Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính bạch đàn và quy trình nhân nhanh Invitro một số dòng bạch đàn ưu trội của vườn giống Fortip Vạn Xuân phục vụ sản xuất

BỘ CÔNG THƯƠNG TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY ……………………*…………………… BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI CẤP BỘ NĂM 2008 TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG VÔ TÍNH BẠCH ĐÀN VÀ QUY TRÌNH NHÂN NHANH INVITRO MỘT SỐ DÒNG BẠCH ĐÀN ƯU TRỘI CỦA VƯỜN GIỐNG FORTIP VẠN XUÂN PHỤC VỤ SẢN XUẤT CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ CÔNG THƯƠNG CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS PHẠM ĐỨC HUY 7116 17/02/2009 PHÚ THỌ, THÁNG 12/2008 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT HSNC: Hệ số nhân chồi TLCHH: Tỷ lệ chồi hữu hiệu BAP: 6-Benzylaminopurine NAA: 1-Naphtalene acetic acid IBA: 3-Indolbutiric acid Hvn (m): Chiều cao vút Dg (cm): Đường kính phía vị trí ghép Dt (m): Đường kính tán S (%): Tỷ lệ sống N: Số mẫu kiểm tra MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TÓM TẮT I TỔNG QUAN 1.1 Cơ sở pháp lý đề tài 1.2 Tính cấp thiết mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.2.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Địa điểm, đối tượng nội dung nghiên cứu 1.3.1 Địa điểm nghiên cứu 1.3.2 Đối tượng nghiên cứu 1.3.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước II THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu 9 2.1.1 Trồng vườn giống 2.1.2 Trồng chăm sóc vườn vật liệu 10 2.1.3 Thử nghiệm nhân giống invitro 10 2.1.3.1 Phương pháp cắt, rửa khử trùng mẫu 11 2.1.3.2 Thử nghiệm chọn môi trường 11 2.1.3.3 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến HSNC TLCHH 11 2.1.3.4 Điều kiện thí nghiệm 13 2.1.3.5 Thu thập xử lý số liệu 13 2.2 Thiết bị, dụng cụ nguyên vật liệu 15 2.3 Kết thực nghiệm thảo luận 16 2.3.1 Trồng vườn giống 2.3.1.1 Điều tra chọn địa điểm thu thập điều kiện tự nhiên địa điểm thiết lập vườn giống 16 16 2.3.1.2 Thiết kế trồng vườn giống 16 2.3.1.3 Sinh trưởng dòng tháng tuổi 16 2.3.2 Trồng vườn vật liệu 21 2.3.3 Thử nghiệm nhân giống invitro 21 2.3.3.1 Nghiên cứu môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi 21 2.3.3.2 Ảnh hưởng BAP đến hệ số nhân chồi tỷ lệ chồi hữu hiệu 23 2.3.3.3 Ảnh hưởng BAP NAA đến hệ số nhân chồi tỷ lệ chồi hữu hiệu 26 2.3.3.4 Ảnh hưởng BAP IBA đến hệ số nhân chồi tỷ lệ chồi hữu hiệu 30 2.3.2.5 So sánh HSNC TLCHH dòng III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 33 3.1 Kết luận 33 3.2 Kiến nghị 33 IV TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHẦN PHỤ BIỂU TÓM TẮT Đề tài: “Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính Bạch đàn quy trình nhân nhan in vitro số dòng Bạch đàn ưu trội vườn giống FORTIP Vạn Xuân phục vụ sản xuất” thực năm (2007 2008) Năm 2007, đề tài chọn lọc 20 trội vườn giống FORTIP Vạn Xuân, thử nghiệm phương pháp ghép tạo 400 ghép với cành ghép lấy từ 20 trội chọn lọc Năm 2008, đề tài thực mục tiêu xây dựng vườn giống từ ghép 20 dòng chọn lọc tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro cho dòng ưu trội từ 20 dòng chọn lọc Vườn giống