Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll. et Mor.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘYTẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁI THỊ CẨM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG CHỐNG OXY HĨA VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA CÂY HỒNG QN (FLACOURTIA RUKAM ZOLL ET MOR.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH - Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘYTẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁI THỊ CẨM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA CÂY HỒNG QUÂN (FLACOURTIA RUKAM ZOLL ET MOR.) NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62.72.04.06 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS HUỲNH NGỌC THỤY PGS.TS ĐỖ THỊ HỒNG TƯƠI TP HỒ CHÍ MINH - Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận án i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt ADN ALT AST BHA CCl4 COSY d d DEPT DMEM DMF DMSO dNTP DPPH EAC ESI-MS Chữ nguyên Acid desoxynucleic Alanine Aminotransferase Aspartate aminotransferase Butylated hydroxylanisol Carbon tetraclorid Correlation Spectroscopy Doublet Chemical shift Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Dulbecco’s Modified Eagle Medium Dimethyl formamid Dimethyl sulfoxyd Deoxynucleotid triphosphat 2,2-Diphenyl Picryl Hydrazyl Ehrilch Ascites Carcinoma Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy HDL HMBC HR-MS HSQC IC J High Density Lipoprotein Heteronuclear Multiple Bond Correlation High Resolution mass Heteronuclear Single Quantum Correlation Inhibitory Concentration LDL LOD Low-density lipoproteins Limit of Detection LOQ m Limit of Quantification Multiplet MIC MS NCBI Minimal inhibitory concentration Mass Spectrometry National Center for Biotechnology Information NMR Nuclear Magnetic Resonance Ý nghĩa Đỉnh đơi Độ dời hóa học Lipoprotein tỷ trọng cao Nồng độ ức chế Hằng số ghép Lipoprotein tỷ trọng thấp Giới hạn phát Giới hạn định lượng Đỉnh đa Nồng độ ức chế tối thiểu Khối phổ Cộng hưởng từ hạt nhân ii PBS PCR PDA Phosphate Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Photodiode Array PIC ppm q s SDS SKLM Polymorphism Information Content Parts per million Quartet Singlet Sodium dodecyl sulfat t TLTK TT Triplet UPLC UV Ultra-Performance Liquid Chromatography Ultraviolet VLDL VS Very-low-density lipoprotein Vanilin sulfuric Dãy diode quang Chỉ số đa hình di truyền Phần triệu Đỉnh bốn Đỉnh đơn Sắc ký lớp mỏng Đỉnh ba Tài liệu tham khảo Thuốc thử Sắc ký lỏng siêu hiệu Tử ngoại Lipoprotein tỷ trọng thấp iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Flacourtia 1.2 Tổng quan Flacourtia rukam 26 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 3.1 Kết khảo sát dược liệu Flacourtia rukam 57 3.2 Kết định tính nguyên liệu 70 3.3 Kết sàng lọc tác dụng sinh học 72 3.4 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất 76 3.5 Xây dựng quy trình định lượng poliothrysosid thân Flacourtia rukam UPLC-PDA 112 CHƯƠNG BÀN LUẬN 127 4.1 Về mặt thực vật học 