BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU Trần Thị Thuỳ Linh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LOÀI TU HÙNG TAI (Pogostemon auricularius (L ) Hassk ), HỌ HOA MÔI (Lamia[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆ U Trần Thị Thuỳ Linh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA LOÀI TU HÙNG TAI (Pogostemon auricularius (L.) Hassk.), HỌ HOA MÔI (Lamiaceae) Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ tr uyền Mã số: 972.02.06 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2023 Cơng trình hoàn thành tại: - Viện Dược liệu - Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế - Viện Hóa học, Viện Cơng nghệ sinh học Vi ện Hóa sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) Người hướng dẫn khoa học: GS TS Nguyễn Thị Hoài PGS TS Lê Việt Dũng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án đư ợc bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện tổ c Viện D ược liệu Vào hồi … … phú t, ngày … tháng … năm 202… Có thể tìm đọc Luận án : - Thư viện Quốc gia Hà Nội - Thư viện Viện Dược liệu A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Pogost emon Desf chi lớn họ Hoa môi (Lamiaceae) sử dụng Y học cổ truyền nhiều nư ớc, phần lớn nước châu Á, để chữ a đau bụng tiêu chảy, đau dày, thấp khớp, cảm mạo, nhức đầu, hạ sốt, làm vết thương nhanh lên da non v.v Thành phần hoá học chi Pogost emon Des f đa dạng với nhóm hợp chất có hoạt tính si nh học flavonoid, terpenoid, steroid v.v Các nghiên cứu Y học đại cho thấy số dịch chiết hay hợp chất phân lập từ loài thuộc chi Pogostemon Desf chứa đựng nhi ều hoạt tính sinh học tốt kháng vi si nh vật, giảm đau, chống viêm, chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư v.v Loài Tu hùng tai Pogost emon auricularius (L.) Hassk người dân sử dụng để chữa đau dày, cảm sốt, viêm họng Dịch chiết loài thể số hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng viêm, làm tan huyết khối, ức chế enzym α-amylase, chống tiêu chảy Ở nước ta, số lượng nghiên cứu thành phần hoá học tác dụng sinh học loài giới Việt Nam cịn khiêm tốn Từ l í trên, đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học loài Tu hùng tai (Pogostemon auricularius (L.) Hassk.), Họ Hoa môi (Lamiaceae)” Mục tiêu nội dung Luận án 2.1 Mục tiêu Luận án Mục tiêu Xác định cấu trúc hóa học số hợ p chất phân lập đư ợc từ phân đoạn có tác dụng chống viêm in vitro Mục tiêu Đánh giá độc tính cấp phân đoạn có tác dụng chống viêm in vitro thử số tác dụng sinh học dịch chiết toàn phần, dịch chiết phân đoạn số hợp chất phân lập đư ợc 2.2 Nội dung Luận án Ø Về thực vật - Mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Ø Về thành phần hóa học - Định tính nhóm chất dược liệu phản ứng hóa học - Chiết xuất phân lập 11 hợp chất theo định hướng tác dụng sinh học - Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Ø Về độc tính tác dụng sinh học - Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro ức chế sản sinh NO cao chiết toàn phần, cao phân đoạn hợp chất tinh khiết Đánh giá khả điều hoà cytokin (IL-6, IL-10, TNF-a) - Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư, khả cảm ứng apoptosis khả cảm ứng sinh caspase-3 - Xác định độc tính cấp cao chiết chống viêm in vitro tốt Những đóng góp Luận án 3.1 Về hóa học Từ thân loài Pogostemon auricularius (L.) Hassk phân lập xác định cấu trúc hóa học 11 hợp chất, đó: - hợp chất mới, bao gồm merot erpenoid (Pogostemin A-C), dẫn xuất phl orogluci nol (Pogostemonon A-D, Pogostemon D) tr iterpen (Pogostem) - hợp chất lần phân lập từ loài Pogostemon auricularius (L.) Hassk diterpenoid (geranyll inalool ) sterol (stigmasterol) 3.2 Về độc tính cấp tác dụng sinh học Luận án cơng bố độc tính cấp phân đoạn ethyl acetat loài Pogostemon auricularius (L.) Hassk Luận án công bố về: - Tác dụng chống viêm ức chế sản sinh NO mẫu cao chiết methanol toàn phần, cao phân đoạn n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat cao chiết nước từ loài Tu hùng tai - Tác dụng chống viêm ức chế sản sinh NO hợp chất báo cáo Khả điều hoà cytokin (IL-6, IL-10 TNF-a) Pogostemin C báo cáo - Tác dụng gây độc tế bào ung thư dòng: Hep-G2 (ung thư gan người), AGS (ung thư dày người), KB (ung thư biểu mô người), LU-1 (ung thư phổi người) SW-480 (ung thư ruột kết người) hợp chất báo cáo Khả gây apoptosis, cảm ứng caspase-3 dòng tế bào LU-1 Pogostemin A báo cáo Ý nghĩa luận án Đây lần loài Tu hùng tai mọc tự nhiên Việt Nam nghiên cứu đầy đủ thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học - Tên khoa học mẫu nghiên cứu xác định giúp cho kết nghiên cứu hóa học tác dụng sinh học khẳng định rõ nguồn gốc - Kết nghiên cứu thành phần hóa học: phân lập 11 hợp chất phân đoạn chiết khác nhau, có hợp chất mới, hợp chất lần cơng bố có lồi Pogostemon auricularius (L.) Hassk Kết nghiên cứu thành phần hóa học giúp bổ sung tư liệu cho ngành hóa học hợp chất thiên nhiên nói chung chi Pogostemon lồi P auricularius nói riêng - Kết nghiên cứu tác dụng sinh học chứng minh cao chiết ethyl acetat từ lồi Tu hùng tai có tác dụng chống viêm ức chế sản sinh NO mạnh Bên cạnh đó, số hợp chất tìm thấy cho tác dụng sinh học tốt chống viêm ức chế sản sinh NO, điều hoà cytokin, gây độc tế bào ung thư, cảm ứng caspase-3 cảm ứng apoptosis Bố cục luận án Luận án có 123 trang, gồm chương, 25 bảng, 33 hình, 181 tài liệu tham khảo phụ lục Các phần luận án: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (27 trang), Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu (15 trang), Kết nghiên cứu (57 trang), Bàn luận (20 trang), Kết luận kiến nghị (2 trang) B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Đã tổng hợp trình bày cách hệ thống kết nghiên cứu từ trước đến thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học chi Pogostemon Desf loài P auricularius (L.) Hassk CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu nghiên cứu thân Tu hùng tai thu hái huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Tr ị (N16°44′38,9″; E107°14′51,1″) vào tháng năm 2016 Mẫu tiêu có đủ quan sinh dưỡng (thân, lá, rễ) quan sinh sản (hoa) lưu trữ Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược - Đại học Huế với số hiệu mẫu PA01 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Xác định tên khoa học lồi nghiên cứu sở phân tích đặc điểm hình thái t hực vật, so sánh với tài liệu cơng bố lồi khóa phân loại thực vật - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập dựa thông số vật lý phương pháp phổ HR-EI-MS, 1D 2D NMR, CD kết hợp đối chiếu với tài liệu công bố - Đánh giá tác dụng chống viêm ức chế sản sinh NO đại thực bào chuột RAW 264.7 - Đánh giá khả điều hoà cytokin IL-6, IL-10 TNF-a - Đánh giá khả gây độc tế bào phương pháp nhuộm SRB - Đánh giá khả cảm ứng apoptosis thuốc nhuộm nhân tế bào Hoechst 33342 trắc lưu tế bào - Đánh giá khả cảm ứng sinh caspase-3 - Đánh giá độc tính cấp cao chiết ethyl acetat theo hướng dẫn Bộ Y tế Việt Nam CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết nghiên cứu thực vật 3.1.1 Đặc điểm hình thái Cây mọc hàng năm, bị đứng, cao 40-100 m Thân có tiết diện vuông, bề mặt phủ dày lông Lá mọc đối; cuống phủ nhiều lông, dài 5-12 