Ảnh hưởng một số điều kiện lên men aspergillus oryzae t6 tới khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm glucosidase trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người có đường huyế

Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 12: 1631-1639 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(12): 1631-1639 www.vnua.edu.vn ẢNH HƯỞNG MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Aspergillus Oryzae T6 TỚI KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT KÌM HÃM - GLUCOSIDASE TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHOẺ CHO NGƯỜI CÓ ĐƯỜNG HUYẾT CAO VÀ THỪA CÂN Nguyễn Đức Tiến*, Nguyễn Thị Huyền Viện Cơ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch * Tác giả liên hệ: nguyenductienvcd@gmail.com Ngày nhận bài: 05.10.2022 Ngày chấp nhận đăng: 20.12.2022 TÓM TẮT Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng số điều kiện lên men tới khả sinh tổng hợp chất kìm hãm glucosidase (AGIs) Aspergillus oryzae T6 (A oryzae T6) nuôi cấy môi trường bán rắn từ đỗ đen trình sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khoẻ cho người có đường huyết cao người thừa cân Bằng phương pháp xác định hoạt tính ức chế α- glucosidase kết cho thấy, trình sinh tổng hợp hoạt chất AGIs môi trường bán rắn từ đỗ đen (Vigna cylindrica Skeels) cho đạt hiệu tốt độ dày khối môi trường 24cm, thời gian định kỳ đảo trộn khối môi trường 12 lên men đảo trộn lần, độ ẩm môi trường bán rắn 55% thời gian lên men 56 Chế phẩm AGIs tạo có IC50 đạt 0,202 ± 0,006 mg/ml ứng dụng cho sản xuất thực phẩm giúp ổn định glucose máu người có glucose cao máu người thừa cân Từ khóa: Aspergillus oryzae, đỗ đen, đường huyết, thừa cân, kìm hãm - glucosidase Effects of some Fermentation Conditions of Aspergillus oryzae T6 on the Biosynthesis of -Glucosidase inhibitors in the Production of Health Foods for People with High Blood Glucose and Overweight ABSTRACT This study evaluated the influence of some fermentation conditions on the biosynthesis of α-glucosidase inhibitors (AGIs) of Aspergillus oryzae T6 (A oryzae T6) cultured on semi-solid medium from black beans in the production of health-protective foods for people with high blood glucose and overweight By determining the inhibitory activity of α-glucosidas the results showed that the biosynthesis of AGIs on semi-solid medium from black beans (Vigna cylindrica Skeels) gave the best effect in terms of the thickness of the fermentation medium block (24cm) The periodic agitation of the semi-solid medium from black beans during fermentation was every 12 hours; humidity of semi-solid medium from black beans for fermentation