoa) ở phía dưới hay phía trên

của cụm hoa, thường có màu sắc khác với lá bắc hữu thụ Ở một số loài 1-2 lá bắc dưới cùng của cụm hoa phát triển rất to bao lấy cả cụm hoa khi non gọi là

lá bắc tổng bao (nhưng sớm rụng) (Alpinia)

- Lá bắc con: Đính giữa gốc lá bắc và bầu, bao lấy hoa Lá bắc con mở

Ďến gốc hay dạng ống Đôi khi lá bắc con không có hoặc sớm rụng

Cụm hoa: Cụm hoa dạng chùy, dạng chùm hay dạng bông, mọc ở các vị

trí khác nhau: Cụm hoa mọc trên ngọn thân có lá gặp ở các chi như Alpinia,

Hedychium, Cụm hoa mọc từ thân rễ sát mặt Ďất, riêng với thân có lá gặp ở

các chi như Amomum, Hornstedtia, Curcuma, Zingiber, Cụm hoa mọc giữa các bẹ lá ở các chi Boesenbergia, Curcuma, Distichochlamys, Đôi khi trong cùng một chi, cụm hoa mọc ở trên ngọn thân có lá và cả từ thân rễ (Zingiber), hay từ giữa các bẹ lá và từ thân rễ (Curcuma) Một số ít loài có cụm hoa xuất hiện trước lá hay xuất hiện Ďồng thời với chồi lá non (Curcuma) Cuống cụm

hoa mọc từ thân rễ ở một số chi Ďược bao phủ bởi các bẹ lá dạng vảy lợp lên

nhau nhiều hay ít, hay không lợp lên nhau (Amomum, Zingiber, )

Quả: Quả nang chẻ ô; Ďôi khi quả mọng, quả nạc; quả có lông hay

không; quả có nhiều dạng khác nhau:

+ Hình tròn hay bầu dục, Ďường kính từ 0,3-0,4 cm Ďến 2-3 (4) cm,

hiếm khi quả hình bầu dục có ngấn giữa (Alpinia galanga); hình thoi (Alpinia

oxymitra) hay hình trứng hẹp (Amomum mengtzense)

+ Có gờ nổi hay có cánh dạng quả khế theo chiều dọc (Alpinia,

Elettari, Elettariopsis, Amomum)

+ Trơn hay có lông, có gai mềm, gai phân nhánh hay không (Alpinia,

Amomum)

Hạt: Hình bầu dục, gần tròn hay có góc cạnh; màu Ďỏ, màu Ďen, nâu

hay màu xám; có áo hạt mềm màu Ďen, trắng, hay Ďôi khi có màu Ďỏ; áo hạt rách không Ďều

1.1.2.2 Đặc điểm chi Riềng – Alpinia Roxb

Chi Riềng - Alpinia Roxb là một chi lớn thuộc họ Gừng

(Zingiberaceae), trên thế giới có khoảng 300 loài, phân bố ở vùng nhiệt Ďới và cận nhiệt Ďới châu Á, một số ít ở Ôxtrâylia và quần Ďảo Thái Bình Dương [8]

Ở Việt Nam chi Riềng hiện có 33 loài [8, 18]

Hình 1.1: Đặc Ďiểm hình thái cây

Riềng (Alpinia officinarum)

(Nguồn ảnh: itmonline.org và

http://www.botanyvn.com)

Đặc điểm hình thái: Cây thảo cao 1-3 (4) m, thân rễ bò, dày Lá nhiều,

phiến lá hình bầu dục dài hay dạng mác, có cuống hay không Cụm hoa dạng chùm hay bông, trên ngọn thân có lá, hoa Ďính thưa hay dày, cụm hoa khi non thường Ďược bao bởi 1-3 lá bắc (thường gọi là lá bắc tổng bao - nhưng sớm rụng) Các lá bắc (nếu có) mở Ďến gốc, bao một hoa hay vài hoa trong một

cụm nhỏ (cincinnus); các lá bắc con dạng ống hay mở Ďến gốc, Ďôi khi không

có Đài hoa có phần dưới dạng ống, trên xẻ 1 bên hay chia 3 thùy nhỏ dạng răng Tràng có phần dưới dạng ống, trên xẻ thành 3 thùy, thùy lưng thường to hơn hai thùy bên, Ďầu có dạng mũ nông hay sâu Cánh môi to, có màu sặc sỡ, thường to rộng hơn các thùy tràng, phía Ďầu xẻ thành 2-3 thùy hay nguyên Nhị có chỉ nhị dạng bản, ngắn hoặc dài; bao phấn 2 ô, phần phụ trung Ďới kéo dài lên phía trên thành mào hay không Nhị lép bên 2, tiêu giảm thành dạng dùi, dạng răng hay tiêu giảm hoàn toàn Bầu hình cầu hay gần hình cầu Vòi nhụy mảnh, núm nhụy thường loe hình phễu, Ďôi khi có dạng chùy Vòi nhụy lép ngắn, dạng bản hay dùi Quả nang, hình cầu hay hình bầu dục, hiếm khi

hình thoi (A oxyphylla), tự mở hoặc mở không Ďều Hạt nhiều, thường có góc

cạnh, có áo hạt [8]

Sinh học và sinh thái: Phần lớn các loài trong chi này ưa bóng, ưa ẩm,

mọc dưới tán rừng, dưới bóng các cây khác, nhưng có số ít loài vẫn phát triển

tốt ở nơi ít bóng như ven Ďường lớn hay ở trảng cỏ (A.malaccensis, A

hainanensis, A gagnepainii)

Giá trị sử dụng chi Riềng: Nhiều loài trong chi Riềng Ďược sử dụng làm

thuốc, làm gia vị hoặc tinh dầu chiết xuất ở các loài Ďược ứng dụng trong các

lĩnh vực y học, dược phẩm, công nghiệp thực phẩm…Rễ của các loài Alpinia

officinale, Alpinia galanga, Alpinia conchigera, Alpinia zerumbet…Ďược sử

dụng làm gia vị trong các món ăn truyền thống của nhiều dân tộc Tinh dầu Ďược chiết xuất từ các loài này có tác dụng kích thích tiêu hóa, làm cho các món ăn có hương vị hấp dẫn, ngon miệng, Ďồng thời có khả năng tiêu diệt hoặc kìm hãm sự hoạt Ďộng của các vi sinh vật có hại Trong các bài thuốc của người Trung Quốc

và một số nước Đông Dương, thân rễ của nhiều loài trong chi Riềng (Alpinia)

Ďược dùng làm thuốc chữa các bệnh khó tiêu, co giật, long Ďờm, viêm phổi, chữa các vết thương, vết loét…[16, 25]

1.1.2.3 Đặc điểm chi Gừng – Zingiber

Chi Gừng – Zingiber thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), trên thế giới có

khoảng 150 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt Ďới và cận nhiệt Ďới Ở Châu Á có khoảng 45 loài, trong Ďó Việt Nam có 11 loài [6]

Đặc điểm hình thái: Cây thân thảo cao Ďến 2-3m Thân giả mọc thẳng

Ďứng, thân rễ phân nhánh, có củ Lá mọc thành 2 dãy song song, gốc lá phồng lên hình nêm Cụm hoa hình nón hẹp, mọc từ thân rễ sát mặt Ďất hay trên ngọn thân có lá Đài dính nhau hình ống, chia thùy về một phía, trên chia 3 răng Tràng hoa hình ống, mỏng, tràng giữa màu trắng hay màu kem, thường lớn hơn hai thùy bên Các nhị lép ở bên gắn với cánh môi tạo thành cánh môi

