Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của lá huyền tinh (Tacca ieontopetaloides (L.) Kuntze)

Luận văn lựa chọn lá huyền tinh được thu hái ở vùng Bảy Núi, tỉnh An Giang là đối tượng nghiên cứu và tách chiết hợp chất. Các cao phân đoạn hexane, ethyl acetate, butanol và nước thu được bằng phương pháp chiết -lỏng lỏng từ cao tổng ethanol được xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật và khảo sát khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa. Kết quả cho thấy, lá huyền tinh chứa nhiều nhóm hợp chất quan trọng như alkaloid, saponin, flavonoid và tannin. Trong các cao phân đoạn, cao ethyl acetate thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS˙ + cao nhất, với giá trị IC 50 lần lượt là 70.13 ± 2.2, 42.77 ± 0.1 µg/mL. Ngoài ra, cao ethyl acetate thể hiện hoạt tính kháng viêm in vitro cao gấp 2 lần chất chuẩn diclofenac sodium với giá trị IC 50 đạt 11.11 ± 0.5 mg/mL. Bên cạnh đó, cao ethyl acetate ức chế đối với hầu hết các chủng vi sinh vật thử nghiệm đặc biệt trên vi khuẩn Gram (+) Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, MRSA ATCC 43300 với giá trị MIC lần lượt là 6000, 6000 và 3000 µg/mL. Từ cao chiết ethyl acetate, luận văn đã phân lập được hợp chất luteolin. Cấu trúc của hợp chất được phân tích dựa vào dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và MS so sánh với tài liệu tham khảo. Luteolin thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH và thể hiện giá trị IC 50 = 52.75 ± 2.53 µg/mL tương đương với vitamin C. Luteolin đồng thời cũng có khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram (+) là E. faecalis ATCC 29212, S. aureus ATCC 29213, MRSA ATCC 43300 với kính vòng ức chế tương ứng là 11, 11 và 13 cm và cho giá trị MIC đối với MRSA đạt 200 µg/mL

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

( Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2019

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC BACH KHOA -ĐHQG -HCMCán bộ hướng dẫn khoa học: TS Lê Xuân Tiến

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Ngô Đại Nghiệp

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS TS Quách Ngô Diễm Phương

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 17tháng 07 năm 2019

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 Chủ tịch: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

2 Thư ký: TS Phan Thị Huyền

3 Phản biện 1: PGS.TS Ngô Đại Nghiệp

4 Phản biện 2: PGS.TS Quách Ngô Diễm Phương

5 ủy viên: PGS.TS Lê Phi Nga

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

PGS.TS Nguyễn Đức Lượng GS.TS Phan Thanh Sơn Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Trần Minh Thục Vi MSHV: 1670722

Ngày, tháng, năm sinh: 15/08/1992 Nơi sinh: Phú Yên Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LÁ HUYỀN TINH ỢACCA LEONTOPETALOIDES (L.) KUNTZE)

Nhiệm vụ và nội dung: Nghiên cứu thành phần hóa thực vật có trong lá huyền tinh và

đánh giá hoạt tính sinh học của các cao chiết Phân lập hợp chất từ cao chiết cho hoạt tính cao nhất

Ngày giao nhiệm vụ : 6/2018

Ngày hoàn thành nhiệm vụ : 7/2019

Cán bộ hưởng dẫn : TS Lê Xuân Tiến

CÁN Bộ HƯỚNG DẪN

(Họ tên và chữ ký)

Tp HCM, ngày 07 tháng 07 năm 2019

CHỦ NHIỄM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

TS Lê Xuân Tiến PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN:

Người duyệt (chấm sơ bộ):

Đơn vị:

Ngày bảo vệ:

Điểm tổng kết:

Nơi lưu trữ luận văn:

LỜI CẢM ƠN

Trong hành trình chinh phục kiến thức, em luôn có sự đồng hành và giúp đỡ của nhữngngười bạn, người cô, người thầy mà nếu thiếu họ em sẽ không thể hoàn thành luận văncủa mình

Lời cảm on đầu tiên, em xin gửi đến các thầy, các cô của bộ môn Công nghệ sinh học đãluôn tận tâm truyền đạt cho em kiến thức mới về các lĩnh vực trong công nghệ sinh học

để em thêm hiểu rõ và yêu quý bộ môn mà em đã lựa chọn

Em xin chân thành cảm on thầy Lê Xuân Tiến Thầy đã luôn giúp đỡ và hướng dẫn cho

em, chỉ dạy những kiến thức mà em còn thiếu sót Thầy luôn tràn đầy năng lượng vàmang năng lượng tích cực ấy truyền sang mọi ngưòi Thầy giúp em thấy được khó khănnào cũng có thể vượt qua, có cố gắng thì mọi việc sẽ thành công

Đặc biệt, em xin gửi lòi cảm on đến cô Nguyễn Kim Minh Tâm, người đã luôn luônđồng hành và theo sát em trong quá trình làm thí nghiệm Cô tận tĩnh hướng dẫn những

kỹ năng, thao tác thí nghiệm và hon nữa, cô luôn cùng chia sẻ với em những lúc bị khókhăn, áp lực, luôn thúc đẩy, động viên em trong quá trình làm việc

Cũng xin gửi lòi cảm on đến những người bạn, người em đã luôn sát cánh cùng em trongsuốt quá trình hoàn thành luận văn Họ là những ngưòi mang lại tiếng cười, giúp đỡ vàcùng với em chia sẻ những buồn vui trong suốt khoảng thời gian học tập dưói mái trườngBách Khoa

