Công nghệ sinh học đại cương - CHƯƠNG 4. CÔNG NGHỆ LÊN MEN

Công nghệ sinh học đại cương

CHƯƠNG 4 CÔNG NGHỆ LÊN MEN

1 LÊN MEN LÀ GÌ?

Sự lên men: quá trình trao đổi chất, qua đó các

chất hữu cơ mà trước tiên là đường bị biến đổi dưới tác dụng của enzyme VSV

Phân loại:

Dựa theo cơ chế quá trình lên men

 Lên men yếm khí (lên men rượu, axetonbutylic, latic,…)

 Lên men hiếu khí (lên men axetic, xitric,…)

Dựa vào tác nhân cung cấp hệ enzyme

 Lên men ứng dụng nấm men

 Lên men ứng dụng vi khuẩn

 Lên men ứng dụng nấm mốc

Dựa vào tính chất của các sản phẩm lên men

 Công nghiệp lên men cổ điển: sản xuất rượu, axetonbutylic,…

 Với công nghiệp lên men hiện đại: sản xuất vitamin, kháng sinh, axitamin, protein bằng con đường sinh tổng hợp

2 BẢN CHẤT QUÁ TRÌNH LÊN MEN

Lên men là quá trình oxy hóa khử được tiến hành do hoạt động sống của VSV nhờ sự xúc tác của các enzyme nhằm cung cấp năng lượng và hợp chất trung gian cần thiết cho chúng

Quá trình lên men có thể chia làm hai pha:

• Pha thứ nhất là pha sinh trưởng: chủ yếu là quá trình sinh tổng hợp protein và xây dựng TB Các TB trong giai đoạn này rất trẻ, sinh trưởng và tăng sinh khối nhanh

• Pha thứ hai là pha tích tụ các sản phẩm của sự trao

Đường cong sinh trưởng đặc trưng của TB VSV

4 giai đoạn sinh trưởng của TB VSV

• Giai đoạn 1 (pha Lag): thích nghi - VSV làm quen với môi trường

• Giai đoạn 2 (pha Log): tăng trưởng - VSV phát triển mạnh tăng sinh khối

• Giai đoạn 3 (pha tĩnh): cân bằng - nguồn dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, số tế bào sinh ra = số

TB chết đi

• Giai đoạn 4 (pha chết): suy vong - nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, chất thải VSV tích tụ, TB chết chiếm ưu thế

3 VAI TRÒ CỦA VSV TRONG CN LÊN MEN

Giống VSV đóng vai trò quyết định:

• Năng suất sinh học

• Phẩm chất sinh học

• Giá thành sản phẩm

Yêu cầu về giống VSV

• Năng suất sinh học cao

• Sản phẩm dễ thu nhận, tinh sạch

• Có tính ổn định

• Thích nghi trong điều kiện lên men công nghiệp

• Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, hoặc tận dụng các nguồn phế liệu phế thải trong công nghiệp thực phẩm

• Cho sản phẩm có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm khác

Tạo giống VSV??

1 Phân lập giống

Tìm vị trí phân lập giống

Lấy mẫu đem phân lập

Nuôi trên môi trường tập trung

Pha loãng

Nuôi trên môi trường đặc hiệu

2 Chọn giống: tuyển chọn được giống có chất lượng

tốt nhất phục vụ cho sản xuất

3 Định danh

Phương pháp truyền thống

• Kiểm tra hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá VSV

• Phương pháp sinh hoá

Phương pháp hiện đại: PP SH phân tử

• Phân tích nucleic acid

• Phân tích protein

ngắn

Ly trích mẫu Dùng PCR khuếch đại rDNA 16s

Tinh sạch sản phẩm Thực hiện PCR

Giải trình tự Đối chiếu trên ngân hàng gen

Huấn luyện giống thích nghi  không di truyền Thay đổi đặc tính di truyền

- Cổ điển: lai, gây đột biến

- Hiện đại: tạo dòng, chuyển gen

Cải thiện giống VSV

Phương pháp lên men: có 2 phương pháp

Phương pháp nuôi cấy không liên tục

4 CÁC PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN

Phương pháp lên men nổi

khuẩn, vi khuẩn

nước đường hóa, nước bã rượu, rỉ đường phối hợp với một số muối khoáng

trường nuôi cấy VSV cần phải thoáng, rộng, không quá sâu, bề dày môi trường thường khoảng 2-5 cm