127 iv 4.2 Về định tính nguyên liệu 130 4.3 Sàng lọc tác dụng sinh học 131 4.4 Chiết xuất phân lập hợp chất F rukam 137 4.5 Về định lượng poliothrysosid mẫu dược liệu Hồng quân 142 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 145 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN .149 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Điểm khác biệt loài mang tên Hồng quân Việt Nam Bảng 1.2 Flavon phân lập từ loài thuộc chi Flacourtia .8 Bảng 1.3 Flavonol phân lập từ loài thuộc chi Flacourtia Bảng 1.4 Các hợp chất phenolic glycosid 12 Bảng 1.5 Các dẫn chất acid quinic 14 Bảng 1.6 IC50 dịch chiết F indica thử nghiệm DPPH NO .18 Bảng 1.7 IC50 chất phân lập từ dịch F inermis thử nghiệm DPPH 19 Bảng 1.8 Hoạt tính chống oxy hóa chi Flacourtia .19 Bảng 1.9 MIC dịch chiết từ F indica số loài vi khuẩn 20 Bảng 1.10 MIC dịch chiết từ F indica số loài nấm 21 Bảng 1.11 MIC dịch chiết MeOH từ rễ F indica số vi khuẩn 21 Bảng 1.12 % ức chế gốc tự IC50 dịch chiết F indica 23 Bảng 1.13 Các chế phẩm có Flacourtia 25 Bảng 1.14 Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết hợp chất từ vỏ thân F rukam 29 Bảng 1.15 Hoạt tính hạ cholesterol cao chiết từ vỏ thân F rukam .30 Bảng 2.1 Ký hiệu mã hóa mẫu dùng nghiên cứu 32 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng thử nghiệm độc tính tế bào XO 36 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi RbcL sử dụng phản ứng PCR .38 Bảng 2.4 Thành phần thử tác dụng ức chế XO giếng đĩa 96 46 Bảng 3.1 So sánh đặc điểm hình thái F rukam F indica .59 Bảng 3.2 So sánh khác biệt trình tự gen mẫu HQ275 HQ2941 69 Bảng 3.3 Mức độ tương đồng 12 mẫu Hồng quân BLAST NCBI 69 Bảng 3.4 Xác định độ ẩm, độ tro hàm lượng chất chiết cao toàn phần 70 Bảng 3.5 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật F rukam .70 Bảng 3.6 Kết định lượng cao toàn phần thân cành F rukam .72 Bảng 3.7 Hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn thử nghiệm DPPH .73 Bảng 3.8 Hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn lực khử sắt 74 Bảng 3.9 % ức chế dòng tế bào MDA-MB-231 74 Bảng 3.10 % ức chế dòng tế bào HepG2 75 vi Bảng 3.11 % ức chế dòng tế bào RD 75 Bảng 3.12 Hoạt tính độc tế bào mẫu thử dòng tế bào ung thư 75 13 13 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ H -NMR C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) hợp chất (1) 83 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ H -NMR C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) hợp chất (2) với acid chaumoogric (CDCl3 399,65 MHz; CDCl3 100,4 MHz) 86 13 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ H -NMR C -NMR hợp chất (3) poliothrysosid (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) 88 13 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ H -NMR C -NMR ( DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) hợp chất (4) với Koabursid ( DMSO-d6: 400 MHz, DMSO-d6: 100 MHz) .90 13 Bảng 3.17 Dữ liệu phổ H-NMR C -NMR hợp chất (5) với daucosterol ( DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) 