Lời cảm ơn đặc biệt nhất, con xin gửi đến cha mẹ Cha mẹ đã luôn tạo điều kiện tốt nhất

để con được học tập, luôn bên cạnh để cổ vũ và động viên con Cha mẹ luôn là một điểmtựa để con có thể chia sẻ mọi niềm vui và khó khăn trong cuộc sống

Cuối cùng, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người, cầu chúc mọi đều tốtđẹp sẽ đến và hy vọng trên con đường tương lai sắp tới, em sẽ luôn có mọi người đồnghành bên cạnh

Trần Minh Thục Vi

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Luận văn lựa chọn lá huyền tinh được thu hái ở vùng Bảy Núi, tỉnh An Giang là đốitượng nghiên cứu và tách chiết hợp chất Các cao phân đoạn hexane, ethyl acetate,butanol và nước thu được bằng phương pháp chiết -lỏng lỏng từ cao tổng ethanol đượcxác định sơ bộ thành phần hóa thực vật và khảo sát khả năng kháng khuẩn và kháng oxyhóa Ket quả cho thấy, lá huyền tinh chứa nhiều nhóm hợp chất quan trọng như alkaloid,saponin, flavonoid và tannin Trong các cao phân đoạn, cao ethyl acetate thể hiện hoạttính kháng oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS '+ cao nhất, vói giátrị IC50 lần lượt là 70.13 ± 2.2, 42.77 ±0.1 pg/mL Ngoài ra, cao ethyl acetate thể hiện

hoạt tính kháng viêm in vitro cao gấp 2 lần chất chuẩn diclofenac sodium với giá trị IC50

đạt 11.11 ±0.5 mg/mL Bên cạnh đó, cao ethyl acetate ức chế đối với hầu hết các chủng

vi sinh vật thử nghiệm đặc biệt trên vi khuẩn Gram (+) Enterococcus faecalis ATCC 29212,

Staphylococcus aureus ATCC 29213, MRS A ATCC 43300 với giá trị MIC lần lượt là 6000,

6000 và 3000 pg/mL

Từ cao chiết ethyl acetate, luận văn đã phân lập được họp chất luteolin cấu trúc của họpchất được phân tích dựa vào dữ liệu phổ ^-NMR, 13C-NMR và MS so sánh với tài liệutham khảo Luteolin thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc tự doDPPH và thể hiện giá trị IC50 = 52.75 ± 2.53 pg/mL tương đương với vitamin c.

Luteolin đồng thời cũng có khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram (+) là E faecalis

ATCC 29212, s aureus ATCC 29213, MRS A ATCC 43300 với kính vòng ức chế tương

ứng là 11, 11 và 13 cm và cho giá trị MIC đối với MRSA đạt 200 pg/mL

This research was carried out to study the preliminary phytochemical, the optimisation of

extraction process and the bioactivities of Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze leaves The

results indicated that the leaves contained many valuable compounds including alkaloids,flavonoids, saponins and tannins All extracts from different solvent (n-hexane, ethylacetate, n-butanol and water) showed significant antioxidant, and antibacterial activities,among those ethyl acetate extract showed the highest that activities Free radicalscavenging activities according to DPPH and ABTS '+ assays of the extract showed the

IC50 values as 70.13+ 2.2, 42.77 + 0.1 pg/mL, respectively In vitro anti-inflammatory

activity of ethyl acetate extract was with the IC50 value of 11.11 + 0.5 mg/mL Inaddition, ethyl acetate extract was able to against all of the tested microorganisms,

especially against Gram-positive bacteria such as Enterococcus faecalis ATCC 29212,

Staphylococcus aureus ATCC 29213, MRS A ATCC 43300 with the MIC values of 6000, 6000and 3000 pg/mL, respectively

Luteolin was isolated The chemical structure of luteolin was determined by ^-NMR, 13NMR spectroscopies Antioxidant and antibacterial activities of luteolin were evaluated.Luteolin was against all tested Gram-positive bacteria, especially MRSA ATCC 43300with the MIC value of 200 pg/mL The IC50 value of DPPH assays showed the result of52.75 + 2.5 pg/mL

C-LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Trần Minh Thục Vi, học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, khóa 2016 đợt

2, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh, xin camđoan công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện, số liệu là kết quả nghiên cứu thực

sự của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Lê Xuân Tiến

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp củamình

Tp Hồ Chỉ Minh, ngày 07 tháng 07 năm 2019

Học viên thực hiện

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

ABSTRACT iii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC BẢNG xi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xiii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan chi Tacca 2

1.1.1 Phân bố của chi Tacca 2

1.1.2 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Tacca 4

1.1.3 Công dụng các loài thuộc chi Tacca 12

1.2 Cây huyền tinh (Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze) 13

1.2.1 Mô tả thực vật 13

1.2.2 Thành phần hóa học của Tacca leontopetaloỉdes (L.) Kuntze 14

1.2.3 Công dụng của Tacca leontopetaloỉdes (L.) Kuntze 14

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về Tacca Leontopetaloỉdes (L.) Kuntze 15

1.3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 18

1.4 Ỹ nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 18

CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cưu 19

2.1 Nguyên liệu- hóa chất- thiết bị 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Thiết bị 20

2.1.4 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.2.1 Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật 22