 Khi phát triển trong môi trường lên men VSV cần oxy không khí để hô hấp và sản phẩm của sự hô hấp là khí

CO 2 , hơi nước, nhiệt lượng tỏa ra xung quanh

 Ưu điểm

- Phương pháp thao tác đơn giản

- Không đòi hỏi quá cao về trang thiết bị, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp

- Quá trình sản xuất tiêu tốn ít năng lượng

- VSV được nuôi cấy trong điều kiện không vô trùng tuyệt đối Nếu có VSV tạp nhiễm thì chỉ cần loại bỏ phần đó

- Thích hợp với điều kiện sản xuất có trình độ cơ khí hóa

Phương pháp lên men chìm

 Phương pháp dùng cho cả VSV kỵ khí và hiếu khí

 Đây là phương pháp hiện đại đã được dùng trong khoảng nửa cuối thế kỷ XX và cho kết quả rất lớn đối với công nghệ vi sinh

 Nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề sâu dùng môi trường dinh dưỡng lỏng (dịch thể)

 Chủng VSV được gieo cấy vào MT phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào tiếp xúc với dịch dinh dưỡng  phải khuấy và cung cấp oxy bằng cách sục khí liên tục

 Nuôi cấy chìm được dùng phổ biến trong CN vi sinh để sản xuất men bánh mì, protein đơn bào từ nấm men, các phế phẩm vi sinh làm phân bón cố định đạm, làm thuốc trừ sâu, các enzim, các axit amin, vitamin, các chất kháng sinh, các chất kích thích sinh học …

Ưu điểm

- Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền

- Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho 1 đơn vị sản phẩm thấp

- Dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn

- Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hóa, tự động hóa cho toàn bộ quá trình

Nhược điểm

- Đòi hỏi trang thiết bị cao, dễ bị nhiễm trùng toàn bộ

- Thiết bị lên men chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẩn thẩn, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín và làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối

- Trong lên men chìm cần phải khuấy và sục khí liên tục vì VSV chỉ sử dụng được oxy hòa tan trong môi trường

- Khí được nén qua hệ thống lọc sạch khí Hệ thống này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy

Lên men bằng phương pháp nuôi cấy chìm ở quy mô phòng thí nghiệm (5L)

Quy mô pilot (200 L)

Phương pháp lên men bán rắn

 Phương pháp trung gian giữa lên men bề mặt và lên men bề sâu

 Môi trường lên men thường: 70% nước còn lại là các chất như cám, trấu, bắp…

 Nhược điểm: hiệu quả thanh trùng kém do

sự truyền nhiệt kém của các hợp chất độn khô trong môi trường lên men

Các phương pháp nuôi cấy liên tục

Phương pháp đơn cấp

- VSV được nuôi trong một nồi lên men Môi trường dinh dưỡng được bổ sung cũng như môi trường đã lên men rút

ra khỏi nồi lên men một cách liên tục với cùng một tốc độ

- Phương pháp này đơn giản, dễ ứng dụng vào sản xuất đối với tế bào nấm men để thu sinh khối hoặc sản phẩm là các chất chuyển hóa gắn trực tiếp với sự phát triển của tế bào

Phương pháp nhiều cấp

- VSV được nuôi ở hệ thống nồi lên men đặt làm nhiều cấp.

