Thực nghiệm này cho phép đưa trực tiếp tế bào gan vào tĩnh mạch cửa. Sau khi tế bào được đưa vào tĩnh mạch cửa, đường đi của tế bào được mô tả như sau:
Hình 4.1: Đường đi của tế bào gan sau khi được bơm vào tĩnh mạch cửa
(Nguồn từ INSERM 00-20, Paris)
Các tế bào sau khi vựợt qua xoang tĩnh mạch và khoảng cửa sẽ vào nhu mô gan và phát triển tại đây. Các tế bào sau khi ghép tại vùng gan mà chúng khu trú được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang. Có hai vùng thuộc nhu mô gan được phân tích: khoảng cửa và vùng nhu mô gan.
hiện nghiên cứu ghép tế bào gan để thử nghiệm về kỹ thuật ghép sau khi đã đựoc tiến hành cắt gan 40% ở thùy phải. Nhóm thử nghiệm đầu tiên này không thành công, không có chuột sống sau khi được ghép tế bào. Nguyên nhân có thể liên quan đến liều gây mê và kỹ thuật cắt gan.
Nhóm thứ hai với cải tiến về kỹ thuật cắt gan bằng mối chỉ Vicryl đã cho kết quả khả quan hơn nhóm đầu tiên. Có 2 chuột sống sau ghép. Cả hai chuột này đều phát hiện thấy có tế bào ghép trong nhu mô gan khi phân tích mô bệnh học.
Chúng tôi nhận thấy tỷ lệ sống sau ghép ở nhóm chuột sơ sinh (74%) cao hơn ở nhóm chuột trưởng thành (20%). Lý do có thể là nhóm chuột trưởng thành phải trải qua phẫu thuật cắt gan, bơm tế bào trực tiếp và tĩnh mạch cửa. Quá trình này gây sang chấn lớn cho chuột. Chuột có thể tử vong do chảy máu, do tắc mạch, do nhiễm trùng. Trong khi đó, chuột sơ sinh chỉ cần tiêm tế bào qua da vào vùng lách, nên không ảnh hưởng nhiều đến sức sống.
Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện tế bào ghép trong nhu mô gan ở chuột trưởng thành (100%) cao hơn so với chuột sơ sinh (40%) ở nhóm sống sau ghép. Do ở chuột trưởng thành, tế bào được bơm trực tiếp vào tĩnh mạch cửa, trong khi ở nhóm chuột sơ sinh, tế bào được đưa qua đường lách bằng tiêm qua da. Tại thời kỳ này, mặc dù lách là một cơ quan có thể nhìn thấy qua da chuột, nhưng để chắc chắn tế bào được bơm vào lách chứ không bị tiêm ra ngoài hoặc vào ổ bụng là một kỹ thuật phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm thực hiện.
Với những kết quả trên, chúng tôi nhận thấy đây chỉ là thực nghiệm ban đầu, với số mẫu nhỏ và thời gian nuôi chuột sau ghép ngắn, chỉ trong vòng 5 ngày. Vì đây là ghép dị loài, lấy tế bào gan người ghép vào cơ thể chuột, nên sau 5 ngày thường xảy ra phản ứng thải ghép. Các tế bào ghép sẽ bị hệ miễn dịch của chuột phá hủy, hoặc chuột sẽ tử vong do hậu quả của các phản ứng thải ghép cấp. Do vậy, kết quả trong nghiên cứu này có ý nghĩa chỉ ra rằng kỹ thuật ghép ban đầu trên mô hình này là khả thi, và là cơ sở để tiến hành các
nghiên cứu xa hơn.
Trên thế giới, các thử nghiệm ghép dị loài thường được thực hiện trên các mô hình động vật được gây suy giảm miễn dịch, nuôi trong môi trường sạch đặc biệt. Các thử nghiệm trên mô hình này có thể theo dõi trong một khoảng thời gian dài hơn tùy vào điều kiện nuôi dưỡng và đặc điểm của vật nuôi. Tuy nhiên tại Việt nam chưa có điều kiện thực hiện thí nghiệm đối với loại mô hình này nên trong khuôn khổ của nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra kết quả của một theo dõi ngắn hạn trên mô hình chuột nhắt thường.
4.6. Phân tích mô bệnh học:
Qua phân tích mô bệnh học, chúng tôi ước tính số tế bào ghép được phát hiện trong nhu mô gan của chuột trưởng thành chiếm 3.7%, chuột sơ sinh chiếm 7.5%. Điều này phản ảnh hiệu quả ghép trên hai mô hình chuột này là khác nhau, và cao hơn ở nhóm chuột sơ sinh.