92 13 Bảng 3.18 Dữ liệu phổ H -NMR C -NMR hợp chất (6) (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) 95 13 13 13 Bảng 3.19 Dữ liệu phổ H- NMR C -NMR (DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) hợp chất (7) .98 Bảng 3.20 Dữ liệu phổ H- NMR C -NMR (DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) hợp chất (8) acid vanilic .100 Bảng 3.21 Dữ liệu phổ H- NMR C -NMR (DMSO-d6 500 MHz, DMSO-d6 125MHz) hợp chất (9) với stigmasterol (CDCl3 100 MHz) 102 13 Bảng 3.22 Dữ liệu phổ H- NMR C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) hợp chất (10) β-sitosterol (CDCl3 với giọt MeOH-d4 100,06 MHz) 104 Bảng 3.23 Dữ liệu phổ NMR hợp chất (11) .105 Bảng 3.24 Hoạt tính chống oxy hóa hợp chất thử nghiệm DPPH 106 Bảng 3.25 Năng lực khử sắt hoạt tính chống oxy hóa hợp chất 107 Bảng 3.26 Giá trị IC50 mẫu thử 108 Bảng 3.27 Kết tác dụng in vivo hạ acid uric máu mẫu thử 109 Bảng 3.28 % ức chế hoạt tính độc tế bào MDA-MB-231 cao phân đoạn 109 Bảng 3.29 Hoạt tính độc tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 chất phân lập 110 Bảng 3.30 % ức chế hoạt tính độc tế bào HepG2 110 Bảng 3.31 Hoạt tính độc tế bào ung thư gan người HepG2 mẫu thử 110 Bảng 3.32 % ức chế hoạt tính độc tế bào RD 111 Bảng 3.33 Hoạt tính độc tế bào ung thư vân người RD mẫu thử 111 Bảng 3.34 Kết đánh giá độ tinh khiết poliothrysosid UPLC 113 vii Bảng 3.35 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống 119 Bảng 3.36 Mối tương quan nồng độ diện tích pic poliothrysosid .120 Bảng 3.37 Kết khảo sát độ lăp lại poliothrysosid 122 Bảng 3.38 Kết khảo sát độ poliothrysosid 122 Bảng 3.39 Hàm lượng poliothrysosid theo địa điểm thu hái 124 Bảng 3.40 Kết định lượng poliothrysosid theo phận dùng 125 Bảng 3.41 Hàm lượng poliothrysosid theo thời điểm thu hái 126 Bảng 4.1 So sánh điểm khác biệt trình tự gen F rukam F indica 129 46 2D Graph f = a/(1+exp(-(x-x0)/b)) 120 100 Data 80 60 Y [Equation] f = a/(1+exp(-(x-x0)/b)) fit f to y ''fit f to y with weight reciprocal_y ''fit f to y with weight reciprocal_ysquare ''fit f to y with weight reciprocal_x ''fit f to y with weight reciprocal_xsquare ''fit f to y with weight reciprocal_pred ''fit f to y with weight reciprocal_predsqr ''fit f to y with weight weight_Cauchy [Constraints] [Options] tolerance=1e10 stepsize=1 iterations=200 40 20 0 Number of Iterations Performed = 13 IC50 = 3.51 µg/ml X Data Col vs Col x column vs y column 10 12 14 47 Phụ lục 70 Kết thử độc tính tế bào Bảng kết độc tính tế bào MDA-MB-231 MDA-MB-231 MT DMSO Cao TP Cao CHCl3 100 50 25 12.5 100 50 25 12.5 0.433 0.705 0.697 0.425 0.418 0.487 0.234 0.396 0.422 0.448 0.384 0.722 0.655 0.427 0.444 0.518 0.189 0.334 0.395 0.42 0.368 0.751 0.778 0.419 0.435 0.502 0.177 0.332 0.389 0.402 0.395 0.423667 0.432333 0.502333 MEAN 0.726 0.71 0.2 0.354 0.402 0.423333 SEM 0.023259 0.062522 0.033867 0.004163 0.013204 0.015503 0.03005 0.036387 0.017578 0.02318 %DMSO 55.6338 59.67136 60.89202 70.75117 28.16901 49.85915 56.61972 59.62441 % ỨC CHẾ 44.3662 40.32864 39.10798 29.24883 