trồng tháng năm 2008, diện tích 1,0 Đội Ngọc Mỹ - Công ty lâm nghiệp Lập Thạch – Vĩnh Phúc Các dòng ghép cho tỷ lệ sống cao, biến động từ 82-100% Đến sinh trưởng dòng ghép tương đối tốt không bị sâu bệnh Đề tài thực thử nghiệm nhân giống in vitro giai đoạn nhân chồi bao gồm: thử nghiệm môi trường bản, nồng độ BAP, ảnh hưởng phối hợp BAP + NAA BAP + IBA Đề tài chọn môi trường MS + 30g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP + 1.5 mg/l NAA, pH =6 thích hợp môi trường thử nghiệm môi trường phù hợp cho dòng tiến hành nghiên cứu I TỔNG QUAN 1.1 Cơ sở pháp lý đề tài - Căn định số 1999/QĐ-BCT, ngày 03/12/2007 Bộ trưởng Bộ Công nghiệp việc giao kế hoạch khoa học công nghệ năm 2008 cho Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy - Căn hợp đồng nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ số 45.08 RD/HĐ-KHCN, ngày 23/01/2008 - Căn định số 12/QĐ-KHTH, ngày 28/01/2007 Viện trưởng Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy việc giao nhiệm vụ nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ - Căn quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống vườn giống (QPN 15 – 93) Bộ Lâm nghiệp ngày 02/11/1993 (chi tiết xem phụ biểu 5) 1.2 Tính cấp thiết mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.2.1 Tính cấp thiết đề tài Ở nước ta nay, Bạch đàn (Eucalyptus) loài trồng rừng chủ lực hầu hết vùng sinh thái nhằm đáp ứng nhu cầu nguyên liệu giấy, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ xẻ củi Trong khoảng 10 năm trở lại đây, suất rừng trồng bạch đàn cải thiện rõ rệt nhờ kết chương trình cải thiện giống Giai đoạn từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on Forest Tree Improvement) cải thiện giống rừng xây dựng 46 rừng giống vườn giống cho loài Bạch đàn, Keo tràm Keo tai tượng với nguồn hạt lấy từ giống, xuất xứ triển vọng nước Dự án xây dựng nhiều vườn giống, rừng giống hệ hệ 1.5 đáp ứng nhu cầu giống cho nghiên cứu sản xuất [3] Vườn giống Bạch đàn Vạn Xuân, Phú Thọ gồm 144 gia đình thiết lập năm 1996 vườn giống có nhiều gia đình cá thể có suất cao dự án FORTIP nói Đây nguồn vật liệu quý cần để chọn lọc dòng có suất cao từ nhân giống phục vụ trồng rừng xây dựng vườn giống cho phục phụ chương trình nghiên cứu cải tạo giống Đồng thời, để đạt kết tốt chương trình cải thiện giống không dừng lại chỗ có giống cải thiện mà giống phải nhân rộng phục vụ sản xuất cung cấp vật liệu cho chương trình cải thiện giống khác Do đó, yêu cầu cần thiết xây dựng vườn giống từ dòng chọn lọc tiến hành nhân giống vô tính phục vụ cho trồng rừng thử nghiệm từ bước đưa giống chất lượng cao vào trồng rừng sản xuất Trong xây dựng rừng giống, vườn giống, để tăng phẩm chất di truyền hạt giống, người ta thiết lập vườn giống ghép với cành ghép lấy từ tuyển chọn gốc ghép có sức chống chịu tốt với điều kiện bất lợi ngoại cảnh khí hậu, đất đai, sâu bệnh vv Vườn giống trồng từ ghép có nhiều ưu điểm rõ rệt so với vườn giống trồng từ hạt nhanh quả, trì đặc tính di truyền mẹ [12] Về nhân giống vô tính, nước ta nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro phương pháp ưu Đặc biệt nhân giống bạch đàn nói riêng lâm