Tuy nhiên ở cả hai mô hình chuột này, số lượng tế bào mắc lại ở khoảng cửa còn nhiều (Hình 8). Các tế bào sẽ không xâm nhập được vào nhu mô gan để nhân lên thay thế các tế bào nhu mô gan của cơ thể nhận, và sẽ chết tại đây sau vài ngày sau ghép. Mặc dù kích thước của tế bào gan phôi thai người (15µ) nhỏ hơn kích thước của tế bào gan người trưởng thành (30µm)
Một số yếu tố ảnh hưởng đến chỉ số đánh giá hiệu quả ghép như: kỹ thuật ghép đơn giản hay phức tạp, tỷ lệ sống sau ghép, tỷ lệ phát hiện tế bào ghép trong nhu mô gan. Tuy nhiên, có một số lợi thế ở mô hình chuột sơ sinh so với chuột trưởng thành như:
- Cơ thể chuột sơ sinh nhỏ hơn, do đó có thể đạt được hiệu quả ghép tốt hơn với lượng tế bào đưa vào với thể tích ít hơn, tránh được các biến chứng liên quan đến tắc mạch. Hơn nữa, tránh được tình trạng thiếu tế bào ghép so với trọng lượng cơ thể nhận.
- Về lý thuyết, hệ miễn dịch của chuột sơ sinh chưa trưởng thành đầy đủ, do đó các phản ứng thải ghép ở chuột sơ sinh yếu hơn ở chuột trưởng thành.
Do vậy, với nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy thực nghiệm ghép tế bào gan trên mô hình chuột sơ sinh có hiệu quả hơn mô hình chuột trưởng thành.
CHƯƠNG V
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN:
1. Phân lập thành công tế bào gan phôi thai người:
22/62 (35%) mẫu thai từ 9-13 tuần tuổi của các bà mẹ tự nguyện đình chỉ thai nghén từ Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội được phân lập
15/15 (100%) mẫu thai từ 9-13 tuần tuổi các bà mẹ tự nguyện đình chỉ thai nghén từ Bệnh Viện Kremlin Bicetre Paris được phân lập
2. Nuôi cấy thành công tế bào gan phôi thai người trong môi trường invitro
3. Phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào:
Hợp tế bào thu được là không đồng nhất, bao gồm: các tế bào gốc bipotent biểu hiện cùng một lúc marker của tế bào gan Alpha-1-antitrypsine, C-met, và marker của tế bào đường mật CK 19. Ngoài ra còn có các tế bào chỉ thể hiện marker của tế bào đường mật là CK 7.
4. Ghép tế bào thành công trên mô hình chuột trưởng thành và sơ sinh với các đặc điểm như sau:
- Tỷ lệ sống sau ghép ở nhóm chuột sơ sinh (74%) cao hơn ở nhóm chuột trưởng thành (20%).
- Tỷ lệ phát hiện tế bào ghép trong nhu mô gan ở chuột trưởng thành (100%) cao hơn so với chuột sơ sinh (40%) ở nhóm sống sau ghép.
- Hiệu quả ghép ở chuột sơ sinh (7.5%) cao hơn ở chuột trưởng thành (3.7%)
II. KIẾN NGHỊ
Sau khi thực hiện đề tài nghiên cứu này, chúng tôi có một số kiến nghị sau: 1. Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh đã và đang là một trong những định hướng nghiên cứu của khoa học hiện đại. Dựa trên kết quả nghiên cứu bước đầu về tế bào gan phôi thai người, có thể mở ra các nghiên
cứu sử dụng các nguồn tế bào gốc khác với mục đích biệt hóa thành tế bào gan, ứng dụng cho điều trị như: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc dây rốn...
2. Ghép tế bào nói chung và ghép tế bào gan là một cách thức điều trị mới, đã và đang được nghiên cứu khá rộng rãi ở nước ngoài do một số ưu điểm của phương pháp này như giảm can thiệp phẫu thuật, giải quyết vấn đề người cho, giảm chi phí thực hiện...Do vậy, các nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này cần thiết được tiếp tục triển khai để có thể đưa các nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm đến gần hơn với thử nghiệm lâm sàng, phục vụ cho mục đích điều trị bệnh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. IJ, F. journal hepatology 40, 878 886 (2004).
2. Allen, K. J. & Soriano, H. E. Liver cell transplantation: the road to clinical application. J Lab Clin Med 138, 298-312 (2001).
3. Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Palmiter, R. D. & Brinster, R. L. Complete
reconstitution of mouse liver with xenogeneic hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 4942-6 (1995).