2.2.2 Chiết cao phân đoạn và đánh giá hoạt tínhsinh học 23

2.2.3 Tách chiết hợp chất 25

2.2.4 Xác định tính chất của hợp chất tách được 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Chuẩn bị dược liệu 26

2.3.2 Xác định độ ẩm 27

2.3.3 Xác định tro toàn phần 27

2.3.4 Xác định thành phần hóa thực vật 28

2.3.5 Phương pháp chiết 29

2.3.6 Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa 29

2.3.6.1 Phương pháp xác định khả năng trung hòa gốc tự do DPPH 30

2.3.6.2 Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do ABTS 32

2.3.7 Phương pháp xác định khả năng kháng vi sinh vật 34

2.3.7.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch 35

2.3.7.2 Phương pháp pha loãng trong thạch 36

2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng kháng viêm 36

2.3.9 Phương pháp định lượng 38

2.3.9.1 Phương pháp định lượng flavonoid 38

2.3.9.2 Phương pháp định lượng saponin theo oleanolic acid 40

2.3.9.3 Định lượng đường khử theo glucose 42

2.3.10 Phương pháp sắc ký 44

2.3.10.1 Sắc ký bản mỏng 44

2.3.10.2 Sắc ký cột 45

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46

3.1 X ác định sơ bộ thành phần hóa thực vật: 46

3.1.1 Định danh: 46

3.1.2 Độ ẩm và tro toàn phần của dược liệu: 46

3.1.3 Chiết cao phân đoạn 48

3.1.4 Kết quả định tính thành phần hóa thực vật 49

3.2 Hoạt tính sinh học của cao chiết lá huyền 50

3.2.1 Khả năng kháng oxy hóa 50

3.2.1.1 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH 50

3.2.1.2 Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS'+ 50

3.2.2 Khả năng kháng khuẩn của các loại cao: 52

3.2.3 Khả năng kháng viêm của cao ethyl acetate: 54

3.2.4 Kết quả định lượng hợp chất: 55

3.3 Tách chiết hợp chất: 55

3.3.1 Phân lập hợp chất trong cao EtOAc lá huyền tinh: 55

3.3.1.1 Kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC): 55

3.3.1.2 Kết quả sắc ký cột thô: 57

3.3.1.3 Tinh sạch phân đoạn 1.6: 58

3.3.2.1 Phổ MS: 62

3.3.2.2 PhổNMR: 62

3.3.3 Hiệu suất quá trình tách chiết 65

3.4 Hoạt tính sinh học của luteolin: ốố 3.4.1 H oạt tính kháng oxy hóa của luteolin: 66

3.4.2 H oạt tính kháng khuẩn của luteolin: 68

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

4.1 Kết luận 71

4.2 Kiến nghị 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài thuộc chi Tacca 4

Hình 1.2 Cấu trúc taccalonolides A và B 5

Hình 1.3 Cấu trúc của một số taccalonolide phân lập từ Tacca plantaginea 6

Hình 1.4 Cấu trúc của spirotanol saponins phân lập từ Tacca leontopetaloides 7

Hình 1.5 Cấu trúc của các diarylheptanoids và glycosides ở Tacca ssps 8

Hình 1.6 Một số hợp chất khác của chi Tacca 9

Hình 1.7 Taccalonolide phân lập từ Tacca paxiana 10

Hình 1.8 Các hợp chất phân lập từ T chantrieri 11

Hình 1.9 Các taccavietnamoside A-E phân lập từ Tacca vietnamensis 12

Hình 1.10 Cây huyền tinh và củ huyền tinh 14

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu tổng quát 21

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 22

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình chiết cao phân đoạn lá huyền 24

Hình 2.4 Sơ đồ quá trình phân lập hợp chất 25

Hình 2.5 Sơ đồ xác định hoạt tính sinh học của hợp chất 26

Hình 2.6 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH 30

Hình 2.7 Quy trình thực hiện phương pháp bắt gốc tự do DPPH 31

Hình 2.8 Phản ứng trung hòa gốc tự do ABTS'+ 33

Hình 2.9 Quy trình thực hiện phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS '+ 33

Hình 2.10 Quy trình thực hiện phương pháp kháng viêm in vitro 37

Hình 2.11 Quy trình định lượng flavonoid 39

Hình 2.12 Quy trình định lượng saponin 41

Hình 3.1 Lá huyền tinh sau khi phơi khô 46

Hình 3.2 Sắc ký đồ của cao EtOAc với các hệ dung môi khác nhau, quan sát dưới đèn uv 254 nm (trái), 365 nm (phải) 56

Hình 3.3. Sự tách chất trong cột sắc ký 57

Hình 3.4. TLC của các ống phân đoạn 1.6.7 60

Hình 3.5 Chất rắn VI 61

Hình 3.6 TLC của mẫu VI giải ly với các hệ dung môi khác nhau quan sát dưới ánh sáng thường (trái) và đèn uv 245 nm (phải) 61

Hình 3.7. Cấu trúc của luteolin 63

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của luteolin 66

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Tacca phân lập ở Việt Nam 2

Bảng 1.2 Các hợp chất diaryl heptanoid glycoside 7

Bảng 1.3 Hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu thô 16

Bảng 1.4 Thành phần hóa thực vật của các mẫu Tacca leontopetaloids 16

Bảng 2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm DPPH 32

Bảng 2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm ABTS'+ 34

Bảng 2.3 Nồng độ các mẫu thử trong DMSO 36

Bảng 2.4 Các mẫu chuẩn bị cho phương pháp kháng viêm 38

Bảng 2.5 Chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm định lượng flavonoid 40