nghiệp nói chung phương pháp cho hiệu rõ rệt Từ đặc điểm trên, xây dựng vườn giống ghép với cành ghép từ ưu trội vườn giống FORTIP Vạn Xuân thử nghiệm nhân giống in vitro cần thiết Xây dựng vườn giống cung cấp nguồn hạt giống cho khảo nghiệm chọn lọc giống phục vụ lai tạo giống Thử nghiệm nhân giống in vitro nhằm tạo phục vụ khảo nghiệm dòng vô tính, công nhận giống phát triển vào sản xuất 1.2.2 Mục tiêu đề tài 1) Xây dựng vườn giống từ ghép dòng bạch đàn suất cao vườn giống FORTIP Vạn Xuân 2) Xác định điều kiện nuôi cấy in vitro (môi trường hóa học) thích hợp để nhân nhanh dòng chọn lọc vườn giống FORTIP Vạn Xuân phục vụ sản xuất 1.3 Địa điểm, đối tượng nội dung nghiên cứu 1.3.1 Địa điểm: Vườn giống thiết lập Đội Ngọc Mỹ - Công ty Lâm nghiệp Lập Thạch với diện tích 1,0 Vườn vật liệu thử nghiệm nhân giống in vitro Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy 1.3.2 Đối tượng nghiên cứu • Cây trồng vườn giống: Vườn giống trồng từ ghép với cành ghép lấy từ 20 trội chọn lọc vườn giống Vạn Xuân (20 trội chọn năm 2007 đề tài chi tiết xem phụ biểu 1) Cây ghép đem trồng có vết ghép ổn định Sinh trưởng phát triển tốt, không sâu bệnh, tán phát triển cân đối, chiều cao > 50cm • Cây thử nghiệm nuôi cấy in vitro: Từ 20 trội chọn lọc, đề tài lựa chọn tích thân cao làm đối tượng để tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro, cụ thể trội sau: Cây trội số 154, 141, 122, 136 126 (đặc điểm cụ thể trội thử nghiệm nhân giống in vitro xem phụ biểu 1) 1.3.3 Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu đề ra, đề tài thực nội dung nghiên cứu sau: Điều tra chọn địa điểm thiết lập vườn giống Thu thập điều kiện tự nhiên, đất đai địa điểm thiết lập vườn giống Thiết kế trồng vườn giống Trồng chăm sóc vườn vật liệu phục vụ cho nuôi cấy in vitro Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro Thu thập tiêu nghiên cứu, xử lý số liệu viết báo cáo khoa học 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu 1.4.1 Trong nước Ở Việt Nam, từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on Forest Tree Improvement) cải thiện giống rừng xây dựng 46 rừng giống vườn giống cho loài Keo tràm, Keo tai tượng Bạch đàn với nguồn hạt lấy từ xuất xứ tốt nước Các gia đình trồng vườn giống theo khối, lặp lại lần Sau đánh giá sinh trưởng giữ lại gia đình tốt có triển vọng [3] Ngoài diện tích rừng giống trên, nước ta chiếm đa số rừng giống chuyển hoá từ rừng tự nhiên rừng trồng, nên phẩm chất di truyền hạt giống thấp Chúng ta có khoảng 2.000 rừng giống vườn giống loại Thông Lâm Đồng, Thông Nhựa Quảng Bình, Tếch Định Quán, Keo Bạch đàn Vùng Trung tâm Bắc Vấn đề xây dựng rừng giống Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy quan tâm từ lâu, năm 1996 Viện chuyển hoá 10,3 rừng giống từ rừng trồng với nguồn hạt nhập nội Hiện nay, rừng giống chuyển hoá cho hiệu kinh tế rõ rệt, rừng trồng từ nguồn hạt cho suất chất lượng rừng tăng lên rõ rệt Trong năm gần đây, Trung tâm nghiên cứu giống rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam xây dựng vườn giống Bạch đàn ghép Ba Vì phục vụ cho công tác lai tạo Đây số vườn giống lâm nghiệp trồng nghép