62 mẫu nghiên cứu được thu thập tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội cho các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Các sản phụ tự nguyện đình chỉ thai nghén trong khoảng 9-13 tuần thai, sau khi làm các thủ tục đăng ký tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội, sẽ được tiến hành đình chỉ thai nghén theo quy trình của Bệnh Viện.
Mẫu nghiên cứu được thu thập về Bệnh Viện Nhi TƯ, đựng trong chai Duran 250-500ml tùy theo số lượng mẫu được thu thập, vô trùng. Mẫu nghiên cứu được tiến hành xử lý phân lập ngay hoặc được giữ trong nhiệt độ +40, tại ngăn mát tủ lạnh cho đến khi được phân lập trong vòng 6h kể từ khi nhận mẫu. 15 mẫu nghiên cứu được thu thập tại Khoa Sản Bệnh Viện Kremlin Bicetre, và tiến hành xử lý tại phòng thí nghiệm 00-20, phục vụ cho mục đích nghiên cứu trên động vật thí nghiệm.
3.1.2. Quy trình xử lý mẫu và phân lập tế bào gan phôi thai người: Chuẩn bị dụng cụ:
- Khu vực xử lý mẫu sạch - Tủ an toàn sinh học bậc II - Khay thủy tinh vô trùng
- Dao mổ, panh gắp và kéo vô trùng
- Tube Corning vô trùng 15ml x 3 chiếc, 50ml x 2 chiếc - Máy khuấy từ có gia nhiệt
- Con khuấy từ
- Cóng Scott 100 ml vô trùng
- Màng lọc 70µm vô trùng dùng một lần - Pipet aid, pipet thủy tinh 5ml,10ml,25ml.
- Máy ly tâm góc văng
Chuẩn bị hóa chất:
- PBS 1X x 1000 ml đã khử trùng - HEPES
- Collagenase type III (PAA)
- Môi trường nuôi cấy: DMEM-HAM'S F12 Williams E (Sigma), kháng sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine 100µg/ml (Gibco), 2mM Glutamine (Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine Serum (Gibco), 10-8M 3-3"- triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M Hydrocortisol (Merk), 10-8M Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic (Sigma), 1mg/ml apo-transferin (Sigma) và 100µg/ml Vitamin C (Roche).
Quy trình xử lý và phân lập tế bào:
- Tổ chức thai được đặt trên khay thủy tinh, rửa qua bằng PBS 1X. - Gan của thai nhi được phân lập từ tổ chức thai bằng mắt thường, sử
dụng panh kéo và dao cắt.
- Các mảnh gan được thu thập vào tube Corning 15ml vô trùng, đựng sẵn dung dịch HEPES.
- Ly tâm ống 15ml 3 lần với HEPES,
- Chuẩn bị máy khuấy từ 370C, cóng Scott đựng 50ml HEPES có Collagenase type 3, nồng độ 1-2mg/ml tùy theo tuổi thai.
- Cho các mảnh gan vào dung dịch trên, khuấy trên máy khuấy từ 370C trong 1 giờ.
- Sau 1 giờ, thêm 50ml môi trường nuôi cấy tế bào gan để kết thúc quá trình xử lý với Collagenase.
- Hỗn hợp tế bào sau khi xử lý được lọc qua một màng lọc vô trùng kích thước 70µm, và được ly tâm trong 5 phút ở 500 vòng/phút.
- Khối tế bào thu được được tiếp tục rửa 3 lần trong môi trường cho tế bào gan thai người.
- Cuối cùng, các tế bào đựợc đánh giá khả năng sống bằng phản ứng nhuộm nhân với Trypan, đánh dấu các tế bào chết trên tiêu bản Malasser.
3.1.3. Quy trình nuôi cấy tế bào gan thai người: Chuẩn bị dụng cụ: Chuẩn bị dụng cụ:
- Tủ an toàn sinh học bậc 2 - Đĩa nuôi cấy 35mm (Corning)
- Pipet aid, pipet thủy tinh 5ml,10ml, 25ml. - Tủấm 370C CO2 5%
Chuẩn bị hóa chất:
- Môi trường cấy ngày đầu tiên: DMEM-HAM'S F12 Williams E (Sigma)
- Môi trường cấy những ngày tiếp theo: DMEM-HAM'S F12 Williams E
(Sigma), bổ sung thêm kháng sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine
100µg/ml (Gibco), 2mM Glutamine (Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine
Serum (Gibco), 10-8M 3-3"-triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M
Hydrocortisol (Merk), 10-8M Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic
(Sigma), 1mg/ml apo-transferin (Sigma) và 100µg/ml Vitamin C
(Roche).
Quy trình nuôi cấy tế bào gan thai người:
- Tế bào gan sau khi phân lập với Collagenase được đánh giá về số lượng tế bào sống bằng phản ứng nhuộm Trypan, đánh dấu tế bào chết trên lam kính Malasser.
