ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG VÔ TÍNH BẠCH ĐÀN VÀ QUY TRÌNH NHÂN NHANH INVITRO MỘT SỐ DÒNG BẠCH ĐÀN ƯU TRỘI CỦA VƯỜN GIỐNG FORTIP VẠN XUÂN PHỤC VỤ SẢN XUẤT

TÓM TẮT Đề tài: “Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính Bạch đàn và quy trình nhân nhan in vitro một số dòng Bạch đàn ưu trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân phục vụ sản xuất” được thực h

BỘ CÔNG THƯƠNG TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM

VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY

………*………

BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI

CẤP BỘ NĂM 2008 TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG VÔ TÍNH BẠCH ĐÀN VÀ QUY TRÌNH NHÂN NHANH INVITRO MỘT SỐ DÒNG BẠCH ĐÀN ƯU TRỘI CỦA VƯỜN GIỐNG FORTIP

VẠN XUÂN PHỤC VỤ SẢN XUẤT

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ CÔNG THƯƠNG

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS PHẠM ĐỨC HUY

7116

17/02/2009

PHÚ THỌ, THÁNG 12/2008

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

HSNC: Hệ số nhân chồi TLCHH: Tỷ lệ chồi hữu hiệu

BAP: 6-Benzylaminopurine

NAA: 1-Naphtalene acetic acid

IBA: 3-Indolbutiric acid

1.2 Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.3 Địa điểm, đối tượng và nội dung nghiên cứu 4

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 7

2.1.3.1 Phương pháp cắt, rửa và khử trùng mẫu 11 2.1.3.2 Thử nghiệm và chọn môi trường cơ bản 11

2.1.3.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến HSNC và

2.1.3.4 Điều kiện thí nghiệm 13 2.1.3.5 Thu thập và xử lý số liệu 13

2.2 Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu 15

2.3.1.1 Điều tra chọn địa điểm và thu thập điều kiện tự nhiên của địa điểm thiết lập vườn giống 16

2.3.1.2 Thiết kế và trồng vườn giống 16

2.3.1.3 Sinh trưởng của các dòng ở 6 tháng tuổi 16

2.3.3.1 Nghiên cứu môi trường cơ bản thích hợp cho nhân nhanh chồi 21

2.3.3.2 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu

2.3.3.3 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu 26

2.3.3.4 Ảnh hưởng của BAP và IBA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu 30

TÓM TẮT

Đề tài: “Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính Bạch đàn và quy trình nhân nhan in vitro một số dòng Bạch đàn ưu trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân phục vụ sản xuất” được thực hiện trong 2 năm (2007 và 2008) Năm 2007,

đề tài đã chọn lọc được 20 cây trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân, thử nghiệm các phương pháp ghép và tạo được 400 cây ghép với cành ghép được lấy

từ 20 cây trội đã chọn lọc

Năm 2008, đề tài đã thực hiện 2 mục tiêu chính là xây dựng vườn giống

từ cây ghép của 20 dòng đã được chọn lọc và tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro cho 5 dòng ưu trội nhất từ 20 dòng đã chọn lọc

Vườn giống được trồng tháng 6 năm 2008, diện tích 1,0 ha tại Đội Ngọc

Mỹ - Công ty lâm nghiệp Lập Thạch – Vĩnh Phúc Các dòng cây ghép cho tỷ lệ sống cao, biến động từ 82-100% Đến nay sinh trưởng của các dòng cây ghép tương đối tốt và không bị sâu bệnh

Đề tài thực hiện các thử nghiệm nhân giống in vitro giai đoạn nhân chồi bao gồm: thử nghiệm môi trường cơ bản, nồng độ BAP, ảnh hưởng phối hợp của BAP + NAA và BAP + IBA Đề tài chọn được môi trường MS + 30g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP + 1.5 mg/l NAA, pH =6 là thích hợp nhất trong các môi trường đã thử nghiệm và cũng là môi trường phù hợp cho cả 5 dòng tiến hành nghiên cứu

I TỔNG QUAN

1.1 Cơ sở pháp lý của đề tài

- Căn cứ quyết định số 1999/QĐ-BCT, ngày 03/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Công nghiệp về việc giao kế hoạch khoa học và công nghệ năm 2008 cho Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

- Căn cứ hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số 45.08 RD/HĐ-KHCN, ngày 23/01/2008

- Căn cứ quyết định số 12/QĐ-KHTH, ngày 28/01/2007 của Viện trưởng Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy về việc giao nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ

- Căn cứ quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống và vườn giống (QPN 15 – 93) của Bộ Lâm nghiệp ngày 02/11/1993 (chi tiết xem phụ biểu 5)

1.2 Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài

1.2.1 Tính cấp thiết của đề tài

Ở nước ta hiện nay, cây Bạch đàn (Eucalyptus) là một trong những loài cây

trồng rừng chủ lực trên hầu hết các vùng sinh thái nhằm đáp ứng các nhu cầu nguyên liệu giấy, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ xẻ và củi Trong khoảng 10 năm trở lại đây, năng suất rừng trồng bạch đàn đã được cải thiện rõ rệt nhờ kết quả của các chương trình cải thiện giống

Giai đoạn từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on Forest Tree Improvement) về cải thiện giống cây rừng đã xây dựng 46 ha rừng giống và vườn giống cho các loài cây Bạch đàn, Keo lá tràm và Keo tai tượng với nguồn hạt được lấy từ các giống, xuất xứ triển vọng trong và ngoài nước Dự án cũng

đã xây dựng được nhiều vườn giống, rừng giống thế hệ 1 và thế hệ 1.5 đáp ứng nhu cầu giống cho nghiên cứu và sản xuất [3]