nước ta [3] Đối với lĩnh vực nhân giống in vitro, nhiều khó khăn cần giải quyết, song năm gần đây, việc áp dụng biện pháp nhân giống in vitro vào nghiên cứu thực tiễn sản xuất lâm nghiệp thu kết qủa đáng khích lệ Một số sở tiến hành nhân giống in vitro quy mô công nghiệp Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy – Phù Ninh – Phú Thọ, Lâm trường thực nghiệm Yên Lập – Quảng Ninh, Công ty Giống Lâm nghiệp Trung ương, …vv Đồng thời, số tỉnh địa phương thành lập phòng nuôi cấy in vitro để phục vụ cho công tác giống trồng có thành công bước đầu PHẦN BA XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG CHƯƠNG TẠO CÂY GHÉP Điều 35 Tiêu chuẩn để làm gốc ghép Cây để làm gốc ghép phải tuổi vườn ươm sinh trưởng khỏe mạnh, không bị sâu bệnh, có đường kính phát triển để phù hợp với kích thước cành ghép Kỹ thuật tạo làm gốc ghép kỹ thuật tạo chăm sóc Điều 36 Cành ghép lấy từ trội chọn lọc đánh giá Hội đồng giống ngành lâm nghiệp công nhận Khi cắt khỏi mẹ cành ghép phải cắt bớt phiến bảo quản điều kiện ẩm mát Điều 37 Mùa ghép xác định theo đặc điểm sinh học, vật hậu, yêu cầu sinh thái cành ghép theo diễn biến thời tiết khí hậu vùng Điều 38 Trước ghép phải tạo điều kiện cho làm gốc ghép sinh trưởng phát triển khỏe mạnh, phải bảo đảm cho đất có đủ độ ẩm cần thiết Sau ghép phải có biện pháp che nắng giữ ẩm cho ghép phát triển thuận lợi Điều 39 Khi ghép mắt ghép áp mà cành ghép chắn liền sinh với gốc ghép cần cắt bỏ phần gốc ghép cách chỗ ghép 10-12cm Điều 40 Phải kịp thời cắt bỏ chồi phụ mọc từ gốc ghép suốt trình sinh trưởng ghép Điều 41 Số ghép dòng thay đổi tùy theo số dòng vô tính tham gia xây dựng vườn giống (ít không 20 dòng) số lần lặp chúng vườn giống Khi số dòng vô tính diện tích vườn giống nhiều số ghép dòng CHƯƠNG 10 TRỒNG, CHĂM SÓC VƯỜN GIỐNG VÀ THU HÁI QUẢ Điều 42 Trước trồng vườn giống phải thiết kế Nội dung bước thiết kế tuân thủ quy định phần quy phạm Điều 43 Mật độ trồng vườn giống mật độ cuối (200 đến 400 cây/ha 200-400 cụm cây) Tùy theo phát triển tán loài mà thay đổi khoảng cách trồng 5m x 5m, 6m x 6m 6m x 7m 7m x 7m Nguyên tắc chung có tán nhỏ trồng mật độ cao, có tán lớn trồng mật độ thấp Điều 44 Khi trồng ghép (vườn giống vô tính) hố trồng (theo mật độ cuối cùng) Khi trồng hạt (vườn giống hạt) cụm (trồng cách 1m) coi cụm Khoảng cách tâm cụm khoảng cách tính theo mật độ cuối Điều 45 Bố trí vườn giống phải bảo đảm nguyên tắc dòng vô tính gia đình không trồng cạnh Sơ đồ bố trí theo phụ lục Điều 46 Việc lựa chọn sơ đồ bố trí cụ thể phải vào yêu cầu cải thiện giống, trình độ cho phép cán kỹ thuật công nhân trồng rừng sở phải cấp có thẩm quyền phê duyệt Điều 47 Cây trồng vườn giống bố trí thành nhiều khối Trong khối trồng ghép dòng vô tính cụm gia đình Điều 48 Kích thước hố trồng vườn giống vô tính 60 x 60 x 60cm Kích thước trồng vườn giống hạt kích thước trồng rừng giống (xem Điều 22) Phải bón lót đủ lượng phân hữu trước trồng phải nhiều so với trồng rừng sản xuất Điều 49 Yêu cầu kỹ thuật trồng, thời vụ trồng, chăm sóc bảo vệ vườn giống yêu cầu cho rừng giống (xem phần 2) Điều 50 Tỉa thưa cho vườn giống hạt thực cụm bắt đầu khép tán Việc