mm, phần gần khơng cuống; phiến hình trứng, 2,5-7 × 1,5-3 cm, hai mặt phủ lông dài, đặc biệt phần gân lá, gốc tròn hay tù, đơi hình nêm, mép xẻ cư a, đỉnh tù hay nhọn; gân bên 5-7 cặp, rõ mặt Cụm hoa đỉnh cành, dài cỡ 3-12 cm, đường kính khoảng cm hoa nở Lá bắc hình trứng, khoảng × 1-1,2 mm, có lơng Hoa gần khơng cuống Đài hình chng, dài khoảng mm, chia thùy hình tam giác, mép có lơng Tràng hoa màu trắng hay tím nhạt, dài khoảng mm, nhẵn hay có lơng t hưa mặt ngoài, đỉnh chi a thùy gần Nhị 4, thị, đính ống tràng, dài khoảng mm, phần phủ lông dài, phần tr ên nhẵn Bầu nhẵn, vòi nhụy nhẵn, dài khoảng mm, xẻ thùy đỉnh 3.1.2 Giám định tên khoa học Đã giám định tên khoa học Tu hùng tai thu hái huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị Pogostemon auricularius (L.) Hassk., thuộc họ Lami aceae 3.2 Kết nghiên cứu hóa học 3.2.1 Định tính nhóm hợp chất hữu Kết cho thấy nhóm hợp chất có loài Tu hùng tai gồm alcaloid, flavonoid, glycosid tim, saponin, axit hữu cơ, steroid, tanin, đường khử, chất béo khơng có coumarin, anthranoid, axit amin 3.2.2 Chiết xuất, phân lập hợp chất Phần mặt đất loài Tu hùng tai rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô nhiệt độ 50-60°C, xay thành bột thô tiến hành chiết xuất, phân lập chất Khối lượng dược liệu khô đem chiết xuất 2,5 kg Dùng MeOH để làm ẩm toàn lượng bột Tu hùng tai bình chiết, đậy kín để n để bột thấm ẩm trương nở hoàn toàn Tiến hành ngâm chiết cách thêm MeOH vừa đủ ngập cách bề mặt dược liệu khoảng cm Quá trình chiết xuất tiến hành nhiệt độ phịng với đợt chiết (3 × 10 L /7 ngày) Gộp dịch chi ết, cất thu hồi dung môi áp suất giảm nhiệt độ 50-60°C thu cao toàn phần MeOH (M, 207 g) Phân tán cao chiết toàn phần M L nước cất, chiết phân bố với dung mơi (2L × 5) có độ phân cực tăng dần là: n-hexan, diclorometan ethyl acetat Thu hồi dung môi áp suất giảm, thu cao chiết phân đoạn tương ứng, ký hiệu H (58 g), D (51 g), E (47 g) W (41 g) cao phần nước cịn l ại Q trình phân lập dựa định hướng hoạt tính chống viêm Từ kết sảng lọc khả ức chế sản sinh NO, phân đoạn E có tác dụng tốt lựa chọn để thực trình phân lập Quá trình phân lập thu 11 hợp chất 3.2.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất Dựa vào khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều, hai chiều (NMR) đối chiếu với tài liệu tham khảo, xác định cấu trúc 11 hợp chất * Hợp chất PH16: (hợp chất mới) dạng bột màu vàng Phổ HR-ESI-MS: m/z 385,2735 [M+H]+ cho công thức C25H 37O 385,2743 Phổ H-NMR tín hiệu nhóm methin olefin t ại δH 5,98 (s, H-20) gợi ý diện nối đơi, tín hiệu hai nhóm olefin δH [4,91 (br.s, H-12a), 4,86 (br.s, H-12b)] gán cho nối đơi ngoại vịng (exo-methylen), tín hiệu nhóm methyl đư ợc ghi nhận δ H [1,23 ( s, H -15), 1,20 (d, J = 6,5 Hz, H3-25), 1,01 (s, H3-13), 0,99 ( s, H3 -14), 0,92 (t, J =7,5 H z, H 3-16)] tí n hiệu 18 proton nhóm met hin germinal methin khoảng dịch chuyển hoá học δ H 2,64-1,51 Phổ 13C-NMR HSQC 25 tín hiệu carbon bao gồm carbon nhóm car bonyl δ C 180,3 (C-21), nhóm carbon oxymethin δ C [167,9 (C-19), 163,1 (C-23)], nhóm carbon mang oxi δ C 88,0 (C-8); nhóm carbon sp2 bậc bốn δ C [151,8 (C-1), 97,7 (C22)], nhóm nối đơi ngoại vịng (exo-methylen) δ C 110,7 (C12); nhóm carbon sp methin δC 110,0 (C-20), nhóm car bon sp3 bậc bốn δC 34,0 (C-4), tín hiệu carbon sp nhóm methin δC [53,7 (C -5), 41,3 (C-11), 39,2 (C-18), 34,3 (C-9)], nhóm car bon sp3 methylen δC [37,9 (C-7), 36,6 (C-3), 35,2 (C-2), 32,7 (C-10), 27,4 (C-17), 24,4 (C-24), 22,3 (C-6)] nhóm methyl δC [30,2 (C-13), 22,1 (C-14), 20,9 (C-15), 11,5 (C-16), 17,7 (C-25)] Trên