PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT & ELISA

Western blot  Dùng để phát hiện 1 protein chuyên biệt trong một hỗn hợp phức tạp nhiều proteinmô,dịch chiết mô  Western blot được phát triển bởi George Stark..  SDS có điện tích âm r

WESTERN BLOT & ELISA

I.Giới thiệu

1 Western blot

 Dùng để phát hiện 1 protein chuyên biệt trong một hỗn hợp phức tạp nhiều

protein(mô,dịch chiết mô)

 Western blot được phát triển bởi George Stark Công nghệ này dùng kháng thể để xác định vị trí của Protein

NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP

Chuyển protein

lên màng

(Transfer of protein )

Mục đích PVDF, nitrocellulose.

Sample preparation ( Chuẩn bị mẫu)

grind the tissue with liquid

nitrogen

Centrifuge tube

VOATEX

RIPA Lysis Buffer

Protease & phosphatase

4 0 C

ultra speed centraifuge tube

collect the supernatant

LY TÂM

Mẫu chứa

protein

4 0 C

RIPA Lysis Buffer: Lysates tế bào

 SDS có điện tích âm rất lớn ,liên kết với mạch

polypeptide, SDS bao lấy protein có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm(-) sang cực dương(+).

 protease và phosphatase :chất ức chế, ngăn chặn

sự tiêu hóa của mẫu bởi các enzyme của chính

mẫu.

 Chuẩn bị mô thường được thực hiện ở nhiệt độ

lạnh để tránh biến tính protein và suy thoái,bảo vệ mẫu.

 Kết hợp voatex,ly tâm Nhanh chóng giúp ly giải

tế bào và hòa tan protein.

Video về bước chuẩn bị mẫu và SDS-Tác nhân làm biến tính protein

Electrophoresis ( Điện di )

 Điện di để phân tách protein trong mẫu Sự phân tách này dựa trên điểm đẳng điện (isoelectric

point - pI), khối lượng phân tử, điện tích, hoặc

phối hợp các yếu tố trên Đặc điểm của quá trình phân tách phụ thuộc vào cách xử lý mẫu và đặc điểm của bản gel.

 Cho tới nay, phương pháp điện di sử dụng phổ biến nhất là gel polyacrylamide và đệm tải là

sodium dodecyl sulfate (SDS )

Electrophoresis ( Điện di )

 SDS –PAGE (SDS polyacrylamide gel

electrophoresis) giữ polypeptide ở trạng thái biến tính sau khi chúng đã bị xử lý với chất khử mạnh

và mất đi cấu trúc bậc 2 bậc 3 (thí dụ, cầu

disulfide) và phân tách protein dựa trên khối

lượng phân tử.

 Protein trong mẫu mang điện tích âm SDS và dịch chuyển tới cực dương qua mạng acrylamide bản gel

 Electrophoresis(điện di)

Cực âm (-)

Cực dương (+) Protein

- Protein nhỏ di chuyển nhanh hơn và do đó chúng được phân tách theo khối lượng (thường sử dụng đơn vị kilo, kDa)

- Nồng độ acrylamide xác định khả năng phân tách (độ phân giải) của bản gel nồng độ càng cao thì phân tách càng tốt protein

có khối lượng phân tử nhỏ Protein chỉ di chuyển theo một hướng dọc theo bản gel.

Các giếng

Gel SDS–Polyacryamide (SDS-PAGE)

nhỏ gel chứa mẫu

vào các rãnh(giếng) một hay 2 giếng

cho thang (marker hay ladder), là sản phẩm thương mại chứa các protein với khối lượng phân tử xác định, được nhuộm để tạo ra băng màu

và nhìn thấy được

Tiến hành điện di

Video sds-page và điện di

*Điện di một chiều:

Mẫu được tải lên giếng.

Đặt hiệu điện thế lên gel.

Các protein dịch chuyển với tốc độ khác nhau.

Tạo thành các vạch khác nhau trên gel.

*Cũng có thể sử dụng gel 2 chiều (two-dimensional (2-D) gel)

+Phương pháp electroblot: dùng dòng điện

để kéo các protein lên màng PVDF hoặc nitrocellulose

Transfer of proteins ( chuyển protein)

 Phương pháp thấm:Đặt màng lên mặt bản gel rồi đặt một tấm giấy lọc tiếp lên trên Đặt cả bộ trong dịch đệm, dịch đệm có thể thấm lên giấy lọc bằng lực mao dẫn, và mang theo cả protein

 phương pháp electroblot : sử dụng dòng điện để kéo protein từ gel lên màng PVDF hay

nitrocellulose Protein di chuyển từ gel lên màng

và vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel Kết

quả của quá trình lai thấm này là protein được

phơi ra trên lớp mỏng để thực hiện xác định và

phát hiện.

 Màng nitrocellulose rẻ hơn màng PVDF, nhưng dễ

vỡ và không bền.

