Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây gừng bản địa ở Bắc Kạn (Gừng đá) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ XUÂN DƢƠNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC, QUY TRÌNH NHÂN GỐNG IN VITRO VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY GỪNG BẢN ĐỊA Ở BẮC KẠN (GỪNG ĐÁ) Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 9.42.02.01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NƠNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2019 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đặng Trọng Lƣơng TS Đỗ Tuấn Khiêm Phản biện 1:………………………………………… Phản biện 2: ………………………………………… Phản biện 3: ………………………………………… Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án tiến sĩ họp Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam ngày….tháng….năm… Có thể tìm kiếm luận án thƣ viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây gừng địa Bắc Kạn (Gừng đá) xếp vào nhóm quý cần bảo tồn theo Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN ngày 05/12/2005 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Gừng đá lồi địa mang tính chất đặc sản tỉnh Bắc Kạn, chúng phân bố chủ yếu xã Liêm Thủy, Xuân Dương thuộc huyện Na Rì, tỉnh Bắc Kạn Trong năm gần đây, nhu cầu sử dụng Gừng đá người dân địa phương du khách đến Bắc Kạn tăng cao, đặc biệt vào dịp lễ tết, giá thành thường dao động từ 600 nghìn đến triệu đồng/ 1kg tươi Điều dẫn đến việc khai thác ngày cạn kiệt nguồn gen Gừng đá mọc tự nhiên Mặc dù hiệu kinh tế cao, Gừng đá trồng chủ yếu theo kinh nghiệm, diện tích manh mún, nhỏ lẻ, việc nhân giữ giống theo kinh nghiệm người dân, củ giống không đảm bảo chất lượng, nhiễm bệnh nhiều dần thối hóa Hơn nữa, tên khoa học loài chưa xác định cụ thể Do đặc điểm hình thái có nhiều đặc điểm giống với gừng thường (Zingiber officinarum Roscoe) nên xếp vào chi Gừng (Zingiber), tên khoa học Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN “Zingiber sp.” Nhằm tạo sở liệu đặc điểm sinh học phục vụ cho công tác định danh, bước đầu xác định thành phần hóa học hoạt tính sinh học tinh dầu thu từ gừng địa Bắc Kạn, đồng thời xây dựng quy trình nhân nhanh từ lát cắt chồi, áp dụng vào việc tạo nguồn giống bệnh cung cấp cho người dân, lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro hoạt tính sinh học tinh dầu gừng địa Bắc Kạn (Gừng đá)” Mục tiêu luận án Xác định lồi, đặc điểm sinh học, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học tinh dầu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống công nghệ nuôi cấy mơ từ lát cắt chồi góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen gừng địa Bắc Kạn Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Cung cấp dẫn liệu khoa học đặc điểm sinh học khả nhân giống công nghệ nuôi cấy mô loài gừng Bắc Kạn, sở để bảo tồn phát triển nguồn gen có giá trị; Kết luận án tà liệu tham khảo cho nghiên cứu đào tạo 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài góp phần làm sáng tỏ vị trí phân loại gừng Bắc Kạn từ mở hướng cho nghiên cứu tiếp theo; Quy trình nhân giống cơng nghệ ni cấy mơ tế bào áp dụng vào thực tiễn tạo số lượng lớn giống đồng đều, bệnh, tạo điều kiện thuận lợi cho việc mở rộng quy mô phát triển lồi gừng Bắc Kạn, góp phần xóa đói giảm nghèo cho đồng bào miền núi Những đóng góp luận án Luận án cơng trình nghiên cứu cách có hệ thống vị trí phân loại định danh cho lồi gừng Bắc Kạn dựa vào đặc điểm hình thái trình tự đoạn gen đặc trưng ITS (Internal Transcribed Spacer) gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) Xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống nguồn gen gừng Bắc Kạn công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật thông qua tạo callus từ lát cắt