was 55% and fermentation time was 56 hours The resulting AGIs products with IC50 of 0.202 ± 0.006 mg/ml were applied to food production to help stabilize blood glucose in people with high blood sugar and overweight Keywords: Aspergillus oryzae, blood glucose, α-glucosidase inhibitors, overweight, Vigna cylindrica skeels T VN ỏi thỏo ỵng (T) v tha cồn ang tr thnh mt nhng vỗn sc khúe nghiêm trọng vĆi tỷ lệ míc bệnh gia tëng tồn giĆi ĐTĐ thÿa cân khơng chỵ gây nhiều biến chĀng nguy hiểm, đặc biệt täi cĄ quan mít, tim, thên, não hệ thống mäch máu vi cỏc bnh in hỡnh nhỵ bnh thờn T thÿa cân, bệnh lý võng mäc ĐTĐ, suy gan,… mà q trình kiểm sốt bệnh cüng gặp nhiều khị khën Trong đò, thuốc điều trð ĐTĐ tha cõn trờn th trỵng ang gp phõi mt s tác dýng khơng mong muốn sā dýng Chính 1631 Ảnh hưởng số điều kiện lên men Aspergillus Oryzae T6 Tới khả sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm - glucosidase sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khoẻ cho người có đường huyết cao thừa cân vêy việc tìm lội thuốc mĆi để điều trð bệnh ĐTĐ thÿa cân chỷ ỵc nhiu nh nghiờn cu quan tồm, c biệt lội thuốc có nguồn gốc tÿ thiên nhiờn, dỵc liu v ngun vi sinh vờt phong phỳ Chỗt AGIs l mt nhng chỗt thỵng s dýng để ngÿa bệnh ĐTĐ loäi II thÿa cân béo phỡ Hoọt chỗt AGIs cú chc nởng ngởn s tọo thành monosacarit tÿ disaccarit làm cho trình sinh tổng hp insulin din d dng v họn ch hỗp thý monosacarit rut (Holman, 1998) Chỗt AGIs cú th tng hp theo ỵng húa hc hoc t nhiờn nh thc vờt, ng vờt v vi sinh vờt Chỗt AGIs tng hp bỡng húa hc hin thỵng gõy mt s tỏc dýng phý, nhỵ ri loọn chc nởng gan v chng au dọ dy Hoọt chỗt AGIs t ờu lờn men nh Aspergillus oryzae ỵc ỏnh giỏ cao v ng dýng h tr tr bnh ỏi thỏo ỵng, kim soỏt cõn nng ngỵi tha cõn, ang ỵc quan tõm nghiờn cu v sõn xuỗt an ton, khơng có tác dýng phý (Fujita & cs., 2001) Hiện trờn th gii cỹng nhỵ nỵc ó cị số cơng trình nghiên cĀu khai thác thu nhờn AGIs bỡng cỏc phỵng phỏp lờn men ờu đỗ (Nguyễn ĐĀc Tiến, 2018) Đã cò nghiên cĀu thu nhờn hoọt chỗt AGIs, ó xỏc nh ỵc mụi trỵng đêu đen nhiệt độ lên men cûa chûng A oryzae T6 (Nguyễn ĐĀc Tiến & cs., 2013; Nguyễn ĐĀc Tin, 2018), nhiờn sõn xuỗt AGIs t A oryzae T6 lờn men trờn mụi trỵng bỏn rớn hiu q, cỉn xác đðnh số thơng số lên men sõn xuỗt Mýc tiờu cỷa nghiờn cu ny l xỏc nh dy cỷa mụi trỵng lờn men sõn xuỗt, thi gian nh k õo trn mụi trỵng quỏ trỡnh lờn men, ốm v thąi gian lên men cho khâ nëng hình thành AGIs cao cỷa nỗm A oryzae T6 ỵc nghiờn cu ging A.oryzae T6 (phõn lờp t mộu mc tỵng Bổn - Yờn Nhõn - Hỵng Yờn) lỵu tr b sỵu têp giống cûa Viện CĄ điện nông nghiệp Công nghệ sau thu hộch (Nguyễn ĐĀc Tiến & Hồng