Vườn giống Bạch đàn tại Vạn Xuân, Phú Thọ gồm 144 gia đình được thiết lập năm 1996 là một trong những vườn giống có nhiều gia đình và cá thể có năng suất rất cao trong dự án FORTIP nói trên Đây là nguồn vật liệu quý cần để chọn lọc những dòng có năng suất cao từ đó nhân giống phục vụ trồng rừng và

xây dựng vườn giống cho phục phụ các chương trình nghiên cứu cải tạo giống tiếp theo

Đồng thời, để đạt được kết quả tốt thì một chương trình cải thiện giống không chỉ dừng lại ở chỗ có được những giống được cải thiện mà giống đó phải được nhân rộng phục vụ sản xuất và cung cấp vật liệu cho các chương trình cải thiện giống khác Do đó, yêu cầu cần thiết là xây dựng vườn giống từ các dòng

đã chọn lọc và tiến hành nhân giống vô tính phục vụ cho trồng rừng thử nghiệm

từ đó từng bước đưa cây giống chất lượng cao vào trồng rừng sản xuất

Trong xây dựng rừng giống, vườn giống, để tăng phẩm chất di truyền của hạt giống, người ta thiết lập vườn giống bằng cây ghép với cành ghép lấy từ cây tuyển chọn và gốc ghép là cây có sức chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của ngoại cảnh như khí hậu, đất đai, sâu bệnh vv Vườn giống trồng từ cây ghép có nhiều ưu điểm rõ rệt so với vườn giống trồng từ hạt như nhanh ra quả, duy trì các đặc tính di truyền của cây mẹ [12]

Về nhân giống vô tính, hiện nay ở nước ta thì nhân giống bằng phương

pháp nuôi cấy in vitro là phương pháp ưu thế nhất Đặc biệt trong nhân giống

cây bạch đàn nói riêng và cây lâm nghiệp nói chung thì đây là phương pháp cho hiệu quả rõ rệt nhất

Từ những đặc điểm trên, xây dựng vườn giống bằng cây ghép với cành ghép từ những cây ưu trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân và thử nghiệm

nhân giống in vitro là cần thiết Xây dựng vườn giống cung cấp nguồn hạt giống

cho khảo nghiệm chọn lọc giống mới và phục vụ lai tạo giống Thử nghiệm nhân

giống in vitro nhằm tạo cây con phục vụ khảo nghiệm dòng vô tính, công nhận

giống mới và phát triển vào sản xuất

1.2.2 Mục tiêu của đề tài

1) Xây dựng vườn giống từ cây ghép của các dòng bạch đàn năng suất cao tại vườn giống FORTIP Vạn Xuân

2) Xác định điều kiện nuôi cấy in vitro (môi trường hóa học) thích hợp để nhân

nhanh các dòng đã được chọn lọc tại vườn giống FORTIP Vạn Xuân phục

vụ sản xuất

1.3 Địa điểm, đối tượng và nội dung nghiên cứu

1.3.1 Địa điểm:

Vườn giống được thiết lập tại Đội Ngọc Mỹ - Công ty Lâm nghiệp Lập

Thạch với diện tích 1,0 ha Vườn vật liệu và thử nghiệm nhân giống in vitro tại

Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy

1.3.2 Đối tượng nghiên cứu

• Cây trồng vườn giống:

Vườn giống được trồng từ cây ghép với cành ghép lấy từ 20 cây trội được chọn lọc của vườn giống Vạn Xuân (20 cây trội đã được chọn năm 2007 của đề tài này chi tiết xem phụ biểu 1)

Cây ghép đem trồng là cây có vết ghép đã ổn định Sinh trưởng phát triển tốt, không sâu bệnh, tán lá phát triển cân đối, chiều cao > 50cm

• Cây thử nghiệm nuôi cấy in vitro:

Từ 20 cây trội đã chọn lọc, đề tài lựa chọn 5 cây có thể tích thân cây cao

nhất làm đối tượng để tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro, cụ thể là các cây

trội sau: Cây trội số 154, 141, 122, 136 và 126 (đặc điểm cụ thể của 5 cây trội

thử nghiệm nhân giống in vitro xem phụ biểu 1)

1.3.3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:

1 Điều tra chọn địa điểm thiết lập vườn giống

2 Thu thập điều kiện tự nhiên, đất đai của địa điểm thiết lập vườn giống

3 Thiết kế và trồng vườn giống

4 Trồng và chăm sóc vườn vật liệu phục vụ cho nuôi cấy in vitro

5 Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro

6 Thu thập các chỉ tiêu nghiên cứu, xử lý số liệu và viết báo cáo khoa học

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu

1.4.1 Trong nước

Ở Việt Nam, từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on Forest Tree Improvement) về cải thiện giống cây rừng đã xây dựng 46 ha rừng giống và vườn giống cho các loài cây Keo lá tràm, Keo tai tượng và Bạch đàn với nguồn hạt được lấy từ các xuất xứ tốt trong và ngoài nước Các gia đình trồng trong vườn giống theo khối, lặp lại 8 lần Sau đó đánh giá sinh trưởng và giữ lại những gia đình tốt nhất có triển vọng [3]

Ngoài diện tích rừng giống trên, hiện nay nước ta chiếm đa số là các rừng giống được chuyển hoá từ rừng tự nhiên hoặc rừng trồng, nên phẩm chất di truyền của hạt giống còn thấp Chúng ta có khoảng 2.000 ha rừng giống và vườn giống các loại như Thông 3 lá ở Lâm Đồng, Thông Nhựa ở Quảng Bình, Tếch ở Định Quán, Keo và Bạch đàn ở Vùng Trung tâm Bắc bộ

Vấn đề xây dựng rừng giống đã được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy quan tâm từ lâu, năm 1996 Viện đã chuyển hoá được 10,3 ha rừng giống từ rừng trồng với nguồn hạt nhập nội Hiện nay, rừng giống chuyển hoá này đã cho hiệu quả kinh tế rõ rệt, rừng trồng từ nguồn hạt này cho năng suất và chất lượng rừng tăng lên rõ rệt

