Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây gừng bản địa ở bắc kạn (gừng đá) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ XUÂN DƢƠNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC, QUY TRÌNH NHÂN GỐNG IN VITRO VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY GỪNG BẢN ĐỊA Ở BẮC KẠN (GỪNG ĐÁ) Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 9.42.02.01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2019 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đặng Trọng Lƣơng TS Đỗ Tuấn Khiêm Phản biện 1:………………………………………… Phản biện 2: ………………………………………… Phản biện 3: ………………………………………… Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án tiến sĩ họp Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam ngày….tháng….năm… Có thể tìm kiếm luận án thƣ viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây gừng địa Bắc Kạn (Gừng đá) xếp vào nhóm quý cần bảo tồn theo Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN ngày 05/12/2005 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Gừng đá lồi địa mang tính chất đặc sản tỉnh Bắc Kạn, chúng phân bố chủ yếu xã Liêm Thủy, Xuân Dương thuộc huyện Na Rì, tỉnh Bắc Kạn Trong năm gần đây, nhu cầu sử dụng Gừng đá người dân địa phương du khách đến Bắc Kạn tăng cao, đặc biệt vào dịp lễ tết, giá thành thường dao động từ 600 nghìn đến triệu đồng/ 1kg tươi Điều dẫn đến việc khai thác ngày cạn kiệt nguồn gen Gừng đá mọc tự nhiên Mặc dù hiệu kinh tế cao, Gừng đá trồng chủ yếu theo kinh nghiệm, diện tích manh mún, nhỏ lẻ, việc nhân giữ giống theo kinh nghiệm người dân, củ giống không đảm bảo chất lượng, nhiễm bệnh nhiều dần thối hóa Hơn nữa, tên khoa học loài chưa xác định cụ thể Do đặc điểm hình thái có nhiều đặc điểm giống với gừng thường (Zingiber officinarum Roscoe) nên xếp vào chi Gừng (Zingiber), tên khoa học Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN “Zingiber sp.” Nhằm tạo sở liệu đặc điểm sinh học phục vụ cho công tác định danh, bước đầu xác định thành phần hóa học hoạt tính sinh học tinh dầu thu từ gừng địa Bắc Kạn, đồng thời xây dựng quy trình nhân nhanh từ lát cắt chồi, áp dụng vào việc tạo nguồn giống bệnh cung cấp cho người dân, lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro hoạt tính sinh học tinh dầu gừng địa Bắc Kạn (Gừng đá)” Mục tiêu luận án Xác định lồi, đặc điểm sinh học, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học tinh dầu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống công nghệ nuôi cấy mơ từ lát cắt chồi góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen gừng địa Bắc Kạn Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Cung cấp dẫn liệu khoa học đặc điểm sinh học khả nhân giống công nghệ nuôi cấy mô loài gừng Bắc Kạn, sở để bảo tồn phát triển nguồn gen có giá trị; Kết luận án tà liệu tham khảo cho nghiên cứu đào tạo 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài góp phần làm sáng tỏ vị trí phân loại gừng Bắc Kạn từ mở hướng cho nghiên cứu tiếp theo; Quy trình nhân giống cơng nghệ ni cấy mơ tế bào áp dụng vào thực tiễn tạo số lượng lớn giống đồng đều, bệnh, tạo điều kiện thuận lợi cho việc mở rộng quy mô phát triển lồi gừng Bắc Kạn, góp phần xóa đói giảm nghèo cho đồng bào