Đình Hña, 2014); Đỗ đen xanh lñng (Vigna cylindrica Skeels): Thu mua en xanh lũng sõn xuỗt vý ụng xuồn (thu hoäch tháng 4) ć xã Vïnh Thuên, huyện Vïnh Thọnh, tợnh Bỡnh nh cú lỵng 1.000 họt l 118,85g; dung trọng 807,3 ± 0,8 g/l; độ èm 12,73 ± 0,26%; Gluxit 52,16 ± 0,21%; tro tổng số 3,35%; protein 23,55 ± 0,2% thành phæn axit amin g/100g là: 3,85g Threonin; 5,23g Valine; 1,52g Methionine; 1,46g Isoleucine; 1,14g Leucine; 1,25g Phenylalanine; 0,40g Tryptophan 1,24g Lysine Cám gäo dựng nghiờn cu ỵc thu mua t c s xay xát gäo (ć n Mơ - Ninh Bình), tÿ lỳa gọo sau xay xỏt ỵc dit enzyme lipase bỡng phỵng phỏp sỗy cỏm nhit 100-105C/10 phỳt, thành phæn: độ èm 7,2%, Protein (13,2%), Lipit (17,5%), Sợi thô (9,3%), carbohydrate (37,6%), Tro thô (7,2%), Canxi (0,74 mg/g), Magie (8,2mg/g), Photpho (15,4 mg/g), Phytin photpho (9,7 mg/g), Silica (8,7 mg/g), Kẽm (41 mg/g), Vitamin B1 (17,5 mg/g) Vitamin B2 (3,8 mg/g) Xā lý nguyên liệu chuèn bð mụi trỵng: en xanh lủng sọch, ngồm nỵc 10 gią ć nhiệt độ phñng, để phút, phối chế 10% cám gäo, điều chỵnh độ èm, đem hỗp chớn nhit 121C vũng 60 phỳt 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xác định hoạt tính AGIs 2.1 Vt liu - 10g mụi trỵng sau lờn men ỵc nghin nhú bỡng ci s, b sung 90g nỵc cỗt, chit 100C gi Lc bỡng ly tâm ć 3.800 vòng/phút 15 phút, thu dðch trong, xác đðnh% hột tính AGIs hột lăc AGIs (giỏ tr IC50) Tỗt cõ cỏc húa chỗt s dýng nghiờn cu ny u ỵc mua t hóng Sigma-Aldrich: - glucosidase tÿ ruột non chuột (rat interstinal aceton power), p-Nitrophenyl -Dglucopyranoside (PNP-G), NaCl, Tris Base, đệm phosphat 0,1M (Sigma Chemical Co, Mỹ); Chûng - Xác đðnh% hột tính AGIs bỡng xỏc nh s tọo thnh 4-nitrophenol bỵc súng 405nm sau phân Āng xúc tác cûa -glucosidase vĆi cĄ chỗt p-Nitrophenyl -D-glucopyranoside (pNPG) cú tham gia cỷa hoọt chỗt AGIs, iu kin phõn ng nng c chỗt mg/ml, thąi PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1632 Nguyễn Đức Tiến, Nguyễn Thị Huyền gian phân Āng 30 phút v lỵng -glucosidase l 50àl (nng 0,2 U/ml) I (%) = (A đối chĀng – Améu) × 100/Ađối chĀng Trong đị I(%): % hột tính kìm hãm -glucosidase; A i chng: hỗp thý cỷa mộu phõn ng bao gm c chỗt pNPG v glucosidase; Amộu: hỗp thý cỷa mộu phõn ng bao gm c chỗt p NPG, -glucosidase v dung dch cha hoọt chỗt AIGs (Tomoyuki & cs., 1999) - Hột lăc kìm hãm -glucosidase IC50 (Inhibitory concentration) l nng cỷa hoọt chỗt m cú th kỡm hóm ỵc 50% hoọt enzyme -glucosidase (Chen & cs., 2007) IC50 ỵc xỏc nh bỡng cỏch khõo sỏt hoọt tớnh kỡm hóm cỷa hoọt chỗt vi enzyme nồng độ khác Nếu hột lăc kìm hãm enzyme cỷa hoọt chỗt bin thiờn tuyn tớnh vi nng , s v ỵc mt ỵng thợng y = ax + b (vĆi y