- Nồi thứ nhất được dùng cho VSV phát triển tốt nhất, các nồi sau để các tế bào tiết ra chất chuyển hóa

Ưu điểm

- Giảm bớt thời gian của thiết bị để làm vệ sinh, khử khuẩn và làm nguội

- Giảm bớt thể tích của toàn bộ thiết bị

- Có khả năng tự động hóa các thao tác

- Tăng hiệu suất của toàn bộ quá trình CN nhờ

Nhược điểm

• Đòi hỏi cán bộ và công nhân thành thạo chuyên môn

• Giá thành cao đối với tự động hóa và dụng cụ

đo lường hiện đại

• Phải vô khuẩn tuyệt đối trong toàn bộ thời gian thao tác

5 CÁC SẢN PHẨM CN LÊN MEN

Các nhóm sản phẩm căn bản

• Sinh khối VSV: nấm men bánh mì, men chăn nuôi, vaccine, protein đơn bào, phân vi sinh, chế phẩm diệt côn trùng, probiotic

• Enzyme VSV: alpha amylase, glucose isomerase, protease, lipase, pectinase, cellulase…

• Các sản phẩm trao đổi chất: sản phẩm sơ cấp (rượu bia, amino acid, acid hữu cơ, vitamine…) và sản phẩm thứ cấp (thuốc kháng sinh, các chất tăng trưởng và các chất có hoạt tính SH)

• Các sản phẩm tái tổ hợp gen: các r-protein và các

sp khác được tạo ra nhờ các TB VSV chuyển gen

• Các sp chuyển hóa SH: steroid, vitamine C, acrylamide, được sản xuất bằng TB VSV hoặc enzyme

• Biopolymer: các polysaccharide ngoại bào như xanthan, gellan, alginate vi sinh, cellulose vi khuẩn… và các chất hoạt động bề mặt (biosurfactant) được sản xuất bằng CN lên men

Sản xuất sinh khối VSV

Nấm men bánh mì

Nấm men bánh mì thật chất là sinh khối TB nấm

men saccharomyces cerevisiae được nuôi trong môi

trường giàu đường có bổ sung phosphore và ammonium

Tế bào nấm men có 3 vai trò trong sản xuất men

bánh mì:

• Làm nở bột mì nhão do lên men rượu sinh ra khí

• Bọt khí làm xốp bánh

Trong sản xuất bánh mì hiện nay ở châu Âu, người

Nấm men nhão (paste)

• Là khối nấm men thu được sau khi ly tâm nấm men lỏng

• Độ ẩm khoảng 70 – 75%, hoạt lực làm nở bánh kém hơn nấm men lỏng do quá trình ly tâm kéo dài làm nhiều tế bào chết

• Ưu điểm: kéo dài được thời gian sử dụng và thuận lợi trong vận chuyển, nếu được bảo quản lạnh ở 4 – 70C thì có thể sử dụng trong khoảng

10 ngày

• Liều lượng sử dụng nấm men paste khoảng 1 – 5% tùy theo chất lượng nấm men

Nấm men khô

• Nấm men khô được sản xuất từ nấm men paste bằng cách sấy ở nhiệt độ dưới 400C hoặc sử dụng phương pháp sấy thăng hoa

• Tuy hoạt lực làm nở bánh không cao nhưng thời gian sử dụng rất lâu và dễ dàng vận chuyển

Rỉ đường

Xử lý rỉ đường

Nấm men giống

Nuôi cấy men giống

Nuôi cấy men thương phẩm

Ly tâm tách rửa men

Định hình Ép

Sấy

Bao gói Đóng gói men ép

Công nghiệp rượu bia

Lên men các loại đường thành rượu được thực hiện

bởi nhiều loại nấm men (loài saccharomyces và VK)

Nguyên liệu: 3 nhóm

• Các cơ chất giàu đường: rỉ đường, nước mía, củ cải đường, nước trái cây chín… lên men trực tiếp

• Tinh bột từ các loại ngũ cốc như lúa mì, gạo, ngô…

 lên men qua 2 giai đoạn

• Phức hợp lignocellulose từ gỗ, phế thải nông nghiệp, lâm nghiệp…  sử lý phân cắt cellulose thành glucose khó khăn và tốn kém