3 thùy, thùy giữa rộng Ďầu hay chẻ ở Ďỉnh Chỉ nhị ngắn, Ďược bao bọc bởi phần phụ dài của vòi nhụy Bầu 3 ô, mỗi ô nhiều noãn Đính noãn trung trụ

Vòi nhụy mảnh, kéo dài phía sau bao phấn, Ďầu nhụy không mở rộng Quả nang chẻ ô hay nứt hỗn hợp Hạt màu Ďen, Ďược bao bọc bởi áo hạt, áo hạt màu trắng, mép xẻ thùy bất thường Đặc Ďiểm dễ nhận biết nhất là 2 mép phần tiếp nối giữa cuống lá và bẹ lá giống như khuỷu (Ďầu gối); phần phụ của trung Ďới kéo dài và cong ở Ďầu, bao lấy vòi nhụy [6]

Hình 1.2: Đặc Ďiểm hình thái cây

Gừng (Zingiber officinarum) (Nguồn ảnh: https://vi.wikipedia.org)

Sinh học và sinh thái: Các loài thuộc chi Gừng Ďược trồng nhiều ở các

nước trong vùng nhiệt Ďới, từ Đông Á Ďến Đông Nam Á và Nam Á Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản là những nước trồng nhiều gừng nhất thế giới Ở Việt Nam, cây Ďược trồng ở nhiều Ďịa phương, từ miền núi Ďến Ďồng bằng và hải Ďảo Gừng trồng sau một năm nếu không thu hoạch sẽ có hiện tượng tàn lụi (phần trên mặt Ďất) qua Ďông Thời gian sinh trưởng mạnh của cây thường vào mùa hè – thu khi thời tiết nóng và ẩm [9]

Giá trị sử dụng chi Gừng (Zingiber): Theo y học cổ truyền, gừng tươi

Ďược gọi là sinh khương, gừng khô gọi là can khương Sinh khương có vị cay, tính hơi ôn tác Ďộng vào ba kinh phế, tỳ và vị Có tác dụng phát biểu tán hàn, ôn

trung, làm hết nôn, tiêu Ďờm, hành thủy giải Ďộc Dùng chữa ngoại cảm, biểu chứng, bụng Ďầy trướng, nôn mửa, giải Ďộc bán hạ nam tinh, cua cá, Ďờm ẩm sinh ho Can khương vị cay, tính ôn Bào khương (can khương bào chế rồi) vị cay Ďắng tính Ďại nhiệt Tác dụng vào sáu kinh tâm, phế, tỳ, vị, thận và Ďại tràng

Có tác dụng ôn trung tán hàn, hồi dương thông mạch, dùng chữa thổ tả, bụng

Ďau, chân tay lạnh, mạch nhỏ, hàn ẩm, xuyễn, phong hàn thấp tỳ [23]

Trong nhân dân, gừng gió là một vị thuốc giúp tiêu hóa, dùng trong những trường hợp kém ăn, ăn uống không tiêu, nôn mửa, tiêu chảy, cảm mạo, phong hàn làm thuốc ra mồ hôi, chữa ho mất tiếng Gừng tươi (sinh khương) dùng với liều 3-6 g dưới dạng thuốc sắc hay thuốc pha hoặc rượu gừng (mỗi ngày 2-5 ml) Gừng khô (can khương) dùng khi bị lạnh mà Ďau bụng, tiêu chảy, mệt lả, nôn mửa [23]

Tại một số nước trên thế giới, như Trung Quốc gừng Ďược dùng làm thuốc chống Ďộc, an thần, chống viêm, kích thích ăn ngon miệng và làm dễ tiêu Được chỉ Ďịnh trong bệnh tả (phối hợp với nhiều dược liệu khác), thấp khớp mạn tính, nhức Ďầu kiểu Ďau dây thần kinh và co cứng, hen phế quản, buồn nôn, nôn, viêm phế quản Tại Ấn Độ, gừng Ďược dùng rộng rãi Ďể làm gia vị, sản xuất oleoresin và cất tinh dầu gừng Gừng bảo quản Ďể giữ lâu là gừng tươi gọt vỏ, ngâm trong sirô hay mật ong, hoặc chế biến thành mứt gừng, hay thành Ďồ uống Gừng Ďược xếp vào những thuốc chống trầm cảm

và là một thành phần của một số chế phẩm chống tác dụng của thuốc ngủ Trong thú y, gừng Ďược dùng làm thuốc kích thích và gây trung tiện trong bệnh khó tiêu do mất trương thực của ngựa và trâu bò Gừng còn là một nguyên liệu mới Ďể chiết xuất enzym thủy phân protein, ngoài Ďu Ďủ Gừng có trong thành phần một bài thuốc cổ truyền Ayurveda dùng rộng rãi ở Nepal Ďể chữa các chứng bệnh cúm, cảm lạnh, kém ăn, khó tiêu, tiêu chảy, viêm khớp

và Ďể làm thuốc giảm tiết acid dịch vị, chống co thắt, làm hồi tỉnh Ở

Indonesia người dân dùng gừng Ďể chữa Ďau bụng, ho và dùng làm thuốc bôi ngoài da cho phụ nữ và trẻ em Ở Bungari, gừng Ďược dùng dạng chè thuốc

Ďể chữa cảm lạnh, sổ mũi, ho, sốt, viêm họng [9, 25]

1.2 Giới thiệu về cây gừng Bắc Kạn

Cây Gừng Ďá ở tỉnh Bắc Kạn là một trong những nguồn gen có giá trị dinh dưỡng cao, thích nghi tốt và là giống bản Ďịa mang tính chất Ďặc sản của Ďịa phương, có thể phát triển và mở rộng sản xuất Cây Gừng Ďá Ďược xếp vào nhóm giống cây thực phẩm quý hiếm cần Ďược bảo tồn theo Quyết Ďịnh

số 80/2005/QĐ-BNN ngày 05 tháng 12 năm 2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Hình 1.3 Cây gừng Bắc Kạn trong Ďiều kiện tự nhiên

(Ảnh chụp tại xã Liêm Thủy – Huyện Na Rì – Tỉnh Bắc Kạn, tháng 8/2016) Qua kết quả Ďiều tra khảo sát cũng như kinh nghiệm của những hộ dân Ďược Ďiều tra trên Ďịa bàn tỉnh Bắc Kạn cho thấy, cây Gừng Ďá Ďược phân bố chủ yếu tại 2 xã: Liêm Thủy và Xuân Dương, huyện Na Rì, tỉnh Bắc Kạn Huyện Na Rì có tổng diện tích: 864,5 km2 , trong Ďó diện tích rừng và Ďất lâm nghiệp là 74.760,6 ha (hơn 14.000 ha rừng núi Ďá) Đặc biệt huyện có 2.730

ha rừng núi Ďá liền kề với chiều dài gần 70km trải dài qua 5 xã gồm: Liêm Thủy, Xuân Dương, Dương Sơn, Hảo Nghĩa, Cư Lễ Đây là rừng nguyên sinh với hệ sinh thái Ďa dạng, có nhiều loài Ďộng vật, thực vật quý hiếm Ďang Ďược bảo vệ Địa hình của huyện Na Rì Ďã ảnh hưởng trực tiếp Ďến quá trình hình thành Ďất, cụ thể là các quá trình rửa trôi và tích luỹ Quá trình rửa trôi diễn ra mạnh vào mùa mưa ở vùng núi Ďá chia cắt, dốc nhiều, ở vùng Ďồi núi thấp có những thung lũng tương Ďối bằng phẳng, thích nghi với các loại cây lương thực và cây ngắn ngày vùng nhiệt Ďới