tỉa thưa tiến hành bước lại cụm Cây giữ lại phải sinh trưởng phát triển tốt nhất, đạt yêu cầu cao sản phẩm giống theo mục tiêu đặt Phương pháp thực tỉa rừng giống (xem chương VIII) Điều 51 Tỉa thưa di truyền vườn giống thực sau giống trưởng thành thể đầy đủ yêu cầu chọn giống có kết khảo nghiệm hậu Chỉ chặt tỉa dòng vô tính gia đình không đạt yêu cầu chọn giống cho hậu (đời sau) không đạt yêu cầu theo mục tiêu đề Điều 52 Thu hái để cung cấp hạt cho trồng rừng sản xuất tiến hành thu hái rừng giống (xem Điều 35) 10 PHỤ LỤC MỘT SỐ KIỂU SẮP XẾP CÂY CHỦ YẾU TRONG CÁC VƯỜN GIỐNG Sắp xếp theo hàng có chuyển dịch cách xắp xếp mà trật tự hàng không thay đổi, song trật tự hàng có thay đổi Đây cách xếp đơn giản dễ thực hiện, song có tượng tổ hợp lặp phần có định kỳ Vì nên hạn chế sử dụng Thí dụ (cho 20 dòng) Hàng 1 Hàng 16 17 18 Hàng 10 11 Hàng 20 19 12 20 13 14 15 16 17 10 18 11 19 10 12 20 11 13 12 14 15 20 10 13 14 Sắp xếp theo khối hoán vị: Chuyển dịch bậc thang có hệ thống lần gặp để tránh lặp lại trật tự khối Đây phương pháp áp dụng Mỹ, Colombia, Canada, ưu điểm cách xếp dễ thực hiện, tránh tổ hợp lặp định kỳ, song tạo thụ phấn chéo ngẫu nhiên Thí dụ 20 10 11 12 11 13 14 15 16 10 13 14 12 17 18 19 20 15 17 18 19 a) Khối xuất phát b) Khối lặp lại chuyển dịch bậc thang có hệ thống lần đầu Sắp xếp theo khối đảo nghịch biến đổi khác việc dùng khối cặp đôi với nối tiếp đảo ngược dòng khối xếp ngẫu nhiên khác cho cặp khối Kiểu xếp phù hợp cho tự thụ phấn Khi dùng cho thụ phấn chéo phải có biến đổi để tránh hai dòng nằm cạnh Cách bố trí dùng cho Ulmus carpiniflolia Hà Lan 11 11 12 12 10 10 5 12 5 11 11 10 11 10 1 10 9 11 12 12 8 10 12 11 9 Sắp xếp theo khối đảo nghịch Sắp xếp theo khối cân không đầy đủ: cách xếp mà vị trí khối nhỏ khối nhỏ vườn giống ấn định ngẫu nhiên Cách xếp cho phép xếp ngẫu nhiên dòng vô tính tạo khả so sánh tính chất dòng vô tính cách Đây cách xếp phù hợp với thụ phấn chéo, dùng Đức Ưu điểm cách xếp dự kiến hoán vị cạnh khối nhỏ, phương pháp thích hợp để so sánh công thức xếp vườn giống nghiên cứu so sánh dòng vô tính, thích hợp cho nghiên cứu khả tổng hợp riêng; song không thích hợp cho tỉa thưa có hệ thống Thí dụ: Trường hợp có: 10 dòng vô tính khối nhỏ có 3cây lần lặp 30 khối nhỏ (khối cây) 12 10 10 10 1 10 9 10 5 9 10 10 6 10 10 7 9 10 7 8 10 9 10 6 1 10 8 10 10 6 10 10 10 9 6 10 a) Kế hoạch lý thuyết b) Sau xếp ngẫu nhiên khối khối Sắp xếp mạng cân dùng số dòng vô tính bình phương số nguyên Cách xếp có ưu điểm khối nhỏ lần gặp ngẫu nhiên cách xếp giống với ô vuông latinh Đây cách xếp dùng Đức Mỹ 11 10 21 10 12 17 22 21 11 12 13 14 15 13 13 23 16 22 15 16 17 18 19 20 14 19 24 11 17 24 10 21 22 23 24 25 10 15 20 25 12 18 24 1 17 22 18 14 10 12 23 16 13 24 10 17 21 20 14 25 18 11 22 15 19 11 18 21 12 24 15 19 10 22 13 16 25 20 23 14 11 13 19 25 14 20 23 19 15 16 12 24 20 21 17 13 25 25 dòng, khối nhỏ cây, lần lặp, 30 khối nhỏ 13 Sắp xếp hoàn toàn ngẫu nhiên: Được thực cách trước hết chia vườn giống thành khối để đủ cho dòng có cá thể tham gia, vị trí cá thể khối hoàn toàn ngẫu nhiên Sau phải điều chỉnh để tránh tượng dòng nằm cạnh Đây phương