4 Phương pháp hóa-lý Phương pháp phóng xạ-enzym Phương pháp phóng xạ-miễn nhiễm Phương pháp miễn nhiễm-enzym Phương pháp huỳnh quang Phươg pháp quang sinh học Phương pháp quang phổ Phương pháp sắc ký – Sắc ký lớp mỏng: • Tetracycline 0,025 μg/ml • Chloramphenicol μg/ml • Neomycine 15 μg/ml • Streptomycine 0,5 μg/ml – Sắc ký khí: áp dụng sữa Giới hạn phát hiện: • Tetracycline 0,5-10 μg/ml • Chloramphenicol 0,01 μg/ml • Penicilline 0,005 UI/ml – Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp dùng phổ biến để định tính định lượng chất kháng sinh Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 53 CHƯƠNG CHẤT DIỆT KHUẨN Giới thiệu chung Phương pháp vi sinh Phương pháp biến đổi chuyển hóa nấm men Phương pháp thường dùng: test trình lên men a Nguyên tắc b Tiến hành – Chuẩn bị mẫu – Chuẩn bị nấm men – Kiểm tra q trình lên men • Khơng có mẫu kiểm chứng: thể tích CO2 nhỏ ml khơng có kết luận mẫu có mặt chất diệt khuẩn • Khi có mẫu kiểm chứng: thể tích CO2 tách mẫu kiểm tra nhỏ mẫu kiểm chứng 50% ta kết luận mẫu có chất diệt khuẩn Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn-ĐHBK 54 27 2.1.2 Áp dụng cho sản phẩm thực phẩm – Sữa sản phẩm sữa: Phương pháp Kluyver – Rượu vang, bia loại đồ uống có cồn: • Phương pháp thức Pháp • Phương pháp Kluyver-Mossel • Phương pháp De Clerck, Aubert Jerumans • Phương pháp Beatsle, Mossel Verheyden Phương pháp phát triển môi trường thạch Phương pháp Drieux Thierry Phương pháp Mossel Eijgelaar Phương pháp hóa-lý Axit Sorbic Sorbat – Phương pháp so màu (Schmidt) – Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – Phương pháp sắc ký khí (GC) – Phương pháp sắc ký hiệu cao (HPLC) Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 55 2.2 Axit Benzoic dẫn xuất –Phương pháp sắc ký giấy (Parkinso) –Phương pháp sắc ký giấy (Joux –Phương pháp sắc ký mỏng Đối với rượu vang, Ribereau-Gayon Peynaud đưa phương pháp xác định: –Phương pháp thức –Phương pháp Blarez –Phương pháp Guillaume Mehl Ngoài phương pháp HPLC dùng để xác định axit Benzoic dẫn xuất axit cacboxylic Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn-ĐHBK 56 28 Anhydric sunfurơ sunfit – Nhận biết mùi – Con đường hóa học Có nhiều phương pháp kỹ thuật dùng định lượng: a Sản phẩm lỏng (vang, bia, nước táo nước ép hoa ) b Sản phẩm bán lỏng rắn (mù tạt, khô, cá ) Phương pháp MonierWilliamvà Shipton c.Các phương pháp khác: phương pháp so màu, trọng lượng , dựa sở tạo chất màu tím Rosaniline với SO2 2.4 Biphenyl Orthophenyl-phenol Các hợp chất sử dụng xử lý bề mặt cam, quýt Chúng xác định theo phương pháp Gunther, Blinn Barkley Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 57 Dẫn xuất halogen axit axetic Công thức chung CH2XCOOH Trong axit monobromaxetic dùng nhiều – Phương pháp Florentin-Munch – Phương pháp Cristol-Benezech – Phương pháp Jaulnes – Phương pháp Vivario Axit boric – Phương pháp chuẩn độ: chuẩn độ axit với có mặt glycerol, thường áp dụng cho sản phẩm sữa – Phương pháp so màu Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn-ĐHBK 58 29 Formaldehyt dẫn xuất – Tiến hành chưng cất mẫu có bổ sung dung dịch H2SO4 pha lỗng lần Thử định tính với H2SO4 đặc có dùng thị phenolphtalein – Diemair Postel đưa phương pháp kiềm hóa formol phản ứng với axit cromotropic với có mặt H2SO4 Nếu có formol xuất màu tím – Censi Cremonini đưa phương pháp định lượng formol cách dùng 2,4-dinitrophenylhydrazine Axit formic Phương pháp Lecoq Hợp chất Flo Phương pháp Truhaut 10 Hợp chất amonium Phương pháp Diemair-Postel Phương pháp Miller-Wildbrett Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 59 2.11 Hydroperoxyt Được áp dụng nhiều công nghiệp sữa – Phương pháp hóa học: • Phương pháp Pien, Desirant Lafontaine • Phương pháp Rouquette • Phương pháp Amin Olson • Phương pháp Ferrier • Phương pháp Gupta – Phương pháp enzym Việc phân giải H2O2 nhờ peroxydaza có sẵn sữa nguyên liệu tạo oxy hoạt động thu nhận bởi: • Orthotolidin tạo phức màu xanh • Gaiacol tạo phức màu hồng cá hồi 2.12 Hypoclorit cloramin – Phương pháp hồ tinh bột – Phương pháp huỳnh quang Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn-ĐHBK 60 30 CHƯƠNG ĐỘC TỐ VI NẤM Giới thiệu chung Phân tích Aflatoxin Chuẩn bị mẫu Phương pháp nhanh sử dụng cột nhồi áp dụng cho sản phẩm rau Phương pháp sắc ký mỏng – Phương pháp CEE (rau quả) – Tách chiết – Tinh chế dịch – Chạy sắc ký mỏng – Phân tích định tính – Một vài lưu ý: • Mẫu nhiều chất béo cần phải loại bỏ chất béo trước • Threobromin cacao cần phải bị loại bỏ Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 61 Phương pháp HPLC Các sản phẩm từ sữa: định phân aflatoxin M1 Phương pháp chuẩn hóa Hiệp hồi Quốc tế ngành sữa – Chuẩn bị dung dịch chuẩn aflatoxin M1 – Tách chiết – Tinh chế dịch chiết – Sắc ký mỏng chiều (sữa) – Sắc ký hai chiều (pho mát) – Xác minh có mặt aflatoxin M1 2.5.2 Sử dụng HPLC Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn-ĐHBK 62 31 Phân tích Epoxy-tricotecen Các test sinh học Ức chế trình sinh trưởng lymphomcytes murins in vitro Đặc tính hoại da – Tách chiết tinh chế mẫu – Chấm mẫu Kỹ thuật ROMER, BOLING Mc DONALD – Tách chiết – Tinh chế dịch chiết – Chuẩn bị dung dịch chuẩn: T-2 diaxetoxyscirpenol (DAS) – Chạy sắc ký – Độ nhạy phương pháp Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 63 Định phân deoxynivalenol (DON) – Tách chiết – Tinh chế cột – Chạy sắc ký mỏng Zearalenon – Tách chiết – Tinh chế cột chuyển sang pha lỏng kiềm tính – Sắc ký mỏng – Xác minh có mặt zearalenon – Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn-ĐHBK 64 32 Phương pháp miễn dịch học Trong số phương pháp hóa-miễn dịch, phương pháp miễn dịch phóng xạ hay radio-immuno-assay (RIA), phương pháp enzym học miễn dịch hay enzyme-linked-immuno-sorbent-assay (ELISA) lực miễn nhiễm (immuno-affinity) sử dụng định phân độc tố vi nấm Hai phương pháp RIA ELISA dựa cạnh tranh liên kết độc tố chưa biết mẫu phân tích với độc tố biết mẫu chuẩn vị trí đặc hiệu kháng thể Ái lực miễn nhiễm (immuno-affinity) kỹ thuật sắc ký dựa trực tiếp liên kết kháng nguyên (độc tố) với kháng thể cố định cột Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 65 5.1 Phương pháp RIA Phương pháp cần có tiếp xúc đồng thời mẫu phân tích hay mẫu chuẩn với hàm lượng độc tố biết không đổi kháng thể đặc hiệu Độc tố tự độc tố liên kết với kháng thể sau phân tách tiến hành đo hoạt tính phóng xạ phân đoạn Nồng độ độc tố mẫu phân tích xác định dựa đường chuẩn xây dựng tỉ lệ hoạt tính phóng xạ phân đoạn liên kết hoạt tính phóng xạ phân đoạn tự với logarit nồng độ độc tố mẫu chuẩn Các test RIA chủ yếu sử dụng để định phân aflatoxin sử dụng để định phân độc tố T-2, ochratoxin zearalenon Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn-ĐHBK 66 33 Phương pháp ELISA Phương pháp ELISA có hai dạng: – Với kỹ thuật trực tiếp, kháng thể đặc hiệu với hàm lượng xác định cố định sắc ký (hay ống) định phân vi lượng Dung dịch mẫu phân tích lượng biết khơng đổi liên hợp “độc tố-enzym” ủ đồng thời với Sau rửa, liên hợp độc tố-enzyme giữ lại sắc ký thông qua kháng thể tách cách sử dụng chất tạo màu (chromogène) đặc hiệu với enzym Đo cường độ màu máy đánh giá mắt thường – Với kỹ thuật gián tiếp, độc tố cố định sắc ký thông qua liên hợp độc tố-polypeptit Sau dung dịch mẫu phân tích lượng xác định không đổi kháng thể ủ đồng thời với Sau công đoạn rửa, lượng kháng thể gắn kết vào sắc ký xác định cách sử dụng liên hợp enzym “enzymimmunoglobulin (kháng thể đặc hiệu)” Cường độ màu tạo thành sau cho chất sinh màu đặc hiệu với enzym đo máy đánh giá mắt thường Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN 67 Sắc ký lực miễn nhiễm (immuno-affinity) Kỹ thuật sắc ký lực miễn nhiễm (immuno-affinity) (IAC) gồm bước sau: – Kháng thể đặc hiệu trước tiên cố định chất mang trơ gắn vi cột – Dung dịch có chứa độc tố (kháng gen) cần phân tích chạy qua cột – Rửa để loại bỏ chất nhiễm tạp Sau độc tố nhả hấp thụ cách sử dụng dung dịch thích hợp dung dịch rượu etylic – Độc tố vi nấm thu sau tinh chế rửa giải định phân theo phương pháp mô tả Vũ Hồng Sơn-ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn-ĐHBK 68 34 ... huỳnh quang Vũ Hồng Sơn- ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn- ĐHBK 60 30 CHƯƠNG ĐỘC TỐ VI NẤM Giới thiệu chung Phân tích Aflatoxin Chuẩn bị mẫu Phương pháp nhanh sử dụng cột nhồi áp dụng cho sản phẩm rau Phương... chuẩn độ axit với có mặt glycerol, thường áp dụng cho sản phẩm sữa – Phương pháp so màu Vũ Hồng Sơn- ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn- ĐHBK 58 29 Formaldehyt dẫn xuất – Tiến hành chưng cất mẫu có bổ sung... axit cacboxylic Vũ Hồng Sơn- ĐHBK HN PhD Vũ Hồng Sơn- ĐHBK 56 28 Anhydric sunfurơ sunfit – Nhận biết mùi – Con đường hóa học Có nhiều phương pháp kỹ thuật dùng định lượng: a Sản phẩm lỏng (vang,