Trước Ďây, cây gừng Ďá chủ yếu mọc tự nhiên trên các núi Ďá có Ďộ cao trung bình 500-700m so với mặt nước biển Cây Gừng Ďá thích hợp với Ďất mùn trên núi cao, loại Ďất có hàm lượng mùn cao và tơi xốp Bên cạnh Ďó, cây Gừng Ďá có khả năng chịu hạn, chịu rét do chủ yếu trồng ở vùng Ďồi núi, nơi

mà hầu hết diện tích sản xuất phụ thuộc vào nước trời Đặc biệt, cây gừng Ďá

là cây thích hợp với khí hậu mát mẻ, ưa bóng, phát triển tốt nhất dưới ánh sáng tán xạ của rừng nguyên sinh

Trong những năm gần Ďây, do tình trạng khai thác ngoài tự nhiên ồ ạt dẫn Ďến số lượng cây gừng Ďá hoang dã ngày càng cạn kiệt, một số hộ dân Ďã

di thực cây gừng Ďá trên núi về trồng tại các hốc Ďá và vườn quanh nhà với số lượng nhỏ, chủ yếu chỉ Ďủ Ďể phục vụ sinh hoạt của gia Ďình trong những dịp

lễ tết Hiện nay, rất khó khăn Ďể thu thập Ďược mẫu Gừng Ďá hoang dã trong

tự nhiên do số lượng còn rất ít

Dưới tác Ďộng từ các yếu tố tự nhiên, thời tiết của Ďịa phương, cây Gừng Ďá ở Bắc Kạn Ďã có những hương vị Ďặc biệt, ruột màu vàng, có mùi thơm Ďặc trưng và khi giã củ vắt lấy nước làm phụ gia bảo quản thực phẩm Ďược tươi lâu, Ďặc biệt là trong việc chế biến lạp xường, một món ăn truyền thống và là Ďặc sản của tỉnh Bắc Kạn Trong bảo quản thực phẩm, thịt tươi sống khi Ďược ướp với Gừng Ďá có mầu Ďỏ tươi, bảo quản Ďược lâu dài, khi

ăn có hương vị thơm Ďặc trưng Bên cạnh Ďó, Gừng Ďá còn Ďược chế biến thành tinh bột dùng làm dược liệu rất quý

Cây Gừng Ďá Ďang dần trở thành cây trồng Ďược phát triển vì giá trị kinh tế của nó mang lại cho người dân, hơn nữa cây Gừng Ďá sống Ďược ở những nơi có Ďất hang hốc núi Ďá mà ít có loại cây nào trồng Ďược Vì vậy, Gừng Ďá Ďang dần trở thành cây xóa Ďói giảm nghèo cho người dân vùng sâu vùng xa của tỉnh Mặc dù hiệu quả kinh tế của cây gừng Ďá cao, nhưng trước Ďây loại cây này vẫn chỉ Ďược trồng chủ yếu theo kinh nghiệm, diện tích manh mún, nhỏ lẻ ở các huyện và chỉ tập trung chủ yếu ở huyện Na Rì của tỉnh Bắc Kạn, nên sản phẩm chưa mang tính hàng hóa, chưa có lượng giống

Ďủ lớn Ďể phát triển thành vùng trồng tập trung Việc nhân và giữ giống vẫn theo kinh nghiệm của người dân, do vậy củ giống không Ďảm bảo về chất lượng, nhiễm bệnh nhiều và dần thoái hóa

1.3 Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học và phân loại cây họ Gừng

1.3.1 Trên thế giới

Trước Ďây, việc nghiên cứu Ďa dạng sinh học và phân loại thực vật chủ yếu dựa vào phương pháp so sánh hình thái Trong những năm gần Ďây, công nghệ sinh học ngày càng phát triển Ďã hỗ trợ rất tích cực cho phương pháp so sánh hình thái ở thực vật Bên cạnh việc nghiên cứu so sánh hình thái, nhiều tác giả còn sử dụng phương pháp phân tích sinh học phân tử, nghiên cứu 2

vùng gen ITS và matK Vì vậy mối quan hệ cũng như vị trí của các taxon

trong họ Gừng Ďược sáng tỏ hơn, Ďây cũng là ưu Ďiểm nổi trội của hệ thống này so với các hệ thống phân loại trước Ďây về họ Gừng [78] Với những tiến

bộ trong công tác phân loại thực vật, trong những năm gần Ďây nhiều loài mới thuộc họ Gừng Ďược phát hiện mới và bổ sung, làm Ďa dạng thêm thành phần loài Trong Ďó có thể kể Ďến một số công trình tiêu biểu như:

Tại Đài Loan – Trung Quốc, Tseng et al., (2011), Ďã ghi nhận loài

Alpinia oui (Zingiberaceae) là loài mới của Đài Loan Theo danh lục sách Ďỏ

IUCN loài này Ďược xếp vào diện nguy cấp và có nguy cơ tuyệt chủng (VU D1), bởi vì trong tự nhiên chúng chỉ còn ít hơn 1000 cá thể và chỉ phân bố ở phía Tây Bắc của Đài Loan [108] Cũng tại Hải Nam – Trung Quốc, Pu Zou

et al., (2012) Ďã lần Ďầu tiên mô tả và Ďịnh danh loài Alpinia rugosa [117]

Năm 2016, công bố các thông tin về loài Alpinia austrosinense từ Trung Quốc và các Ďặc Ďiểm phân biệt với loài thân thuộc là Alpinia pumila [116]

Tại Ấn Độ, năm 2013, Pantilunglu và Yogendra Kumar thuộc trường

Đại học North-Eastern Hilll Ďã ghi nhận loài Alpinia blepharocalyx là loài bổ

sung cho Ấn Độ Đồng thời nhóm tác giả Ďã xây dựng khóa Ďịnh loại Ďể có thể xác Ďịnh loài một cách dễ dàng [89]

Năm 2017, Nobuyuki Tanakai và Mu Mu Aung khi nghiên cứu các loài

thuộc chi Gừng (Zingiber) tại phía Tây Bắc của Myanma Ďã phát hiện một loài mới cho khoa học và Ďược Ďặt tên là Z flavofusifome [105]

Tại Lào, Souvannakhoummane et al., (2018), Ďã ghi nhận 8 loài thuộc họ Gừng (Zingibeaceae) bổ sung cho hệ thực vật Lào bao gồm các loài: Zingiber

densissimum S.Q.Tong & Y.M.Xia, Acta Phytotax Sin 25(6): 467 (1987); Zingiber kerrii Craib, Bull Misc Inform Kew 10: 403 (1912); Zingiber ligulatum Roxb., Asiat Res 11: 348 (1810); Zingiber nudicarpum D.Fang,

Guihaia 2: 139 (1982); Zingiber orbiculatum S.Q.Tong, Acta Phytotax Sin 25(6): 463 (1987); Zingiber parishii Hook.f subsp phuphanense Triboun & K.Larsen, Thai J Bot 6(1):62 (2014); Zingiber recurvatum S.Q.Tong & Y.M.Xia, Acta Phytotax Sin 25(6): 470 (1987) và loài Zingiber smilesianum

Craib, Bull Misc Inform Kew 10: 403 (1912) [102]

Như vậy, việc nghiên cứu phân loại các loài trong họ Gừng tiếp tục phát hiện các loài mới cho khoa học hoặc ghi nhận sự phân bố của các loài ở các

Ďịa phương, các nước khác nhau Đây là cơ sở Ďể tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện, sắp xếp hệ thống phân loại các loài trong họ Gừng, tạo tiền Ďề cho các nghiên cứu sâu hơn, nhằm khai thác giá trị sử dụng và bảo tồn các loài có giá trị trong họ này