Bảng 2.6 Chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm định lượng saponin 42

Bảng 2.7 Chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm định lượng đường khử 44

Bảng 3.1 Kết quả định danh mẫu thực vật 46

Bảng 3.2 Độ ẩm của vật liệu sau khi sấy (%) 47

Bảng 3.3 Hàm lượng tro toàn phần (%) 47

Bảng 3.4 Kết quả chiết cao tổng EtOH lá huyền tinh 48

Bảng 3.5 Ket quả chiết cao phân đoạn lá huyền tinh 48

Bảng 3.6 Kết quả định tính thành phần hóa thực vật cao lá huyền 49

Bảng 3.7 Giá trị IC50 của cao chiết lá huyền theo phương pháp DPPH 50

Bảng 3.8 Giá trị IC50 của cao chiết lá huyền theo phương pháp ABTS'+ 51

Bảng 3.9 Đường kính vòng ức chế của cao ethyl acetate và cao hexane trên các chủng vi khuấn thử nghiệm 52

Bảng 3.10 Ket quả MIC của cao EtOAc trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 53

Bảng 3.12 Kết quả định lượng các thành phần trong cao EtOAc lá huyền 55

Bảng 3.13. Ket quả các phân đoạn sắc ký cột thô 57

Bảng 3.14. Ket quả các phân đoạn sắc ký phân đoạn 1.6 59

Bảng 3.15 Kết quả sắc ký cột hexane: EtOAc phân đoạn 1.6.7 60

Bảng 3.16. So sánh dữ liệu phổ ^-NMR giữa VI và luteolin 63

Bảng 3.17. So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR giữa luteolin và VI 64

Bảng 3.18 Ket quả IC50 của luteolin và vitamin c theo phưong pháp DPPH 66

Bảng 3.19 Đường kính vòng ức chế của luteolin trên vi sinh vật thử nghiệm 68

Bảng 3.20 MIC của luteolin trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm 69

IC50 Half Maximal Inhibitory Concentration

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNS 3, 5- dinitrosalicylic acid

MHA Mueller Hinton Agar

MHB Mueller Hinton Broth

MIC Minimum Inhibitory Concentrations

MỞ ĐẦU

Việt Nam có một hệ thực vật rất đa dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài thực vậtmang nhiều giá trị mà ta chưa biết đến Việc tìm ra, nghiên cứu và ứng dụng các loài câynày đang là một vấn đề mà các nhà khoa học rất quan tâm

Huyền tinh là một loài thực vật bản địa ở vùng Thất Sơn, An Giang có rất nhiều tiềmnăng ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm, Huyền tinh được coi như một nguồn tinhbột mới thay thế cho các loại tinh bột truyền thống như ngô, khoai, sắn, góp phầnkhông nhỏ trong việc cải thiện nạn đói và sự tăng trưởng kinh tế ở châu Phi Bên cạnh

đó, bột huyền tinh đã được sử dụng trong dân gian như một loài thuốc chữa trị tốt chocác bệnh như đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, nôn mửa, xuất huyết Ngoài ra, huyền tinhcòn là một nguyên liệu sạch đầy hứa hẹn để sản xuất bao bì không gây ô nhiễm môitrường

Tuy nhiên, các nghiên cứu trên thế giới cho đến nay đều chỉ tập trung khai thác sử dụngtinh bột từ củ huyền tinh, rất ít nghiên cứu về thành phần hợp chất cũng như hoạt tínhcủa các bộ phận khác của cây như lá, hoa, quả Tại An Giang, đa số ngưòi dân tập trungvào việc khai thác củ huyền làm thực phẩm, lá huyền tinh tươi đôi khi được sử dụng nhưmột loại rau dùng trong các bữa ăn hằng ngày Sau khi thu hoạch củ, hầu hết lá huyềntinh sẽ bị bỏ đi hoặc tận dụng làm compost cho mùa huyền tinh năm sau

Do đó, luận văn “Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của lá huyền tinh

(Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze)” nhằm góp phần hiểu rõ hơn và đánh giá tiềm năng của

loài cây ở vùng Bảy Núi, An Giang, đồng thời tạo tiền đề cho các nghiên cứu về ứngdụng lá huyền tinh trong tương lai

STT Tên khoa học Tên khác Tên thường gọi Noi phân bố

1 Tacca chantrỉerỉ A

NDRÉ

Tacca paxiana L IMPR ,

Schizocapsa breviscapa

STT Tên khoa học Tên khác Tên thường gọi Noi phân bố

Tacca

subflabellatap p L ING

Tacca vieừiamensis T HIN ET

Tacca plantaginea Tacca subflabellata

Tacca khanhhoaensis Hình 1.1 Hình ảnh một sổ loài thuộc chi Tacca

1.1.1 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Tacca

Đã có trên 134 hợp chất với các hoạt tính khác nhau được chiết tách từ chi Tacca bao gồm các nhóm chính như diaryheptanoid, taccalonolide, saponin và các phenolic glycoside [8].

