Hai chuột trường thành và 5 chuột sơ sinh sống sau khi ghép 5 ngày được lấy gan để phân tích. Mảnh gan sau khi cắt được làm đông lạnh và cắt lạnh. Trên cả hai mẫu gan của 2 chuột trưởng thành và 3/5 chuột sơ sinh có phát hiện được các tế bào ghép dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nhiều tế bào sau khi ghép mắc lại ở khoảng cửa của gan, không xâm nhập được vào nhu mô gan (Hình 3.7). Tuy nhiên trên nhiều lát cắt chúng tôi phát hiện thấy nhiều cụm tế bào đã xâm nhập vào nhu mô gan. (Hình 3.8 và 3.9)
Hình 3.7: Các tế bào gan sau khi ghép mắc lại ở khoảng cửa
Hình 3.9: Các tế bào gan xâm nhập vào nhu mô gan chuột sơ sinh Chúng tôi tiến hành đếm số tế bào được đánh dấu trên 100 vi trường. Giả sử mỗi vi trường có tổng số 450 tế bào. Theo công thức tính:
(Tổng số tế bào ghép/100/450)x100 sẽ cho phép chúng tôi ước tính được phân trăm số tế bào gan thai người được ghép trong nhu mô gan của chuột thí nghiệm. Trong nghiên cứu của chúng tôi, ở chuột trưởng thành, phần trăm số tế bào gan được ghép có trong nhu mô gan chuột là 3.7%, ở chuột sơ sinh là 7.5%.
CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 4.1. Phân lập tế bào gan phôi thai người:
Gan của thai nhi trong khoảng 9-13 tuần tuổi từ những người mẹ tự nguyện đình chỉ thai nghén, được thu thập tại Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội. Chương trình này đã được sự thống nhất của lãnh đạo giữa hai bệnh viện.
62 mẫu thu thập từ Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội được chia thành ba mức độ khác nhau:
- 22 mẫu có đủđiều kiện đưa vào xử lý, và phân lập được gan từ tổ chức thai, thu được tế bào gan. Đây là những mẫu chủ yếu ở tuần thai từ 12- 13 tuần. Ngoài ra đây là những mẫu tổ chức thai còn tương đối nguyên vẹn.
- Có 15 mẫu sau khi thu thập mảnh gan từ tổ chức thai, không đủ điều kiện để tiến hành phân lập, do số lượng tổ chức gan thu được quá ít. Khi đưa vào phân lập không thu được đủ tế bào gan để nuôi cấy.
- Có 25 mẫu còn lại không thu thập được các mảnh gan từ tổ chức thai. Đây là những mẫu chủ yếu ở tuần thai nhỏ, từ 9-11 tuần tuổi, hoặc những mẫu không còn đủ nguyên vẹn để tiến hành phân tích.
15 mẫu thu thập tại Bệnh Viện Kremlin Bicetre, những mẫu thai phục vụ cho chương trình nghiên cứu được thu thập riêng biệt vào các túi bảo quản riêng biệt bằng hệ thống hút vô trùng, với lực hút khác nhau tương ứng với từng tuần thai khác nhau, để tránh làm tổn thương đến tổ chức thai tối đa.Trong điều kiện của Việt nam, do không được trang bị hệ thống trên nên chất lượng mẫu bịảnh hưởng.
Số mẫu có thểđưa vào nghiên cứu invitro chỉ chiếm 35% 4.2. Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người:
Các tế bào sau khi phân lập được nuôi cấy trong đĩa nuôi cấy tế bào (Corning 35mm) với môi trường pha chế cho tế bào gan thai người. Sau ngày đầu tiên
của quá trình nuôi cấy, môi trường nuôi cấy đầu tiên được thay thế và bổ sung thêm một số chất nuôi dưỡng khác, trong vòng 5 ngày.
Tế bào gan phôi thai người là tế bào nhạy cảm trong môi trường nuôi cấy, dễ bị tổn thương và khả năng phân bào tăng sinh rất hạn chế. Từ ngày thứ nhất đến ngày thứ ba, tế bào sau khi bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy phát triển nhanh, các tế bào gan có hình đa giác 5 cạnh, nhân tròn có hai hạt nhân. Tuy nhiên từ ngày thứ 4 trở di, có sự xuất hiện của các tế bào liên kết, các tế bào này có xu hướng phát triển nhanh và lấn át các tế bào gan. Sau ngày thứ 5, chúng tôi quan sát thấy tế bào gan có xu hướng thoái triển, tăng kích thước nhân và tế bào chất, sau đó các tế bào bị vỡ, không còn nguyên hình thái ban đầu.
Do vậy, việc phát triển tế bào gan phôi thai người invitro vẫn còn là một vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu. Hiện nay trên thế giới, có một số nhóm tiến hành nghiên cứu đưa một số gen vào trong các tế bào có tính chất khó bảo tồn và tăng sinh để phát triển dòng tế bào cho các nghiên cứu liên quan. Ví dụ tế bào IPFLS (Immortalization of a primate bipotent epithelial stem cells), là dòng tế bào gan phôi thai của linh trưởng đã được làm cho "bất tử" bằng cách đưa một vector retrovirus vào hệ gen của tế bào này để phục vụ cho mục đích nghiên cứu, cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho việc bảo quản đông lạnh tế bào khi cần thiết.