- Cấy tế bào vào đĩa Corning 35mm2 với mật độ 25,000 tế bào/cm2 - Đặt vào tủ cấy 370C CO2 5%.
- 24h sau khi cấy tế bào, đánh giá lại tình trạng mọc của tế bào qua kính hiển vi soi ngược
- Loại bỏ môi trường nổi của ngày đầu tiên, thay thế bằng 2.5ml môi trường mới của ngày thứ hai bổ sung các hoạt chất nhưđã kể trên. - Đưa lại vào tủ cấy 370C CO2 5% và theo dõi những ngày tiếp theo - Thay môi trường 1 ngày/1 lần
- Nuôi tế bào trong 5 ngày, sau đó đưa vào sử dụng cho các mục đích khác.
3.1.4. Quy trình thực hiện phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang: Chuẩn bị dụng cụ:
- Tube Eppendorf 1.5ml
- Pipet man và đầu côn 20-200µl, và 200-1000µl - Hộp kín tránh ánh sáng - Máy lắc - Kính hiển vi huỳnh quang Chuẩn bị hóa chất: - PBS 1X - Triton 0.1% - Paraformaldehyde 4%
- Kháng thể đơn dòng của chuột kháng albumin người, gắn trực tiếp với FUTC (fluorochrome) (1/100, Dako), hoặc với kháng thểđơn dòng của thỏ kháng α1-antitrypsin người (1/100, Dako), kháng thể đơn dòng của chuột kháng CK-19 (1/100, Dako), kháng CK-18 (1/200, Dako), kháng CK-17 (1/100, Dako), kháng CK8/18 (1/200, Dako). kháng thể đơn dòng ở chuột kháng E-Cadherin người (1/200, Dako).
Quy trình phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang:
- Tế bào gan được rửa 3 lần với PBS 1X (Gibco)
- Tế bào được cố định trong PBS-Triton 0.1% trong 5 phút tại nhiệt độ phòng, chuẩn bị cho gắn kháng thể kháng cytokeratine,
một số kháng thể khác. S
- Sau khi cốđịnh, tế bào được rửa 3 lần trong PBS 1X
- Xử lý trong PBS-Gelatin 1% trong vòng 1 giờ để làm tăng tính thấm màng tế bào.
- Tế bào được ủ với một số loại kháng thể khác nhau: kháng thể đơn dòng của chuột kháng albumin người, gắn trực tiếp với FUTC (fluorochrome) (1/100, Dako), hoặc với kháng thể đơn dòng của thỏ kháng α1-antitrypsin người (1/100, Dako), kháng thể đơn dòng của chuột kháng CK-19 (1/100, Dako), kháng CK-18 (1/200, Dako), kháng CK-17 (1/100, Dako), kháng CK8/18 (1/200, Dako, kháng thể đơn dòng ở chuột kháng E-Cadherin người (1/200, Dako).
- Sau khi ủ với kháng thể, tế bào được rửa 3 lần với PBS 1X để loại bỏđi những kháng thể thừa không được gắn trên màng tế bào.
- Ủ với kháng thể thứ hai kháng lại kháng thể đầu tiên, gắn với FITC (1/1500).
- Tiêu bản sau khi hoàn thành được phủ một lớp DAPI cho phép nhuộm nhân tế bào thành màu xanh, và phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang.
3.1.5. Quy trình đánh dấu tế bào gan invitro bằng HOECHST Chuẩn bị dụng cụ: Chuẩn bị dụng cụ:
- Tube Eppendorf 1.5ml
- Pipet man và đầu côn 20-200µl, và 200-1000µl - Hộp kín tránh ánh sáng
- Kính hiển vi huỳnh quang
Chuẩn bị hóa chất:
- HOECHST (Bis Benzimid, Sigma) - Fetal Bovin Serum (Gibco)
Quy trình đánh dấu tế bào bằng HOECHST invitro:
- Ủ 20x106 tế bào trong 2ml môi trường không có FBS với 10µl HOECHST (Sigma) trong vòng 30 phút ở 370C.
- Thêm vào đó FBS theo tỷ lệ 1/10 để kết thúc quá trình đánh dấu tế bào.
- Rửa khối tế bào 3 lần, mỗi lần đều cần chuyển khối tế bào sang các ống
đựng mới, để loại trừ lượng chất đánh dấu dư thừa đọng lại trên thành
ống đựng tế bào cũ.
- Những tế bào sau khi đánh dấu được phân tích trên kính hiển vi huỳnh quang để đánh giả tỷ lệ phần trăm số tế bào được đanh dấu trên tổng số tế bào đã có.