Trong những năm gần đây, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã xây dựng vườn giống Bạch đàn ghép tại Ba

Vì phục vụ cho công tác lai tạo Đây cũng là một trong số rất ít vườn giống cây lâm nghiệp được trồng bằng cây nghép ở nước ta [3]

Đối với lĩnh vực nhân giống in vitro, mặc dù còn nhiều khó khăn cần giải quyết, song trong những năm gần đây, việc áp dụng các biện pháp nhân giống in

vitro vào nghiên cứu và thực tiễn sản xuất trong lâm nghiệp đã thu được kết qủa

đáng khích lệ Một số cơ sở đã tiến hành nhân giống in vitro ở quy mô công

nghiệp như Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy – Phù Ninh – Phú Thọ, Lâm trường thực nghiệm Yên Lập – Quảng Ninh, Công ty Giống cây Lâm nghiệp Trung ương, …vv Đồng thời, một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng

nuôi cấy in vitro để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã có những thành

công bước đầu

Một số loài cây trồng rừng quan trọng, một số loài cây quý hiếm đã được

nghiên cứu và sản xuất Cây Bạch đàn (Eucalyptus), cây Tếch (Techtona

grandis), cây Hông (Paulownia fortunei) đã được Viện nghiên cứu cây nguyên

liệu giấy Phù Ninh sản xuất ở quy mô công nghiệp; cây Keo lai (A mangium x

A auriculiformis) cây Trầm gió (Aquilaria crassna Pierri), cây tre Tàu

(sinocalamus latiflus), tre Mạnh tông (Dendrocalamus asper) và nhiều loài cây

khác đã nghiên cứu thành công Các kết quả này cho thấy bước đầu có nhiều triển vọng cho sản xuất cây con giống chất lượng cao

Mai Đình Hồng, 1995 đã đưa ra môi trường nuôi cấy in vitro cây bạch đàn

urô dòng U6 như sau: môi trường nhân chồi là MS + 3% đường + 4.5 g/l agar + 0.5 mg/l BAP + 0.25 mg/l NAA Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh là MS 1/4 nồng độ + 1.5 % đường + 5 g/l agar + 1 mg/l IBA [2]

Nhóm tác giả của Viện Sinh học nhiệt đới, Sở NN&PTNT Kiên Giang và Trường Đại học Nông lâm Tp.HCM đã nghiên cứu và đưa ra môi trường nuôi

cấy cây Trầm hương (Aquilaria crassna) là WPM + 0.1 mg/l BA + CW (10%)

cho phát sinh chồi Môi trường thuận lợi cho tạo chồi và nhân nhanh chồi là WPM + BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) [7]

Cũng với cây trầm, Đoàn Thị Mai và cộng sự đã đưa ra môi trường nhân chồi thích hợp là MS cải tiến bổ sung 1.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l kinetin Môi trường ra rễ thích hợp nhất là 1/2 MS cải tiến bổ sung 2.0 mg/l IBA [5]

Nhân giống in vitro cây Tre tàu (Sinocalamus latiflorus) và tre Mạnh tông (Dendrocalamus asper) với mẫu vật được lấy từ hạt và được khử trùng bằng

hypoclorit canxi trong 15 phút, HgCr2 trong 5 phút Qua nhiều công thức thí nghiệm, nghiên cứu thu được kết quả sau: Tạo chồi từ hạt tốt trên môi trường

MS có BA 3 mg/l và Kinetin 1 mg/l; nhân chồi tốt trên môi trường MS có BA 2mg/l và kinetin 1 mg/l; chồi, cây con ra rễ và sinh trưởng thành cây hoàn chỉnh tốt trên môi trường có nồng độ khoáng MS giảm 1/2 và IBA 10 mg/l [10]

Nhân giống vô tính cây Hông (Paulownia fortunei) bằng phương pháp

nuôi cấy mô Mẫu nuôi cấy tạo vật liệu ban đầu từ chồi đỉnh và chồi bên Mẫu vật được khử trùng bằng hypoclorit canxi trong 20 phút sau đó cấy vào các loại môi trường khác nhau Kết quả thu được như sau: môi trường thích hợp nhất cho tạo chồi và nhân nhanh chồi là MS cải tiến có bổ sung 30 g/l đường, 8 g/l agar, 5

mg/l BA và 0.1 mg/l NAA Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh tối ưu là 1/2 dinh dưỡng khoáng MS + 20g/l đường + 0.1 mg/l NAA + 1.0 g/l than hoạt tính [13]

1.4.2 Ngoài nước

Ở các nước có nền lâm nghiệp phát triển, mạng lưới cung ứng giống được xây dựng khá hoàn chỉnh Mỗi địa phương đều có rừng giống và vườn giống cung cấp nguồn hạt giống, vật liệu nhân giống cho địa phương đó Do vậy chủ động nguồn giống cho các chương trình trồng rừng của khu vực

Ngoài vườn giống lấy hạt, một số nước còn thiết lập vườn giống nghiên cứu hay còn gọi là ngân hàng dòng (clone banks) với mục đích là lưu giữ và bảo tồn các giống đã tuyển chọn phục vụ cho các chương trình cải thiện giống dài hạn nhằm sản xuất một lượng lớn hạt giống từ những dòng ưu tú đã chọn lọc

Trong lĩnh vực nhân giống in vitro, môi trường hóa học dùng cho các loài

cây thân gỗ rất đa dạng, tuy nhiên người ta thường sử dụng 5 loại môi trường sau[14]:

™ Môi trường khoáng MS (Murashige & Skoog, 1962) là môi trường cơ bản,

giàu dinh dưỡng thích hợp cho các loài thực vật nói chung Môi trường này không chỉ đơn thuần sử dụng trong nuôi cấy mô mà nó còn được sử dụng trong nuôi cấy tế bào, nuôi cấy phôi vô tính, nuôi cấy hạt phấn, bao phấn…vv