1.3.2 Ở Việt Nam

Năm 2000, trong “Cây Cỏ Việt Nam” Phạm Hoàng Hộ và cộng sự Ďã

mô tả ngắn gọn với hình vẽ Ďơn giản kèm theo của 22 chi, 108 loài họ Gừng ở Việt Nam [20] Trong công trình này, tác giả Ďã Ďề cập Ďến hệ thống phân loại của Schumann (1904) với 2 phân họ và 4 tông, nhưng các taxon bậc chi lại không Ďược mô tả và sắp xếp theo hệ thống, có khóa Ďịnh loại Ďã Ďến chi nhưng thiếu Ďầy Ďủ Tác giả Ďã mô tả 108 loài trong 22 chi nhưng chỉ có khóa của 10 chi, không có khóa Ďịnh loại tới loài Với kết quả này, tài liệu “Cây Cỏ Việt Nam” Ďã bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam gần một nửa số chi và một nửa số loài so với Gagnepain (1908)

Tiếp nối các công trình nghiên cứu kể trên, Ďã có nhiều công trình nghiên cứu các chi, các loài mới, loài bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam của

họ Gừng Ďược công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước như của Larsen & Newman [79, 87], Nguyễn Quốc Bình & Newman [88], Rehse & Kress [95], Sâm Ngọc Lý và cộng sự [83], Ďặc biệt tác giả Nguyễn Quốc Bình Ďã có nhiều công bố về họ Gừng ở Việt Nam [1, 2, 3, 4, 5,7]

Trong những năm gần Ďây các nhà khoa học Ďã ghi nhận nhiều loài bổ sung và loài mới cho họ Gừng (Zingiberacea) tại Việt Nam Năm 2015, trong quá trình nghiên cứu họ Gừng (Zingiberaceae) ở Bắc Trung Bộ, Đỗ Ngọc Đài

và cộng sự Ďã phát hiện và bổ sung loài Etlingera yunnanensis (T L Wu & S

J Chen) R M Sm cho hệ thực vật Việt Nam, nâng tổng số loài của chi

Etlingera lên 5 loài [34] Lê Thị Hương và cộng sự ghi nhận loài Riềng nhiều

hoa Alpinia polyantha D Fang là loài bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam,

nâng tổng số loài của chi Riềng (Alpinia) lên 32 loài [17] Cũng trong năm

này, Leong-Skornickova và cộng sự Ďã công bố 9 loài thuộc chi Gừng

(Zingiber) là loài mới cho khoa học [80]

Năm 2016, Lý Ngọc Sâm khi nghiên cứu tại Núi Dầu và bán Ďảo Sơn Trà thuộc tỉnh Quảng Nam và Đà Nẵng Ďã phát hiện và mô tả 01 loài mới cho khoa

học và Ďược Ďặt tên là Zingiber skornickovae thuộc họ Gừng (Zingiberaceae),

góp phần làm Ďa dạng cho hệ thực vật Việt Nam [104]

Cũng trong năm 2017, Nguyễn Viết Hùng và cộng sự Ďã phát hiện và

bổ sung loài Zingiber nitens M.F Mewman cho hệ thực vật Việt Nam, nâng tổng số loài của chi Gừng (Zingiber) lên 35 loài [15]

Năm 2017, Lê Thị Hương và cộng sự Ďã phát hiện và bổ sung loài

Riềng lá nhăn (Alpinia rugosa S J Chen &Z Y Chen) cho hệ thực vật Việt Nam, nâng tổng số loài của chi Riềng (Alpinia Roxb.) lên 33 loài [18]

Bên cạnh các nghiên cứu về phân loại thực vật các loài thuộc họ Gừng (Zingiberacea) tại Việt Nam cũng có các nghiên cứu về giá trị sử dụng các loài trong họ này Theo Lê Thị Hương và cộng sự khi nghiên cứu giá trị sử dụng của

chi Riềng (Alpinia) và Sa nhân (Amomum) ở Bắc Trung Bộ cho thấy, trong tổng

số 22 loài thuộc chi Riềng (Alpinia), 10 loài thuộc chi Sa nhân (Amomum) thuộc

4 nhóm giá trị sử dụng khác nhau, nhóm cây cho tinh dầu chiếm tỷ lệ cao nhất với 30 loài; tiếp Ďến là nhóm làm thuốc 25 loài, nhóm cho gia vị 9 loài và thấp nhất là nhóm ăn Ďược 7 loài [16]

Với cây gừng Bắc Kạn, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào nhằm xác Ďịnh chính xác tên khoa học của loài Do một số Ďặc Ďiểm hình thái

bên ngoài của cây giống với cây gừng thường (Zingiber officinarum Roscoe)

và thường mọc ở trên các núi Ďá nên chúng Ďược người dân Ďịa phương gọi là

“Gừng Ďá”, “Gừng núi Ďá”, “Gừng núi” Trong Quyết Ďịnh số BNN ngày 05/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn về việc ban

80/2005/QĐ-hành danh mục nguồn gen cây trồng quý hiếm cần bảo tồn tên khoa học của loài

này chưa Ďược xác Ďịnh cụ thể, hiện Ďược xếp vào chi Gừng (Zingiber) với tên khoa học là “Zingiber sp.” Do Ďó, cần thiết phải có nghiên cứu bài bản nhằm

xác Ďịnh tên khoa học của loài và vị trí phân loại của chúng trong họ Gừng dựa vào phân tích Ďặc Ďiểm hình thái và ứng dụng công nghệ sinh học

1.4 Nghiên cứu về phân loại thực vật dựa trên trình tự gen

1.4.1 Giới thiệu về vùng ITS-rDNA (Internal transcribed spacer)

rDNA là nhóm gen mã hoá rRNA của ribosome và Ďóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA Ďược nghiên cứu vì

nó là gen có nhiều bản sao và Ďặc biệt không mã hoá cho bất kỳ protein nào Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hoá Phần lớn phân tử rDNA tương Ďối ổn Ďịnh nên Ďược xem

là cơ sở Ďể tìm ra sự tương Ďồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau Các mồi thiết kế dựa trên những Oligonucleotide có tính bảo thủ cao Ďược sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch Ďại các vùng tương Ďương dùng trong so sánh [109]

Hình 1.4 Sơ Ďồ vùng rDNA- ITS [38]

Các vùng ITS có Ďộ dài 600 Ďến 700 bp là các vùng tiến hóa nhanh nên

có thể thay Ďổi về trình tự cũng như Ďộ dài Các vùng bên cạnh ITS lại rất bảo thủ nên Ďược sử dụng Ďể thiết kế các mồi chung cho nhân bản vùng ITS Số bản sao các Ďoạn lặp lại của rDNA lên tới 30000 trong một tế bào Điều này giúp cho ITS trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu tiến hóa, phát sinh

loài và Ďa dạng di truyền Do ITS có tính bảo thủ cao trong loài nhưng lại thay Ďổi ở các loài khác nhau cho nên ITS Ďược biết Ďến là kỹ thuật quan trọng trong phân loại các nhóm (taxon) có mối liên kết gần Các nghiên cứu về phát sinh loài dựa vào rDNA hay các chuỗi ITS giúp hiểu biết sâu về tiến hóa và sự lai tạo ở các loài thực vật khác nhau [31]