miền núi Những đóng góp luận án Luận án cơng trình nghiên cứu cách có hệ thống vị trí phân loại định danh cho lồi gừng Bắc Kạn dựa vào đặc điểm hình thái trình tự đoạn gen đặc trưng ITS (Internal Transcribed Spacer) gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) Xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống nguồn gen gừng Bắc Kạn công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật thông qua tạo callus từ lát cắt chồi, góp phần tạo số lượng lớn giống đồng đều, bệnh, tạo điều kiện thuận lợi cho việc mở rộng quy mơ phát triển lồi gừng Bắc Kạn, góp phần xóa đói giảm nghèo cho đồng bào miền núi Cấu trúc luận án: Luận án gồm 116 trang với 25 bảng số liệu 29 hình Luận án gồm phần: Mở đầu (3 trang); Tổng quan tài liệu (32 trang); Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu (19 trang); Kết thảo luận (60 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang) Luận án tham khảo 118 tài liệu 35 tài liệu tiếng Việt 83 tài liệu tiếng Anh CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần Tổng quan tà liệu trình bày khái quát chung họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.) Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học phân loại họ Gừng, qua cho thấy việc nghiên cứu phân loại loài họ Gừng tiếp tục phát loài cho khoa học ghi nhận phân bố loài địa phương, nước khác Đây sở để tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện, xếp hệ thống phân loại loài họ Gừng, tạo tiền đề cho nghiên cứu sâu hơn, nhằm khai thác giá trị sử dụng bảo tồn loài có giá trị họ Với gừng Bắc Kạn, chưa có cơng trình nghiên cứu nhằm xác định xác tên khoa học lồi Do đó, cần thiết phải có nghiên cứu nhằm xác định tên khoa học loài vị trí phân loại chúng họ Gừng dựa vào phân tích đặc điểm hình thái ứng dụng cơng nghệ sinh học giải trình tự vùng ITS-rADN (Internal transcribed spacer) vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) Trong nghiên cứu Kress et al., (2002, 2005) phân tích làm sở cho nghiên cứu Phân tích kết đạt việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào nhân giống họ gừng Thế giới Việt Nam Trong tập trung phân tích nghiên cứu Trịnh Thị Thanh Hương cộng (2014) sở để thực nghiên cứu Phần tổng quan tài liệu đề cập tới số cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu thuộc họ gừng, qua cho thấy, nghiên cứu tinh dầu họ gừng chưa nhiều, đặc biệt lồi phân bố tự nhiên gần chưa có nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu ni cấy mô so với mọc tự nhiên Do cần có nghiên cứu cách có hệ thống để đánh giá ảnh hưởng việc nhân giống trồng phương pháp nuôi cấy mô đến thành phần hóa học tinh dầu, từ có giải pháp nhằm khai thác sử dụng có tinh dầu hiệu CHƢƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Cây gừng địa Bắc Kạn (Gừng đá) - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực mẫu gừng thu thập tỉnh Bắc Kạn Đề tài tập trung xác định vị trí phân loại lồi gừng Bắc Kạn phân tích hình thái thị phân tử trình tự gen matK ITS Phân tích thành phần hóa học, hoạt tính sinh học tinh dầu xây dựng quy trình nhân giống cơng nghệ ni cấy mô từ lát cắt chồi 2.2 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu vật mọc tự nhiên (mẫu hoang dã) thu thập 