™ Môi trường MS cải tiến (Murashige & Skoog medium including Nitsch

vitamins, 1969) Đây là môi trường MS (1962) được bổ sung thêm một số loại vitamin Thành phần môi trường được nghiên cứu và công bố bởi Nitsch năm 1969, môi trường này được sử dụng để nuôi cấy nhiều loài cây

khác nhau trong đó có cây mận (Prunus spp), cây ôliu (Olea

europaea)…vv

™ Môi trường WPM (Woody Plant Medium) được Mccown đưa ra vào năm

1980 là môi trường thường được dùng để nuôi cấy các loài cây gỗ Đã có

nhiều công trình nuôi cấy in vitro sử dụng môi trường này như nhân giống thông (Loblolly pine, Pinus taeda) ở Mỹ

™ Môi trường Litvay là môi trường mà tên môi trường được lấy từ tên tác

giả nghiên cứu ra (Litvay J.D, 1985) Đây cũng là môi trường được tác giả

sử dụng để nuôi cấy cây thông nói chung (Pinus)

™ Môi trường WV3 (Westvaco3 Medium, 1997) là môi trường đã được sử

dụng để nuôi cấy cây thông, cây dương

lai (P caribaea x P elliottii) ở Ôxtrâylia,…vv

Công trình của M.E.cortezzi Graca và S.Mendes thuộc Trung tâm nghiên

cứu lâm nghiệp Curitiba, Brazil đã nuôi cấy in vitro cây Bạch đàn (Eucalyptus

dunnii Maid) tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BAP + 0,01 mg/l

IBA[16]

I Joihs và cộng sự của Viện nghiên cứu lâm nghiệp Ấn Độ đã nuôi cấy

thành công cây Bạch đàn lai (E.terecornis x E.gandis) trên môi trường MS +

BAB 1,0mg/l và NAA 1,0 mg/l[15]

c) Trồng và chăm sóc vườn giống

Thường xuyên kiểm tra, theo dõi và cắt tỉa các chồi phát sinh ở phần gốc ghép Chăm sóc năm 1 (năm 2008) 3 lần, cụ thể như sau:

Lần 1: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích, rẫy cỏ và xới vun

đất màu xung quanh gốc với đường kính từ 0,5 – 0,6m Tiếp tục trồng dặm cây chết, thời gian chăm sóc từ 1-1,5 tháng, thời gian chăm sóc vào tháng 5-6

Lần 2: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích, rẫy cỏ và xới vun

đất màu xung quanh gốc với đường kính từ 0,6 – 0,8m Thời gian chăm sóc vào tháng 8-10 Bón thúc 500gam phân NPK

Lần 3: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích

™ Theo dõi, thu thập số liệu của vườn giống

Theo dõi thu thập các chỉ tiêu Hvn; Hg; Dt; sâu bệnh và phẩm chất cây: tốt, xấu, trung bình

- Cây tốt: là cây sinh trưởng tốt, tán lá xanh đẹp, phát triển cân đối, không sâu bệnh

- Cây trung bình: là cây sinh trưởng phát triển ở mức độ trung bình, không sâu bệnh

- Cây xấu: là cây sinh trưởng kém, còi cọc, sâu bệnh

2.1.2 Trồng và chăm sóc vườn vật liệu

Vườn vật liệu được trồng từ cây ghép của 5 cây trội chọn lọc Cây được trồng ra đất theo luống, giữa các luống cách nhau 0,5m Cây được trồng theo hàng trên luống với cự ly 25 x 25cm, mỗi giống trồng 20 cây

Trước khi trồng làm đất toàn diện và nhặt sạch cỏ, khi trồng bón lót 100g phân NPK cho mỗi hố Vườn vật liệu được tưới chăm sóc và rẫy nhổ cỏ và cắt tỉa tạo chồi thường xuyên nhằm cung cấp nguồn vật liệu tốt nhất cho nhân giống

in vitro

2.1.3 Thử nghiệm nhân giống in vitro

Sơ đồ chung của phương pháp nhân giống in vitro

Cây trội (đối tượng cần nhân giống)

Xử lý cho nảy chồi và cắt mẫu

Khử trùng mẫu nuôi cấy

Cấy mẫu vào Môi trường tái sinh chồi (giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu)

5 loại môi trường khác nhau để tìm ra môi trường thích hợp nhất Nuôi mẫu trong tủ lạnh

Tăng tỷ lệ sống của mẫu nuôi cấy

Môi trường nhân nhanh chồi

Môi trường được bổ sung auxin, cytokinin, các chất đa lượng, vi lượng và vitamin với tỷ lệ khác nhau nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi

Nội dung cụ thể của phương pháp như sau:

2.1.3.1 Phương pháp cắt, rửa và khử trùng mẫu cấy

• Cắt mẫu

Mẫu nuôi cấy (explant) lấy từ chồi bên của cây cấp dòng Mẫu được lấy ở chồi từ 30-40 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, cắt bỏ phần ngọn non, toàn bộ phiến lá và gần hết phần cuống lá (cuống lá được cắt sát với chồi) Mẫu cấy có chiều dài từ 1.5-3.0 cm, đường kính mẫu cấy từ 1-2 mm, mang từ 2-3 nách lá trong đoạn từ lá thứ 3 đến lá thứ 6

2.1.3.2 Thử nghiệm và chọn môi trường cơ bản

Đề tài tiến hành cấy mẫu đã được khử trùng vào ống nghiệm chứa 5 loại môi trường sau có bổ sung sucrose 30g/l; 4.5g/l agar, 2.0mg/l vitamin B2, pH=6

và không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (thành phần 5 loại môi trường xem phụ biểu 2)[14]