phổ COSY xuất tư ơng tác H-16 (δH 0,90)/H-17 (δ H 1,68; 1,53)/H-18 (δ H 2,47)/H-25 (δH 1,20) gợi ý trật tự liên kết C-16/C-17/C-18/C-25 Ngoài ra, phổ H MBC xuất tư ơng tác H-17a (δH 1,68)/H-25 (δ H 1,20) với C-19; tương t ác H-20 (δH 5,98) với C-18/C-19/C-21/C-22 H-24a (δ H 2,64)/H-24b (δ H 1,95) với C-21/C-22/C-23 gợi ý diện vịng γ-pyron với nhóm sec-butyl nhóm methylen C-19 C-24 Tương tác HMB C H-13 (δ H 1,01)/H-14 (δH 0,99) C-3 (δC 36,6)/C-4 (δC 34,0)/ C-5 (δC 53,7) gợi ý có mặt nhóm gem-dimethyl C-4 Tương tự, t ương tác HMBC H-12 (δH 4,86; 4,91) C-1 (δC 151,8)/C-2 (δ C 35,2)/C-11 (δ C 41,3) gợi ý diện nhóm exo-methylen C-1 Trên phổ COSY xuất tương tác giữ a H-7 (δ H 2,12; 1,92)/H-6 (δH 1,78; 1,44)/H-5 (δ H 1,90)/H-11 (δH 2,44)/H-10 (δH 1,69; 1,55)/H-9 (δ H 2,02) cho phép thiết lập trật tự C-7/C-6/C5/C-11/C-10/C-9 Tương tự, tương tác H-2 (δ H 2,41; 2,15)/H3 (δH 1,70; 1,64) phổ COSY cho phép thiết lập trật tự C2/C-3 Kết hợp liệu phổ HMBC phổ COSY cho phép thiết lập trật tự liên kết mạch car bon từ C-7 đến C-2, trật tự mạch liên kết giữ a C -11 C-2 qua C-1 C-5 C-3 qua C-4 Các liệu phổ gợi ý diện vòng 4,4-dimethyl1-methylenecyclohexane bao gồm C-1-C-5 C-11-C-14 cấu trúc PH16 Ngoài ra, tươ ng tác tr ên phổ HMBC H-15 đến C-7/C-8/C-9; gi ữa H-10a (δH 1,55)/H-10b (δ H 1,69) đến C-8/ C-9 gợi ý mạch carbon C-7-C-8-C-9 Bên cạnh đó, tương tác H-10a/H-10b/H-9 đến C-24 H-24a/H-24b đến C8/C-9/C-10 gợi ý mảnh cấu trúc 1-methylene-4,4,8trimethylbi cycl o[5.4.0]undecane gắn với C-22 vòng γ-pyrone qua cấu nối C-24 Mặc dù thiếu chứng t rực tiếp có mặt vịng 3,4-di hydropyr an bao gồm C-8-C-9 C-22-C-24 tồn cấu trúc hợp chất PH16, liên kết C-8 C-23 qua cầu oxy hình thành vịng C đề nghị để phù hợp với công thức phân tử hợp chất PH16 Ngoài ra, dịch chuyển từ trường thấp carbon methine C-8 δ C 88,0 làm rõ có mặt cầu nối ether C-8 C-23 Do đó, hợp chất PH16 xác định mer oterpenoid với γ-pyron khung bicyclo[5.4.0] undecane Phần sesquiterpen hợp chất PH16 tương tự xi monican phân lập từ Ximenia americana Cấu hình tương đối PH16 làm sáng tỏ dựa liệu phổ NOESY so sánh với liệu NMR báo cáo ximonican Khi so sánh liệu 13C-NMR hợp chất PH16 [δ C 53,7 (C-5) 41,3 (C-11)] chất t ham khảo xi monican [δC 52,01 (C-5) 40,16 (C-11)] gợi ý vị trí axial H-5 (δ H 1,90) H-11 (δ H 2,44) cấu trúc hợp chất PH16 Bên cạnh đó, định hướng β H-11, H-3b (δH 1,64), H-7b (δ H 2,12), H-14, H15, H-10b H-24b xác đị nh dựa t rên tương tác NO ESY H-11/H-3b, H-11/H-7b, H -11/H-14, H-3b/H-14, H-7b/H-15, H-10b/H-15 H-15/H-24b; định hướng α H-5, H9, H-13, H-10a, H-24a H-3a (δH 1,70) xác định dựa tươ ng tác NOESY H-5/H-9, H-5/H-13, H-10a/H-24a H-13/H-3a Những liệu phổ NOESY ng minh vòng cycloheptan (B) dihydropyran (C) tồn cấu dạng trans Như vậy, hợp chất PH16 meroterpenoi d đặt tên Pogostemin A * Hợp chất PH15: (Hợp chất mới) dạng bột màu vàng nhạt Phổ HR-ESI -MS: m/z 385,2735 [M+H] + tương ứng với công thức C 25H 37O3 Các liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất PH15 tương đồng với hợp chất PH1 Tr ên phổ 1H xuất tín hiệu nhóm methin olefin δH 6,00 (s, H-20) gợi ý diện nối đôi ba lần thế, tín hiệu hai nhóm olefin δ H [4,82 (br.s, H-13a) 4,75 (br.s, H-13b)] gán cho proton nối đơi ngoại vịng (exo-methylen) tín hiệu nhóm methyl ghi nhận δH [1,22 (dd, J = 7,0; 1,0 Hz, H3-25), 1,15 (br.s, H 312), 1,00 (s, H3-14), 1,00 (s, H3-15), 0,90 (t, J =7,5 Hz, H 3-16)] Phổ 13C-NMR HSQC r a 25 tín hiệu carbon bao gồm nhóm car bonyl t ại δC 180,2 (C-21), t ín hiệu nhóm carbon oxymethin δC [168,0 (C-19) 163,2 (C-23)], tín hi ệu nhóm car bon