1.4.2 Giới thiệu về vùng matK (maturaseK)

Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) Ďược phát hiện Ďầu tiên trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gen trnK mã hóa

cho tRNALys (UUU) của lục lạp Nó gồm 1 Ďoạn ORF chứa 509 codon nằm

trong intron của gen trnK và dường như chưa rõ chức năng Các nghiên cứu

sử dụng trình tự gen matK Ďể xây dựng cây phát sinh loài như cho thấy gen

matK có tính Ďa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen matK

trở thành gen chỉ thị quan trọng Ďể giúp phân loại thực vật Nhiều nghiên cứu

trên thế giới Ďã chỉ ra, ở rất nhiều loài thực vật sử dụng gen matK lục lạp có thể phân biệt Ďược loài, thậm chí dưới loài [43] Gen matK mã hóa cho enzyme

maturase, enzyme này có liên quan Ďến quá trình loại bỏ các intron trong quá

trình phiên mã mRNA Do gen matK tiến hóa nhanh và có mặt ở hầu hết các

loài thực vật nên Ďược sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu phát sinh loài, mối quan hệ di truyền ở thực vật CBOL (Consortium for the Barcode of Life)

Ďã tiến hành phân tích gen matK ở trên 550 loài thực vật và thấy rằng có hơn 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch Ďại gen matK bằng 1 cặp mồi, CBOL Ďã Ďề nghị sử dụng gen matK là một trong những chỉ thị chuẩn cho việc

xây dựng cây phân loại dựa vào số liệu so sánh các trình tự Cũng có thể xác Ďịnh sự thay Ďổi của các chuỗi bằng cắt hạn chế vùng ITS bằng các enzyme cắt hạn chế và phân tách các phân Ďoạn bằng gel agarose hoặc polyacrylamide Những thay Ďổi về các chuỗi tạo ra bằng kỹ thuật cắt hạn chế vùng ITS hay còn gọi là Ďa hình Ďộ dài Ďoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP) có thể dùng trong phân loại Do sự bảo thủ trong cấu tạo bậc hai, ITS Ďược xem như công cụ quan trọng cho việc so sánh tiến hóa của cơ thể nhân thực [107] Đối với nhiều cơ thể, ITS2 trong rRNA Ďược tổ chức xung quanh trung tâm bảo thủ chung của cấu trúc bậc hai từ Ďó bốn vòng xoắn Ďược tạo ra Cơ sở dữ liệu

về cấu trúc của ITS2 chứa hơn 288.000 cấu trúc tiên Ďoán cho các chuỗi ITS2

Ďã biết hiện nay Các trình tự này của ITS2 mở ra một khả năng mới là kết hợp các thông tin về cấu trúc trong nghiên cứu tiến hóa ITS Ďược sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền và phân loại [115], trong nghiên cứu nguồn gốc, phát sinh loài [75] và trong nghiên cứu mã vạch thực vật [111]

Trong những năm gần Ďây nhiều công trình nghiên cứu sử dụng trình tự gen trong phân loại Ďã Ďược công bố Tại Trung Quốc, sau khi nghiên cứu các

vùng gen rbcL, matK, trnH-psbA, ITS của 6286 cá thể thực vật thuộc 1757

loài, 141 chi, 75 họ, 42 bộ nhóm nghiên cứu mã vạch thực vật Ďã Ďi Ďến kết

luận là cặp chỉ thị matK và ITS có khả năng phân loại cao nhất, Ďến 75.3% số

loài [62]

Zuo et al., (2011), sau khi nghiên cứu các vùng gen atpFatpH,

psbA-trnH, psbK-psbI, psbM-trnD, matK, rps16, rpoB, rpoC1, rbcL, ITS và nad1

của 33 quần thể P bipinnatifidus, 5 quần thể P japonicus, 2 quần thể P

stipuleanatus, 2 quần thể P trifolius và các quần thể của P ginseng, P notoginseng, P pseudoginseng, P quinquefolius Ďã chỉ ra rằng vùng gen ITS

có mức Ďộ Ďa dạng di truyền cao nhất, có khả năng phân biệt loài Ďến 87,5%

và dưới loài Ďến 84,21% [118]

Năm 2015, Jiabin Deng et al., Ďã sử dụng ba vùng gen lục lạp rbcL,

psbA-trnH và petA-psbJ Ďể xác Ďịnh mối quan hệ họ hàng giữa 6 loài nghệ dược liệu (curcuma), Ďây là những loài rất khó phân biệt về hình thái Kết quả nghiên cứu cho thấy các mối quan hệ di truyền Ďược liên kết với sự phân bố

Ďịa lý của sáu loài này; trong Ďó loài Curcuma sichuanensis là một loài Ďột biến của Curcuma longa, Curcuma sichuanensi không xác Ďịnh là một loài Ďơn và Curcuma chuanhuangjiang Ďược xác Ďịnh là một loài riêng biệt [49]

Đối với cây Gừng (Zingiberaceae), Kress et al., là những người Ďầu

tiên sử dụng trình tự DNA Ďể phân tích mối quan hệ họ hàng Năm 2002,

Kress et al., phân tích trình tự DNA của các vùng Ďệm (ITS) và các vùng

matK cho thấy họ Gừng Zingiberaceae có thể chia ra bốn phân họ và sáu chi:

Siphonochiloideae (Siphonochileae), Tamijioideae (Tamijieae), Alpinioideae (Alpinieae, Riedelieae), và Zingiberoideae (Zingibereae, Globbeae) [78] Năm 2005, Kress et al., tiếp tục nghiên cứu về mối quan hệ tiến hóa của một tập hợp các loài thuộc chi Alpinia bằng phương pháp giải trình tự Ďoạn gen ITS và gen matK của 72 loài thuộc chi Alpinia, 27 loài không thuộc Alpinia

thuộc phân họ Alpinioideae, tám loài trong phân họ Zingiberoideae, một loài

trong phân họ Tamijioideae và ba loài trong chi Siphonochilus Phân tích kết quả của cả bộ dữ liệu cho thấy chi Alpinia Ďược chia thành 6 nhánh [77]

Nhánh I: Fax – gồm có 2 loài Alpinia abundiflora và Alpinia fax, phân

bố ở Sri Lanka và một phần nhỏ của Ấn Độ, Ďược xác Ďịnh là một nhánh mới

cùng nhóm với Aframomum châu Phi và Renealmia châu Phi.

Nhánh II: Galanga – gồm 4 loài A galangga, A conchigera, A nigra,

A bilamellata, phân bố ở châu Á

Nhóm III: Carolinensis – Các loài thuộc nhánh này gồm A aenea, A

cylindocephala, A monopleura, A eremochlamys và A coeruleoviridis

Nhóm IV: Zerumbet – là nhánh lớn nhất trong nghiên cứu và bao gồm

bốn nhóm (A zerumbet, A polyantha, A glabra, và A aquatica)

Nhóm V: Eubractea - tương tự nhánh Zerumbet nhưng rất khó Ďể xác Ďịnh Ďặc Ďểm hình thá Ďặc trưng Một số loài phân bố ở Philippines, Úc, Quần

Ďảo Bismarck và vùng nhiệt Ďới Thái Bình Dương Các nhánh gồm A

arundelliana, A caerulea và A modesta chỉ chứa các loài Úc Một nhánh

Ďược tìm thấy chủ yếu ở Philippines bao gồm ba loài Alpinia (A Elegans, A

pinetorum và A luteocarpa)

Nhóm VI: Rafflesiana chỉ bao gồm hai loài A javanica và A

rafflesiana, phân bố ở Sunda Shelf miền nam Thái Lan, bán Ďảo Malaysia,

Sumatra và Java

Cho Ďến nay, kết quả nghiên cứu của Kress et al., (2005) là nghiên cứu

Ďầy Ďủ và có hệ thống về phân loại họ gừng (Zingiberaceae) dựa trên trình tự

gen ITS và matK Đồng thời nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc sử dụng dữ liệu Ďơn ITS hoặc matK có thể xây dựng Ďược cây phát sinh loài, tuy nhiên chỉ số