1 Công thức 1: Môi trường Litvay

2 Công thức 2: Môi trường MS

3 Công thức 3: Môi trường MS cải tiến

4 Công thức 4: Môi trường WPM

5 Công thức 5: Môi trường WV3

6 Công thức 6: Đối chứng (môi trường nuôi cấy dòng PN14 không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng)[8]

2.1.3.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến HSNC và TLCHH

Các chất điều hoà sinh trưởng tuy chiếm hàm lượng rất nhỏ trong môi trường nuôi cấy nhưng có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của quá

trình nhân giống Trong môi trường nhân giống in vitro người ta thường sử dụng

các chất kích thích sinh trưởng trong nhóm auxin như NAA và IBA Các chất trongvà cytokinin Auxin được sử dụng để điều chỉnh sự phát sinh rễ Cytokinin

sử dụng để điều chỉnh sự phát sinh chồi Tỷ lệ cân đối giữa auxin/cytokinin tạo

cây hoàn chỉnh [1] Trong nhân giống in vitro, người ta thường sử dụng auxin là

IAA, NAA và IBA, cytokinin là BAP, BA và kinetin

• Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu

Từ môi trường cho HSNC tốt nhất ở các thí nghiệm về ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến HSNC (MS + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2, pH=6) chúng tôi tiến hành bổ sung BAP ở mức các nồng độ thay đổi như sau:

Công thức 12: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14)

• Ảnh hưởng phôi hợp của BAP và NAA đến HSNC và TLCHH

Để tìm hiểu ảnh hưởng của auxin đến quá trình phát sinh chồi trong sự tương tác với BAP và cũng là để tìm ra môi trường thích hợp cho nhân chồi 5 dòng nghiên cứu, đề tài tiến hành bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau vào môi trường MS + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l BAP, pH=6 (môi trường cho HSNC và TLCHH cao nhất ở thí nghiệm trên) Nồng độ NAA trong môi trường thay đổi như sau:

• Ảnh hưởng phôi hợp của BAP và IBA đến HSNC và TLCHH

Song song với việc nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA, đến HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu Đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của BAB và IBA đến hiệu quả của quá trình nhân nhanh chồi Môi trường WPM + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l BAP,

pH=6 được bổ sung IBA ở mức các nồng độ (mg/l) thay đổi như sau:

Công thức 24: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14)

2.1.3.4 Điều kiện thí nghiệm

™ Sau khi cấy mẫu được duy trì trong tủ lạnh (ngăn mát 120C±1) 48 giờ

™ Quá trình nuôi cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện ánh

sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau:

- Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn nêon với cường độ ánh từ

1000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày

- Nhiệt độ: duy trì nhiệt độ trong phòng từ 23 – 270C

- Độ ẩm: thường xuyên xấp xỉ 60%

™ Các thí nghiệm chọn loại môi trường cơ bản, mỗi công thức theo dõi 60 mẫu sống (ống nghiệm) Vì giai đoạn này tỷ lệ chồi hữu hiệu chưa thể hiện

rõ nên đề tài chỉ đánh giá kết quả qua HSNC sau 4 tuần nuôi cấy

™ Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo dõi

10 bình, mỗi bình 6 chồi nuôi cấy Môi trường chứa trong bình tam giác Đánh giá kết quả qua HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy

™ Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại, mỗi lần 60 mẫu

2.1.3.5 Thu thập và xử lý số liệu

™ Thu thập các chỉ tiêu

- Số chồi mới tạo thành

- Số chồi hữu hiệu: Những chồi có chiều cao từ 1,0 cm trở lên, thân, lá

và ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus Ghi tình trạng phát triển của chồi ở cả hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ bao gồm: hình thái của chồi, những chồi chết, chồi bị đen

∑ Chồi tạo thành HSNC (lần) = -

∑ Chồi ban đầu

∑ Chồi hữu hiệu TLCHH (%) = - x 100

Kết quả thực nghiệm cho thấy, các dòng có sinh trưởng và phát triển (HSNC và TLCHH) đồng gần như nhau ở cùng một môi trường cơ bản hoặc nồng độ chất điều hòa sinh trưởng nên đề tài phân tích ảnh hưởng của môi trường hoặc nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến 5 dòng

Để tiến hành phân tích phương sai, trước hết cần kiểm tra các mẫu có nằm trong một tổng thể hay không nói cách khác phương sai tổng thể bằng nhau là điều kiện cần và đủ để tiến hành phân tích phương sai một nhân tố Khi giá trị Sig trong bảng Test of Homogeneity of Variances >0,05 điều này có nghĩa phương sai tổng thể bằng nhau và ngược lại

Nếu phương sai tổng thể không bằng nhau, chúng tôi sẽ tiến hành kiểm tra

sự sai khác về tỷ lệ sống của cành ghép qua tiêu chuẩn LSD Các công thức có

sự sai khác được đánh dấu (*), còn lại là không sai khác

- Phân tích phương sai một nhân tố (Anova)

Giả thuyết Ho: Không có sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh (chỉ tiêu so sánh

đồng đều ở các nhân tố kiểm tra)

Giả thuyết H 1: Có sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh (chỉ tiêu so sánh có sự khác nhau rõ rệt về mặt thống kê)

+ Trong bảng ANOVA, Nếu giá trị Sig của F thu được >0,05 thì chấp nhận

H0 (Không có sự sai khác)

+ Trong bảng ANOVA, nếu giá trị Sig của F <0,05 thì chấp nhận H1 (Sai khác rõ rệt về mặt thống kê)

- Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan

Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm ảnh hưởng của các nhân tố đến kết quả nghiên cứu Trong bảng phân nhóm Duncan, chỉ tiêu so sánh được chia thành các nhóm khác nhau Giữa các nhóm có sự sai khác nhau rõ rệt, trong cùng một nhóm không có sự sai khác

Khi sử dụng phương pháp phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan có thể có nhiều đối tượng so sánh ở cùng một cấp, điều này có nghĩa chỉ tiêu so sánh nằm