pháp dễ sử dụng tỉa thưa có hệ thống, song khó thực trường Phương pháp dùng nhiều Ôxtrâylia, Canađa, Đanh Mạch, Na Uy, Nam Phi, Liên Xô (cũ), Mỹ, Đức, Nam Tư v.v Một biến tướng phương pháp dùng Thái Lan để trồng vườn giống Tếch xếp ngẫu nhiên hai lần Thí dụ: Khi trồng khoảng cách 12m x 12m lần đầu để khoảng cách 24m x 24m bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lần thứ hai lại bố trí ngẫu nhiên khoảng lại để thành khoảng cách 12m x12m, đồng thời có điều chỉnh để tránh hai dòng vô tính nằm cạnh 14 PHỤ BIỂU 6: PHÂN TÍCH THỐNG KÊ VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG ĐẾN HSNC VÀ TLCHH 5.1 Ảnh hưởng môi trường đến HSNC Test of Homogeneity of Variances HSNC Levene Statistic df1 1.033 df2 Sig 84 404 ANOVA HSNC Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square 391 078 724 84 009 1.115 89 F Sig 9.062 000 5.2 Ảnh hưởng BAP đến HSNC TLCHH Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig HSNC 3.747 84 074 TLCHH 2.211 84 061 ANOVA Sum of Squares HSNC Between Groups Within Groups Total TLCHH Between Groups Within Groups Total df Mean Square 4.426 737 84 5.162 89 1331.144 266.229 303.216 84 3.610 1634.360 89 F 885 100.945 Sig .000 009 73.753 000 15 5.3 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến HSNC TLCHH Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig HSNC 899 84 486 TLCHH 239 84 944 ANOVA Sum of Squares HSNC Between Groups Total 5.4 F 730 632 84 008 4.281 89 1041.402 208.280 385.936 84 4.594 1427.338 89 Total Within Groups df 3.648 Within Groups TLCHH Between Groups Mean Square Sig 96.947 000 45.333 000 So sánh khả nhân nhanh dòng nghiên cứu Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig HSNC 414 85 798 TLCHH 494 85 740 ANOVA HSNC TLCHH Sum of Squares df Mean Square F Sig Between Groups 268 067 1.419 235 Within Groups 4.013 85 047 Total 4.281 89 Between Groups 20.567 5.142 311 870 Within Groups 1406.771 85 16.550 Total 1427.338 89 16 HSNC Duncan Subset for alpha = 0.05 Dong N Dòng 154 18 1.7389 Dòng 141 18 1.8517 1.8517 Dòng 136 18 1.8578 1.8578 Dòng 126 18 1.8656 1.8656 Dòng 122 18 1.9000 Sig .114 550 Means for groups in homogeneous subsets are displayed TLCHH Duncan Subset for alpha = 0.05 Dong N Dòng 126 18 18.9944 Dòng 154 18 19.2278 Dòng 136 18 19.9500 Dòng 141 18 20.0333 Dòng 122 18 20.2000 Sig .438 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 17 QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO CHO DÒNG BẠCH ĐÀN CHỌN LỌC I CẮT, BẢO QUẢN VÀ KHỬ TRÙNG MẪU CẤY 1.1 Nguồn lấy mẫu Mẫu lấy từ nguồn sau: - Chặt để tạo chồi: Phương pháp tạo nhiều chồi nhược điểm phải chặt bỏ, để khắc phục nhược điểm cách bảo tồn lưu giữ vườn dòng in vitro Khi sử dụng phương pháp cần lưu ý đến khả đâm chồi bất định loài để định chiều cao gốc chặt Với loài dễ mọc chồi bất định bạch đàn, phi lao thường để chiều cao gốc chặt 10 - 15 cm từ mặt đất Với loài khó mọc chồi như loài keo tràm, keo tai tượng thường để chiều cao gốc chặt từ 0.7 - 1.2 m - Khoanh vỏ: Từng loài khác kỹ thuật khoanh vỏ khác Đối với bạch đàn thường khoanh cách mặt đất 10 - 15 cm, khoanh cắt khoảng 2/3 đường chu vi Dọn sạch, quanh