4. Grompe, M., Laconi, E. & Shafritz, D. A. Principles of therapeutic liver repopulation. Semin Liver Dis 19, 7-14 (1999).
5. De Vree, J. M. et al. Correction of liver disease by hepatocyte transplantation in a mouse model of progressive familial intrahepatic cholestasis.
Gastroenterology 119, 1720-30 (2000).
6. Fausto, N. & Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mech Dev 120, 117-30 (2003).
7. Roskams, T. A., Libbrecht, L. & Desmet, V. J. Progenitor cells in diseased human liver. Semin Liver Dis 23, 385-96 (2003).
8. Wagers, A. J. & Weissman, I. L. Plasticity of adult stem cells. Cell 116, 639-48 (2004).
9. Lagasse, E. et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med 6, 1229-34 (2000).
10. Camargo, F. D., Finegold, M. & Goodell, M. A. Hematopoietic
myelomonocytic cells are the major source of hepatocyte fusion partners. J Clin Invest 113, 1266-70 (2004).
11. Susick, R. et al. Hepatic progenitors and strategies for liver cell therapies. Ann N Y Acad Sci 944, 398-419 (2001).
12. Zaret, K. S. Regulatory phases of early liver development: paradigms of organogenesis. Nat Rev Genet 3, 499-512 (2002).
13. Mahieu-Caputo, D. et al. Repopulation of athymic mouse liver by
cryopreserved early human fetal hepatoblasts. Hum Gene Ther 15, 1219-28 (2004).
14. Allain, J. E. et al. Immortalization of a primate bipotent epithelial liver stem cell. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 3639-44 (2002).
15. Naldini, L. et al. The tyrosine kinase encoded by the MET proto-oncogene is activated by autophosphorylation. Mol Cell Biol 11, 1793-803 (1991).
16. Royal, I. & Park, M. Hepatocyte growth factor-induced scatter of Madin-Darby canine kidney cells requires phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem 270, 27780-7 (1995).
17. Cantley, L. C. The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science 296, 1655-7 (2002).
18. Ponzetto, C. et al. Specific uncoupling of GRB2 from the Met receptor.
Differential effects on transformation and motility. J Biol Chem 271, 14119-23 (1996).
19. Boccaccio, C. et al. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature 391, 285-8 (1998).
20. Amicone, L. et al. Temporal and tissue-specific expression of the MET ORF driven by the complete transcriptional unit of human A1AT gene in transgenic mice. Gene 162, 323-8 (1995).
21. Amicone, L. et al. Transgenic expression in the liver of truncated Met blocks apoptosis and permits immortalization of hepatocytes. Embo J 16, 495-503 (1997).
22. Rodrigues, G. A. & Park, M. Dimerization mediated through a leucine zipper activates the oncogenic potential of the met receptor tyrosine kinase. Mol Cell Biol 13, 6711-22 (1993).
23. Peschard, P. et al. Mutation of the c-Cbl TKB domain binding site on the Met receptor tyrosine kinase converts it into a transforming protein. Mol Cell 8,
24. Nitou, M., Sugiyama, Y., Ishikawa, K. & Shiojiri, N. Purification of fetal mouse hepatoblasts by magnetic beads coated with monoclonal anti-e-cadherin antibodies and their in vitro culture. Exp Cell Res 279, 330-43 (2002).
25. Thomson, J. A. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-7 (1998).
26. Zhen, Z. et al. Structural and functional domains critical for constitutive activation of the HGF-receptor (Met). Oncogene 9, 1691-7 (1994).
27. Jeffers, M., Koochekpour, S., Fiscella, M., Sathyanarayana, B. K. & Vande Woude, G. F. Signaling requirements for oncogenic forms of the Met tyrosine kinase receptor. Oncogene 17, 2691-700 (1998).
28. Delgado, J. P. et al. Long-term controlled immortalization of a primate hepatic progenitor cell line after Simian virus 40 T-Antigen gene transfer. Oncogene
24, 541-51 (2005).
29. Gropp, M. et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Mol Ther 7, 281-7 (2003).
BÁO CÁO TÓM TẮT I.MỞ ĐẦU
Tế bào gốc là một nhóm các tế bào có khả năng vô hạn trong việc tự thay mới, và biệt hoá thành nhiều loại tế bào của các mô, cơ quan khác nhau trong cơ thể. Vì thế, tế bào gốc được xem như một nguồn tế bào tiềm năng có thể dùng để khôi phục và tái tạo lại những tổn thương của các mô và cơ quan.
Gan là một trong những cơ quan mang nhiều chức năng nhất của cơ thể, và là cơ quan dễ bị tổn thương bởi nhiều nguyên nhân bẩm sinh và mắc phải, nếu không được điều trị sẽ nhanh chóng dẫn đến tử vong.