ở giữa 2 cấp Nếu có nhiều đối tượng có giá trị so sánh cùng ở 2 cấp chứng tỏ chỉ tiêu so sánh phân cấp không nhiều (nói các khác là ảnh hưởng của các nhân tố kiểm tra không lớn)

2.2 Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu

- Panh, kéo nuôi cấy mô

- Thước đo chiều cao, thước đo đường kính, địa bàn

- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô và các trang thiết bị phụ trợ khác

2.3 Kết quả thực nghiệm và thảo luận

2.3.1 Trồng vườn giống

2.3.1.1 Điều tra chọn địa điểm thiết lập vườn giống và thu thập điều kiện

tự nhiên của địa điểm thiết lập vườn giống

Thuộc xã Hợp Lý, huyện Lập Thạch, tỉnh Vĩnh Phúc Ở độ cao 100m so với mực nước biển, độ dốc bình quân 120, hướng phơi Tây Bắc Đất Feralit vàng

đỏ phát triển trên đá mẹ phiến sạn kết Độ sâu tầng đất từ 30-80cm, thành phần

cơ giới thịt trung bình, hơi chặt, tỷ lệ đá lẫn từ 10-15% Thực bì chủ yếu là sim, mua, chiều cao bình quân <1,0cm, độ che phủ bình quân <30% Lượng mưa bình quân năm từ 1600-1700mm, nhiệt độ bình quân năm 230C Hàng năm xuất hiện sương hại từ tháng 11 năm trước đến tháng 3 năm sau Trồng rừng trên đất sau khai thác bạch đàn

Đề tài đã tiến hành đào và mô tả phẫu diện đất, kết quả mô tả phẫu diện đất được thể hiện ở phụ biểu 4

Ở khu vực này cây Bạch đàn nói chung cũng như Bạch đàn urophylla sinh trưởng phát triển tốt Địa điểm trồng vườn giống có độ dốc nhỏ, và có cách ly với rừng trồng Bạch đàn Ở đây cũng chưa từng xảy ra sâu bệnh hại rừng trồng Bạch đàn ở mức độ nguy hiểm Đồng thời đất rừng thuộc sự quản lý của Công ty lâm nghiệp Lập Thạch thuộc quy hoạch vùng nguyên liệu của Công ty giấy Bãi Bằng nên thuận lợi cho việc quản lý, bảo vệ và duy trì vườn giống lâu dài Do vậy, đây là địa điểm tốt để thực hiện xây dựng vườn giống của đề tài

2.3.1.2 Thiết kế và trồng vườn giống

Kết hợp với Công ty thiết kế lâm nghiệp, đề tài đã xây dựng hồ sơ thiết kế

và trồng vườn giống theo đúng quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống, vườn giống của Bộ NN&PTNT Sơ đồ bố trí các dòng trồng tại vườn giống thể hiện tại phụ biểu 3

2.3.1.3 Sinh trưởng của các dòng

Vườn giống được trồng giữa tháng 6/2008, đến đầu tháng 12/2008 đề tài tiến hành đo đếm các chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển Kết quả sinh trưởng và phát triển của các dòng cây ghép ở 6 tháng tuổi như sau:

a) Tỷ lệ sống

Tỷ lệ sống phản ánh sự thích ứng của điều kiện lập địa và khí hậu đối với cây trồng [9] Lập Thạch là nơi thích hợp cho trồng rừng Bạch đàn đồng thời cây ghép được trồng có bầu to (Φ14cm) Cây đem trồng đủ tiêu chuẩn, sinh trưởng và phát triển tốt nên ở tất cả các dòng , khi đem trồng cây sinh trưởng, phát triển tốt nên hầu hết cây trồng đều sống 100% Tuy nhiên do vết ghép yếu nên một số cây

bị gãy ở phần ghép do gió bão hoặc sự va quyệt của gia súc nên tỷ lệ sống biến đổi từ 82-100% Kết quả tỷ lệ sống của các dòng được thể hiện ở bảng 02

Tỷ lệ sống có sự khác nhau giữa các dòng nhưng không phải do bản chất

di truyền của cây mà do các tác động cơ học nên sự khác nhau về tỷ lệ sống không có ý nghĩa nhiều về sự thích ứng của cây trồng đối với điều kiện lập địa

b) Sinh trưởng chiều cao vút ngọn

Hvn là yếu tố quan trọng để đánh giá năng suất sinh khối của cây trồng Đối với cây lấy gỗ thì Hvn không những thể hiện năng suất mà còn thể hiện chất lượng gỗ Bảng 02 cho thấy chiều cao vút ngọn của các dòng cây ghép có sự khác nhau không nhiều Hvn trung bình cao nhất là dòng số 14 với 1.93m, sau đó đến dòng số 5 với 1.87m và thấp nhất là dòng số 6 với 1.5m

Để kiểm tra sự sai khác về mặt thống kê, đề tài phân tích phương sai một nhân tố Bảng 01 cho thấy sinh trưởng hvn giữa các dòng không có khác nhau rõ rệt vì giá trị Sig >0.05

c) Sinh trưởng đường kính phía trên vị trí ghép

Cùng với sinh trưởng chiều cao, đường kính ở thân cây có yếu tố quyết định đến năng suất và chất lượng gỗ Bạch đàn Trong trường hợp này thì đường kính phía trên vị trí ngoài việc cho thấy sinh trưởng đường kính của cây mẹ, còn cho thấy khả năng tương thích giữa cành ghép và gốc ghép

Bảng 02 cho thấy Dg bình quân của các dòng là 1.9cm, giữa các dòng có

sự khác nhau không nhiều, chỉ tiêu này biến động từ 1.5 - 2.4cm Trong đó, cao nhất là dòng số 4 với Dg=2.4cm và thấp nhất là dòng số 1 với Dg = 1.53 cm Chỉ tiêu này không có sự sai khác về mặt thống kê

d) Sinh trưởng đường kính tán

Sinh trưởng Dt thể hiện khả năng sử dụng không gian dinh dưỡng của cây trồng (gồm cả phía trên mặt đất và hệ rễ dưới mặt đất) Đối với rừng giống và vườn giống từ cây ghép thì đường kính tán ảnh hưởng rõ rệt đến sản lượng và chất lượng hạt giống