gốc tiến hành khoanh tiến hành chăm sóc làm cỏ, tưới nước, bón phân Các chồi mọc lên từ chỗ khoanh vỏ đưa vào làm vật liệu nuôi cấy - Ghép cây: Ghép cành, mắt cần nhân giống lên gốc ghép non loài - Ngoài có nhiều phương pháp khác như: giâm hom, triết cành, ươm rễ, ken 1.2 Kích thước mẫu nuôi cấy Mẫu nuôi cấy to khả nhiễm khuẩn lớn lấy mẫu nên chọn mẫu nhỏ (nhỏ đến mức tối thiểu cho phép) Nếu nuôi cấy chồi mẫu nuôi cấy phải lấy đủ đoạn có chứa chồi nách chồi đỉnh Lấy mẫu vị trí khác ảnh hưởng khác đến kết nuôi cấy, tuỳ loài mục đích nuôi cấy mà chọn vị trí lấy mẫu cho thích hợp Mẫu lấy chồi từ 30-40 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, cắt bỏ phần non, toàn phiến gần hết phần cuống (cuống cắt sát với chồi) Mẫu cấy có chiều dài từ 1.5-3.0 cm, đường kính 18 mẫu cấy từ 1-2 mm, mang từ 2-3 nách đoạn từ thứ đến thứ 1.3 Tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy - Tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến kết nuôi cấy Tuổi sinh lý già khả phát sinh hình thái yếu Theo thuyết phát triển giai đoạn gốc phần non cây, lấy mẫu phần tỷ lệ mẫu đưa vào thành công - Thời gian lấy mẫu: Nên lấy mẫu vào buổi sáng không lấy vào thời điểm có nguy bị nấm bệnh, tốt nên phun phòng nấm bệnh định kỳ cho nguồn mẫu định sử dụng - Mùa cắt mẫu: Nên cắt vào cuối giai đoạn ngủ thời điểm lượng auxin tập trung nhiều để chuẩn bị cho trình nảy chồi Đối với bạch đàn lấy mẫu nuôi cấy tháng 11 khả nảy chồi kém, tốt lấy vào tháng 3-4 1.4 Bảo quản mẫu - Sau cắt rời mẹ, mẫu lúc bị cân sinh thái, chủ yếu lượng nước bị Để khắc phục tượng cần làm sau: Mẫu vật lấy song để vào bình lạnh, nhiệt độ thấp làm giảm bớt khả thoát nước 1.5 Khử trùng mẫu cấy Vô trùng mẫu cấy thao tác khó, thành công lần khử trùng Tuy kiên trì tìm nồng độ thích hợp thời gian vô trùng thích hợp sau vài lần thử chắn đạt kết tốt Mẫu nuôi cấy lấy với kích thước vừa đủ, sơ rửa vòi nước máy Nếu vật liệu nhỏ cho vào cốc lọc lưới xịt mạnh vòi nước Nếu vật liệu cấy có nhựa bám dây bẩn tự nhiên cần rửa bột xà phòng giặt thông thường với liều lượng khoảng thìa cà phê/100 ml nước Khuấy phút, dùng bút lông cọ rửa vết bẩn rõ Sau xối nước máy cho hết xà phòng, thấm khô mẫu cấy giấy thấm Bước trùng hoá chất: bước phải thực tủ cấy vô trùng 19 Đưa mẫu cấy vào cốc đong trùng Dùng cồn 75oc để đẩy hết bọt khí mẫu nuôi cấy khoảng thời gian - giây, sau rửa lại nước cất vô trùng từ - lần Khử trùng mẫu HgCl2 0,1% thời gian 11 phút Ngoài thời gian phụ thuộc vào độ non già mẫu nuôi cấy thời điểm Sau rửa lại nước cất vô trùng - lần Cuối trước cấy cần thấm khô mẫu giấy thấm cắt bỏ tất vết cắt cũ để loại trừ phần mô bị thuốc sát trùng thấm sâu Mức độ cắt nhiều tuỳ thuộc chủng loại thuốc đặc điểm giải phẫu mẫu Cần ý toàn trình sát trùng tráng rửa cần đảm bảo đủ lượng để làm ngập mẫu nuôi cấy II CẤY MẪU Mẫu cấy vào môi trường ống nghiệm, kỹ thuật cấy sau: - Dùng panh gắp mẫu dùng kéo cắt bỏ phần không cần thiết cuống lá, đoạn thân nách - Thả mẫu vào ống nghiệm bình tam giác - Dùng kim cấy cấy phần gốc mẫu vật vào môi trường - Mẫu cấy xong phải gói kín bảo quản lạnh 72 Chú ý: Khi lấy mẫu phải cấy ngày III