02 xã Liêm Thủy Xuân Dương thuộc huyện Na Rì tỉnh Bắc Kạn, độ cao từ 846 - 862m so với mực nước biển Tổng số mẫu sử dụng để phân tích hình thái giải trình tự gen ITS gen matK 06 mẫu - Vật liệu sử dụng để nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro chồi tái sinh từ mẹ khỏe mạnh, bệnh Kích thước chồi từ – 8cm 2.3 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Xác định loài gừng địa Bắc Kạn dựa vào phân tích đặc điểm hình thái giải trình tự đoạn gen ITS gen matK - Nội dung 2: Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống gừng Bắc Kạn công nghệ nuôi cấy lớp mỏng in vitro - Nội dung 3: Đặc điểm nông sinh học gừng Bắc Kạn có nguồn gốc ni cấy mơ - Nội dung 4: Xác định thành phần hóa học hoạt tính sinh học tinh dầu gừng Bắc Kạn 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm hình thái Sử dụng phương pháp hình thái so sánh, tham khảo chuyên khảo Phạm Hoàng Hộ (2000) [20], Nguyễn Quốc Bình (2011) [6] Thực vật chí Trung Quốc [48] 2.4.2 Phương pháp phân loại thực vật dựa trình tự gen 2.4.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 2.4.2.2 Điện di kiểm tra kết tách chiết DNA tổng số 2.4.2.3 Kiểm tra chất lượng DNA gel agarose 2.4.2.4 Kiểm tra chất lượng DNA máy đo quang phổ 2.4.2.5 Khuếch đại DNA kỹ thuật PCR 2.4.2.6 Giải trình tự sản phẩm PCR 2.4.2.7 Hiệu chỉnh trình tự 2.4.2.8 Xây dựng phát sinh lồi 2.4.3 Phương pháp ni cấy mơ 2.4.3.1 Nghiên cứu tạo mẫu in vitro 2.4.3.2 Nghiên cứu tạo callus 2.4.3.3 Nghiên cứu tái sinh chồi từ callus 2.4.3.4 Nghiên cứu nhân nhanh chồi 2.4.3.5 Nghiên cứu tạo hoàn chỉnh 2.4.3.6 Nghiên cứu chế độ luyện giá thể 2.4.3.7 Nghiên cứu biến đổi sinh lý, hóa sinh in vitro giai đoạn 2.4.4 Đặc điểm sinh trưởng phát triển có nguồn gốc in vitro 2.4.5 Phương pháp phân tích sinh hóa Chưng cất thu tinh dầu phương pháp lơi nước Việc phân tích định tính thực hệ thống thiết bị sắc ký khí phổ ký liên hợp GC/MS hãng Agilent Technologies HP 6890N 2.4.6 Phương pháp phân tích hoạt tính kháng vi sinh vật Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tiến hành để đánh giá khả kháng sinh mẫu chiết thực phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp Vander Bergher Vlietlinck (1991) McKane & Kandel (1996) 2.5 Địa điểm thời gian nghiên cứu Các nghiên cứu phân tích đặc điểm hình thái thực Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam – 18 Hoàng Quốc Việt – Hà Nội Các mẫu tiêu gửi kiểm tra Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc, Quảng Châu, Trung Quốc Thời gian thực hiện: từ 2/2016 - 6/2017 Các nghiên cứu giải trình tự đoạn gen đặc trưng thực Viện Công nghệ sinh học -Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện: từ 01/2017 - 7/2017 Các nghiên cứu nhân giống in vitro thực Viện Di truyền Nông nghiệp – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; Trường Đại học Hùng Vương – Thành phố Việt Trì – Tỉnh Phú Thọ Thời gian thực hiện: từ 2/2016 - 6/2017 Các nghiên cứu phân tích hóa sinh, hoạt tính kháng sinh thực Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện: từ 7/2017 8/2018 Các nghiên cứu đánh giá khả sinh trưởng phát triển gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô thực tỉnh Phú Thọ Huyện Na Rì – tỉnh Bắc Kạn Thời