no mang oxi t ại δ C 88,0 ( C-4), tín hiệu nhóm carbon sp2 bậc bốn δ C [154,6 (C -8) 98,0 (C-22)], nhóm car bon sp3 bậc bốn δ C 33,5 (C-11), tín hiệu carbon nhóm đơi ngoại vịng (exo-methylen) δ C 110,1 (C-13), nhóm carbon methin δC 110,0 (C-20), tín hiệu nhóm carbon sp3 nhóm methin δC [56,5 (C -1), 42,5 ( C-9), 39,2 (C-18), 35,3 (C-5)], tín hiệu nhóm carbon sp3 methylen δ C [38,7 (C-3), 38,4 (C-10), 36,6 (C-7), 33,2 (C-6), 22,9 (C-2), 27,4 (C-17), 23,6 (C-24)] nhóm methyl δC [19,8 (C-12), 29,7 (C-14), 22,6 (C-15), 11,5 (C-16), 17,7 (C-25)] pyron sesquiterpen Tuy nhiên liệu phổ 2D -NMR PH4 ghi nhận có mặt có nhóm 1-met hylprop-1-enyl với cấu hình E liên kết đơi Δ18 thay t hế nhóm sec-butyl (có phân tử PH16 PH15) gắn vào vòng γ-pyron C-19 điểm khác biệt hợp phần sesquiterpenoid Bên cạnh đó, số ghép 3J 1-2 H-1 H-2 16,0 Hz, tương tác phổ NOESY gi ữa H-1 (δH 5,25) H-3b (δH 2,44) đề nghị cấu hình E liên kết đôi Δ1 Các tương t ác H-7b (δ H 1,90)/H-9 (δH 5,08) H-10a (δH 2,26)/H10b (δH 1,80)/H-14 phổ NOESY xác nhận cấu hình E liên kết đôi Δ8, tương tác H-16(δ H 1,85) H-25(δH 1,94) gợi ý cấu hình E liên kết đôi Δ18 Dựa vào liệu phổ trên, cấu tr úc PH4 làm sáng tỏ đặt tên Pogostemi n C * Hợp chất PH10: Pogostemonon B (Hợp chất mới) dạng bột màu trắng Phổ HR-ESI-MS: m/z 405,1909 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C22 H29O7 Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu đặc trưng nhóm methyl δH [2,01 (s, H3-14), 1,23 (d, J = 7,0 Hz, H 3-1′), 1,15 (d, J = 6,5 Hz, H3-5′′), 0,92 (t, J = 7,5 Hz, H3-4′′) 0,91 (t, J = 7,5 Hz, H3-4′)], tín hiệu proton sextet δ H [2,54 (sextet, J = 7,0 Hz, H2′), 3,98 (sextet, J = 6,5 Hz, H-2′′)], proton olefin δH 6,08 (s, H-3) proton nhóm methylen δH 3,63 (br s, H 2-7) Phổ 13C-NMR HSQC 22 tín hiệu carbon bao gồm nhóm methyl, nhóm methylen, nhóm methin 11 carbon khơng liên kết hydro Trong đó, xuất tín hiệu đặc trưng nhóm carbonyl δC 212,6 (C1′′), 171,3 (C-6) tín hiệu nhóm methyl gắn với vịng thơm δC 8,1 (C-14) Dựa vào liệu phổ 1D-NMR, hợp chất PH10 đề xuất dẫn xuất phloroglucinol Trên phổ HMBC hợp chất PH10 xuất tương tác H-4′′ (δH 0,92)/H-5′′ (δH 1,15) C-2′′ (δC 47,0)/C-3′′ (δC 28,3), H-5′′ C-1′′ (δC 212,6) gợi ý có mặt nhóm 1-oxo-2-met hylbutyl Ngồi ra, tương tác HMBC H-14 (δH 2,01) C-11 (δ C 162,4)/C-12 (δC 105,2)/C-13 (δC 161,3) gợi ý nhóm methyl gắn với nhân thơm C-12 Sự dịch chuyển hóa học phổ 13 C-NMR vịng pyron, cụ thể hợp chất PH10 [δC 169,5 (C-2), 102,2 (C-3), 169,5 (C-4), 103,0 (C- 10 5) 171,3 (C-6)] tương tự hợp chất 6-(2-butyl)-3-ethyl-4hydroxy-2-pyrone (còn gọi germicidin) [δC 165,9 (C-2), 99,6 (C-3), 167,2 (C-4), 104,7 (C-5) 167,5 (C-6)] phân lập từ phần dịch môi trường nuôi cấy Streptomyces viridochromogenes, điều phân tử PH10 chứa cấu trúc α-pyron Ngoài ra, tương tác phổ HMBC H-7 (δ H 3,63) C-4 (δC 169,5)/C-5 (δC 103,0)/C-6 (δC 171,3), H-3 (δH 6,08) C-2 (δC 169,5)/C-5 mà khơng có tương tác với C-6 cố cho có mặt vịng αpyron PH10 Bên cạnh đó, tương tác phổ HMBC H-1′ (δH 1,23)/H4′ (δH 0,91) C-2′ (δC 40,9)/C-3′ (δC 28,5), H-1′/H-2′ (δH 2,54)/H-3′ (δH 1,58; 1,70) đến C-2 phổ HMBC cho phép xác định nhóm sec-butyl gắn vào vịng α-pyron vị trí C-2 Li ên kết gốc phloroglucinol vịng α-pyron qua cầu methylen (C(7)H 2) thiết lập thông qua dịch chuyển mạnh phía trường thấp H 2-7 (δH 3,63) Đặc biệt, tương tác phổ HMBC proton nhóm methylen (H2-7) với C-4 (δC 169,5)/C-5 (δC 101,7)/C-6 (δC 170,7)/ C-8 (δC 106,5)/C-9 (δC 158,7)/C-13 (δC 161,3) cố hình thành cầu methylen gốc phloroglucinol vòng α-pyron Dựa vào liệu phổ trên, hợp chất PH10 xác