3.1.6. Quy trình ghép tế bào trên mô hình chuột thí nghiệm: Chuẩn bị dụng cụ: Chuẩn bị dụng cụ:
- Bơm tiêm vô trùng 1ml
- Bơm tiêm Hamilton 10µl vô trùng - Dao mổ, kéo, panh
- Bàn cốđịnh chuột phủ toan vô trùng - Băng dính cốđịnh - Tampon vô trùng - Gạc vô trùng Chuẩn bị hóa chất: - Ketamin (Imagene) - Xylastin (Rampoun) - Nước muối sinh lý. - Betadine
Chuẩn bị chuột thí nghiệm:
- Chuột trưởng thành
Quy trình gây mê chuột
- Pha 0.9ml Ketamin (Imagene) và 0.2% Xylastin (Rampoun) trong 3.8ml nước muối sinh lý.
- Tiêm vào khoang màng bụng của chuột nhắt trắng trưởng thành với hàm lượng 1ml/20mg trọng lượng.
- Thời gian tác dụng ước tính trong vòng 30 phút.
Quy trình ghép tế bào trên mô hình chuột trưởng thành:
- Sau khi gây mê, chuột nhắt được cốđịnh trên bàn mổđã chuẩn bị sẵn - Đặt chuột nằm ngửa, cố định bốn chân chuột xuống bàn mổ bằng băng
dính cốđịnh. Sát trùng vùng bụng
- Mở bụng chuột vùng dưới hạ sườn theo đường mổ ngang - Bộc lộ vùng ổ bụng, và vùng gan chuột.
- Dùng gạc mềm làm ẩm bằng nươc muối sinh lý phủ lên vùng ruột - Cặp tại cuống gan. Cắt 40% gan ở thùy phải. Khâu cầm máu - Bộc lộ vùng tĩnh mạch cửa.
- Tế bào đã được đánh dấu được chuẩn bị trong bơm tiêm 1ml, nối với catheter 29G. Đặt catheter vào tĩnh mạch cửa, bơm chậm tế bào trong vòng 10 phút. Nồng độ tế bào ước tính 8x105 tế bào trong 300µl nước muối sinh lý vô trùng.
- Rút catheter, cầm máu bằng tampon. - Đóng bụng chuột.
- Sát trùng vết mổ
- Đặt chuột trở lại lồng. Làm ấm chuột dưới bóng đèn 60W cho đến khi hồi tỉnh
- Đánh giấu lồng và bắt đầu theo dõi hết 5 ngày sau mổ.
Quy trình ghép tế bào trên mô hình chuột sơ sinh:
- Chuột sơ sinh 3-5 ngày sau đẻđược tiêm tế bào trực tiếp không cần gây mê
- Bộc lộ vùng lách của chuột. (Nhìn thấy dưới da)
- Chuẩn bị tế bào trong bơm tiêm Halminton 10µl qua đường dưới da. - Bơm tế bào vào vùng lách qua da, tránh tiêm tế bào vào ổ bụng. Nồng
độ tế bào ước tính 4x105 tế bào trong 300µl nước muối sinh lý vô trùng. - Sau khi tiêm, đặt chuột vào lồng riêng. Làm ấm dưới bóng đèn 60W. - Bắt đầu theo dõi chuột sau khi tiêm cho đến hết 5 ngày sau tiêm.
3.1.7. Quy trình phân tích mô và tế bào học: Chuẩn bị dụng cụ: Chuẩn bị dụng cụ:
- Khuôn nhựa giữ mẫu bệnh phẩm - Bình đựng nitơ lỏng
- Dao mổ, kéo và panh - Lam kính - Lamen 24x54 mm - Máy cắt lạnh - Kính hiển vi huỳnh quang Chuẩn bị hóa chất: - Cryopreservation - Nitơ lỏng
Quy trình phân tích mô và tế bào học:
- Chuột sau khi được ghép được nuôi sống trong 5 ngày. - Sau đó toàn bộ gan của chuột đựoc ghép được thu hoạch.
- Gan sau khi thu hoạch được làm đông lạnh trong isopentan, và được giữở -800C.
- Gan đựợc cắt lạnh 7µm, dán trên lam kính, và được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang.
3.1.8. Thu thập và phân tích số liệu:
- Đếm số lượng tế bào được đanh dấu trên mỗi lam kính
= (số tế bào đếm được trên tiêu bản/100/450)x100.
3.2. Kết quả phân lập tế bào gan phôi thai người:
Trong số 62 mẫu thu thập từ Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội phục vụ cho các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, có:
- 22 mẫu có đủđiều kiện đưa vào xử lý, và phân lập được gan từ tổ chức thai, thu được tế bào gan.
- 15 mẫu sau khi thu thập mảnh gan từ tổ chức thai, không đủ điều kiện để tiến hành phân lập, do số lượng tế bào quá ít hoặc mẫu bị nhiễm trùng.