gian thực hiện: từ 4/2016 - 8/2018 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Vị trí phân loại gừng Bắc Kạn 3.1.1 Đặc điểm sinh học gừng Bắc Kạn 3.1.1.1 Một số đặc điểm hình thái nơng học Bảng 3.1: Một số tính trạng đặc trưng gừng Bắc Kạn TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Tính trạng Chiều cao Hình dạng thân cắt ngang tới gốc: Mùi thân Độ dài cuống Hình dạng Chiều dài Chiều rộng Tỷ lệ dài/rộng Màu phiến Có vệt sọc Mép Màu mép Mùi Tần suất hoa Số hoa/khóm Cấu tạo hoa Màu sắc hoa Hình dạng củ Kích thước củ Màu vỏ củ Màu thịt củ phần trung tâm Màu phụ thịt củ Năng suất củ/khóm (kg) Số củ khóm Dài củ Rộng củ vị trí rộng Thời gian sinh trưởng Mức độ biểu Cao 80-150 cm Tròn Có Ngắn (3-6 mm) Hình mác - elip Từ 13 - 16 cm Từ 2,5 – 3,3 cm Từ – Xanh đậm Có Có lơng mi Xanh đậm Có Mỗi năm lần Có - hoa Dạng cụm Nâu đỏ, vàng Phân nhánh Nhỏ (200g) Đỏ nâu Xám Có màu vàng 150 – 300g – củ – 10cm – 3cm Dài >10 tháng 3.1.2 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái 3.1.2.1 Phân loại đến bậc chi Kết mơ tả hình thái so sánh với khóa phân loại Nguyễn Quốc Bình (2011), gừng Bắc Kạn với đặc điểm có cụm hoa ngọn, thân có lá, nhị lép hình dùi, hình cầu, đặc điểm lồi thuộc chi Riềng (Alpinia) để phân biệt với loài chi khác thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) [6] Trên sở chúng tơi xác định lồi có tên Gừng đá Bắc Kạn thuộc chi Riềng (Alpinia), phát có giá trị trước chúng người dân gọi tên thông thường “Gừng đá” hiểu thuộc chi Gừng (Zingiber) 3.1.2.2 Phân loại đến bậc loài Sau xác định nguồn gen gừng Bắc Kạn thuộc chi Riềng (Alpinia), chúng tơi sử dụng khóa phân loại đến loài chi Riềng (Alpinia) Việt Nam [8] Tuy nhiên, mô tả đặc điểm cho thấy lồi khơng giống lồi đ�u tái sinh rễ tạo hoàn chỉnh tốt với thời gian rễ từ 19 – 21 ngày, chiều cao TB/cây 9,63cm, số TB/cây 5,33 lá, số rễ TB 5,51 rễ/chồi chiều dài TB rễ 4,43cm Kết nghiên cứu phù hợp với cơng bố trước tác giả nghiên cứu nhân giống họ gừng, đặc biệt khẳng định kết nghiên cứu Trịnh Thị Thanh Hương cộng (2014) nghiên cứu đối tượng gừng đá Bắc Kạn [19,51,112] 0,2 0,4 1,0 0,8 0,6 0,2 A 0,4 0,8 1,0 0,6 B Hình 3.15 Hình thái hồn chỉnh sau tuần ni cấy A: Trên mơi trường ½MS (hàm lượng NAA bổ sung từ 0,2 -1,0mg/l) B: Trên môi trường MS (hàm lượng NAA bổ sung từ 0,2 -1,0mg/l) 3.2.6 Giai đoạn 3.2.6.1 Giá thể 15 tục đẻ nhánh mức độ đẻ nhánh thấp giai đoạn đầu Đến 320 ngày sau trồng, số nhánh/cây trung bình đạt 5,34 nhánh/cây 3.3.4 Một số yếu tố cấu thành suất giống gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô Kết nghiên cứu cho thấy 320 ngày sau trồng số củ /khóm trung bình giống gừng Bắc Kạn đạt 4,73củ/khóm, chiều dài củ trung bình đạt 5,41cm chiều rộng củ trung bình đạt 2,26cm Năng suất cá thể khối lượng củ/khóm giống gừng Bắc Kạn đạt trung bình 147,7g/khóm 3.4 Thành phần hóa học tinh dầu gừng Bắc Kạn 3.4.1 Kết tách chiết tinh dầu Tinh dầu thu từ mẫu thân có màu vàng nhạt, mùi thơm dễ chịu Ở mẫu gừng Bắc Kạn tự nhiên, từ 400g mẫu tươi thu 0,440g tinh dầu, đạt hàm lượng 0,110 % (tính theo nguyên liệu mẫu tươi) Ở mẫu gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô, hàm lượng tinh dầu mẫu trồng Bắc Kạn trồng Phú Thọ có tỉ lệ hàm