Dt của các dòng nói chung khá cao (1.1m) và giữa các dòng có sự biến động mạnh Cao nhất là dòng 13 và dòng 7 với Dt là 1.34m; thấp nhất là dòng 19 với Dt là 0.87m Tuy nhiên sự khác nhau này cũng không có ý nghĩa về mặt thống kê toán học

Tóm lại: Sinh trưởng của các dòng cây ghép không có sự sai khác rõ rệt

về cả Hvn, Dg và Dt Có thể tại thời điểm đo đếm vườn giống mới ở 6 tháng tuổi nên các chỉ tiêu này chưa được thể hiện một các rõ ràng Tại thời điểm này, vườn giống chưa có hiện tượng sâu bệnh hại

Bảng 02: So sánh phương sai của các chỉ tiêu sinh trưởng

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 3.438 19 181 1.007 455 Within Groups 33.603 187 180

Hvn (m)

Total 37.041 206 Between Groups 9.589 19 505 830 670 Within Groups 113.739 187 608

Dg (cm)

Total 123.329 206 Between Groups 2.791 19 147 1.356 154 Within Groups 20.258 187 108

Dt (m)

Total 23.049 206

Bảng 01 Sinh trưởng và tỷ lệ sống của các dòng ở 6 tháng tuồi

Cây sau khi ghép Cây ghép 6 tháng tuổi tại vườn giống

Ảnh 1: Cây sau khi ghép và cây ghép trồng tại vườn giống

Cây ghép 6 tháng tuổi tại vườn giống Vị trí ghép

Ảnh 2: Cây ghép trồng tại vườn giống và vị trí ghép

2.3.2 Trồng vườn vật liệu

Vườn vật liệu được trồng từ cây ghép của 5 cây trội chọn lọc Cây được trồng ra đất theo luống, giữa các luống cách nhau 0,5m Cây được trồng theo hàng trên luống với cự ly 25 x 25cm Mỗi cây trội trồng 20 cây ghép theo đúng phương pháp và kỹ thuật đề ra

2.3.3 Thử nghiệm nuôi cấy in vitro

2.3.3.1 Nghiên cứu môi trường cơ bản thích hợp cho nhân nhanh chồi

Để một nghiên cứu về nhân giống in vitro thành công thì một trong những

giai đoạn quan trọng trước hết là xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho đối tượng cần nhân giống Điều này phụ thuộc trước hết vào thành phần và nồng độ chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy [1] Giai đoạn này nhằm tìm được môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi, giai đoạn có vai trò quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân giống

Đề tài thử nghiệm 5 loại môi trường bổ sung 30g/l sucrose + 4.5 g/l agar +

2.0 mg/l vitamin B2, pH=6 thường được sử dụng để nhân giống các loài cây thân

gỗ để tìm môi trường thích hợp cho các dòng nghiên cứu Ở đây, đề tài bổ sung 2.0 mg/l vitamin B2 vì đây là vitamin quan trọng trong nuôi cấy các loài bạch đàn nói chung và thường được sử dụng với nồng độ 2.0mg/l

Do môi trường cơ bản chưa được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng nên

đề tài chỉ đánh giá qua HSNC Đồng thời môi trường đối chứng ở đây đề tài cũng sử dụng môi trường nuôi cấy của dòng PN14 không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Kết quả được trình bày ở bảng 03 và biểu đồ 01

Bảng 03 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến HSNC của 5

dòng nghiên cứu

HSNC (lần) Stt Môi

MS cải tiến Đối chứng

Bảng 03 cho thấy, môi trường MS cho HSNC cao nhất ở cả 5 dòng nghiên cứu (dòng 154 là 1.12%; dòng 141 là 1.06; dòng 122 là 1.03%; dòng 136 là 1.16% và 1.21% với dòng 126) Sau môi trường MS thì môi trường đối chứng cho HSNC cao thứ 2, tiếp đó là môi trường MS cải tiến, Litvay, WPM và cuối cùng là WV3 Điều này được thể hiện rõ hơn ở biểu đồ 01

Môi trường khoáng MS là môi trường giàu dinh dưỡng được sử dụng để nuôi cấy các loài thực vật nói chung và thích hợp cho nhiều loài khác nhau Môi trường này không những được sử dụng trong nuôi cấy chồi mà còn được sử dùng trong nuôi cấy tế bào lát mỏng, tế bào đơn, nuôi cấy phôi…vv [10] Điều này cúng phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu về nuôi cấy bạch đàn trong và ngoài

nước Để kiểm tra xem sự khác biệt về HSNC thu được, đề tài tiến hành phân tích phương sai một nhân tố kết quả thu được như sau:

Kết quả ở bảng phân tích phương sai (phụ biểu 5.1) cho thấy giá trị Sig của

F < 0.05 rất nhiều Do đó, HSNC ở các môi trường nuôi cấy đã có sự sai khác rõ rệt về mặt thống kê

Để xác định môi trường cho HSNC nhân chồi cao nhất, đề tài tiến hành phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan, kết quả thu được như sau

Bảng 04: Phân nhóm về ảnh hưởng của môi trường đến HSNC

HSNC

Subset for alpha = 0.05

WV3 15 9227 Litvay 15 9493 WPM 15 9787 9787

môi trường đối chứng (1,06 lần) nên đề tài chọn môi trường MS có bổ sung

30g/l sucrose + 4.5 g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2, pH=6 cho các thử nghiệm

tiếp theo

2.3.3.2 Ảnh hưởng của BAP đến HSNC VÀ TLCHH

Hầu hết các công trình nghiên cứu về nuôi cấy in vitro đã chỉ ra rằng chất

điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng, quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân giống Cụ thể nó quyết định đến HSNC, tốc độ nhân nhanh chồi và TLCHH Đề tài sử dụng các chất điều hoà sinh trưởng trong nhóm auxin có NAA và IBA, nhóm cytokinin là BAP