chồi, góp phần tạo số lượng lớn giống đồng đều, bệnh, tạo điều kiện thuận lợi cho việc mở rộng quy mơ phát triển lồi gừng Bắc Kạn, góp phần xóa đói giảm nghèo cho đồng bào miền núi Cấu trúc luận án: Luận án gồm 116 trang với 25 bảng số liệu 29 hình Luận án gồm phần: Mở đầu (3 trang); Tổng quan tài liệu (32 trang); Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu (19 trang); Kết thảo luận (60 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang) Luận án tham khảo 118 tài liệu 35 tài liệu tiếng Việt 83 tài liệu tiếng Anh CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần Tổng quan tà liệu trình bày khái quát chung họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.) Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học phân loại họ Gừng, qua cho thấy việc nghiên cứu phân loại loài họ Gừng tiếp tục phát loài cho khoa học ghi nhận phân bố loài địa phương, nước khác Đây sở để tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện, xếp hệ thống phân loại loài họ Gừng, tạo tiền đề cho nghiên cứu sâu hơn, nhằm khai thác giá trị sử dụng bảo tồn loài có giá trị họ Với gừng Bắc Kạn, chưa có cơng trình nghiên cứu nhằm xác định xác tên khoa học lồi Do đó, cần thiết phải có nghiên cứu nhằm xác định tên khoa học loài vị trí phân loại chúng họ Gừng dựa vào phân tích đặc điểm hình thái ứng dụng cơng nghệ sinh học giải trình tự vùng ITS-rADN (Internal transcribed spacer) vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK) Trong nghiên cứu Kress et al., (2002, 2005) phân tích làm sở cho nghiên cứu Phân tích kết đạt việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào nhân giống họ gừng Thế giới Việt Nam Trong tập trung phân tích nghiên cứu Trịnh Thị Thanh Hương cộng (2014) sở để thực nghiên cứu Phần tổng quan tài liệu đề cập tới số cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu thuộc họ gừng, qua cho thấy, nghiên cứu tinh dầu họ gừng chưa nhiều, đặc biệt lồi phân bố tự nhiên gần chưa có nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu ni cấy mô so với mọc tự nhiên Do cần có nghiên cứu cách có hệ thống để đánh giá ảnh hưởng việc nhân giống trồng phương pháp nuôi cấy mô đến thành phần hóa học tinh dầu, từ có giải pháp nhằm khai thác sử dụng có tinh dầu hiệu CHƢƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Cây gừng địa Bắc Kạn (Gừng đá) - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực mẫu gừng thu thập tỉnh Bắc Kạn Đề tài tập trung xác định vị trí phân loại lồi gừng Bắc Kạn phân tích hình thái thị phân tử trình tự gen matK ITS Phân tích thành phần hóa học, hoạt tính sinh học tinh dầu xây dựng quy trình nhân giống cơng nghệ ni cấy mô từ lát cắt chồi 2.2 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu vật mọc tự nhiên (mẫu hoang dã) thu thập 02 xã Liêm Thủy Xuân Dương thuộc huyện Na Rì tỉnh Bắc Kạn, độ cao từ 846 - 862m so với mực nước biển Tổng số mẫu sử dụng để phân tích hình thái giải trình tự gen ITS gen matK 06 mẫu - Vật liệu sử dụng để nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro chồi tái sinh từ mẹ khỏe mạnh, bệnh Kích thước chồi từ – 8cm 2.3 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Xác định loài gừng địa Bắc Kạn dựa vào phân tích đặc điểm hình thái giải trình tự đoạn gen ITS gen matK - Nội dung 2: Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống gừng Bắc Kạn công nghệ nuôi cấy lớp mỏng in vitro - Nội dung 3: Đặc điểm nông sinh học gừng Bắc Kạn có nguồn gốc ni cấy mơ - Nội dung 4: Xác định thành phần hóa học hoạt tính sinh học tinh dầu gừng Bắc Kạn 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm hình thái Sử dụng phương pháp hình thái so sánh, tham khảo chuyên khảo Phạm Hoàng Hộ (2000) [20], Nguyễn Quốc Bình (2011) [6] Thực vật chí Trung Quốc [48] 2.4.2 Phương pháp phân loại thực vật dựa trình tự gen 2.4.