71.83099 50.14085 43.38028 40.37559 KQ TD yếu, IC50 > 100 ug/ml IC50 = 48.90 ug/ml Cao EtOAc Cao n-BuOH Cao nước 12.5 25 25 100 50 25 100 50 12.5 100 50 12.5 0.132 0.603 0.58 0.731 0.642 0.613 0.586 0.614 0.627 0.64 0.622 0.652 0.14 0.618 0.535 0.707 0.647 0.68 0.614 0.652 0.638 0.59 0.627 0.648 0.124 0.683 0.584 0.694 0.66 0.647 0.598 0.627 0.605 0.628 0.696 0.649 0.132 0.634667 0.566333 0.710667 0.649667 0.646667 0.599333 0.631 0.623333 0.619333 0.648333 0.649667 0.008 0.042525 0.027209 0.018771 0.009292 0.033501 0.014048 0.019313 0.016803 0.026102 0.041356 0.002082 18.59155 89.38967 79.76526 100.0939 91.50235 91.07981 84.41315 88.87324 87.79343 87.23005 91.31455 91.50235 81.40845 10.61033 20.23474 -0.0939 8.497653 8.920188 15.58685 11.12676 12.20657 12.76995 8.685446 8.497653 IC50 = 41.40 ug/ml TD yếu, IC50 > 100 ug/ml TD yếu, IC50 > 100 ug/ml MDA-MB-231 MT DMSO FRC11 FRE11 100 50 25 12.5 100 50 25 12.5 0.441798 0.447228 0.37063 0.405342 0.367505 0.404224 0.378997 0.398806 0.423138 0.429156 0.445948 0.437737 0.376233 0.366525 0.383784 0.367487 0.334076 0.409197 0.409388 0.481132 0.46686 0.455052 0.390958 0.357353 0.404129 0.372168 0.346309 0.414754 0.402859 0.424051 MEAN 0.451535 0.446672 0.379274 0.376407 0.385139 0.381293 0.353128 0.407586 0.411795 0.44478 SEM 0.013433 0.008671 0.0105 0.025475 0.018349 0.019996 0.023224 0.008095 0.010352 0.031586 %DMSO 84.91092 84.26915 86.22414 85.36297 79.05739 91.2494 92.19171 99.5763 % ỨC CHẾ 15.08908 15.73085 20.94261 8.750597 7.808289 0.423701 KQ TD yếu TD yếu 13 758 4.6 370 MDA-MB-231 MT DMSO 0.441798 0.445948 0.46686 0.451535 0.013433 MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ 0.447228 0.437737 0.455052 0.446672 0.008671 100 0.379006 0.399268 0.404506 0.39426 0.013467 88.26601 11.73399 FRE12 50 25 0.389533 0.393669 0.399705 0.416605 0.409047 0.430448 0.399428 0.413574 0.00976 0.018576 89.42309 92.59002 10.57691 7.409982 TD yếu 12.5 0.452233 0.455482 0.422243 0.443319 0.018325 99.24931 0.750692 OD570 MDA-MB-231 MT DMSO 1%100 µM 20 µM10 µM 2.5 µM 100 µM 80 µM 60 µM 40 µM 20 µM 10 µM µM 2.5 µM IC50 7.25 10.18 -7.46 -3.98 -5.51 -10.32 8.96 5.51 7.34 -5.71 -5.71 -4.37 -10.70 10.85 6.29 9.68 -5.38 -5.91 -2.42 -11.45 0.469 0.370 21.23 10.01 FRE13 0.456 0.463 21.65 0.463 0.471 0.461 KQ % ức chế µM 0.422 0.435 0.422 0.504 0.488 0.495 0.518 0.363 0.422 0.438 0.429 0.490 0.490 0.483 0.513 0.372 0.420 0.441 0.425 0.496 0.499 0.482 0.525 80 µM 60 µM 40 µM 21.04 TB > 100 µM 48 OD570 MDA-MB-231 MT DMSO 1%100 µM 80 µM 60 µM 40 µM 20 µM 10 µM 0.447 0.432 0.446 0.379 0.494 0.483 0.487 0.509 0.441 FRHC12 0.437 0.451 0.388 0.509 0.479 0.489 0.537 0.452 0.436 0.452 0.407 0.501 0.501 0.474 0.520 KQ MDA-MB-231 MT DMSO 0.463 0.506 0.495 0.488 0.022 MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ 20 0.453 0.097 0.438 0.062 0.461 0.078 0.451 0.079 0.011 0.017 17.54 82.46 PACLITAXEL 10 0.201 0.304 0.201 0.256 0.256 0.308 0.219 0.289 0.032 0.029 48.65 64.14 51.35 35.86 IC50 = 11.06 uM % ức chế µM 0.490 0.517 0.508 2.5 µM100 