định dẫn xuất phloroglucinol đặt lên Pogostemonon B * Hợp chất PH19: (hợp chất mới) dạng bột màu vàng nhạt Phổ HR-ESI-MS xuất pic ion giả phân tử m/z 441,1897 [M+Na] + tính tốn cho C2 3H3 0O7Na 441,1889 Các liệu phổ H 3C-NMR hợp chất PH19 Bảng 3.10 tương đồng với hợp chất PH10 Trong cấu trúc PH19 xuất tín hiệu nhóm methyl si nglet Như vậy, cấu t rúc hợp chất PH19 dẫn xuất phl oroglucinol mới, đặt tên Pogostemonon D * Hợp chất PH13: (hợp chất mới) thu dạng bột màu trắng Phổ HR-ESI -MS: m/z 417 ,1906 [M+H] + tương ứng với công thức phân tử C 3H29O Các liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất PH13 Bảng 3.10 tương đồng với hợp chất PH19 Tuy nhiên, liệu phổ hợp chất PH13 xuất tín hiệu 11 mảnh cấu trúc 1-met hylprop-1-enyl Như PH13 dẫn xuất phloroglucinol , đặt lên Pogostemonon C * Hợp chất PH6: (hợp chất mới) dạng bột màu vàng Phổ HR-ESI -MS: m/z 417,1906 [M+H] + tương ứng với công thức phân tử C 23H 29O7 Các liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất PH6 Bảng 3.10 t ương đồng với hợ p chất PH13 Điểm khác biệt phân t PH6 xuất tín hiệu vịng γ-pyron PH6 xác đị nh dẫn xuất phloroglucinol đặt lên Pogostemonon A * Hợp chất PH18: (hợp chất mới) dạng bột màu tr ắng Phổ HR-ESI -MS: m/z 415,1753 [M+H] + tương ứng với công thức phân tử C 23H 27O Các liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất PH18 Bảng 3.10 tương đồng với hợp chất PH13 hợp chất PH10, PH19 Điểm khác biệt phân t PH18 xuất t ín hiệu khung 2,3-dimethyl-4-chromanon Dựa liệu phổ, hợp chất PH18 dẫn xuất phloroglucinol mới, đặt tên Pogostemon D * Hợp chất PH14: (hợp chất mới) dạng bột màu trắng Phổ HR-ESI-MS: m/z 523,3201 [M+Cl]− tương ứng với công thức phân tử C 0H48O 5Cl Phổ H-NMR tín hiệu đặc trưng nhóm methyl bậc ba δH 0,90-1,09, t ín hiệu 10 nhóm methylen, đặc biệt xuất pr oton oxymethylen δ H 3,68 (d, J = 10,0 Hz, H-23a), 3,44 (d, J = 10,0 Hz, H-23b) Phổ 1H-NMR cịn thể tí n hiệu proton methin, có tín hiệu proton oxymethin t ại δ H 3,76 (ddd, J = 10,5; 10,0; 4,0 Hz, H-2), 3,40 (d, J = 10,0 H z, H-3), 4,08 (d, J = 2,5 Hz, H-18), tín hiệu proton dioxymethi n δH 4,19 (s, H-29) tín hiệu proton olefinic δH 5,77 (d, J = 2,5 Hz, H-12) Ngồi ra, phổ 1H-NMR cịn cho thấy tí n hi ệu nhóm methoxy δ H 3,36 (s, H3-28) Phổ 13C-NMR HSQC 30 tín hiệu carbon gợ i ý cấu trúc olean-12-ene nor-tri terpen Độ dịch chuyển hóa học δ C 69,0 (C-2), 80,9 (C-3), 49,7 (C-5), 47,6 (C-9), 118,8 (C-12), 74,6 (C18) tín hiệu acet al ghi nhận δ C 106,7 (C-29) gợi ý có mặt carbon methine Bên cạnh đó, phổ 13C-NMR cịn cho thấy tí n hiệu 10 carbon methylen bao gồm: hydroxyl methyl en 12 δC 71,1 (C-23), nhóm methoxy δ C 54,9 (C-28) carbon bậc bốn So sánh liệu phổ NMR hợp chất PH14 hợp chất gomphoparvin B, nhóm acetal cấu trúc hợp chất gán vào vị trí C-29, vịng F hình thành t rên liên kết C-18 C-29 qua cầu nối oxy Điều xác nhận dựa vào tươ ng tác t rên phổ HMBC hợp chất PH1 4, tương tác H-29 (δ H 4,18, s) đến C-18 (δC 74,6) Bên cạnh đó, điểm khác biệt xuất nhóm methoxy C28 (δC 54.9) cấu trúc PH14 thay nhóm hydroxyl vị trí hợp chất gomphoparvin B, xác nhận thông qua tương tác phổ HMBC δH 3,36 (3H, s) C-29 (δ C 106,7)/C-30 (δC 21,6) Cấu hình tương đối PH14 xác định dự a vào liệu phổ NOESY Tín hi ệu NOESY H-2 (δH 3,76), H-24 (δH 0,90) H-25 (δ H 1,09) gợi ý định hướng β proton Ngược lại, t ín hiệu NOESY H-27 H18, H-18, H-29 H-30 gợi ý định hướng α proton B ên cạnh đó, số tương tác J2-3 = 10,0 Hz gợi ý cấu hình trans-diaxial H-2 H-3 cho phép xác đị nh H-3 định hướng α Như vậy, cấu trúc hợp chất PH14 triterpen đặt tên Pogostem * Hợp