Vào đầu những năm 1960, Scheuer và cộng sự đã nghiên cứu tính chất của củ và phân lập được một hợp chất đặt tên là Taccalin có màu vàng nhạt vị đắng vói cấu trúc tetracyclic [9] cấu trúc taccalonolides này sau đó được làm rõ vào năm 1987 và thực tế đây một nhóm chất lớn có khả năng gây độc cho tế bào có khả năng trở thành chất chống ung thư [8].

Taccalonolides là nhóm mới của steroid tự nhiên có hoạt tính ổn định Các

Taccalonolides đầu tiên (1-2) được phần lập từ T plantaginea và được làm sáng tỏ cấu trúc

bằng kỹ thuật hiện đại (Hình 1.2) [10].

(4) Taccalonolide AF: R = Oac (6) Taccalonolide H2

(5) Taccalonolide AJ: R = OH

(7) Taccalonolide H

Hình 1.3 Cấu trúc của một số taccalonolide phân lập từ Tacca plantaginea.

Năm 1990, trong chiết xuất ethanol 80% của bột lá T leontopetaloides thu thập ở Sudan,

Abdel-Aziz đã phân lập được các steroidal saponins (8-11) bằng sắc ký cột, cấu trúc củachúng được xác định thông qua phổ khối lượng và cộng hưởng từ hạt nhân *H-NMR và

13C-NMR (Hình 1.4) [12]

OH(8) Leontogenin

(9) Ri = OH, R2 = H, R3 = H(10) Ri = OH, R2 = OH, R3 = H

R 2

OH(11) = OH, R2 = H

Ngoài các chất trên, một phenolic glycoside mới

(4-[6-ơ-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl) -P -D-glucopyranosyloxy] -3 - methoxybenzoic acid) (19),

quercetin-3-a-arabinoside (20), medicagenic acid (21), betulinic acid (22) từ T aspera và T.

chantriers cũng được phân lập và xác định cấu trúc (Hình 1.6) [13].

Hình 1.6 Một số hợp chất khác của chi Tacca

Ở Việt Nam, ba loài thuộc chi Tacca là T chantrieri, T plantaginea và T vietnamensis đã được nghiên

cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Mũhlbauer và cộng sự (2003) đã phân lập được 5 hợp chất taccalonolide mới R-V

(23-27) (Hình 1.7) trong dịch chiết từ rễ Tacca paxiana thu thập ở vùng Thái Nguyên, Việt Nam

[15]

(27) Taccalonolide V

Hình 1.7 Taccalonolide phân lập từ Tacca paxiana

Năm 2012, Tran và cộng sự đã phân lập được ba glycoside diarylheptanoid trên T.

plantaginea: Plantagineosides A, Plantagineosides B và Plantagineosides c (16-18) [16].

Năm 2015, Vo và cộng sự đã phân lập được các hợp chất (28-31) từ dịch chiết methanol

của thân rễ loài râu hùm (Tacca chantrieri) thu hái ở vườn quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên

Huế Bằng phưong pháp phân tích và so sánh phổ cộng hưởng từ hạt nhân ^H-NMR, 13NMR, 2D-NMR), cấu trúc của các hợp chất được xác định (H ÌNH 1.8) [1] Đồng thòi,

C-nhóm tác giả cũng thử hoạt tính gây độc trên tế bào của các chất này ở các dòng tế bàoung thư PC3, LNCaP và MDA-MB-231, kết quả tất cả các chất thể hiện hoạt tính gâyđộc ở mức độ trung bình với giá trị IC50 trong khoảng 17.9 -

hoạt tính ức chế sản sinh oxit nitric trong tế bào BV2 với giá trị IC50 nằm trong khoảng12.4-59.0 pM[17].

Hình 1.9 Các taccavietnamoside A-E phân lập từ Tacca vietnamensis

Các nghiên cứu trên cho thấy Tacca là một họ thực vật lớn chứa nhiều hợp chất có hoạt

tính sinh học cần đuợc nghiên cứu thêm

1.1.2 Công dụng các loài thuộc chi Tacca

Trên thế giới, một số loài thuộc chi Tacca đuợc sử dụng nhu một loại thuốc dân gian để chữa trị các bệnh khác nhau nhu viêm loét dạ dày, viêm ruột, các bệnh ngoài da Tacca

chantrieri đuợc sử dụng ở Trung Quốc trong điều trị viêm loét dạ dày và tá tràng, viêm gan,

bỏng, ngứa ngoài da Rễ của loài Tacca plantaginea đuợc dùng làm thuốc trị đau dạ dày, viêm ruột Loài Tacca integrifolia dùng điều trị mụn nhọt, sung đau vòm họng Ngoài ra, ở Ân Độ

và Indonexia, rễ củ của Tacca leontopetaloỉdes và Tacca palmata giã nhuyễn dùng để điều trị các

vết thuơng do rắn cắn Bột từ củ của

Tacca leontopetaloides điều trị kiết lị và nôn mửa [13, 18] Ngoài ra, rễ củ các loài chi Tacca có

thể sử dụng để làm thực phẩm, phần lá được sử dụng làm rau ăn

1.1 Cây huyền tinh iTacca leontopetaloides (L.) Kuntze)

Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze là loài thực vật có hoa thuộc chi Tacca, còn được biết đến là

cây huyền tinh Phân loại khoa học của cây huyền tinh [19]:

T leontopetaloides Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze

bạch tinh, huyền tinh, củ nưa

Huyền tinh được phân bố ở nhiều nước từ Tây Phi qua Nam Á đến miền Bắc của nước

Úc Và những người di cư đã mang theo loài cây này tới vùng đảo nhiệt đới ở Thái BìnhDưong [72]

Ở Việt Nam, huyền tinh được trồng nhiều ở ven chân núi xã Thới Son, núi cấm (An Hảo)hoặc trồng xen canh dưới tán rừng dọc theo chân núi Giai, núi Két, núi Voi, thuộc địaphận tỉnh An Giang, ngoài ra huyền tinh còn được tìm thấy ở các vùng ven biển NinhThuận, Bình Thuận

đài, 3 cánh hoa nhỏ, 6 nhị, bầu dưới, dính noãn bên Quả không mở, chứa nhiều hạt [21,22] Huyền tinh ra hoa vào tháng 6 - 8, quả chín vào khoảng tháng 10.