Thức uống có nồng độ rượu thấp, sủi bọt mạnh, được tạo

ra từ lên men rượu trên dịch malt với hoa houblon

Quá trình lên men bia trong bồn yếm khí gồm 2 giai đoạn:

• Lên men: lên men nổi và lên men chìm diễn ra ở 20 0 C trong 5-7 ngày

• Ủ chín bia kéo dài từ 4-5 tuần để hình thành hương vị đặc trưng và giảm thiểu các thành phần bất lợi

• Chuẩn bị móc Aspergillus orizae, có tác dụng

đường hóa tinh bột gạo thành glucose

• Cho nấm men sake vào thì sự lên men bắt đầu

• Sự đường hóa và lên men xảy ra cùng lúc tại cùng một thời điểm

Rượu vang Nho

• Rượu không chưng cất truyền thống lâu đời

Nho thu về làm dập, ép lấy nước cho vào thùng lên men

• Sự lên men được thực hiện bằng chủng sản

xuất Saccharomyces cerevisiae hay do các loài nấm men tự nhiên như Saccharomyces

sp, Zygosaccharomyces sp,…

• Champane là rượu vang nho mà giai đoạn

cuối có bổ sung đường để tạo khí CO2 áp lực mạnh

Rượu Cognac

• Rượu nho chưng cất

• Nho được lên men thành rượu vang và tiếp tục được chưng cất

• Rượu được cho vào gỗ sồi tạo hương vị đặc trưng

Công nghiệp sản xuất MSG

• Monosodium glutamat (bột ngọt) được tạo thành từ glutamic acid bằng con đường lên men

• 1980, Ikeda đã chứng mình chất glutamic acid từ tảo bẹ khiến cho các món ăn Nhật Bản có mùi vị ngon và đặc trưng

• Trước kia, glutamic acid được sản xuất bằng các thủy phân các nguồn protein chứa nhiều glutamic acid như đậu nành nhưng hiệu suất thấp

• 1962, Kinoshita đã trình bày cơ chế lên men

glutamic acid từ Corynebacterium glutamicum một

cách hoàn chỉnh

VSV lên men glutamic acid

• Hiện nay sử dụng Corynebacterium glutamicum phổ

biến trong công nghiệp, hầu hết các chủng đột biến

• Các chủng đột biến có thể tạo từ 40-50g/l glutamic acid trong dịch lên men, trong điều kiện PTN có thể thu được 100g/l glutamic acid trong dịch lên men

Điều kiện lên men glutamic acid

• pH thích hợp 7-8

• Chế độ thông khí tốt

• Thiệt hại do sâu bệnh gây ra

hàng năm: 20-35%

• Việc sử dụng thuốc hóa học

dẫn đến nhiều hậu quả

nghiêm trọng

• Sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh

dựa trên nền tảng khoa học

đấu tranh sinh tồn giữa các

Thuốc trừ sâu vi sinh

Ưu điểm

• Không độc hại

• Tiêu diệt chọn lọc các loại sâu bệnh

• Khả năng thích nghi cao

• Nhiễm lên côn trùng bằng nhiều cách

• Tồn tại trong điều kiện môi trường không thuận lợi, ở nhiều dạng khác nhau

• Hiệu quả thuốc thường kéo dài

• Khả năng phát tán rộng trong tự nhiên

Các nhóm vi sinh vật được sử dụng

Hơn 1500 loại VSV

Bacillus popilliae Ấu trùng bình thường của một loài bọ và khi

bị nhiễm Bacillus popilliae

Côn trùng chết do nhiễm Metarhizium anisopliae

Những kết quả đạt được trong nghiên cứu, ứng dụng thuốc trừ sâu vi sinh ở VN

Chế phẩm Bt

 Phòng trừ sâu hại rau ở Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, Thái Nguyên trên diện tích hàng vạn ha, hiệu quả từ 75 - 90% sau 7 ngày phun.