chất PH5: Geranyllinalool đư ợc tách dạng dầu Phổ H-NMR tí n hiệu đặc tr ưng nhóm methyl singlet t ại δH 1,68 (H 3-16); 1,60 (H3-17/H3-20); 1,59 (H3 -19) 1,28 (H 3-18); proton olefine δH 5,92 (dd, J = 10,5, 17,0 Hz, H-2); 5,14 (qt, J = 1,0; 7,0 Hz, H-6); 5,10 (m, H-10/H-14) nhóm exo-met hylen δ H 5,22 ( dd, J = 1,0; 17,0 Hz, H-1a) 5,07 (dd, J = 1,0, 10,5 Hz, H-1b) Phổ 13C-NMR HSQC tín hiệu 20 carbon, gồm nhóm methyl , nhóm methylen, nhóm methin car bon khơng liên kết hydro Trong đó, carbon l hóa sp2 δ C 145,1 (C-2), 135,6 (C-7), 135,1 (C-11), 131,3 (C-15), 124,4 (C-6), 124,2 (C-14), 124,1 (C-10) 111,7 ( C-1) car bon bậc bốn δC 73,5 (C-3) 13 PH10 δC 169,5 102,2 170,0 103,0 171,3 18,6 106,5 158,7 106,7 162,4 105,2 161,3 8,1 − 18,2 40,9 28,5 11,9 212,6 47,0 28,3 12,3 17,3 10 11 12 13 14 15 1' 2' 3' 4' 1' ' 2' ' 3' ' 4' ' 5' ' C − 3,98 sext et (6,5) 1,84m; 1,39 m 0,92 t (7,5) 1,15 d (6,5) 0,91 t (7,5) δH − 6,08 br.s − − − 3,62 s − − − − − − 2,01 s − 1,22 d (7,0) 2,54 sext et (7,0) 1,58 m; 1,7 m 28 ,2 12 ,3 17 ,1 21 2,8 47 ,1 12 ,2 28 ,7 PH19 δC 16 4,6 11 0,0 16 9,0 10 3,1 17 0,8 18 ,6 10 6,5 15 9,4 10 6,4 16 0,8 10 5,3 16 0,8 8,3 9,6 18 ,3 37 ,5 1,8 m; 1,40 m 0,9 t (7.5) 1,1 d (6,5) − 3,98 sext et (6, 5) 0,8 t (7,5) 1,6 m; 1,60 m δH − − − − − 3,6 s − − − − − − 2,0 s 2,03 s 1,2 d (7,5) 2,9 sext et (6, 5) 28,3 12,3 17,5 212,4 46,6 13,6 130,6 PH6 δC 160,0 113,9 180,7 101,7 170,7 20,1 106,3 170,7 109,5 162,7 104,7 163,0 7,9 12,1 14,7 130,7 s s t (1 ,5) br.s 14 1,84 m; 1,39 m 0,92 t (7 ,5) 1,15 d (6,5) 5,75 qq (1,5, 7,5) 1,79 dq (1,0, 7,0) − 4,09 sext et (6,5) δH − − − − − 3,55 − − − − − − 1,98 1,93 1,89 − 28,2 12,3 17,2 212,6 47,1 13,8 133,1 PH13 δC 161,4 110,1 170,1 103,4 170,3 18,8 106,4 159,4 106,5 160,9 105,3 161,3 8,3 11,6 14,5 129,5 s s b r.s s 1,85 m ; 1,40 m 0,93 t (7,5) 1,16 d (6,5) 5,87 qq (1,5 , 7,0) 1,83 dq (1,0 , 7,0) − 3,98 sextet (6,5) δH − − − − − 3,66 − − − − − − 2,05 2,03 1,91 − 0,4 0,1 9,4 97,3 5,7 3,9 32,0 P H18 δC 60,5 07,8 67,3 02,1 68,5 7,6 03,6 154 ,6 01,1 60,5 07,4 63,1 ,4 1,4 4,5 28,2 4,36 dq (1 2, 0, 6,5) 1,25 d (7,0) 1,66 d (6,5 ) − 2,65 dq (12,0, 7,0) 1,79 dq (0,5, 7,0) 5,78 dq (1,5, 7,0) δH − − − − − 3,65 s − − − − − − 2,06 s 2,00 s 1,88 s − Bảng 3.10 Dữ liệu phổ dẫn xuất phloroglucinol PH10, PH19 , PH6, PH13 , PH18 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học 11 hợp chất phân lập từ Tu hùng tai * Hợp chất PH17: Stigmasterol dạng bột màu trắng Phổ HNMR cho thấy tín hiệu prot on olefin mạch hở dạng HC=CH δH 5,16 (dd, 1H, J = 15,5; 3,5 Hz, H-22) 5,02 (dd, 1H, J = 15,5; 9,0 Hz, H -23) tín hiệu đặc trưng cho proton liên kết đôi dạng >C=CH C5 C6 khung stigmastan δ H 5,35 (br.d, J = 4,5 Hz, H-6); tín hi ệu proton oxymethin δ H 3,51 (m, 1H, H-3), tín hiệu nhóm methyl bậc ba δ H 0,70 ( s, H3 -18) 1,03 (s, H3-19), nhóm methyl bậc hai δH 0,81 (d, J = 7,0 Hz, H3 -27), 0,84 (d, J = 7,0 Hz, H 3-26) 0,93 (d, J = 6,5 Hz, H3 -21) nhóm methyl bậc δH 0,85 (t , J = 7,5 Hz, H3 -29) Phổ 13 C-NMR thể tín hiệu 29 carbon, gồm carbon olefin t ại 15 δC 140,8 (C-5); 138,3 (C-22); 129,3 (C-23); 121,7 (C-6) ppm, car bon nhóm oxymethin δ C 71,9 (C-3) nhóm methyl Đối chiếu với ki ện phổ N MR chất tham khảo, hợp chất PH17 xác định stigmasterol 3.3 Kết nghiên cứu độc tính cấp tác dụng sinh học 3.3.1 Hoạt tính chống viêm 3.3.1.1 Sàng lọc hoạt tính chống viêm ức chế sản sinh NO cao chiết Mẫu thử nghiên cứu sàng lọc hoạt tính chống viêm cao chiết toàn phần MeOH (M) cao chiết phân đoạn n-hexan (H), diclorometan (D), ethyl acetat (E), nước (W) Trước thử tác dụng ức chế sản sinh