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 2.4.2.2 Điện di kiểm tra kết tách chiết DNA tổng số 2.4.2.3 Kiểm tra chất lượng DNA gel agarose 2.4.2.4 Kiểm tra chất lượng DNA máy đo quang phổ 2.4.2.5 Khuếch đại DNA kỹ thuật PCR 2.4.2.6 Giải trình tự sản phẩm PCR 2.4.2.7 Hiệu chỉnh trình tự 2.4.2.8 Xây dựng phát sinh lồi 2.4.3 Phương pháp ni cấy mơ 2.4.3.1 Nghiên cứu tạo mẫu in vitro 2.4.3.2 Nghiên cứu tạo callus 2.4.3.3 Nghiên cứu tái sinh chồi từ callus 2.4.3.4 Nghiên cứu nhân nhanh chồi 2.4.3.5 Nghiên cứu tạo hoàn chỉnh 2.4.3.6 Nghiên cứu chế độ luyện giá thể 2.4.3.7 Nghiên cứu biến đổi sinh lý, hóa sinh in vitro giai đoạn 2.4.4 Đặc điểm sinh trưởng phát triển có nguồn gốc in vitro 2.4.5 Phương pháp phân tích sinh hóa Chưng cất thu tinh dầu phương pháp lơi nước Việc phân tích định tính thực hệ thống thiết bị sắc ký khí phổ ký liên hợp GC/MS hãng Agilent Technologies HP 6890N 2.4.6 Phương pháp phân tích hoạt tính kháng vi sinh vật Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tiến hành để đánh giá khả kháng sinh mẫu chiết thực phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp Vander Bergher Vlietlinck (1991) McKane & Kandel (1996) 2.5 Địa điểm thời gian nghiên cứu Các nghiên cứu phân tích đặc điểm hình thái thực Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam – 18 Hoàng Quốc Việt – Hà Nội Các mẫu tiêu gửi kiểm tra Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc, Quảng Châu, Trung Quốc Thời gian thực hiện: từ 2/2016 - 6/2017 Các nghiên cứu giải trình tự đoạn gen đặc trưng thực Viện Công nghệ sinh học -Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện: từ 01/2017 - 7/2017 Các nghiên cứu nhân giống in vitro thực Viện Di truyền Nông nghiệp – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; Trường Đại học Hùng Vương – Thành phố Việt Trì – Tỉnh Phú Thọ Thời gian thực hiện: từ 2/2016 - 6/2017 Các nghiên cứu phân tích hóa sinh, hoạt tính kháng sinh thực Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện: từ 7/2017 8/2018 Các nghiên cứu đánh giá khả sinh trưởng phát triển gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô thực tỉnh Phú Thọ Huyện Na Rì – tỉnh Bắc Kạn Thời gian thực hiện: từ 4/2016 - 8/2018 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Vị trí phân loại gừng Bắc Kạn 3.1.1 Đặc điểm sinh học gừng Bắc Kạn 3.1.1.1 Một số đặc điểm hình thái nơng học Bảng 3.1: Một số tính trạng đặc trưng gừng Bắc Kạn TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Tính trạng Chiều cao Hình dạng thân cắt ngang tới gốc: Mùi thân Độ dài cuống Hình dạng Chiều dài Chiều rộng Tỷ lệ dài/rộng Màu phiến Có vệt sọc Mép Màu mép Mùi Tần suất hoa Số hoa/khóm Cấu tạo hoa Màu sắc hoa Hình dạng củ Kích thước củ Màu vỏ củ Màu thịt củ phần trung tâm Màu phụ thịt củ Năng suất củ/khóm (kg) Số củ khóm Dài củ Rộng củ vị trí rộng Thời gian sinh trưởng Mức độ biểu Cao 80-150 cm Tròn Có Ngắn (3-6 mm) Hình mác - elip Từ 13 - 16 cm Từ 2,5 – 3,3 cm Từ – Xanh đậm Có Có lơng mi Xanh đậm Có Mỗi năm lần Có - hoa Dạng cụm Nâu đỏ, vàng Phân nhánh Nhỏ (200g) Đỏ nâu Xám Có màu vàng 150 – 300g – củ – 10cm – 3cm Dài >10 tháng 3.1.2 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái 3.1.2.1 Phân loại đến bậc chi Kết mơ tả hình thái so sánh với khóa phân loại Nguyễn Quốc Bình (2011), gừng Bắc Kạn với đặc điểm có cụm hoa ngọn, thân có lá, nhị lép hình dùi, hình cầu, đặc điểm lồi thuộc chi Riềng (Alpinia) để phân biệt với loài chi khác thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) [6] Trên sở chúng tơi xác định lồi có tên Gừng đá Bắc Kạn thuộc chi Riềng (Alpinia), phát có giá trị trước chúng người dân gọi tên thông