Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyên hóa di truyền ở trẻ em

Đề tài " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em", được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng quy trình nghiên cứu 2. Phân lập và nuôi cấy invitro tế bào gan phôi thai người 3. Xác định tế bào gốc định hướng dòng gan người bằng phản ứng miễn dịch tế bào 4. Tiến hành thử nghiệm ghép tế bào gan phôi thai người trên chuột nhắt trắng.

BỘ Y TẾ KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU GHÉP TẾ BÀO GAN PHÔI THAI NGƯỜI ĐỂ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH GAN CHUYỂN HÓA DI TRUYỀN Ở TRẺ EM CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: GS.TS.NGUYỄN THANH LIÊM 8729 Hà Nội - 2010 BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU GHÉP TẾ BÀO GAN PHÔI THAI NGƯỜI ĐỂ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH GAN CHUYỂN HÓA DI TRUYỀN Ở TRẺ EM Chủ nhiệm đề tài (ký tên) Cơ quan chủ trì đề tài (ký tên và đóng dấu) BỘ Y TẾ (ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ) Hà Nội - 2010 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Tế bào gốc 5 1.1.1. Định nghĩa 5 1.1.2. Phân loại 5 1.1.3. Tiềm năng ứng dụng 6 1.2. Tế bào gan phôi thai người 8 1.2.1. Định nghĩa 8 1.2.2. Nguồn gốc và đặc điểm 8 1.2.3. Tiềm năng ứng dụ ng 10 1.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nước ghép tế bào gan 11 1.3.1. Nghiên cứu ở nước ngoài 11 1.3.2. Nghiên cứu tại Việt Nam 12 CHƯƠNG II: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Đối tượng nghiên cứu 13 2.2. Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1. Phân lập tế bào gan phôi thai người 13 2.2.2 Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người 14 2.2.3. Hóa miễn dịch huỳnh quang 14 2.2.4. Đánh dấu tế bào gan phôi thai người invitro 15 2.2.5. Ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm 15 2.2.6. Mô và tế bào học 16 2.2.7. Thu thập và phân tích số liệu 16 2.3. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 16 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 3.1. Xây dựng quy trình nghiên cứu 17 3.1.1. Thu thập mẫu nghiên cứu 17 3.1.2. Quy trình xử lý và phân lập tế bào gan phôi thai người 17 3.1.3. Quy trình nuôi cấy tế bào gan thai người 19 3.1.4. Quy trình phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang 20 3.1.5. Quy trình đánh dấu tế bào gan invitro bằng HOECHST 21 3.1.6. Quy trình ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm 22 3.1.7 Quy trình phân tích mô và tế bào học 24 3.1.8. Thu thập và phân tích số liệu 24 3.2. Kết quả phân lập tế bào gan phôi thai người 25 3.3. Kết quả nuôi cấy tế bào gan phôi thai ng ười 25 3.4. Kết quả hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào 27 3.5. Kết quả đánh dấu tế bào invitro bằng HOECHST 28 3.6. Ghép tế bào gan vào mô hình chuột thí nghiệm 29 3.7. Phân tích mô bệnh học 32 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 34 4.1. Phân lập tế bào gan phôi thai người 34 4.2. Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người 34 4.3. Hóa miễn dịch huỳnh quang t ế bào 35 4.4. Kết quả đánh dấu tế bào invitro bằng HOECHST 36 4.5. Ghép tế bào gan trên mô hình chuột thí nghiệm 37 4.6. Phân tích mô bệnh học 39 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I. THÔNG TIN CHUNG 1. Tên đề tài: "Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em" Thuộc: Bệnh Viện Nhi Trung Ương - Chương trình: Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ 2. Chủ nhiệm đề tài: Họ và tên: Nguyễn Thanh Liêm Ngày, tháng, năm sinh: Năm 1952. Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Giáo sư, Tiến sỹ, Bác sỹ Chức vụ: Giám Đốc Bệnh Việ n Nhi TW Điện thoại: Tổ chức: 04.62738566. Mobile: 091542652 Fax: 04.62738573. E-mail: liemnhp@hotmail.com Tên tổ chức đang công tác: Bệnh Viện Nhi Trung Ương. Địa chỉ tổ chức:18/879 Đường La Thành, Đống Đa, Hà nội, Việt Nam Địa chỉ nhà riêng: P303, nhà C, The Manor, Mỹ Đình, Từ Liêm, Hà nội 3. Tổ chức chủ trì đề tài/dự án: Tên tổ chức chủ trì đề tài: Bệnh Viện Nhi Trung Ương Điện thoại: 04.62738573. Fax: 04.62738573 E-mail: nip_vn@hn.vnn.vn Website: http://www.nhp.org.vn Địa chỉ: 18/879 Đường La Thành, Đống Đa, Hà n ội, Việt Nam Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Thanh Liêm Số tài khoản: Ngân hàng: 2 Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Y Tế II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN 1. Thời gian thực hiện đề tài/dự án: - Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 9 năm 2006 đến tháng 9 năm 2009 - Thực tế thực hiện: từ tháng 9 năm 2006 đến tháng 9 năm 2010 - Được gia hạn (nếu có): - Lần 1 từ tháng…. năm…. đến tháng…. năm…. - Lần 2 …. 2. Kinh phí và sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 450 tr.đ, trong đó: + Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 450 tr.đ. + Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.đ. + Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có): b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH: Theo kế hoạch Thực tế đạt được Số TT Thời gian (Tháng, năm) Kinh phí (Tr.đ) Thời gian (Tháng, năm) Kinh phí (Tr.đ) Ghi chú (Số đề nghị quyết toán) 1 9/2006- 100 2006 16.42 2 2007 100 2007 95,998 3 2008 250 2008 104 4 9/2009 2009 155,46 5 2010 38 … 409,878 c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi: Còn dư 40,122 triệu đồng là kinh phí để lại nghiệm thu, sử lý số liệu ,đóng quyển, viết báo cáo, hội thảo lấy ý kiến đóng góp của chuyên gia đầu ngành 3 Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Theo kế hoạch Thực tế đạt được Số TT Nội dung các khoản chi Tổng SNKH Nguồn khác Tổng SNKH Nguồn khác 1 Trả công lao động (khoa học, phổ thông) 250 250 256 256 2 Nguyên, vật liệu, năng lượng 45 45 45 45 3 Thiết bị, máy móc 66 66 66 66 4 Xây dựng, sửa chữa nhỏ 5 Chi khác 89 89 42,878 42,878 Tổng cộng 450 450 409,878 409,878 - Lý do thay đổi (nếu có): Còn dư 40,122 triệu đồng để nghiệm thu và lấy ý kiến chuyên gia, hội thảo ,đóng quyển Đối với dự án: Đơn vị tính: Triệu đồng Theo kế hoạch Thực tế đạt được Số TT Nội dung các khoản chi Tổng SNKH Nguồn khác Tổng SNKH Nguồn khác 1 Thiết bị, máy móc mua mới 2 Nhà xưởng xây dựng mới, cải tạo 3 Kinh phí hỗ trợ công nghệ 4 Chi phí lao động 5 Nguyên vật liệu, năng lượng 6 Thuê thiết bị, nhà xưởng 7 Khác Tổng cộng - Lý do thay đổi (nếu có): 3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án: 4 (Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có) Số TT Số, thời gian ban hành văn bản Tên v ăn bản Ghi chú 1 2 … 4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức đã tham gia thực hiện Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú* 1 Bệnh Viện Phụ Sản Hà Nội Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội Cung cấp mẫu cho nghiên cứu invitro Đã cung cấp 62 mẫu nghiên cứu theo yêu cầu 2 INSERM 00- 20, Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris INSERM 00- 20, Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris Cung cấp mẫu cho nghiên cứu invivo Đã cung cấp 15 mẫu và động vật nghiên cứu - Lý do thay đổi (nếu có): 5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án: (Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân đã tham gia thực hiện Nội dung tham gia chính Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú* 1 Nguyễn Thanh Liêm Nguyễn Thanh Liêm Chủ nhiệm đề tài Nghiệm thu đề tài 2 Ngô Diễm Ngọc Ngô Diễm Ngọc