- 25 mẫu còn lại không thu thập được các mảnh gan từ tổ chức thai. Trong số 15 mẫu thu thập từ Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris, tất cả các mẫu này đều đủđiều kiện đưa vào xử lý và phân lập tế bào gan.
3.3. Kết quả nuôi cấy tế bào gan phôi thai người:
Trong quá trình phát triển của phôi thai, gan là cơ quan sản sinh ra các tế bào gốc tạo máu. Do vậy, khi chúng tôi phân lập tế bào gan từ các mảnh gan của thai nhi tại thời kỳ này, có 3 loại tế bào cùng tồn tại: Nhiều nhất là các tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic stem cells). Tế bào nhu mô gan là các tế bào gốc (Hepatoblasts) có khả năng biệt hóa thành tế bào gan (Hepatocytes) và tế bào đường mật (cholangiocytes), ở các giai đoạn biệt hóa khác nhau. Do vậy, sẽ tồn tại song song cả tế bào nhu mô gan ở giai đoạn chưa biệt hóa là tế bào gốc, các tế bào đã biệt hóa thành tế bào gan và tế bào đường mật.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu trên các mảnh gan của thai nhi từ 9-13 tuần tuổi do đặc điểm của các loại tế bào trên. Thai dưới 9 tuần tuổi không có khả năng thu thập được gan. Thai trên 13 tuần tuổi, tỷ lệ các tế bào gốc giảm xuống đáng kể, do phần lớn các tế bào này đã biệt hóa thành tế bào gan và tế bào đường mật.
Các tế bào gốc tạo máu được loại bỏ dần khỏi quẩn thể tế bào thu được qua các lần rửa khối tế bào, và thông thường sau hai ngày nuôi cấy, các tế bào này
sẽ không bám dính xuống bề mặt đĩa nuôi cấy mà sẽ nổi lên trên môi trường nuôi cấy chọn lọc cho tế bào gan, và sẽ bị loại bỏ dần qua các lần thay rửa môi trường hằng ngày.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào phân lập trong 5 ngày. Từ ngày thứ nhất đến ngày thứ ba, tế bào sau khi bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy phát triển nhanh, các tế bào gan có hình đa giác 5 cạnh, nhân tròn có hai hạt nhân (Hình 3.1). Tuy nhiên từ ngày thứ 4 trở di, có sự xuất hiện của các tế bào liên kết, các tế bào này có xu hướng phát triển nhanh và lấn át các tế bào gan (Hình 3.2a). Sau ngày thứ 5, chúng tôi quan sát thấy tế bào gan có xu hướng thoái triển, tăng kích thước nhân và tế bào chất, sau đó các tế bào bị vỡ, không còn nguyên hình thái ban đầu (Hình 3.2b)
22 mẫu sau khi xử lý đã được phân lập bằng collagenase để thu được tế bào gan theo quy trình chuẩn. Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường cho tế bào gan, tuy nhiên chúng tôi quan sát thấy số lượng các tế bào phân chia rất hạn chế. Các tế bào này sau khi phân lập đã được đưa vào nuôi cấy.
Hình 3.2: Tế bào gan thai người ngày thứ 4 sau nuôi cấy (a). Tế bào gan thai người ngày thứ 5 sau nuôi cấy (b)
3.4. Kết quả hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào:
Chúng tôi tiến hành phân tích một số marker đặc hiệu trên các tế bào thu thập được sau khi nuôi cấy ngày thứ 5, tránh trường hợp các tế bào già đi và thoái triển. Đây là các tế bào biểu mô bộc lộ các marker bề mặt như: CK8/18 (Hình 3.3a). Chúng tôi quan sát thấy một số lượng lớn các tế bào là tế bào gốc (bipotentes), biểu hiện cùng một lúc các marker của thế bào gan Alpha-1- antitrypsin và C-met (Hình 3.3b và 3.3c), và của marker đường mật là CK19 (Hình 3.3d). Tuy nhiên, chúng tôi cũng thấy có một tỷ lệ nhất định các tế bào chỉ biểu hiện các marker của các tế bào đường mật là CK7 nhưng không biểu hiện các marker của tế bào gan (Hình 3.3e). Điều này chứng tỏ rằng, các tế bào chúng tôi thu được là một hỗn hợp các tế bào không đồng nhất, chúng bao gồm các tế bào gốc bipotent chưa biệt hóa, cũng như cả các tế bào gan và tế bào đường mật đã biệt hóa và trưởng thành hơn.
Hình 3.3: Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào với các marker
(a) CK8/18 (x40), (b) Alpha-1-antitripsin 1+DAPI (x20), (c) C-met (x20), (d) CK19 (x60), (e) CK7+DAPI (x20), (f) Chứng âm (x10)
3.5. Kết quảđánh dấu tế bào invitro bằng HOECHST:
HOECHST là một chất đánh dấu nhân huỳnh quang, bằng cách gắn lên các