µM 80 µM 60 µM 40 µM 20 µM 10 µM µM 2.5 µM IC50 0.528 15.18 -0.17 -10.82 -8.26 -9.10 -14.09 -9.83 -18.32 2.10 -12.95 -6.20 -8.58 -19.04 -14.74 -14.17 0.515 13.86 0.03 -10.85 -10.71 -4.72 -14.95 -12.38 -16.18 0.525 10.02 TB > 100 µM 2.5 0.216 0.219 0.276 0.237 0.034 52.57 47.43 Bảng kết độc tính tế bào HepG2 HEPG2 MT DMSO 100 MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ HEPG2 0.623993 0.533073 0.560012 0.572359 0.046701 0.388473 0.350087 0.287828 0.342129 0.050792 MT MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ HEPG2 MT FRC11 KQ 0.01189 41.50282 58.49718 0.623993 0.533073 0.560012 0.572359 0.046701 MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ 0.138635 0.132144 0.155201 0.141993 Cao TP 50 25 0.182433 0.239019 0.180528 0.215045 0.192102 0.181293 0.185021 0.211786 0.006206 0.029001 54.07927 61.90225 45.92073 38.09775 IC50 = 58.42 ug/ml DMSO 0.388473 0.350087 0.287828 0.342129 0.050792 100 0.131702 0.085247 0.09187 0.10294 0.025128 30.08794 69.91206 DMSO 0.623993 0.533073 0.560012 0.572359 0.046701 0.388473 0.350087 0.287828 0.342129 0.050792 MT 0.741 0.768 0.749 DMSO 1% 0.751 0.732 0.748 100 0.317742 0.323243 0.345653 0.328879 0.014784 96.12719 3.872805 Cao EtOAc Cao CHCl3 100 0.256143 0.083654 0.244253 0.09125 0.24157 0.097352 0.247322 0.090752 0.007756 0.006863 72.28899 26.52572 27.71101 73.47428 12.5 50 25 12.5 0.15646 0.168149 0.200528 0.163527 0.209995 0.198392 0.187818 0.209385 0.244782 0.169269 0.195843 0.214567 0.016449 0.023986 0.026189 49.47502 57.24242 62.71526 50.52498 42.75758 37.28474 IC50 = 47.55 ug/ml Cao EtOAc 50 25 0.388185 0.376411 0.36885 0.336999 0.348605 0.335081 0.368546 0.349497 0.019792 0.023328 107.7214 102.1535 -7.72138 -2.15348 IC50 = 91.27 ug/ml Cao nước 50 25 0.369081 0.439707 0.429601 0.464241 0.449426 0.493631 0.416036 0.465859 0.041855 0.026998 121.6019 136.1647 -21.6019 -36.1647 TD yếu Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 0.563 0.619 0.636 0.566 0.625 0.647 0.572 0.616 0.643 12.5 0.40631 0.366128 0.325413 0.365951 0.040449 106.9626 -6.96263 100 0.366117 0.331278 0.299835 0.33241 0.033156 97.15913 2.840866 12.5 0.341265 0.325506 0.376324 0.347698 0.026012 101.6277 -1.62773 50 0.056977 0.052288 0.056457 0.055241 0.00257 16.14623 83.85377 12.5 100 0.660 25.03 0.647 22.62 0.644 23.48 100 0.131702 0.085247 0.09187 0.10294 0.025128 30.08794 69.91206 50 25 12.5 0.388185 0.376411 0.40631 0.36885 0.336999 0.366128 0.348605 0.335081 0.325413 0.368546 0.349497 0.365951 0.019792 0.023328 0.040449 107.7214 102.1535 106.9626 -7.72138 -2.15348 -6.96263 IC50 = 91.27 ug/ml Cao n-BuOH 50 25 12.5 0.481776 0.387649 0.369731 0.444003 0.395501 0.443568 0.456668 0.372746 0.41434 0.460816 0.385298 0.409213 0.019225 0.011558 0.037184 134.6905 112.6178 119.6077 -34.6905 -12.6178 -19.6077 TD yếu Paclitaxel 20 10 0.063957 0.207863 0.347491 0.062567 0.179021 0.353945 0.064865 0.14921 0.302519 0.063796 0.178698 0.334652 0.001157 0.029328 0.028014 18.64683 52.23114 97.81449 81.35317 47.76886 2.185511 IC50 = 11.96 uM