Hiện nay ghép gan đang là phương pháp điều trị hiệu quả duy nhất cho các tổn thương gan trầm trọng. Tuy nhiên biện pháp này gặp rất nhiều khó khăn như kỹ thuật can thiệp phức tạp, tỷ lệ thải ghép cao và đặc biệt là hạn chế về số lượng người cho gan. Trong bối cảnh đó, liệu pháp tế bào sử tế bào gốc biệt hoá thành tế bào gan rồi cấy ghép để chúng tái tạo lại gan tổn thương được xem như một hướng điều trị mới đầy triển vọng.
Với mục tiêu lựa chọn nguồn tế bào gốc nào đểứng dụng cho điều trị, tế bào gan phôi thai người xuất hiện như một ý tưởng mới trong lĩnh vực ghép tế bào gốc, và trở thành một nguồn cho hứa hẹn với nhiều ưu thế về hình thái, độ biệt hóa và tính sinh miễn dịch.
Xuất phát từ thực tiễn này, đề tài " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị một số bệnh gan chuyển hóa di truyền ở trẻ em", được tiến hành với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng quy trình nghiên cứu
2. Phân lập và nuôi cấy invitro tế bào gan phôi thai người
tế bào
4. Tiến hành thử nghiệm ghép tế bào gan phôi thai người trên chuột nhắt trắng.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu:
62 mẫu thai trong khoảng 9-13 tuần tuổi của những sản phụ tự nguyện đình chỉ thai nghén tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội và 15 mẫu thai khoảng 9-13 tuần tuổi của những sản phụ tự nguyện đình chỉ thai nghén tại Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris.
2. Phương pháp nghiên cứu:
Nghiên cứu thực nghiệm ứng dụng các kỹ thuật sinh học trong phân lập nuôi cấy và đánh giá đặc điểm của tế bào gan phôi thai người invitro và invivo:
- Phân lập tế bào gan phôi thai người từ mẫu nghiên cứu - Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người
- Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào
- Đánh dấu tế bào gan phôi thai người invitro
- Ghép tế bào trên mô hình chuột nhắt trắng - Mô và tế bào học
- Phân tích số liệu
Các hóa chất và trang thiết bị sử dụng:
Hóa chất:
PBS 1X x 1000 ml đã khử trùng, HEPES, Collagenase type III (PAA), Môi trường nuôi cấy: DMEM-HAM'S F12 Williams E (Sigma), kháng sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine 100µg/ml (Gibco), 2mM Glutamine
(Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine Serum (Gibco), 10-8M 3-3"-triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M Hydrocortisol (Merk), 10-8M Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic (Sigma), 1mg/ml apo-transferin (Sigma) và 100µg/ml Vitamin C , Triton 0.1%, Paraformaldehyde 4%,
Kháng thể kháng albumin, kháng α1-antitrypsin, kháng CK-19, kháng CK-18, kháng CK-17, kháng CK8/18, kháng E-Cadherin.
Trang thiết bị:
Khu vực xử lý mẫu sạch, Tủ an toàn sinh học bậc II, Khay thủy tinh vô trùng, Dao mổ, panh gắp và kéo vô trùng, Tube Corning vô trùng, Máy khuấy từ có gia nhiệt, Con khuấy từ, Cóng Scott 100 ml vô trùng, Màng lọc 70µm vô trùng dùng một lần, Pipet aid, pipet thủy tinh 5ml,10ml,25ml, Máy ly tâm góc văng, Tủ an toàn sinh học bậc 2, Đĩa nuôi cấy 35mm (Corning), Pipet aid, pipet thủy tinh 5ml,10ml, 25ml, Tủ ấm 370C CO2 5%.
III. DANH MỤC KẾT QUẢ
3.2. Kết quả phân lập tế bào gan phôi thai người:
Trong số 62 mẫu thu thập từ Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội phục vụ cho các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, có:
- 22 mẫu có đủ điều kiện đưa vào xử lý, và phân lập được gan từ tổ chức thai, thu được tế bào gan.
- 15 mẫu sau khi thu thập mảnh gan từ tổ chức thai, không đủ điều kiện để tiến hành phân lập, do số lượng tế bào quá ít hoặc mẫu bị nhiễm trùng. - 25 mẫu còn lại không thu thập được các mảnh gan từ tổ chức thai.
Trong số 15 mẫu thu thập từ Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris, tất cả các mẫu này đều đủđiều kiện đưa vào xử lý và phân lập tế bào gan.