Nơi sống và thu hái: cây mọc hoang ở một số vùng từ Mũi Né (Bình Thuận) đến VũngTàu, Thủ Đức cho đến Núi cấm (An Giang) Cây thường được trồng để lấy củ Củ nặngtới 600 g chứa chất thịt màu trắng, dùng để làm bột

Hình 1.10 Cây huyền tỉnh và củ huyền tỉnh 1.2.2 Thành phần hóa học của Tacca ỉeontopetaỉoides (L.) Kuntze

Củ huyền tinh thu hoạch ở Nigeria có 28.25 29% chất khô, 25 27.25% tinh bột, 40

-43 mg/100 g ascorbic acid [23] Tinh bột củ huyền có hàm lượng amylose vàamylopectin tương ứng là 22.5 và 77.5% [24], Thành phần gần đúng của thịt củ gồm 1.1

- 1.5% protein, 2.7 - 2.73% tro, 0.08 - 0.1% chất béo và 95.02 - 95.42 % tổngcarbohydrate trên tổng chất khô Ngoài ra củ huyền tinh còn chứa tinh bột, ceryl alcohol,saponin dạng steroid và tannin [25] Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật lá huyềntinh ở bốn vùng khác nhau ở Nigeria cho thấy trong lá huyền có chứa alkaloid, saponin,tannin, anthraquinone và glycoside tim [23]

1.2.3 Công dụng của Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze

Tacca ỉeontopetaỉoides là một nguồn thực phẩm quan trọng ở các nước Thái Bình Dương, đặc

biệt là Malaysia Ngoài ra, ở miền tây châu Phi, tinh bột Tacca được sử

dụng làm chất hồ vải [24] Một số quốc gia sử dụng Tacca làm thuốc để chữa trị các bệnh

đau dạ dày, tiêu chảy và kiết lỵ [26]

Các bộ phận của cây Tacca leontopetaloides từ lâu đã được người dân các nước sử dụng làm vị

thuốc truyền thống trong việc điều trị bệnh Ở Ấn Độ, củ được dùng trong điều trị cácbệnh đau bụng, nôn mửa, hen suyễn, viêm phế quản, vảy nến và giun đường ruột [27] ỞHawaii, cây huyền được sử dụng để điều trị chứng nôn liên tục Trong khi đó, ở quần đảoPolynesia, củ huyền tinh sống được hòa với nước và đất sét đỏ dùng để chữa tiêu chảy,kiết lỵ và ngăn chặn xuất huyết dạ dày [23] Trong các tiểu bang của Nigeria, rễ huyềnđược sử dụng để điều trị rắn cắn và một số bệnh khác, hoa huyền được cắt ra và đắp lên

vị trí vết cắn [72] Ở Bờ Biển Ngà, thuốc sắc từ lá được dùng cho bệnh nhân bị vảy nến

và phù nề Ở úc, tinh bột của củ được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh tiêu chảy và kiết

lỵ Ngoài ra, tinh bột từ củ có thể được sử dụng để giảm đau ngực và chữa phát ban ở trẻ

sơ sinh [28]

Ngoài việc điều trị bệnh, cây còn được sử dụng với một số công dụng khác như: nướcrửa củ huyền được sử dụng như một chất giặt rửa ở cao nguyên Nigeria [72] Tinh bộtcũng được sử dụng để tạo ra các biopolymer khi phối trộn với cao su thiên nhiên [26]

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về Tacca Leontopetaloides (L.) Kuntze

Năm 1990, Abdel-Aziz đã phân lập được các hợp chất steroidal saponin (8-11) từ dịchchiết của lá huyền tinh thu thập ở vùng Sudan [12]

Spennemann và cộng sự (1994) đã tiến hành các nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng

có trong tinh bột Tacca và kết quả cho thấy nó có tiềm năng là một nguồn carbohydrate

trong tương lai [29]

Năm 2013, Omojola đã thực hiện nghiên cứu so sánh thành phần trong nguyên liệu khôcủa Tacca, bắp, ngô, lúa mì và sắn (Bảng 1.3) Ket quả cho thấy mặc dù hàm lượngprotein thấp hơn lúa mĩ, ngô và khoai tây, Tacca chứa hàm lượng tinh bột cao tươngđương các loại nguyên liệu trên [37],

Khoai tây Bắp Lúa mì Sắn Tacca

Dragendoff Meyer Wagner’s Kedde Choloroform/

-Năm 2012, Borokini và cộng sự đã nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học ở lá và

củ của Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze thu thập từ bốn vùng khác nhau ở Nigeria để xem

sụ ảnh huởng của điều kiện địa lý và môi truờng lên khả năng tạo các chất chuyển hóathứ cấp Kết quả cho thấy chất chuyển hóa thứ cấp có sụ thay đổi khá nhiều trong mẫu lá

và củ Ngoài ra còn có một số yếu tố khác ảnh huờng đến thành phần hoá thục vật baogồm việc sử dụng các hóa chất (thuốc trừ sâu), các yếu tố di truyền, bệnh và sâu bệnh,bón phân, thu hoạch Đồng thời nghiên cứu này cũng đã xác định alkaloid, saponin và

tannin có trong lá, trong khi chỉ có akaloid hiện diện trong củ huyền tinh (Bảng 1.4)

[72].