BAP là một cytokinin có tác dụng kích thích tạo chồi mạnh và được sử dụng rộng rãi trong các môi trường tạo chồi và nhân chồi BAP gần như là một

chất không thể thay thế trong quá trình nuôi cấy in vitro các loài thực vật Ảnh

hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu được tổng hợp ở bảng 05

Bảng 05 cho thấy, nồng độ BAP có ảnh hưởng mạnh và tích cực đến quá trình phát sinh chồi và sinh trưởng chiều cao của chồi nuôi cấy Khi tăng nồng

độ từ 0.5 mg/l đến 1.5 mg/l khả năng đẻ nhánh của chồi tăng lên rõ rệt Khi tiếp tục tăng nồng độ của BAP tới 2.0 và 2.5 mg/l thì hiệu quả nhân chồi giảm Lúc này xuất hiện những chồi nhỏ, mảnh, mướt, chồi hình thành không rõ rệt thân, lá

và ngọn, những chồi này không có tác dụng cho những lần nhân chồi tiếp theo cũng như cấy tạo rễ nên không được đo đếm Nhiều chồi cấy hình thành khối callus to ở gốc Như vậy, nồng độ BAP cao đã ức chế sinh trưởng và phát triển của chồi

Nồng độ BAP ở mức 1.5mg/l cho HSNC và TLCHH cao nhất cho cả 5 dòng thí nghiệm HSNC và TLCHH của 5 dòng là 1.83 lần và 22.8% với dòng 154; 1.8 lần và 21.3% với dòng 141; dòng 122 là 1.95 lần và 20.8%; dòng 136 là 2.02 lần và 20.1%; với dòng 126 là 1.98 lần và 19.9%

HSNC và TLCHH của môi trường có bổ sung BAP 1.5mg/l vẫn thấp hơn môi trường đối chứng Đặc biệt là TLCHH của môi trường tốt nhất này vẫn thấp hơn môi trường đối chứng rất nhiều Như vậy, chỉ riêng BAP cho HSNC và

TLCHH chưa cao, chưa đáp ứng được yêu cầu nhân nhanh in vitro các dòng

nghiên cứu

Bảng 05 Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH Dòng 154 Dòng 141 Dòng 122 Dòng 136 Dòng 126 Nồng

Biểu đồ 02b: Ảnh hưởng của BAP đến TLCHH của 5 dòng

Bạch đàn

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

Nhằm xác định những khác biệt trên có thực sự khác nhau về mặt thống kê toán học hay không, đề tài tiến hành phân tích phương sai về ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của các dòng nghiên cứu Phụ biểu 5.2 cho

thấy, HSNC và TLCHH ở môi trường nuôi cấy có bổ sung các nồng độ BAP có

Như vậy, nồng độ BAP thích hợp cho nhân nhanh hai 5 dòng là 1.5 mg/l

Do vậy, đề tài sử dụng môi trường MS + 30g/l sucrose + 4.5 g/l agar + 2.0 mg/l

vitamin B2 + 1.5 mg/l BAP, pH=6 cho các thí nghiệm nhân nhanh chồi tiếp

theo

2.3.3.3 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến HSNC VÀ TLCHH

Trong đời sống thực vật, tỉ lệ auxin/cytokinin có vai trò quan trọng trong

sự biệt hóa cơ quan và quyết định sự sinh trưởng, phát triển của cây Nhiều

nghiên cứu đã chứng minh rằng tổ hợp giữa auxin và cytokinin hầu hết đều cho

hiệu quả tốt hơn sự tác động riêng rẽ của cytokinin trong nuôi cấy in vitro

NAA là chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thường có tác dụng mạnh hơn

so với IAA ở đa số các loài thực vật (IAA là chất điều hoà sinh trưởng tự nhiên) NAA có tác dụng kích thích tế bào phát triển theo chiều ngang Nhiều nghiên cứu đã sử dụng NAA kết hợp với cytokinin trong giai đoạn nhân chồi Thông thường NAA được sử dụng với nồng độ từ 0.5 đến 3.0 mg/l cho nhân chồi

Để tìm ra môi trường nhân nhanh chồi thích hợp, đề tài bổ sung NAA với các nồng độ thay đổi vào môi trường MS + 30g/l đường sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP, pH=6 Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 07 và đồ thị 3a, 3b

Bảng 07 cho thấy rằng, khi bổ sung NAA với nồng độ 0.5 mg/l đến 1.5mg/l thì HSNC và TLCHH tăng lên rõ rệt và cao nhất ở nồng độ NAA 1.5mg/l cho tất cả các dòng Khi nồng độ NAA tiếp tục tăng đến 2.0 và 2.5mg/l thì HSNC và TLCHH đều giảm mạnh, đặc biệt TLCHH giảm rất mạnh và rõ rệt Qua quá trình theo dõi, quan sát cho thấy khi bổ sung NAA 1.5 mg/l chồi sinh trưởng và phát triển tốt, thân chồi mập, lá xanh và hình thái cây khoẻ Ngược lại, môi trường có nồng độ NAA 2.0 và 2.5mg/l chồi sinh trưởng kém, chiều cao thấp, phiến lá xoăn và dày, xuất hiện rễ ở thân chồi

HSNC ở cả 5 dòng nghiên cứu với nồng độ 1.5mg/l cao hơn không đáng

kể so với môi trường đối chứng Ngược lại, TLCHH cao hơn tương đối rõ so với môi trường đối chứng tuy nhiên riêng với dòng 136 thì TLCHH ở môi trường có

bổ sung 1.5mg/l NAA lại thấp hơn môi trường đối chứng