ủng hộ (bootraps) không cao dẫn Ďến khó khăn trong việc khẳng Ďịnh vị trí

phân loại Trong khi Ďó, sử dụng kết hợp dữ liệu ITS và matK tạo ra khối dữ

liệu Ďầy Ďủ hơn trong xây dựng cây phát sinh loài với các giá trị ủng hộ cao hơn rất nhiều so với cây Ďơn [77]

Hình 1.5: Cây phát sinh chi Alpinia Ďược dựng bằng phương pháp ML từ

khối dữ liệu kết hợp của matK và ITS [77]

1.4.3.2 Ở Việt Nam

Trong những năm gần Ďây, kỹ thuật giải trình tự gen với Ďặc tính ổn Ďịnh, có Ďộ chính xác Ďang Ďược sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại,

Ďa dạng di truyền và phát sinh hệ thống của một số loài thực vật Phan Kế Long và cộng sự, (2009), Ďã sử dụng Ďoạn gen ITS-rDNA Ďể phân tích mối quan hệ di truyền của các loài lan Hài [22], nghiên cứu mối quan hệ phát sinh

của Bách xanh Ďá vôi (Calocedrus rupestris) và Bách xanh Ďá khác (C

macrolepis) [82] Đặc biệt năm 2014, nhóm tác giả trên Ďã tiến hành phân tích

mối quan hệ di truyền của các mẫu sâm thu ở Lai Châu trên cơ sở phân tích

trình tự nucleotit vùng matK và ITS-rDNA Kết quả nghiên cứu Ďã xác Ďịnh Ďược sâm Lai Châu (P vietnamensis var fuscidiscus) có chiều dài vùng matK

là 1485 nucleotide và khác với sâm Ngọc Linh (P vietnamensis var

vietnamensis) 02 nucleotide Chiều dài vùng ITS-rDNA của sâm Lai Châu (P vietnamensis var fuscidiscus) 588 nucleotide và khác với sâm Ngọc Linh (P vietnamensis var vietnamensis) từ 04 nucleotide (các mẫu thu ở Bản Giang

(huyện Tam Đường) và Nậm Tăm (huyện Sìn Hồ) Ďến 05 nucleotide (các mẫu thu ở Ka Lăng (huyện Mường Tè) Kết quả phân tích mối quan hệ họ

hàng trên cơ sở trình tự nucleotide vùng matK và ITS-rDNA bằng phương

pháp Maximum Parsimony (MP) và Maximum Likelihood (ML) cho thấy,

sâm Lai Châu (P vietnamensis var fuscidiscus) và sâm Ngọc Linh (P

vietnamensis var vietnamensis) tạo thành nhánh riêng biệt và có mối quan hệ

gần gũi với Panax zingiberensis Tam thất trắng (P stipuleanatus) thu Ďược ở Lai Châu khác với sâm Lai Châu (P vietnamensis var fuscidiscus) 26 nucleotide trên vùng gen matK, 25 nucleotide trên vùng ITS-rDNA và khác với sâm Ngọc Linh (P.vietnamensis var vietnamensis) 28 nucleotide trên vùng gen matK, 22 nucleotide trên vùng gen ITS-rDNA Các mẫu tam thất trắng (P stipuleanatus) này khác với các quần thể tam thất trắng (P

stipuleanatus) khác trên thế giới ở 01 nucleotide Ďặc trưng vùng Ďịa lý

(autapomorphis) và chúng có quan hệ gần gũi với Panax pseudoginseng [21]

Cùng nghiên cứu trên Ďối tượng sâm Ngọc Linh, Nguyễn Thị Phương

Trang và cộng sự, (2011) Ďã phân tích mối quan hệ di truyền của sâm Ngọc

Linh (P vietnamensis var vietnamensis) với các loài trong chi Panax dựa trên

kết quả phân tích thông tin di truyền Ďoạn gen ITSrDNA Kết quả cho thấy

sâm Ngọc Linh (P vietnamensis var vietnamensis) có mối quan hệ gần gũi với loài P notoginseng và chúng khác nhau ở 18 nucleotit [33]

Để làm sáng tỏ tên khoa học cho một số loài tre (Bambusa Schreb.) ở

Việt Nam, Vũ Thị Thu Hiền và cộng sự Ďã sử dụng ba cặp mồi Ďặc hiệu

trnLF/trnFR, psbA3’f/trnH và matK19F/matKR Ďể nhân bản Ďoạn gen Ďích

cho 19 mẫu thuộc ba loài tre ở Việt Nam là tre Bụng phật (B vulgaris Schrader ex Wendland cv vittata McC u), tre Vàng sọc (B vulgaris Schrader

ex Wendland.cv.wamin McClure) và tre Đùi gà (B ventricosa McClu) Kết quả Ďều nhân Ďược Ďoạn DNA có kích thước 1000bp cho vùng gen trnL-trnF, 680bp cho vùng psbA-trnH và 1500bp cho gen matK So sánh trình tự

nucleotit của 19 mẫu tre ở cả 3 vùng gen cho thấy giữa các mẫu trong cùng một loài giống nhau 100% Mức Ďộ tương Ďồng nucleotit giữa tre Bụng phật,

tre Vàng sọc và loài B vulgaris trên Genbank (EF137524) là 98,1% Ďối với vùng gen trnL-trnF và 100 % với vùng gen psbAtrnH Mức Ďộ tương Ďồng nucleotit gen psbA-trnH giữa tre Đùi gà và B ventricosa trên Genbank

(EF137524) là 99,0% Mức Ďộ tương Ďồng nucleotit của loài tre Đùi gà và

B.tuldoides trên Genbank (GU063083) là 99,7% Ďối với vùng gen trnL-trnF,

100 % Ďối với vùng gen psbA-trnH và gen maK Kết quả nhận Ďược khẳng Ďịnh loài tre Bụng phật và tre Vàng sọc là cùng loài B vulgaris và loài tre Đùi

gà có thể cùng loài với loài hóp nhỏ (B tuldoides) [11]

Bên cạnh Ďó, trình tự gen matK còn Ďược sử dụng trong nghiên cứu xác

Ďịnh mã vạch Năm 2015, Hà Văn Huân và Nguyễn Văn Long Ďã nghiên cứu

xác Ďịnh Ďoạn mã vạch DNA cho trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia

tamdaoensis) Kết quả nghiên cứu cho thấy trình tự nucleotide của Ďoạn gen matK ở cây Trà hoa vàng tam Ďảo so với ở cây Trà vàng lá dày chỉ sai khác 1

nucleotide (thay A bằng G) ở vị trí 508, so với ở loài Trà vàng petêlô thì có 1 nucleotide sai khác (thay C bằng A) ở vị trí 613; so sánh trình tự nucleotide

của gen matK ở Trà vàng lá dày so với trà vàng petêlô thì có 2 nucleotit sai

khác là thay G bằng A ở vị trí 508 và thay C bằng A ở vị trí 613 [12]

Để hỗ trợ cho việc Ďịnh danh loài Bảy lá một hoa Việt Nam - Paris

vietnamensis (Takht.) H.Li phục vụ nghiên cứu chọn tạo giống và nhân trồng,

nghiên cứu này Ďã mô tả, xác Ďịnh Ďặc Ďiểm hình thái Ďặc trưng và phân tích mã

vạch DNA dựa trên hai vùng gen ITS và psbA-trnH Bảy lá một hoa Việt Nam Ďược phân biệt với các loài khác thuộc chi Paris ở các Ďặc Ďiểm: nhị có trung Ďới

kéo dài hình trụ; cánh hoa dài hơn Ďài (1,2) 1,5 - 2 lần; lát cắt ngang qua bầu có hình sao, 4 - 7 cạnh, cạnh bầu lõm sâu, nhụy có phần hợp rất ngắn, hạt có áo hạt màu Ďỏ Kết quả phân tích các mã vạch DNA cho thấy vùng gen ITS có thể sử

dụng Ďể phân biệt Bảy lá một hoa Việt Nam với các loài thuộc chi Paris với Ďộ

tin cậy cao (giá trị bootstrap là 100) [10]