lượng tinh dầu tương đương nhau, 0,131% 0,133%, cao so với mẫu gừng Bắc Kạn tự nhiên Điều chứng tỏ việc trồng mẫu nuôi cấy mô hai địa điểm khác (Bắc Kạn Phú Thọ) không làm ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu (Bảng 3.17) Tinh dầu thu từ mẫu củ rễ có màu vàng đậm, có mùi thơm dễ chịu giống tinh dầu thu từ phần Khi so sánh với mẫu gừng Bắc Kạn tự nhiên, mẫu gừng nuôi cấy mô cho hàm lượng tinh dầu phần thân cao phần củ rễ Ở mẫu gừng Bắc Kạn tự nhiên, từ 500g mẫu rễ tươi thu 0,412g tinh dầu, đạt hàm lượng 0,082 % (tính theo nguyên liệu mẫu tươi) Ở mẫu gừng Bắc Kạn nuôi cấy mơ, tinh dầu thu từ phận rễ có hàm lượng thấp hẳn 18 so với tinh dầu thu từ phận (0,075% mẫu củ rễ so với 0,131% mẫu thân lá) (Bảng 3.17) 3.4.2 Thành phần hóa học tinh dầu Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) xác định thành phần tinh dầu thân mẫu TNBK gồm 14 cấu tử (chiếm 94,38%), mẫu CMBK gồm 13 cấu tử (chiếm 85,16%), mẫu CMPT gồm 18 cấu tử (chiếm 84,33%) Thành phần tinh dầu thân rễ mẫu TNBK gồm 15 cấu tử (chiếm 94,24%), mẫu CMBK gồm 14 cấu tử (chiếm 85,27%), mẫu CMPT gồm 18 cấu tử (chiếm 88,65%) (bảng 3.18) Tinh dầu thân chứa hợp chất decenal (chiếm tới 80,78 %), decen-1-ol (4,91 %), octenal (2,71 %), decanal (1,25 %) 2-decenoic acid (1,03 %) Decenal thành phần tinh dầu rau mùi Coriandrum sativum L Decenal sử dụng làm gia vị tác nhân hương liệu [84] Cũng giống tinh dầu phần thân lá, tinh dầu thu từ củ rễ gừng tự nhiên hợp chất chiếm hàm lượng cao decenal (chiếm tới 80,48 %), octenal (3,01 %), 2-decenoic acid (1,69 %), decen-1-ol (1,53 %) dodecanal (1,17 %) 19 Bảng 3.18: Thành phần hóa học tinh dầu mẫu nghiên cứu Mẫu thân (%) Mẫu thân rễ (%) TNB K CMB K CMP T1 CMP T2 TNB K CMB K CMP T1 CMP T2 Công thức phân tử - - - - 0,43 - 0,31 2,79 C10H16 Octanal 0,36 0,56 0,41 0,59 0,22 1,05 0,32 0,23 C8H16O Cymene 0,67 0,23 0,68 1,18 0,25 0,15 0,38 0,87 C10H14 Limonene - - - 0,14 0,12 - - 0,98 C10H16 Cineole 1,8 - - 0,27 - 0,39 0,22 0,45 1,78 C10H18O 2,71 0,71 1,64 3,42 3,01 0,32 1,36 4,47 C8H14O Borneol - - 0,34 - 0,36 - 1,02 0,98 C10H18O Decanal 1,25 0,58 0,76 1,85 0,91 - 0,25 1,00 C10H20O Fenchyl acetate - - 2,54 - 2,25 2,11 3,35 5,25 C12H20O2 10 Decenal 80,78 39,60 47,11 53,48 80,48 22,21 42,52 61,59 C10H18O 11 Decen-1-ol 4,91 0,53 1,62 2,26 1,53 0,97 1,55 1,13 C10H20O - - 1,41 - 0,84 1,16 2,35 2,51 C12H20O2 1,03 21,94 8,60 2,67 1,69 36,29 21,22 2,19 C10H18O2 0,46 16,89 15,90 9,25 0,60 16,11 11,75 2,36 C12H22O2 15 Dodecanal 0,98 1,14 1,17 - 1,17 0,64 0,94 0,99 C12H22O 16 Decanol 0,58 - 0,78 - - - - - C10H22O 0,20 0,17 - - - 0,12 - C9H18 TT Hợp chất Camphene Octenal 12 Bornyl acetate 13 2-Decenoic acid 14 Decenyl Acetate 17 Non-1-ene 18 Nonanal - 0,45 0,25 - - 0,64 0,25 - C9H18O 19 Nonanoic acid - 1,70 - - - 1,77 - - C9H18O2 20 Decanoic acid - 0,63 - - - - 0,37 - C10H20O2 94.38 85,16 84,33 98,21 94,24 85,27 88,65 98,05 Tổng Ghi chú: TNBK: Mẫu mọc tự nhiên Bắc Kạn CMBK: Mẫu nuôi cấy mô trồng Bắc Kạn CMPT1: Mẫu nuôi cấy mô trồng Phú Thọ 01 năm tuổi CMPT2: Mẫu nuôi cấy mô trồng Phú Thọ 02 năm tuổi ( - ): Không phát Khi so sánh với tinh dầu số loài thuộc chi Alpinia khác thấy rằng, tinh dầu gừng Bắc Kạn tự nhiên có khác biệt lớn với tinh