Nồng độ cao (µg/ml) 50 25 12.5 17.54 15.26 12.11 14.62 11.55 11.61 17.56 13.95 13.86 TB IC50 > 100 ug/ml 49 FRE11 MT 0.565 0.570 0.559 DMSO 1% 0.559 0.554 0.543 100 0.568 0.560 0.552 OD570 Nồng độ cao (µg/ml) 50 25 0.563 0.570 0.555 0.562 0.567 0.563 % ức chế Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 -1.63 -0.67 -2.03 -1.19 -0.20 -1.45 -1.59 -4.38 -3.56 12.5 0.569 0.562 0.571 KQ FRE12 MT 0.741 0.768 0.749 FRE13 FRHC12 > 100 ug/ml DMSO 1% 0.751 0.732 0.748 % ức chế Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 IC50 15.16 12.58 -0.32 -13.81 12.63 13.24 -2.38 -13.57 12.43 13.66 -1.80 -10.17 TB > 100 ug/ml DMSO 1% 0.548 0.563 0.542 OD570 Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 0.563 0.547 0.571 0.577 0.558 0.542 0.576 0.574 0.553 0.536 0.531 0.549 % ức chế Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 IC50 -2.67 0.17 -4.10 -5.27 0.90 3.65 -2.31 -2.03 -1.88 1.22 2.06 -1.22 TB > 100 ug/ml DMSO 1% 0.548 0.563 0.542 OD570 Nồng độ cao (µg/ml) 50 25 0.483 0.509 0.469 0.513 0.481 0.498 KQ MT 0.585 0.572 0.563 IC50 OD570 Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 12.5 0.854 0.831 0.655 0.646 0.761 0.824 KQ MT 0.585 0.572 0.563 12.5 -1.75 -1.52 -5.15 TB 100 0.454 0.475 0.452 % ức chế Nồng độ cao (µg/ml) 100 50 25 17.10 11.82 7.15 15.66 16.67 8.90 16.75 11.34 8.22 12.5 0.511 0.504 0.509 KQ 12.5 6.84 10.49 6.23 TB IC50 > 100 ug/ml Bảng kết độc tính tế bào RD MT Nồng độ Lần Lần Lần MEAN SEM 1.039 1.069 1.027 1.045 0.021 %DMSO % ỨC CHẾ KQ MT Nồng độ Lần Lần Lần MEAN SEM 1.039 1.069 1.027 1.045 0.021 %DMSO % ỨC CHẾ KQ DMSO 0.631 0.676 0.693 0.667 0.032 DMSO 0.631 0.676 0.693 0.667 0.032 100 0.374 0.438 0.366 0.392 0.039 58.86 41.14 100 0.374 0.438 0.366 0.392 0.039 58.86 41.14 Cao TP 50 25 0.476 0.561 0.550 0.579 0.554 0.560 0.527 0.567 0.044 0.011 79.00 85.01 21.00 14.99 TD yếu 12.5 0.537 0.478 0.475 0.497 0.035 74.51 25.49 Cao TP (TTC1) 50 25 0.476 0.561 0.550 0.579 0.554 0.560 0.527 0.567 0.044 0.011 79.00 85.01 21.00 14.99 TD yếu 100 0.070 0.065 0.066 0.067 0.002 10.05 89.95 12.5 0.537 0.478 0.475 0.497 0.035 74.51 25.49 Cao EtOAc 50 25 12.5 0.376 0.539 0.593 0.455 0.610 0.555 0.394 0.586 0.507 0.408 0.578 0.552 0.042 0.036 0.043 61.22 86.75 82.74 38.78 13.25 17.26 IC50 = 65.89 ug/ml 50 MT DMSO% Nồng độ cao (µg/ml) 1.010 0.812 0.996 0.805 1.001 0.820 1.002 0.812 0.0069 0.0079 MEAN SEM %DMSO % ỨC CHẾ KQ MT DMSO 100 1.171 0.767 0.432 1.058 0.644 0.563 1.154 0.702 0.528 MEAN 1.128 0.704 0.508 SEM 0.061 0.061 0.067 72.08 %DMSO 27.92 % ỨC CHẾ KQ DMSO RD4 MT Nồng độ Lần 0.937818 0.664169 Lần 1.04016 0.740623 Lần 1.047865 0.72857 MEAN 1.008614 0.71112 SEM 0.061432 0.041106 %DMSO % ỨC CHẾ Cao CHCl3 25 50 0.361 0.475 0.362 0.462 0.351 0.475 0.358 0.471 0.0059 0.0078 42.841 57.946 57.159 42.054 IC50 = 38.35 ug/ml 100 0.23 0.246 0.237 0.238 0.0075 29.298 70.702 Cao n-BuOH 25 50 0.553 0.530 0.602 0.629 0.642 0.577 0.599 0.579 0.044 0.049 85.01 82.18 14.99 17.82 TD yếu 12.5 0.598 0.617 0.641 0.619 0.022 87.82 12.18 Cao nước 100 50 25 12.5 