1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro cây họ Gừng

1.5.1 Trên thế giới

Việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy in vitro trong nhân giống vô tính cây họ Gừng Ďược thực hiện rất sớm Năm 1988, Inden et al., Ďã sử dụng Ďỉnh chồi Ďỉnh làm nguồn mẫu khởi Ďầu Ďể nghiên cứu nhân giống in vitro, kết quả

nghiên cứu cho thấy khi sử dụng môi trường MS bổ sung 5 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA từ một chồi ban Ďầu có thể tạo ra hơn 4 chồi trong vòng 9 tuần

[67] Để tạo mẫu sạch Ďưa vào nuôi cấy in vitro, Balachandran et al., (1990) Ďã

khử trùng mẫu mầm gừng và mầm nghệ bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút Sau Ďó nhân nhanh chồi gừng và nghệ trên môi trường MS có nồng Ďộ

khác nhau của BA và Kinetin Nghiên cứu Ďã chỉ ra, trên môi trường MS có bổ sung 3mg/l BAP cho kết quả nhân chồi tốt nhất [39]

Berger et al., (1994) Ďã lựa chọn nguồn mẫu ban Ďầu là củ, thực hiện

công thức khử trùng mẫu củ bằng cách xử lý cồn cho các mẫu cấy ngay sau khi cắt Củ Ďược ngâm trong natri hypochlorite 1% hoặc Canxi hypochlorite 1% hoặc ngâm trong HgCl2 kết quả cho thấy 62 - 90% mẫu sạch vi sinh vật [40]

Tại Braxin, Ricardo et al., (1995), khi nghiên cứu nhân nhanh loài gừng

Zingiber spectabile Griff Ďã chỉ ra, môi trường MS có bổ sung µM

6-benzyladenine (BA) và 5 µM indole-3-acetic acid (IAA) có hiệu quả cao trong tái sinh chồi, môi trường 1/2 MS có bổ sung 5µM Naphthaleneacetic acid (NAA) hoặc IAA [58] Cùng thời Ďiểm này các tác giả trên cũng Ďã công

bố nghiên cứu về nhân nhanh loài Alpinia purpurata K Schum, kết quả

nghiên cứu cho thấy môi trường MS có bổ sung 10 µM 6-benzyladenine và 5

µM NAA có hiệu quả tái sinh Ďa chồi trong thời gian 4 tuần [66]

Rout et al., (2001), Ďã khảo sát sự ảnh hưởng của các chất Ďiều hòa sinh trưởng và Ďiều kiện nuôi cấy lên nhân chồi và hình thành củ gừng in vitro Kết

quả nghiên cứu cho thấy, môi trường MS bổ sung 6 mg/l BA, 1,5mg/l IAA, 3 mg/l Adeninsulfate và 3% sucrose phù hợp Ďể nhân nhanh chồi gừng Để tạo

củ in vitro sử dụng môi trường MS bổ sung 1mg/l BA, 1mg/l IAA và từ 3-8%

sucrose, nuôi cấy trong 8 tuần Để kích thích hình thành rễ, các tác giả Ďã sử dụng các chất Ďiều hòa sinh trưởng như IAA hoặc IBA hoặc NAA Khi sử dụng IAA hoặc IBA ở nồng Ďộ 0,5-1 mg/l bổ sung vào môi trường ½ MS, rễ xuất hiện sau 7-9 ngày nuôi cấy Còn khi sử dụng NAA rễ xuất hiện sau 6-7 ngày nuôi cấy [97]

Nghiên cứu của tác giả Sathyagowri (2011) ở SriLanka cho thấy tầm quan trọng của nguồn mẫu Ďầu tiên có ảnh hưởng Ďến sự tái sinh của cây

gừng in vitro Kết quả nghiên cứu Ďã chỉ ra phương pháp nhân giống bằng

mẫu củ còn nhiều hạn chế Các mẫu củ Ďược khử trùng bằng Ethanol 70% trong 1 phút sau Ďó khử trùng bề mặt bằng Captan 0,3% kết hợp với Doxycycline 0,2% trong 10 phút, tiếp tục khử trùng bằng dung dịch 20% Clorox trong 20 phút Mẫu Ďược cắt với kích thước dài 0,5; 1,0; 2cm và cấy trên môi trường MS bổ sung 3,0mg/l BAP + 0,5mg/l NAA Kết quả cho thấy kích thước mẫu 0,5cm Ďạt tỉ lệ mẫu sống sót cao 66,67%, mẫu phát sinh hình thái Ďạt 44,44% trên môi trường 5,0mg/l BAP + 0,5mg/l NAA, chồi tái sinh sau 6 tuần nuôi cấy Chồi mới Ďược cấy chuyển sang môi trường 3,0mg/l BAP + 0,5mg/l NAA Ďể tái sinh cây con [98]

Các thí nghiệm nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô từ chồi non

ở nách lá của loài gừng Ďen (Z.spectabile) tại Indonexia trong môi trường

Murashige-Skoog có bổ sung chất Ďiều hoà sinh trưởng IAA (indole-3-acetic acid), NAA (Naphthalene - acetic acid) và BA (6-benzyladenin) Ďã cho kết quả cao và Ďược xem là một phương pháp quan trọng Ďể khuyến cáo cho các vùng trồng gừng [44]

Bên cạnh các công trình nghiên cứu tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu củ, Ďỉnh sinh trưởng, nhiều tác giả Ďã công bố các công trình nghiên cứu tái sinh

cây thông qua giai Ďoạn callus Tại Ấn Độ Ďã tái sinh cây in vitro thông qua

callus của giống Gừng chất lượng cao “Garubathan” Callus Ďược tạo thành từ lát cắt chồi trên môi trường MS bổ sung 2,4D và BAP, nhân lên trên môi trường MS bổ sung 2% Ďường + 10% nước dừa + 1mg/l 2,4D + 1mg/l BAP

Số lượng và chất lượng chồi tạo thành từ phôi vô tính tốt nhất trên môi trường 3/4MS bổ sung 5mg/l BAP [106] Nuôi cấy Ďoạn thân trên môi trường bổ sung 2,4D Ďã tạo callus màu vàng dạng hạt cứng (I) và calluss màu trắng nhạt, dính và mềm (II) Callus dạng II Ďược làm khô sau 40-60 ngày nuôi cấy, sau

Ďó chúng tách rời dạng hạt và chuyển sang dạng phôi hóa và tiếp tục chuyển thành phôi vô tính trên môi trường chứa 2mg/l BAP Những phôi vô tính này

chín và nảy mầm trên môi trường bổ sung BAP 2mg/l) và NAA 1mg/l) Callus dạng I cũng tạo Ďược phôi vô tính nhưng chỉ tạo rễ ở tất cả các công thức nuôi cấy Phôi vô tính Ďược tạo trực tiếp từ Ďoạn thân hoặc lá gốc trên môi trường bổ sung Ďơn lẻ TDZ hoặc kết hợp IBA Những nghiên cứu trước Ďã chỉ ra, phôi vô tính của cây gừng có thể Ďược tạo ra từ các mô khác nhau của biểu bì, bao lá mầm, Ďỉnh chồi và Ďỉnh rễ [81]