dầu loài này: tinh dầu gừng Bắc Kạn tự nhiên chứa thành phần decenal, octenal, 2-decenoic acid, decen-1-ol dodecanal tinh dầu Riềng nếp (A galanga) chứa thành phần 1,8-cineol, camphor, alpha-fenchyl acetate; tinh dầu A conchigera chứa 1,8-cineol, 20 myrcen farnesol thành phần tinh dầu A tonkinensis chứa thành phần myrcen, 1,8-cineol camphor [61, 70] Khi phân tích mẫu tinh dầu thu từ gừng nuôi cấy mô 02 năm tuổi trồng Phú Thọ thấy rằng, hàm lượng chất Decenal tăng lên 53,48% (mẫu thân lá) 61,59% (mẫu củ rễ) gần tiệm cận với hàm lượng gừng mọc tự nhiên Điều cho thấy ni cấy mơ tổng hợp chất tương đối đầy đủ đạt năm tuổi Kết hoàn toàn phù hợp với thực tế thời gian thu hoạch gừng Bắc Kạn năm tuổi 3.5 Khả kháng vi sinh vật tinh dầu chiết xuất từ gừng Bắc Kạn Khả kháng nấm kháng khuẩn tinh dầu thu từ gừng Bắc Kạn thử nghiệm chủng vi sinh vật (Bảng 3.20) Kết nghiên cứu cho thấy mẫu tinh dầu thu từ tự nhiên nuôi cấy mô trồng tỉnh Phú Thọ Bắc Kạn 01 năm tuổi có khả kháng 5-6/8 chủng vi sinh vật kiểm định nồng độ ức chế 200g/ml Riêng tinh dầu thu từ nuôi cấy mô 02 năm tuổi trồng tỉnh Phú Thọ có khả kháng 7/8 chủng vi sinh vật kiểm định 21 22 NCM PT-CR2: Mẫu củ rễ NCM Phú Thọ 02 năm tuổi NCM PT-TL2: Mẫu thân NCM Phú Thọ 02 năm tuổi NCM PT-CR1: Mẫu củ rễ NCM Phú Thọ 01 năm tuổi 22 NCM BK-CR1: Mẫu củ rễ NCM Bắc Kạn 01 năm tuổi NCM PT-TL1: Mẫu thân NCM Phú Thọ 01 năm tuổi NCM BK-TL1: Mẫu thân NCM Bắc Kạn 01 năm tuổi Bản địa-CR1: Mẫu củ rễ địa Bắc Kạn 01 năm tuổi Bản địa-TL1: Mẫu thân địa Bắc Kạn 01 năm tuổi Ghi chú: Bảng 3.20: Khả kháng nấm, kháng khuẩn tinh dầu gừng Bắc Kạn nguồn gốc nuôi cấy mô KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN: Đã xác định Gừng đá tỉnh Bắc Kạn thuộc chi Riềng (Alpinia) có tên khoa học Alpinia coriandriodora D.Fang Đây loài bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam, nâng tổng số loài biết chi Alpinia Roxb Việt Nam lên 34 loài Kết phân loại từ phát sinh loài xây dựng khối liệu đơn matK ITS tương đồng nhau, nhiên chúng thể kết từ khối liệu đơn không rõ ràng mức ủng hộ thấp Cây phát sinh loài từ khối liệu kết hợp matK ITS cho thấy loài gừng Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora) có tương đồng di truyền với lồi vùng phân bố có mối quan hệ gần gũi với số thành viên chi Alpinia phía nam Trung Quốc (Quảng Tây, Vân Nam, Quảng Đồng, Hải Nam) A japonica, A coriacea A guangdongensis… Đã xây dựng quy trình nhân giống gừng Bắc Kạn kỹ thuật ni cấy tạo callus từ lát cắt chồi Callus phát sinh tốt mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l TDZ 3,0 mg/l 2,4D Mơi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l Vitamin B1 3,0 mg/l BAP phù hợp để tái sinh chồi từ callus Môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l BAP, 1,0mg/l Kin, 0,2 mg/l α-NAA 100 ml/l nước dừa phù hợp để nhân chồi in vitro Môi trường MS bổ sung 0,6 mg/l α-NAA có hiệu tái sinh rễ tạo hồn chỉnh tốt Giai đoạn thực giá thể 100% cát mịn Bằng phương pháp chưng cất lôi nước thu tinh dầu thân gừng Bắc Kạn với hiệu suất dao động từ 0,110% đến 0,133% thu tinh dầu phần rễ với hiệu suất dao động từ 0,075% - 0,082% so với trọng lượng mẫu tươi Thành phần hóa học tinh dầu gừng Bắc Kạn tự nhiên có