Thư ký đề tài Thực hiện nghiên cứu 3 Nguyễn Huy Bạo Nguyễn Huy Bạo Hợp tác cung cấp mẫu cho nghiên cứu invitro Cung cấp 62 mẫu cho nghiên cứu invitro 4. Tô Minh Hương Tô Minh Hương Hợp tác cung cấp mẫu cho Cung cấp 62 mẫu cho nghiên 5 nghiên cứu invitro cứu invitro 5 Nguyễn Thị Tân Sinh Tư vấn thực hiện nghiên cứu Tư vấn lấy và bảo quản mẫu 6 An Thùy Lan Nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào 7 Vũ Đình Quang Phân lập tế bào Phân lập tế bào 8 Đoàn Thanh Hương Đoàn Thanh Hương Kế toán đề tài Kế toán đề tài 9 Ann Weber Ann Weber Cung cấp mẫu cho nghiên cứu invivo Cung cấp 15 mẫu và động vật thí nghiệm - Lý do thay đổi ( nếu có): 6. Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt được (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* 1 2 - Lý do thay đổi (nếu có): 7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Thực tế đạt được (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* 1 Hội thảo tại BV Nhi TW "Xây dựng quy trình nghiên cứu invitro"- BV Nhi TW- 20/5/2007-23/5/2007- 2 Hội thảo tại BV Nhi TW "Xây dựng quy trình nghiên cứu invivo"- BV Nhi TW- 2/7/2007-5/7/2007 - Lý do thay đổi (nếu có): 8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu: 6 (Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài) Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Theo kế hoạch Thực tế đạt được Người, cơ quan thực hiện 1 Xây dựng quy trình nghiên cứu 9/2006- 12/2007 12/2006- 5/2007 GS.TS. Nguyễn Thanh Liêm BS. Ngô Diễm Ngọc 2 Thu thập mẫu nghiên cứu Phân lập mẫu và nuôi cấy tế bào gan 09/2006- 5/2008 12/2006- 9/2010 BS. Ngô Diễm Ngọc BS. An Thùy Lan 3 Phản ứng miễn dịch tế bào 9/2006- 12/2008 12/2006- 5/2007 BS. Ngô Diễm Ngọc ThS. Vũ Đình Quang 4. Đánh dấu tế bào bằng HOECHST 12/2008- 9/2009 12/2008- 12/2009 Bs Ngô Diễm Ngọc 5. Ghép tế bào trên chuột thí nghiệm 1/2009- 9/2009 1/2009- 9/2010 BS. Ngô Diễm Ngọc 6. Phân tích số liệu, viết nghiệm thu 9/2009 12/2010 GS.TS. Nguyễn Thanh Liêm Bs. Ngô Diễm Ngọc - Lý do thay đổi (nếu có): 1. Do gặp phải một số khó khăn trong quá trình thực hiện phân lập tế bào từ mẫu nghiên cứu, nên thời gian thực hiệnmục tiêu này kéo dài hơn so với thời gian dự kiến. 2. Do khó khăn trong quá trình thực hiện ghép tế bào vào chuột thí nghiệm nên , nên thời gian thực hiện mục tiêu này kéo dài hơn so với thời gian dự kiến, cũng gây ảnh hưởng đến thời gian thu thập mẫu và phân lập mẫu phụ c vụ cho nghiên cứu invivo. III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN SXTN 1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số Tên sản phẩm và Đơn vị đo Số lượng Theo kế Thực tế đạt [...]... Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh đã và đang là một trong những định hướng nghiên cứu của khoa học hiện đại Dựa trên kết quả nghiên cứu bước đầu về tế bào gan phôi thai người, có thể mở ra các nghiên cứu sử dụng các nguồn tế bào gốc khác với mục đích biệt hóa thành tế bào gan, ứng dụng cho điều trị như: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc dây rốn 2 Ghép tế bào nói chung và ghép tế bào. .. của các tế bào biểu mô là E-Cadherine Xét về khả năng ứng dụng trong ghép tế bào để điều trị một số bệnh gan, tế bào gan phôi thai người có nhiều ưu điểm hơn so với tế bào gan trưởng thành [12]: - Tế bào gan phôi thai có kích thước nhỏ hơn (15µm) so với tế bào trưởng thành (30µm), điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc các tế bào sau khi ghép di chuyển qua các xoang tĩnh mạch vào nhu mô gan dễ dàng... Stem cells Tế bào gốc Embryonic stem cells Tế bào gốc phôi ES Adult stem cells Tế bào gốc trưởng thành AS Pluripotent Tế bào gốc vạn tiềm năng Multipotent Tế bào gốc đa tiềm năng Hepatoblast Tế bào gan phôi thai