(0,2-Hossain et al., (2010) khi nghiên cứu phương pháp nhân giống hiệu quả

cho 6 loài gừng Ďịa phương ở Bangladesh Ďã chỉ ra, môi trường hiệu quả tạo callus là MS + 1mg/l IAA + 3mg/l BAP, môi trường tái sinh chồi là MS + 4mg/l BAP + 3mg/l kinetin + 1mg/l IAA, môi trường tạo rễ là MS/2 + 2mg/l IBA + 2mg/l NAA, Ďạt 43,46% số mẫu tạo rễ Cây ra vườn ươm có tỉ lệ sống sót và sinh trưởng tốt Ďạt 66,67-84,62% [63]

Năm 2015, Vijaykumar & Ajay cũng Ďã thành công trong việc nhân

giống loài Alpinia purpurata thông qua giai Ďoạn callus, kết quả nghiên cứu

cho thấy môi trường MS có bổ sung 2,4D (2ppm) và Kinetin (2ppm) cho hiệu quả tạo callus tốt nhất Callus Ďược tái sinh chồi trên môi trường MS có bổ sung BA (3.0ppm) và NAA (0,1ppm) [74]

Để Ďánh giá hiệu quả của việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô Một nghiên cứu tại Hàn quốc so sánh năng suất và chất lượng của

củ và cây gừng Seosanjong trồng ngoài Ďồng ruộng, so sánh những cây Ďược

tạo ra bằng công nghệ nuôi cấy in vitro và những cây Ďược tạo ra từ củ mầm tự nhiên Kết quả cho thấy trong cùng Ďiều kiện nuôi trồng cây nguồn gốc in vitro

có tốc Ďộ sinh trưởng tốt hơn, cây cao hơn, chồi mới nhiều hơn, Ďặc biệt khối lượng tươi cụm củ gừng sau khi thu hoạch nặng hơn 486g so với cây con từ củ mầm tự nhiên [71]

Năm 2012, Sudha et al., Ďã sử dụng phương pháp sắc khí khối phổ

GC-MS Ďể phân tích thành phần tinh dầu của cây Alpinia calcarata Rosc (36 tháng

tuổi) Ďược tạo ra bằng công nghệ nuôi cấy mô cho thấy, hàm lượng và số lượng các chất trong tinh dầu cây Ďược tạo ra bằng công nghệ nuôi cấy mô tương tự như cây bản Ďịa Hơn nữa, việc sử dụng cây nuôi cấy mô có thể tăng 50% sinh khối của cây so với việc nhân giống bằng phương pháp thông thường Do Ďó

hoàn toàn có thể sử dụng phương pháp nhân giống in vitro Ďể sản xuất trên qui

mô công nghiệp, nhằm Ďáp ứng nhu cầu cây dược liệu ngày càng cao [103]

1.5.2 Ở Việt Nam

Từ năm 2006-2008 Viện Di truyền Nông nghiệp Ďã triển khai Ďề tài

“Nghiên cứu Ďánh giá một số Ďặc tính nông sinh học chính và nhân giống in

vitro giống gừng Hawaii” Đây là giống gừng năng suất cao của Hoa Kỳ,

Ďược cố Phó thủ tướng Nguyễn Công Tạn giao cho Viện nghiên cứu Ďánh giá, nhân giống Sau 3 năm nghiên cứu Ďã Ďưa ra một số kết quả khả quan như: Đã khảo sát Ďược giống gừng Hawaii thích hợp trồng ở các vùng khí hậu mát mẻ của miền núi phía Bắc như Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Sapa có thời gian sinh trưởng là 10-11 tháng Đây là giống gừng Ďẻ nhánh nhanh, có nhiều chồi mầm, củ cay rất thích hợp cho sản xuất chế biến các loại thực phẩm mứt gừng Thành công bước Ďầu là xây dựng Ďược môi trường cho khả năng tạo callus tốt nhất là G4 (bổ sung 3mg/l BAP và 2 mg/l 2,4D); môi trường tạo chồi trực tiếp từ meristem thích hợp nhất cho giống gừng Hawaii là môi trường G3 (bổ sung 2 mg/l BAP và 1 mg/l 2,4D) Đây cũng là môi trường Ďể tái sinh chồi từ callus Môi trường thích hợp nhất Ďể nhân nhanh chồi là môi trường G11 có bổ sung 2 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA, sau 4 tuần hệ số nhân Ďạt 3,42 và môi trường ra rễ thích hợp nhất là RG2 có nồng Ďộ NAA 0,5 mg/l Công Ďoạn chuyển cây ra Ďất, Ďã xác Ďịnh Ďược giá thể thích hợp nhất cho cây gừng con giai Ďoạn sau ống nghiệm là giá thể trộn có thành phần Ďất, cát, tro theo tỉ lệ (1: 1: 1) Kết quả Ďánh giá về di truyền của giống cho thấy: Trong số

15 mẫu cây gừng Ďược tạo ra từ nuôi cấy meristem, so sánh với cây trồng ở

Ďồng ruộng bằng kỹ thuật PCR - RAPD cho thấy tần suất Ďột biến sau 7 - 8 lần cấy chuyển rất thấp, chỉ có 1/46 băng (RAPD-locus) cho Ďa hình, tương Ďương

2,2% Ngoài ra, Ďề tài còn Ďi sâu nghiên cứu Ďiều kiện bảo quản in vitro cho

thấy: Bảo quản ở nhiệt Ďộ phòng môi trường thích hợp là MS + 0,5 mg/l BAP + 40 g/l Sorbitol + 6.5 g/l agar + 30g/l Ďường và bảo quản ở nhiệt Ďộ 180C môi trường thích hợp là MS + 1 mg/l BAP + 40 g/l Sorbitol + 15 mg/l ABA + 6,5 g/l agar + 30g/l Ďường

Năm 2009, các nghiên cứu nhân giống gừng in vitro cũng Ďã Ďược tiến

hành bởi Huỳnh Trường Huê tại Trường Đại học An Giang nhằm xây dựng quy

trình nhân giống in vitro cây gừng (Zingiber officinale Rosc.) Trong nghiên cứu

này, tác giả Ďã xử lý khử trùng mẫu bằng Ca(OCl)2 10% trong 25-30 phút cho hiệu quả khử trùng 70% Nhân chồi trên môi trường MS có bổ sung 2mg/l BA

và kích thích tạo rễ trên môi trường bổ sung 1mg/l α-NAA [13] Năm 2014, nhóm tác giả tiếp tục công bố các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất Ďiều hòa sinh trưởng và nồng Ďộ Ďường lên quá trình nhân nhanh chồi gừng invitro Kết quả cho thấy môi trường thích hợp Ďể nhân nhanh chồi là môi trường MS + 2,5 mg/L BA + 0,2 mg/L TDZ + 1mg/L IAA hay MS + 2,5 mg/l

BA + 0,2 mg/l TDZ + 1 mg/l IBA + 20 g/L Ďường [14]

Vệc nghiên cứu nhân giống in vitro các loài dược liệu quý thuộc họ

Gừng Ďược nhiều tác giả quan tâm Năm 2011, Đặng Ngọc Phúc và cộng sự Ďã

nghiên cứu nhân giống in vitro cây Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc chi sa nhân (Amomum), họ gừng (Zingiberaceae) Theo kết quả

nghiên cứu công bố, Ďỉnh sinh trưởng Ďược khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong

12 phút Môi trường MS bổ sung BAP (1,0 mg/l) hoặc kinetin (1,0 mg/l) thích

hợp nhất cho giai Ďoạn tái sinh chồi Chồi in vitro Ďược nhân nhanh trên môi

trường MS bổ sung 1,5 mg/l BAP kết hợp với 0,25 mg/l NAA hoặc 1,5 mg/l kinetin kết hợp với 0,25 mg/l NAA Môi trường tạo rễ là môi trường MS bổ