Bảng 1.4 Thành phần hóa thực vật của các mẫu Tacca leontopetaloids

Trong đó:

(+): phản ứng dương tính (-): phản ứng âm tính ±: có xuất hiện vếtA: mẫu Akoko B: mẫu Eruwa C: mẫu Adamawa D: mẫu Ile-Ife

Năm 2013, Makhtar cho thấy tinh bột huyền khi được phối trộn với cao su tự nhiên và

bổ sung các chất dẻo hóa như: glycerol, dầu olein và dầu cọ thô trong sản xuất polymersinh học giúp tăng khả năng chịu nhiệt của tinh bột và thúc đẩy quá trình phân hủy dễdàng hơn so với các polymer thông thường, chỉ để lại khoảng 6.6% dư lượng polymer.Điều này cho thấy, tinh bột Tacca có tiềm năng để phát triển thành một polymer xanhthân thiện với môi trường [30]

Năm 2014, Ndouyang và cộng sự đã tiến hành đánh giá in vivo về giá trị dinh dưỡng của

củ Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze Kết quả thực nghiệm cho thấy tiêu thụ Tacca chưa qua

chế biến với lượng thấp có tác động tích cực đến sự chuyển hóa lipid trong cơ thể,nhưng cần được nghiên cứu thêm [31]

Năm 2015, Ndouyang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các

phương pháp xử lý các chất không có giá trị dinh dưỡng trong các loại bột Tacca

leontopetaloides Ngâm hoặc đun sôi có thể giảm đáng kể hàm lượng các chất này, đồng thời

có thể loại bỏ saponin, oxalate và alkaloid Sau khi xử lý, các chất không có giá trị dinhdưỡng còn lại ở dưới mức không độc hại và có thể đóng vai trò tích cực trong quá trìnhchuyển hóa [32]

Năm 2015, Abdel-Aziz và cộng sự phát hiện các thành phần đất trồng ảnh hưởng tớikích thước của củ, diện tích lá, chiều cao cây, tốc độ tăng trưởng và phân tích ra thànhphần môi trường tốt nhất cho sự phát triển của cây [33]

Năm 2014, Jiang và cộng sự chỉ ra rằng Tacca leontopetaloỉdes chứa nhiều hợp chất có hoạt

tính sinh học mạnh, ảnh hưởng lên hệ thần kinh, có khả năng gây độc cho tế bào và tiêudiệt côn trùng Tuy nhiên vẫn còn nhiều vấn đề liên quan đến cấu trúc, cơ chế hoạt độngnên cần được nghiên cứu kỹ hơn về thành phần dược lý [13]

Saponin dạng steroid trong Tacca leontopetaloỉdes có thể dùng làm tác nhân diệt ốc gây hại

[73]

Các cao chiết từ củ Tacca leontopetaloides có hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn

in vitro trên Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Shamonella typhi, Escherichia coli, Shigella dysenteria và Candida albicans với vòng kháng khuẩn từ 18 -

27 mm [34].

Nhìn chung, các nghiên cứu trên thế giới hiện nay hầu như đều tập trung vào các thành

phần hóa học và ứng dụng từ củ của loài Tacca leontopetaloides Ở Việt Nam, hiện thời chưa

có các nghiên cứu khoa học về thành phần hóa học của cây Tacca leontopetaloides cũng như

các giá trị dược liệu của nó Đầu năm 2017 Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh An Giangkết hợp với trường Đại học Bách Khoa tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trìnhsản xuất, chế biến và tạo sản phẩm đặc sản từ cây huyền tinh, tỉnh An Giang” Luận vănnày là một phần của đề tài trên

1.3 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Mục tiêu chung của luận văn là cô lập được hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết

lá huyền tinh và đánh giá hoạt tính sinh học của nó Đe đạt được mục tiêu trên, cần thựchiện các nội dung cụ thể như sau:

• Chiết cao tổng và cao phân đoạn từ lá huyền tinh Xác định sơ bộ thành phần hóathực vật của cao chiết

• Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết thành phần, gồm hoạt tính kháng khuẩn,hoạt tính kháng oxy hóa Khảo sát khả năng kháng viêm và định lượng các thànhphần có trong cao chiết có hoạt tính sinh học cao nhất

• Phân lập thành phần hóa học trong cao chiết

• Xác định cấu trúc của hợp chất thu được

• Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro của hợp chất trên.

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thông tin về hoạt tính sinhhọc trong các cao chiết thành phần từ lá huyền và cấu trúc của hợp chất có trong caochiết Từ đó, góp phần giúp các nhà khoa học dễ dàng tìm hiểu và nghiên cứu sâu hơn

về lá huyền trong tương lai

Ý nghĩa thực tiễn: đánh giá và tìm ra các hoạt tính sinh học để góp phần phát triển cácsản phẩm từ cây huyền tinh.

CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Nguyên liệu- hóa chất- thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá huyền tinh (Tacca leontopetaloides) ở vùng núi cấm, tỉnh An Giang, được thu hái

- Hóa chất đánh giá khả năng kháng viêm: DMSO, Na2HP04.12H2 0,NaH2P04.2H2 0(Xilong, Trung Quốc), albumin trứng (HiMedia, Ấn Độ)

- Môi trường thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn: MHA, MHB, TSA, TSB(HiMedia, Ấn Độ)

- Hóa chất đánh giá khả năng kháng oxy hóa: ABTS (Agfa-Gevaert), DPPH(Sigma- Aldrich)

2.1.3 Thiết bị

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV- Vis Thermo Genesys 10S UV-Vis

- Cân 5 số Quintix 125D-1S Sartorius

- Máy cô quay chân không

2.1.4 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm

- Enterococcus faecalis ATCC 29212.

- Staphylococcus aureus ATCC 29213.

- Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300.

Escherichia colỉ ATCC 25922.

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

2.2 Nội dung nghiên cứu

Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu tống quát

Theo quy trình Hình 2.1, lá cây huyền tinh sau khi thu hái ở An Giang vào tháng 8 đuợcphơi trong bóng râm để độ ẩm đạt duới 13% , cắt nhỏ Lá huyền đuợc chiết nóng trongEtOH 96% để thu cao tổng Cao tổng sau đó đuợc chiết lần luợt với các dung môi từkhông phân cục tới phân cục để thu các cao chiết phân đoạn và tiến hành phân tích sơ bộthành phần hóa thục vật có trong các cao chiết này Xác định hoạt tính sinh học của caochiết bằng các phuơng pháp kháng oxy hóa và kháng khuấn để chọn ra đuợc cao chiết cóhoạt tính sinh học cao nhất Cao chiết đuợc lụa chọn sẽ đuợc sử dụng để phân lập hợpchất Hợp chất phân lập đuợc xác định cấu trúc và xác định hoạt tính sinh học

2.2.1 Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Đe phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của lá huyền tinh như sơ đồ Hình 2.2, các

bước được thực hiện cụ thể như sau:

- Định danh: mẫu nguyên liệu dùng định danh bao gồm lá, hoa, quả và củ của cây

huyền tinh Thí nghiệm định danh được thực hiện tại phòng Bảo tàng Thực vật,viện Sinh học nhiệt đới Phương pháp định danh dựa trên các tài liệu “FloweringPlants Families of the World” của Hey wood (2007) [35], “Key to the families ofFlowering Plants of the World” của Hutchinson (1967) [36], và “Cây cỏ ViệtNam” của Phạm Hoàng Hộ (1999) [3],

- Phơi khô và xay nhỏ', lá tươi của cây huyền tinh được phơi khô tới khi độ ẩm

đạt dưới 13% sau đó được xay nhỏ để xác định độ ẩm và tro toàn phần

- Xác định thành phần hóa thực vật: các cao chiết được chuẩn bị như sau: cao

tổng chiết bằng ethanol 96%, sau đó các cao phân đoạn được chiết bằng các dungmôi có tính phân cực tăng dần là hexane, ethyl acetate, butanol và nước Tiếnhành định đính các nhóm chất chính trong từng loại cao chiết phần đoạn lá huyềnbao gồm: alkaloid, flavonoid, saponin, anthranoid, tannin, acid hữu cơ, đườngkhử, chất béo Phương pháp định tính các nhóm chất trên được trình bày cụ thể ởmục 2.3.4

2.2.2 Chiết cao phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học

Tiến hành thu cao chiết phân đoạn như sơ đồ thể hiện ở Hình 2.3:

• Cao EtOH: lá huyền tinh sau khi phơi khô được xay nhỏ và chiết nóng trongEtOH 96% để thu dịch chiết EtOH Cô quay đuổi dung môi, thu cao EtOH

• Cao hexane: từ cao EtOH phân tán với 100 mL nước cất sau đó việc chiết đượctiến hành bằng cách lắc vói dung môi n-hexan Cho hỗn hợp cao EtOH vào bìnhlóng, thêm 30 mL n-hexane, lắc nhẹ chờ cho hỗn hợp phân lớp hoàn toàn Chiếtcho đến khi pha n-hexane thử trên lam kính không còn vết Dịch chiết thu được

cô quay đuổi dung môi thu được cao hexane

• Cao ethyl acetate: từ pha nước thu được sau khi chiết với n-hexane, tiếp tục đượclắc với 30 ml dung môi ethyl acetate, chiết cho đến khi pha ethyl acetate thử trênlam kính không còn vết Pha ethyl acetate được đuối dung môi bằng phươngpháp cô quay thu được cao EtO Ac

• Cao n-butanol: từ pha nước thu được sau khi chiết với ethyl acetate, tiếp tục đượcchiết với 20 mL dung môi n-butanol bão hòa nước Chiết cho đến khi pha n-butanol thử trên lam kính không còn vết Dịch chiết n-butanol được tiến hành côquay để đuổi dung môi thu cao butanol

• Cao nước: pha nước thu được sao khi chiết với n-butanol tiến hành cô quay thuđược cao nước

-|/ -— -Lăc với ethyl acetate —^ Dịch chiết ethyl acetate

Cô quay

Hình 2.3 Sơ đổ quy trình chiết cao phân đoạn lá huyền