thường “Gừng đá” hiểu thuộc chi Gừng (Zingiber) 3.1.2.2 Phân loại đến bậc loài Sau xác định nguồn gen gừng Bắc Kạn thuộc chi Riềng (Alpinia), chúng tơi sử dụng khóa phân loại đến loài chi Riềng (Alpinia) Việt Nam [8] Tuy nhiên, mô tả đặc điểm cho thấy lồi khơng giống lồi cơng bố Việt Nam Trên sở chúng tơi tiếp tục rà soát khu vực lân cận (thuộc Trung Quốc), sử dụng danh mục loài thực vật khóa định loại lồi chi Riềng (Alpinia) Trung Quốc [48] so sánh với loài gần, kết xác định loài gừng Bắc Kạn có tên khoa học Alpinia coriandriodora D.Fang với đặc điểm đặc trưng là: có mùi thơm đặc trưng, rụng bắc Đây loài bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam, nâng tổng số loài biết chi Alpinia Roxb Việt Nam lên 34 loài [18] Loài D Fang cơng bố tạp chí Acta Phytotax Sin 16 (4): 79 năm 1978 [57] 3.1.3 Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trình tự gen ITS gen matK 3.1.3.1 Tách chiết DNA tổng số Đã tách chiết DNA mẫu nghiên cứu Kết cho thấy bố, chúng tơi xây dựng sơ đồ hình mối quan hệ di truyền loài A coriandriodora loài chi Alpinia dựa khối liệu kết hợp vùng gen matK phương pháp Maximum Likelihood (hình 3.9) Sơ đồ hình cho thấy, mẫu gừng Bắc Kạn nhóm với loài: A guinaensis, A zerumbet, A mutica, A polyantha, A mutan, A blepharocalyx, A rugosa, A.calcarata, A macrlure, A guangdongensis A.japonica 3.1.3.5 Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trình tự kết hợp gen ITS matK Kết phát sinh loài từ phát sinh xây dựng khối liệu đơn matK ITS tương đồng nhau, nhiên chúng thể kết từ khối liệu đơn không rõ ràng mức ủng hộ thấp Do chúng tơi sử dụng phát sinh loài từ khối liệu kết hợp matK ITS để xác định mối quan hệ phát sinh lồi chi Alpinia vị trí lồi Alpinia coriandriodora (Hình 3.10) Kết phân tích liệu phân tử kết hợp phương pháp maximum likelihood (ML) and Bayesian Inference (BI) ủng hộ mạnh mẽ Alpinia khơng phải nhóm đơn phát sinh (nonmonophyletic group) với số ủng hộ cao (BS: 100%, PP: 1.0) (Hình 3.10) Cây phân loại phân biệt 06 nhánh riêng biệt Alpinia, kết hoàn toàn tương đồng với nghiên cứu Kress et al., (2005) [77] Trong lồi gừng Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora) ghi nhận thành viên chi Alpinia với vị trí phát sinh lồi thuộc nhánh thứ VI (Hình 3.10) Kết phân tích thể lồi gừng Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora) có mối quan hệ gần gũi với số thành viên Alpinia nam Trung Quốc (Quảng Tây, Vân Nam, Quảng Đồng, Hải Nam) A japonica, A coriacea A guangdongensis… Kết thể A coriandriodora có tương đồng di truyền với 11 loài vùng phân bố Hơn nữa, kết khẳng định chắn cho ghi nhận loài bổ sung Alpinia coriandriodora cho hệ thực vật Việt Nam [51] Hình 3.10 Sơ đồ hình mối quan hệ di truyền loài A coriandriodora loài chi Alpinia dựa khối liệu kết hợp matK ITS (A), vị trí phát sinh lồi Alpinia coriandriodora chi Alpinia (B) Chỉ số ủng hộ ML PP phân tích BI trình bày nhánh “–” thể số ủng hộ thấp 50% Màu đỏ: Vị trí lồi A coriandriodora; Màu xanh: loài thuộc nhánh phân loại với loài A coriandriodora) 12 3.2 Nhân giống gừng Bắc Kạn công nghệ nuôi cấy lớp mỏng 3.2.1 Tạo mẫu in vitro Công thức khử trùng hiệu mẫu chồi non gừng Bắc Kạn khử trùng kép dung dịch NaOCl 2,5% 0,5ml Tween20 thời gian lần phút, lần 15 phút, lần mẫu rửa nước cất tiệt trùng lần 3.2.2 Tạo callus từ lát cắt chồi Bảng 3.6 Ảnh hưởng tổ hợp TDZ 2,4D đến khả tái sinh tạo callus lát cắt chồi (sau tuần nuôi cấy) Công thức Chất ĐHST (mg/l) TDZ 2,4D Tỉ lệ tạo callus (%) Hình thái callus 0 32,22 Một số mẫu khơng tạo callus bị hóa đen CT8 CT9 CT10 0,5 0,5 0,5 1,0 2,0 3,0 34,44 44,44 75,56 Bề mặt callus khô, chắc, màu trắng sáng CT11 0,5 4,0 54,44 Một số mẫu không tạo callus bị hóa đen ĐC LSD0,05 P.value 5,05