CẤY CHUYỂN MẪU 3.1 Cấy chuyển lần đầu: Mẫu cấy môi trường đổ bình tam giác 250ml 500ml Sau cấy mẫu 28 ngày tiến hành cấy chuyển sang môi trường nhân chồi Dùng panh để lấy chồi dùng kéo cắt bỏ bớt lá, đoạn thân khô, phần gốc bị già Dùng kim ấn nhẹ cho phần gốc nằm môi trường Nên chuyển mẫu sang bình để giảm nguy nấm khuẩn tiến hành cấy chuyển mật độ mẫu bình đủ tiêu chuẩn bình giống gốc 3.2 Cấy chuyển bình gốc Mục đích tạo nhiều chồi tốt nên loài khác có cách cấy khác Nếu muốn tạo chồi từ chồi đỉnh chồi bên cắt 20 chồi thành đoạn, đoạn mang theo - nách Dùng kim cấy dàn ấn nhẹ bề mặt môi trường IV ĐIỀU KIỆN VẬT LÝ 4.1 Ánh sáng Ánh sáng nhân tố cần thiết cho quang hợp trình nuôi cấy ánh sáng vai trò quan trọng Cây ống nghiệm sử dụng ánh sáng tự nhiên ánh sáng nhân tạo Nếu sử dụng ánh sáng tự nhiên phòng nuôi dưỡng thiết kế theo kiểu nhà kính bát giác Nếu sử dụng ánh sáng đèn phải có hệ thống đèn chiếu sáng với chủng loại ánh sáng đèn phù hợp Ánh sáng: mẫu nuôi cấy ánh đèn nêon với cường độ ánh từ 1000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày 4.2 Nhiệt độ Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 23-270C nhân chồi thúc chồi 4.3 Độ ẩm Độ ẩm tương đối không khí ảnh hưởng lớn đến khả nảy chồi rễ loài thực vật Vì nuôi cấy mô tạo nuôi cấy cần phải nghiên cứu độ ẩm phải đạt độ ẩm tương đối không khí bình nuôi cấy 85-90% thuận lợi cho phát triển Độ ẩm phòng nuôi lại hoàn toàn ngược lại Độ ấm phòng nuôi không cho phép vượt 60 % V MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Môi trường nuôi cấy môi trường MS có bổ sung thành phần chất sau: 30g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP + 1.5 mg/l NAA, pH =6 Pha môi trường theo phương pháp truyền thống, thành phần môi trường MS sau 21 Các chất đa lượng CaCl2 332.02 mg/l 2.99 mM KH2PO4 170.00 1.25 mM KNO3 1900.00 18.79 mM MgSO4 180.54 1.50 mM NH4NO3 1650.00 20.61 MM Các chất vi lượng CoCl2.6H2O 0.025 mg/l 0.11 µM CuSO4 0.025 0.10 µM 36.700 0.10 mM H3BO3 6.200 0.10 mM KI 0.830 5.00 µM 16.900 0.10 mM Na2MoO4.2 H2O 0.250 1.03 µM ZnSO4.7 H2O 8.600 29.91 µM FeNaEDTA MnSO4 H2O Các chất vitamin Glycine Myo-Inositol 2.00 mg/l 26.64 µM 100.00 0.564 mM Nicotinic acid 0.50 4.06 µM Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0.50 2.43 µM Thiamine HCl (vitamin B1) 0.10 0.30 µM 22 * Thao tác cấy - Cồn 950 dùng để đốt đèn cồn - Cồn 750dùng để sát trùng dụng cụ - Nước rửa khử trùng (do Trung quốc sản xuất có tên LiqunrBenzalkoni Bromidi) dùng để vệ sinh buồng cấy sát trùng tay - Sau hoàn tất công tác vệ bắt đầu thao tác cấy - Châm đèn cồn, cắm dụng cụ cấy vào lọ cồn 750 - Đặt ống nghiệm, bình cấy, bình gốc lên bàn - Mở nút bình gốc, hơ miệng bình lên đèn cồn - Hơ panh kéo lên đèn cồn, hơ cháy hết cồn panh kéo - Khi panh kéo nguội bắt đầu cấy chuyển - Sau cấy hết mẻ từ 7-8 ống nghiệm bình gốc dọn dẹp, vệ sinh mặt bàn cấy Panh kéo cắm trở lại lọ đựng cồn 75o - Dùng kim cấy để dằm mẫu vật xuống nuôi cấy Kim cấy trước đưa vào để dằm mẫu vật hơ lên đè cồn, sử dụng xong cắm trở lại vào lọ đựng cồn 750 - Hơ nút lửa đèn cồn sau đậy nút, bao giấy buộc dây Nếu tiếp tục cấy thao tác lặp lại 23