là% hột tính kìm hãm x nồng độ) Nếu hột lăc kìm hãm enzyme cỷa hoọt chỗt khụng bin thiờn tuyn tớnh vi nng độ, cách gỉn đúng, chọn hai nồng độ kìm hóm trờn v dỵi 50% v v ỵc ỵng thợng y = ax + b Thay y = 50% vào phỵng trỡnh s thu ỵc giỏ tr x, ũ l IC50 2.2.2 Xác định thời gian định kỳ đâo trộn mơi trường đỗ đen q trình lên men A oryzae T6 đến khâ hình thành hoạt chất AGIs Khõo sỏt thi gian nh k õo trn mụi trỵng q trình lên men ć méu cơng thĀc thăc nghiệm khác nhau: không đâo trộn (đối chĀng); 6; 8; 10; 12; 14 16 gią lên men đâo trộn lỉn Các méu cơng thĀc thăc nghiệm cú cựng iu kin: Khay lờn men (kớch thỵc (cm): rộng × dài × cao = 40 × 60 × 35), dy mụi trỵng en xanh lủng 24cm, mêt độ giống A oryzae T6 ban đæu 106 CFU/g, lên men ć nhiệt độ 30 ± 2C/ 60 gi, thu mụi trỵng sau lờn men tÿng cơng thĀc thăc nghiệm đem xác đðnh hột tính AGIs 16,0; 18,0; 20,0; 22,0; 24,0; 26,0; 28,0 30,0cm Các méu thăc nghiệm cò điều kiện: Khay lờn men (kớch thỵc (cm): rng ì di ì cao = 40 × 60 × 35), mêt độ giống A oryzae T6 ban đæu 106 CFU/g, lên men ć nhiệt độ 30 ± 2C, 12 gią lên men đâo trộn lỉn, sau 60 gią lên men, thu mơi trỵng sau lờn men tng cụng thc thc nghim đem xác đðnh hột tính AGIs 2.2.4 Xác định ânh hưởng độ ẩm ban đầu môi trường đỗ đen lên men A oryzae T6 đến khâ hình thành hoạt chất AGIs Khâo sát độ èm ban đæu ć mụi trỵng lờn men, mi mộu cụng thc thc nghiệm khác nhau: 45; 50; 55; 60 65% Các méu cơng thĀc thăc nghiệm cị điều kiện: Khay lờn men (kớch thỵc (cm): rng ì di ì cao = 40 × 60 × 35), độ dày mơi trỵng l 24cm, mờt ging A oryzae T6 ban đæu 106 CFU/g, lên men ć nhiệt độ 30 ± 2C, 12 gią lên men đâo trộn læn, sau 60 gi lờn men, thu mụi trỵng sau lờn men ć tÿng công thĀc thăc nghiệm đem xác đðnh hột tính AGIs 2.2.5 Xác định thời gian lên men đỗ đen A oryzae T6 đến khâ hình thành hoạt chất AGIs Khâo sát thąi gian lên men ć méu công thĀc thăc nghiệm khác nhau: 24; 26; 28; 30; 32; 34; 36; 38; 40; 42; 44; 46; 48; 50; 52; 54; 56; 58; 60; 62; 64; 66 68 gią Các méu công thĀc thăc nghiệm ny cũ cựng iu kin: Khay lờn men (kớch thỵc (cm): rộng × dài × cao = 40 × 60 ì 35) cha mụi trỵng cú t l lỵng en xanh lũng/cỏm gọo tỵng ng: 9/1 (w/w); èm ban đæu 60%; pH ban đæu 5,5; mêt độ giống A oryzae T6 106 CFU/g; độ dy mụi trỵng l 24cm, lờn men nhit độ 30 ± 2C, 12 gią lên men đâo trộn mt lổn, sau 60 gi lờn men, thu mụi trỵng sau lên men ć tÿng công thĀc thăc nghiệm đem xác đðnh hột tính AGIs 2.2.3 Xác định ânh hưởng độ dày khối môi trường lên men A oryzae T6 đến khâ hình thành hoạt chất AGIs 2.2.6 Chi tiêu chất lượng, câm quan an Khâo sát độ dy mụi trỵng lờn men mi mộu cụng thc thc nghim khỏc nhau: Mụi trỵng en xanh lñng lên