khác biệt lớn với tinh dầu loài khác chi Alpinia Hợp chất hóa 23 học có mẫu tinh dầu gừng Bắc Kạn decenal (một hợp chất tinh dầu rau mùi Coriandrum sativum L., có khả kháng khuẩn cao, sử dụng làm gia vị tác nhân hương liệu) chiếm tới 80,87% mẫu tinh dầu thân 80,48% mẫu tinh dầu củ rễ Các mẫu ni cấy mơ 01 năm tuổi có hàm lượng Decenal thấp hẳn so với mẫu tự nhiên (dao động từ 22,21% - 47,11%), 02 năm tuổi hàm lượng Decenal đạt xấp xỉ tự nhiên (53,48% mẫu thân 61,59% mẫu củ rễ) 5.Tinh dầu thu từ gừng Bắc Kạn mẫu tự nhiên nuôi cấy mô trồng tỉnh Phú Thọ Bắc Kạn (01 năm tuổi) có khả kháng 5-6/8 chủng vi sinh vật kiểm định nồng độ ức chế 200g/ml Riêng tinh dầu thu từ nuôi cấy mô 02 năm tuổi trồng tỉnh Phú Thọ có khả kháng 7/8 chủng vi sinh vật kiểm định ĐỀ NGHỊ: - Phát triển gừng Bắc Kạn địa bàn tỉnh miền núi, tạo cấu giống trồng góp phần giúp đồng bào miền núi xóa đói giảm nghèo - Tiếp tục nghiên cứu đánh chất lượng gừng Bắc Kạn tạo công nghệ nuôi cấy mơ so với gừng Bắc Kạn ngồi tự nhiên - Nghiên cứu hoạt tính dược liệu chất chiết xuất từ gừng Bắc Kạn 24 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Vũ Xuân Dƣơng, Đặng Trọng Lương, Đỗ Tuấn Khiêm, Phạm Thanh Loan, Trịnh Thị Thanh Hương (2019) Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng nhân nhanh in vitro riềng địa Bắc Kạn Tạp chí Khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, số (100): 29-36 VU Xuan Duong, NGUYEN Quoc Binh, DANG Trong Luong, NGHIEM Duc Trong, CAO Phi Bang, VU Tien Chinh, YE Xing-er, XIA Nian-he (2019) Alpinia coriandriodora D Fang, A New Record for Flora of Vietnam Journal of Tropical and Subtropical Botany, 27(1): 99 – 101 Cao Phi Bằng, Vũ Xuân Dƣơng, Đặng Trọng Lương (2018) Tác động salicylic acid tới số tiêu sinh lí riềng địa Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora D Fang) điều kiện thiếu nước Tạp chí Phát triển Khoa học công nghệ, tập 21, số T3-2018, 45-49 Vũ Xuân Dƣơng, Nguyễn Thị Hồng Vân, Đặng Trọng Lương, Nguyễn Quốc Bình, Phạm Thanh Loan, Đỗ Tuấn Khiêm, Tạ Thị Thu Thủy, Trần Đăng Thạch (2017) Sự biến đổi thành phần hóa học tinh dầu riềng địa Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora) q trình nhân giống cơng nghệ ni cấy in vitro.Tạp chí hóa học, 55 (5E34) 212-216 Vũ Xuân Dƣơng, Cao Phi Bằng (2016) Biến đổi sinh lý, hóa sinh riềng địa Bắc Kạn (Alpinia sp.) in vitro thời kỳ exvitro Báo cáo khoa học nghiên cứu giảng dạy sinh học Việt Nam – Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 2, tổ chức Trường Đại học sư phạm – Đại học Đà Nẵng, tháng 5/2016 25 ... tính sinh học tinh dầu gừng địa Bắc Kạn (Gừng đá) Mục tiêu luận án Xác định loài, đặc điểm sinh học, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học tinh dầu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống công... in vitro - Nội dung 3: Đặc điểm nơng sinh học gừng Bắc Kạn có nguồn gốc nuôi cấy mô - Nội dung 4: Xác định thành phần hóa học hoạt tính sinh học tinh dầu gừng Bắc Kạn 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu. .. “Zingiber sp.” Nhằm tạo sở liệu đặc điểm sinh học phục vụ cho công tác định danh, bước đầu xác định thành phần hóa học hoạt tính sinh học tinh dầu thu từ gừng địa Bắc Kạn, đồng thời xây dựng quy