NO, cao chiết đánh gi khả gây độc đến phát triển t ế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 nồng độ thử nghiệm 100 20 μg/mL Bảng 3.14 Khả ảnh hưởng đến sống tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 cao chiết Nồng độ (µg/mL) 100 20 M 49,61 110,57 H 46,34 107,09 % tế bào sống D E W 31,18 92,77 63,09 98,79 106,98 86,86 L-NMMA 89,77 95,72 Tại mứ c liều 20 µg/mL, tất mẫu cao chi ết khơng ảnh hư ởng đến phát triển bình thường đại thực bào chuột, tỉ lệ tế bào sống tương đối cao (86,86 - 110,57%) Tuy nhiên, l iều cao 100 µg/mL, cao chiết D, M H tương đối độc, có t ỉ lệ tế bào sống sót khoảng 31,18 - 49,61% Trong đó, cao chiết E có tỉ lệ t ế bào sống sót cao 92,77% Bảng 3.15 Kết ức chế sản si nh NO cao chiết Mẫu nghiên cứu IC 50 ± SD (µg/mL) Cao chiết methanol Cao chiết n-hexan Cao chiết dicloromethan 60,54 ± 2,66 ‒ 28,68 ± 1,49 Cao chiết ethyl acetat Cao chiết nước L-NMMA 25,28 ± 1,52 64,73 ± 1,84 6,22 ± 0,84 16 3.3.1.2 Hoạt t ính chống viêm hợp chất tinh khiết a Hoạt tính ức chế sản sinh N O Trước thử hoạt tính ức chế sản sinh NO, hợp chất đư ợc đánh giá khả gây độc đến phát t riển tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 nồng độ thử nghiệm 100 20 μg/mL Bảng 3.16 Khả ảnh hưởng đến sống tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 hợp chất % tế bào sốn g Nồng độ (µg/mL) Pogostemin A Pogostemin B Pogostemin C 100 21,55 95,4 28,9 20 42,94 99,1 71,3 Pogostemonon A Pogostemonon B Pogostemonon C 100 37,69 105,94 32,98 20 94,22 104,16 > 105 ,57 Pogostemon D Pogostemonon D Pogostem 100 37,54 104,75 40,73 20 89,48 102,16 > 104,99 Bảng 3.17 Kết ức chế sản sinh NO hợp chất t inh khiết Tên hợp chất IC5 ± SD IC50 ± SD (µM) (µg/mL) 15,66 ± 1,79 Pogostemin B 40,78 ± 4,66 1,49 ± 0,06 Pogostemin C 3,76 ± 0,15 12,06 ± 0,79 Pogostemonon A 28,99 ± 1,90 ‒ Pogostemonon B ‒ 11,14 ± 1,7 Pogostemonon C 26,77 ± 4,09 ‒ Pogostemonon D ‒ 3,02 ± 0,31 Pogostemon D 7,29 ± 0,74 ‒ Pogo stem ‒ 6,22 ± 0,84 L-NMMA 33,04 ± 4,46 Ở liều 100 µg/mL, mẫu t Pogostemin B, Pogostemonon B Pogost emonon D có tỉ lệ tế bào sống cao khoảng 95,4 - 105,94%, mẫu thử lại t ỉ 17 lệ tế bào thấp (< 50%) Tuy nhiên, mức liều 20 µg/mL, tỉ lệ tế bào sống sót tất mẫu thử tư ơng đối cao Kết ức chế sản sinh NO hợp chất tinh khiết đư ợc mô tả bảng 3.17 cho thấy hợp chất pogostemin C pogostemon D có khả ức chế mạnh với IC5 lần l ượt 3,76 ± 0,15và 7,29 ± 0,74 µM, mạnh nhiều so ng dương LNMMA điều kiện thử nghiệm Ngoài ra, mẫu thử khác Pogostemonon A Pogostemonon C thể hoạt tính tốt với IC khoảng 26,77 - 28,99 µM Các hợp chất lại cho ức chế sản sinh NO yếu chưa thể hoạt tính điều kiện thử nghiệm b Khả điều hoà cytokin Bảng 3.18 Khả điều hoà cytokin hợp chất Pogostemin C Nồng độ Hàm lượng cytokin (pg/mL) (µM) IL-10 IL-6 TNF-α 50,5 130,97 ± 17,31 384,85* ± 30,94 428,44* ± 51,09 10,1 232,77 ± 14,81 121,35 ± 18,02 534,07 ± 37,99 2,02 214,15 ± 13,08 111,06 ± 14,99 609,82 ± 56,38 0,404 209,97 ± 9,44 141,06 ± 18,36 632,17 ±49,84 Chứng 136,74 ± 8,65 218,81 ± 32,67 714,09 ± 57,29 âm Ghi chú: * Sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 Pogostemin C có tác dụng ức chế sản sinh NO tốt lựa chọn tiếp tục đánh giá khả điều hoà cytokin Pogost emin C có khả kích thích sản sinh IL-10 ức chế sản sinh TNF-α so với đối chứng không ủ mẫu mứ c có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) nồng độ 50,5 µM 3.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 3.3.2.1 Thử nghiệm gây độc tế bào Các hợp chất phân lập từ phân đoạn cao E đánh giá tác dụng gây độc tế bào - phương pháp sử dụng thuốc nhuộm SRB 18