men cûa A oryzae T6 56 gią ỵc chit xuỗt bỡng ton thc phm ca ch phm AGIs tạo từ A oryzae T6 1633 Ảnh hưởng số điều kiện lên men Aspergillus Oryzae T6 Tới khả sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm - glucosidase sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khoẻ cho người có đường huyết cao thừa cân siêu ồm cỵng 8W/cm2/tổn s 20kHz/10 phỳt vi t l dung mơi Ethanol 50%/đỗ đen xanh lịng lên men 10/1 (v/w) 60C, thu dch chit em cụ sỗy khụ nhit 60C/-0,8atm thu ỵc bt ch phốm AGIs (Nguyễn ĐĀc Tiến, 2018) Chế phèm AGIs täo ỵc xỏc nh hoọt tớnh AGIs; Xỏc nh hm lỵng chì, theo AOAC 994.02; Xác đðnh Asen, theo AOAC 952,13; Xỏc nh hm lỵng cadimi, theo AOAC 2000; Xỏc nh hm lỵng thỷy ngõn, theo AOAC 971,21; Xỏc nh hm lỵng ng, theo ISO 8294:1994; Xỏc nh hm lỵng 3-MCPD, theo TCVN 7731: 2007; Xác đðnh tổng số vi khuèn yu khớ, nỗm men, nỗm men, nỗm mc cỏc sân phèm thăc phèm theo TCVN 4886-89; Xác đðnh E.coli, theo TCVN 6846:2007; Xác đðnh Salmonella, theo TCVN 4829:2005; Xác đðnh Staphylococcus aureus, theo TCVN 4830:2005; Xác đðnh Clostridium perfringens, theo TCVN 4991:2005; Xác đðnh Bacillus cereus, theo TCVN 4992:89; Xác đðnh aflatoxin, theo TCVN 7596:2007; Xác đðnh tổng số vi sinh vêt hiếu khí, theo TCVN 4884:2005; Xác đðnh tng bo t nỗm men mc theo TCVN 6265:2007; Xỏc đðnh Coliforms, theo TCVN 4882:2007 sau 10 gią lên men đâo trộn læn, 81,76% ć kỹ thuêt sau gią lên men đâo trộn læn 80,91% ć kỹ thuêt sau gią lên men đâo trộn lổn iu ny cho thỗy thi gian nh k õo trn mụi trỵng quỏ trỡnh lờn men cỹng l mt nhng yu t õnh hỵng ln n s sinh tng hp hoọt chỗt AGIs õo trn nguyờn liệu lên men täo điều kiện A oryzae T6 tiếp xúc vĆi khơng khí lĆn vêy A oryzae phát triển tốt Tuy nhiên thąi gian đâo trộn ngun liệu lên men đðnh kỳ ngín (nhiều lỉn) dễ bð khơ, tốn chi phí cho q trình lên men Khụng õo trn mụi trỵng lờn men A oryzae s dộn n thiu s lỵu thụng oxy v carbon dioxit, nỗm mc chợ phỏt trin b mt ngoi mụi trỵng lờn men ũ s nỗm mc chờm phát triển, dén đến khâ nëng hình thành hột tính AGIs cûa A oryzae cüng giâm Sau 12 gią lên men đâo trộn lỉn phù hợp cho hình thành AGIs, sau 10 gią, gią gią lên men đâo trộn lỉn cho hột tính AGIs cûa A oryzae tëng không đáng kể Vêy, lên men đâo trộn đðnh kỳ sau 12 gią lên men đâo trn mt lổn ỵc chn cho lờn men A oryzae T6 sinh tng hp hoọt chỗt AGIs 2.2.7 X lý số liệu 3.2 Ảnh hưởng độ dày khối môi trường lên men đỗ đen A oryzae T6 đến khâ hình thành hoạt chất AGIs Các số liệu thi gian õo trn, dy mụi trỵng, ốm, thi gian ỵc tớnh toỏn giỏ tr trung bỡnh, độ lệch chn phân tích one-way ANOVA tìm să khác biệt giĂa giá trð trung bình bìng so sánh LSD cò ý nghïa vĆi độ tin cêy P