0.457 0.757 0.675 0.630 0.513 0.774 0.796 0.611 0.549 0.752 0.765 0.621 0.507 0.761 0.745 0.621 0.046 0.012 0.063 0.010 71.93 108.05 105.82 88.13 28.07 -8.05 -5.82 11.87 TD yếu FRC11 100 0.497625 0.557431 0.557819 0.537625 0.034641 75.60253 24.39747 20 0.132 0.085 0.113 0.110 0.024 15.59 84.41 PACLITAXEL 10 2.5 0.336 0.379 0.500 0.310 0.310 0.415 0.349 0.370 0.415 0.332 0.353 0.444 0.020 0.038 0.049 47.12 50.09 62.99 52.88 49.91 37.01 IC50 = 7.59 uM FRE11 25 12.5 50 12.5 0.541 0.514 0.544 0.533 0.0165 65.591 34.409 0.453498 0.320784 0.48621 0.332579 0.528642 0.383864 0.48945 0.345742 0.037676 0.033537 68.82798 48.61938 31.17202 51.38062 0.288076 0.32661 0.393591 0.336092 0.053393 47.26235 100 0.264508 0.267826 0.277113 0.269816 0.006534 37.94231 12.5 100 0.421128 0.471111 0.513543 0.441203 0.499779 0.65497 0.50706 0.476036 0.474942 0.456464 0.482308 0.547818 0.044953 0.015329 0.094782 64.18938 67.82374 77.03591 50 25 0.571384 0.585758 0.56029 0.627174 0.565504 0.628355 0.565726 0.613762 52.73765 FRE12 50 25 12.5 0.590046 0.537618 0.57642 0.612859 0.514144 0.560203 0.00555 0.02426 0.040466 79.55415 86.30919 78.77755 20.44585 13.69081 21.22245 0.591416 0.580631 0.038763 81.65016 18.34984 32 176 26 2.96 40 KQ TD yếu TD yếu IC50 = 77.80 uM OD570 RD MT 0.841 DMSO1% 100µM 80µM 60µM 40µM 0.639 0.433 0.445 0.553 0.594 % ức chế 20µM 10µM µM 2.5µM100µM 0.596 0.629 0.666 0.660 32.16 80µM 60µM 30.29 13.39 40µM 20µM 10µM µM 2.5µM IC50 7.08 6.64 1.58 -4.34 -3.30 FRE13 0.846 0.859 0.654 0.430 0.446 0.540 0.578 0.641 0.418 0.591 0.637 0.451 0.538 0.581 0.586 0.617 0.660 0.653 34.22 0.654 0.673 34.72 31.76 17.49 29.63 15.99 11.71 9.67 2.65 -0.92 0.18 9.35 8.58 3.61 -2.07 -5.07 TB >100µM KQ OD570 RD MT 0.841 FRHC12 0.846 0.859 KQ DMSO 1% 100µM 80µM 60µM 40µM % ức chế 20µM 10µM µM 2.5µM100µM 80µM 60µM 40µM 20µM 10µM µM 2.5µM IC50 0.639 0.600 0.624 0.633 0.673 0.679 0.610 0.618 0.612 6.03 2.28 0.96 -5.36 -6.32 4.47 3.32 4.18 0.654 0.594 0.620 0.659 0.674 0.686 0.603 0.648 0.621 9.13 5.15 -0.78 -3.06 -4.83 7.84 0.92 5.05 0.641 0.592 0.617 0.628 0.683 0.691 0.630 0.633 0.603 7.64 3.69 2.00 -6.62 -7.84 1.71 1.20 5.91 TB > 100µM 51 Phụ lục 71 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết xuất Dung mơi Diện tích pic MeOH (100%) MeOH (70%) MeOH (50%) Nước 100% 275106 231815 382923 203955 Phụ lục 72 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp thời gian chiết xuất Thời gian (phút ) Diện tích pic Đun hồi Siêu âm lưu 95 50 oC oC 15 52099 318412 30 146412 383106 45 60 272130 204593 330365 306183 o Siêu âm (50 C) o Đun hồi lưu (95 C) Phụ lục 73 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống 52 Phụ lục 74 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu Phụ lục 75 Sắc ký đồ độ lặp lại 53 Phụ lục 76 Sắc ký đồ tính tuyến tính Poliothrysosid C (µg/ml) S (µV*S) 100 2298506 50 1159026 25 585238 10 264778 125266 25199 0.5 9834 Mối tương quan nồng độ diện tích pic poliothrysosid Đường tuyến tính chuẩn poliothrysosid 54 Phụ lục 77 Sắc ký đồ độ 80 Phụ lục 78 Sắc ký