 Phòng trừ sâu róm thông ở Thanh Hoá, Nghệ

An, Sơn La hiệu quả trên 80% sau 7-10 ngày

Thuốc trừ sâu vi nấm

Nguyễn Thị Lộc và cộng tác viên đã nghiên cứu, phát triển thành công hai chế phẩm sinh học và hai chế phẩm đó đã được đưa vào danh mục thuốc sinh học bảo vệ thực vật với tên thương mại là Ometar (từ nấm

Beauveria bassiana) được phép sử dụng rộng

rãi tại Việt Nam

Chế phẩm Bt

• Có tới trên 300 chủng Bacillus thuringiensis

khác nhau đã được xác định

• Bt được phân lập đầu tiên vào năm 1901

• Chế phẩm Bt được sản xuất đầu tiên tại Pháp

năm 1938

• Những protein tạo ra bởi Bt có độc tính cao đối

Cơ chế gây độc của tinh thể độc

Nhân tố thúc đẩy tinh thể độc thể hiện hoạt tính

• pH đường ruột

• Khả năng sinh enzyme phân giải protein

Tinh thể độc có 3 vùng chức năng

Quy trình sản xuất thuốc trừ sâu Bt

Chủng Bt thuần khiết

Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2

Lọc và ly tâm Thu sinh khối

HƯỚNG PHÁT TRIỂN

• Phân lập được 463 chủng Bt trên tổng số 1479

chủng nhận được trong mẫu đất ở ĐBSH & BTB.

• Sử dụng kỹ thuật gen để cải biến chủng vi khuẩn

• Việc sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh hoàn toàn phù hợp với chương trình phát triển nông nghiệp bền vững

Probiotic (chế phẩm trợ sinh)

• Probiotic: chế phẩm có chứa các VSV sống vô hại hoặc có lợi có tác dụng làm cải thiện cân bằng VSV trên cơ thể vật chủ

• Prebiotic: thực phẩm của probiotic và những VSV hữu ích trong đường ruột, thúc đẩy sự phát triển của VK có lợi cho đường ruột

• Synbiotic: hỗn hợp của probiotic và prebiotic có tác dụng cải thiện khả năng sống và chiếm ngự trong đường ruột của probiotic Synbiotic cho nhiều ảnh hưởng tốt hơn việc sử dụng probiotic và prebiotic

Đặc điểm của VSV dùng làm probiotic

• Khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ

Hệ VSV đường ruột

yếu cư trú trong đường tiêu hóa

• Rối loạn tiêu hóa: VK có lợi chết đi, VK gây bệnh tăng đột ngột vượt quá ngưỡng cho phép

• Sử dụng probiotic là biện pháp vừa đơn giản, rẻ tiền, vừa có tác dụng cải thiện rõ rệt hệ vi khuẩn đường ruột, khôi phục lại thế cân bằng

• Các vi sinh vật probiotic được lựa chọn dùng cho

người rất phong phú như: Lactobacillus acidophilus,

Cơ chế tác động của Probiotic

• Nảy chồi trong đường ruột, giúp làm tăng hiệu quả hàng rào sinh học

• Tăng cường tái hấp thu nito

Cơ chế hoạt động tiềm năng của Probiotic

• Ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh

• Kích thích sự sản xuất kháng thể

• Sản xuất ra những hợp chất kháng khuẩn

• Biến đổi các độc tố hay receptor của độc tố

• Cạnh tranh môi trường với vi khuẩn gây bệnh

• Giảm thấp sự di chuyển của vi khuẩn gây bệnh

• Chống viêm nhiễm, đặc biệt với tổ chức tế bào niêm mạc ruột

• Tùy theo loài vi sinh vật trong probiotic có thể làm giảm thấp lượng cholesterol máu

• Có thể phòng trừ bệnh viêm dị ứng do đường ruột

Công nghiệp Vaccine

Nuôi nấm men trong nồi lên men để nhận kháng nguyên dùng cho sản xuất vaccine