HHF người Cord blood stem cells Tế bào gốc tạo máu Cytokeratine CK Fetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai bê Hepatocyte Tế bào gan Cholangiocyte Tế bào đường mật Epithelial stem cells Tế bào. .. một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em" , được tiến hành với các mục tiêu sau: 1 Xây dựng quy trình nghiên cứu 2 Phân lập và nuôi cấy invitro tế bào gan phôi thai người 3 Xác định tế bào gốc định hướng dòng gan người bằng phản ứng miễn dịch tế bào 4 Tiến hành thử nghiệm ghép tế bào gan phôi thai người trên chuột nhắt trắng 4 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào gốc: 1.1.1 Định nghĩa: Tế bào. .. biệt hóa của tế bào gan phôi thai người Ttheo IMSERM 00-20, Paris 2006) 1.2.3 Tiềm năng ứng dụng : Một số năm gần đây, các thử nghiệm ghép tế bào gan trưởng thành vào điều trị cho các bệnh nhân mắc suy gan cấp hoặc mạn tính, hay một số bệnh gan chuyển hóa di truyền đã được thực hiện ở một số nước như Pháp và Mỹ [13] Trong một số trường hợp, khi các tế bào gan chưa bị thay đổi về cấu trúc, và gan chưa... nghiên cứu sử dụng tế bào gốc tạo máu trong điều trị cho các bệnh nhân mắc bệnh máu 1.2 Tế bào gan phôi thai người: 1.2.1 Định nghĩa: Gan phôi thai người ở giai đoạn 8-13 tuần tuổi được cấu tạo bởi các tế bào nhu mô gan phôi thai (hepatoblast) Đây là những tế bào gốc đa tiềm năng (bipotential stem cells), có khả năng biệt hóa thành hai dòng tế bào riêng biệt: tế bào gan và tế bào đường mật 1.2.2 Nguồn... tế bào được ghép là yếu tố quan trọng quyết định phản ứng thải ghép hay thành công của cuộc ghép Trong bối cảnh đó, tế bào gan phôi thai người xuất hiện như một ý tưởng mới trong lĩnh vực ghép tế bào gốc, và trở thành một nguồn cho hứa hẹn với nhiều ưu thế về hình thái, độ biệt hóa và tính sinh miễn dịch 3 Xuất phát từ thực tiễn này, đề tài " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một. .. triển phôi thai của động vật có vú, gan được hình thành từ mầm của lá thai trong (tuần thứ 3 của thai kỳ ở người) , cùng với sự ra đời một phần của tụy, phổi và tuyến giáp Những tế bào tại vùng này tự nhân lên, phát triển, hình thành một phần chính là nguồn gốc của gan, bao gồm các tế 8 bào gan phôi thai Sau đó, những tế bào này sẽ biệt hóa thành tế bào gan và tế bào đường mật Tế bào gan phôi thai sử... dễ dàng hơn - Tế bào gan phôi thai có khả năng tăng sinh rất lớn ngay cả khi đã được đưa vào nhu mô gan Điều này có thể mang lại một lợi thế lớn trong ứng dụng điều trị, vì chỉ cần đưa một lượng tế bào nhỏ hơn mà có thể thu được hiệu quả lớn hơn so với tế bào gan trưởng thành - Tế bào gan phôi thai có tinh miễn dịch thấp hơn tế bào gan trưởng thành do đặc tính của tế bào non, chưa biệt hóa hoàn chỉnh... 3.1 Tế bào gan thai người ngày thứ 3 sau khi nuôi cấy 26 Hình 3.2 Tế bào gan thai người ngày thứ 4 và thứ 5 sau nuôi 27 cấy Hình 3.3 Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào với các marker 28 Hình 3.4 Đánh dấu tế bào gan thai người bằng HOECHST 29 Hình 3.5 Bộc lộ vùng gan và tĩnh mạch cửa và cắt gan thùy 31 phải Hình 3.6 Ghép tế bào gan vào tĩnh mạch cửa 31 Hình 3.7 Các tế bào gan sau khi ghép mắc lại ở khoảng . tài: " ;Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em& quot; Thuộc: Bệnh Viện Nhi Trung Ương - Chương trình: Đề tài nghiên cứu khoa học. Y TẾ KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU GHÉP TẾ BÀO GAN PHÔI THAI NGƯỜI ĐỂ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH GAN CHUYỂN HÓA DI TRUYỀN Ở TRẺ EM CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: BỆNH. " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em& quot;, được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng quy trình nghiên cứu 2.