đồ độ 100 55 Phụ lục 79 Sắc ký đồ độ 120 56 Phụ lục 80 Sắc ký đồ mẫu theo dõi theo thời điểm - Mẫu Bến Tre Phụ lục 81 Sắc ký đồ mẫu thu hái theo phận dùng - Lá 57 Phụ lục 82 Sắc ký đồ mẫu thu hái theo phận dùng - Quả non Phụ lục 83 Sắc ký đồ mẫu thu hái theo phận dùng - Rễ 58 Phụ lục 84 Thông tin cấp số nhận diện ngân hàng gen (GenBank: MK088161.1) Flacourtia rukam ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast GenBank: MK088161.1 FASTA Graphics Go to: LOCUS JUN-2019 MK088161 DEFINITION Flacourtia rukam ribulose-1,5-bisphosphate 416 bp DNA linear PLN 03- carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast ACCESSION MK088161 VERSION MK088161.1 KEYWORDS SOURCE chloroplast Flacourtia rukam ORGANISM Flacourtia rukam Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; rosids; fabids; Malpighiales; Salicaceae; Flacourtieae; Flacourtia REFERENCE (bases to 416) AUTHORS Thai,C.T TITLE Identification of Flacourtia rukam in Ben Tre, Viet Nam using rbcL gene JOURNAL REFERENCE Unpublished (bases to 416) AUTHORS Thai,C.T TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (22-OCT-2018) Department of Genetics and Plant Breeding, Cantho University, 3/2, Can Tho, Cantho 084710, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES source Location/Qualifiers 416 /organism="Flacourtia rukam" 59 /organelle="plastid:chloroplast" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:1085434" gene 416 /gene="rbcL" CDS 416 /gene="rbcL" /codon_start=3 /transl_table=11 /product="ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit" /protein_id="QCV37245.1" /translation="AGVKDYKLTYYTPDYETKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVA AESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYDIEPVAGEENQFIAYVAYPLDLFEEGSVTNM FTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPPAYSKTFQGPP" ORIGIN aggctggtgt taaagattat aaattgactt attatactcc tgactatgaa accaaagata 61 ctgatatctt ggcagcattc cgagtaactc ctcaacctgg agttccgccc gaggaagcag 121 gggccgcggt agctgctgaa tcttctactg gtacatggac aactgtgtgg accgatgggc 181 ttaccagtct tgatcgttat aaaggacgat gctacgacat cgagcccgtt gctggagaag 241 aaaatcaatt tattgcttat gtagcttacc ccttagacct ttttgaagaa ggttctgtta 301 ctaacatgtt tacttccatt gtgggtaatg tatttgggtt caaagcctta cgcgctctac 361 gtctggagga tttgcgaatc ccccctgctt attctaaaac ttttcaaggc ccacct LInk: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MK088161 ... sau: Giới (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) (Kingdom) (Phylum) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) (Class) Bộ Sơ ri (Malpighiales) (Order) Họ Liễu (Salicaceae) Chi Flacourtia Loài Flacourtia rukam... 1.2 TỔNG QUAN VỀ FLACOURTIA RUKAM 1.2.1.Thực vật học Tên khoa học: Flacourtia rukam Zollinger et Moritzi Tên đồng danh: Flacourtia cataphracta sensu Blume., Flacourtia edulis Griff., Flacourtia... tập trung loài: Flacourtia indica, Flacourtia montana, Flacourtia sepiaria, Flacourtia jangomas [62], [71], [133], [135] Đặc biệt có lồi khảo sát tác dụng độc tính tế bào Flacourtia indica tác