Video transfer proten

Blocking membrane (khóa màng)

Nhuộm màng với Coomassie hay Ponceau S Thường

sử dụng Ponceau S hơn bởi nó có độ nhạy cao và tính tan trong nước làm cho dễ rửa chất nhuộm

Blocking membrane (khóa màng)

 Bởi màng có khả năng liên kết kháng thể và

protein đích ,cần thực hiện các bước để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể sử dụng để xác định protein đích

 Khóa các liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt màng vào dung dịch protein loãng – điển hình là albumin huyết tương bò (Bovine serum

albumin (BSA)) hay sữa bột không béo (đều có giá thành thấp) với phần nhỏ chất tẩy như Tween 20

 Protein trong dung dịch loãng sẽ gắn với màng ở tất cả các vị trí mà protein đích chưa bám vào Do

đó, khi bổ sung kháng thể, sẽ không còn chỗ trên màng để nó bám vào ngoại trừ các vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích.

 Điều này giảm “nhiễu” trong sản phẩm cuối của Western blot, cho kết quả rõ ràng và loại trừ

dương tính giả.

Video bước khoá màng

Detected (phát hiện)

 Kháng thể sơ cấp:ủ dịch loãng kháng thể sơ cấp (thường sử dụng nồng độ 0.5 and 5

micrograms/ml) với màng và có lắc nhẹ Tiêu biểu

là dung dịch này gồm dịch muối đệm với lượng

nhỏ chất tẩy và đôi khi có sữa bột hay BSA Có thể giữ dịch kháng thể và màng và ủ cùng một nơi

trong thời gian 30phút tới qua đêm Cũng có thể ủ

ở nhiệt độ khác, nhiệt độ càng cao càng kích thích liên kết, cả liên kết đặc hiệu (protein đích) và

không đặc hiệu.

Detected (phát hiện)

 Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp

chưa liên kết, tiếp tục gắn kháng thể thứ hai, bám trực tiếp vào phần đặc hiệu theo loài của kháng

thể sơ cấp

 Kháng thể thứ cấp có khả năng liên kết với

enzyme thông báo Enzyme này tác dụng với cơ

chất tương ứng tạo phản ứng màu.Do đó phát hiện được protein quan tâm.

 Cũng thường liên kết kháng thể thứ cấp với biotin hay một enzyme như alkaline

phosphatase hay horseradish peroxidase

CƠ CHẾ

 Tiếp theo là protein được định danh bằng cách

cho cơ chất vào để xác định màu,huỳnh

quang, hay xac định đồng vị phóng xạ

Xác định phát quang hoá học

Ph ươ ng pháp xác đ nh b ng phát quang ị ằ hóa h c ph thu c và quá trình trong ọ ụ ộ ủ

western blot v i c ch t phát quang khi ớ ơ ấ

đ nh l ị ượ ng k t qu theo m t đ quang ế ả ậ ộ

Chi phí cao, nh h ả ưở ng t i s c kh e ớ ứ ỏ

và an toàn c a ng ủ ườ i s d n ử ụ g

Ứng dụng western blot

Western Blot cho phép các nhà điều tra xác định trọng lượng phân tử của protein và để đo lường số lượng tương đối của các protein hiện diện trong các mẫu khác nhau.

Hai xét nghiệm máu được sử dụng trong chẩn đoán mắc bệnh mãn tính với vi rút suy giảm miễn dịch ở

người (HIV) bao gồm Western Blot và phương pháp Elisa Sử dụng Western Blot để phát hiện kháng thể chống HIV trong một mẫu huyết thanh của con người.

 Western Blot cũng được sử dụng như là các thử

nghiệm cho bệnh “bò điên” (BSE).

 Một số hình thức kiểm tra bệnh Lymple thường dùng Western Blot.

 Western Blot cũng có thể được sử dụng như một thử nghiêm để xác nhận nhiễm viêm gan B.

+ƯU ĐIỂM:

Cụ thể tương tác của các kháng thể và kháng nguyên

có thể được trực tiếp hình dung

+NHƯỢC ĐIỂM:

Yêu cầu kỹ thuật,Đắt

VIDEO WESTERN BLOT

KĨ THUẬT ELISA- Nguyên lý của ELISA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Hay còn gọi

là phương pháp ELISA hay EIA

- Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson Prior mô tả phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng xạ (radioimmunoassay) dùng để xác định KN,

- Kỹ thuật gắn kết enzyme với KN hay KT được phát triển bởi Stratis Avrameas và G.B Pierce

 Năm 1966, Wide và Porath

phát triển phương pháp gắn

KN và KT trên bề mặt rắn (bề mặt của các vi phiếm hay các đĩa) nhờ đó mà KN hay KT không được gắn kết sẽ dễ

dàng được rửa trôi.

 Peter Perlmann và Eva

Engvall (Thụy Điển) cùng với nhóm Anton Schuurs và

Bauke van Weemen (Hà Lan) công bố phương pháp được đặt tên ELISA (EIA) dựa trên tất cả những bước phát triển nói trên Phương pháp chính thức ra đời vào năm 1971.

1 ELISA gián tiếp (indirect ELISA)

2 Sandwich ELISA

3.ELISA cạnh tranh

Ứng dụng

 - Xác định nồng độ của KT trong huyết thanh;

- Kiểm tra sự có mặt của KN;

- Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học….

Trong thực phẩm

 Phương pháp Elisa có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi

tăng sinh.

 Phát hiện độc tố trong tảo.

 Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,sán lá gan… trong thực phẩm.

 Phát hiện chất chloramphenicol (chất không được phép

có trong tôm, cá và các sản phẩm thuỷ sản khác)

Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm,tàn dư thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu…

 Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét.

Trong nông-lâm-ngư nghiệp

 Chuẩn đoán bệnh Tristeza(tác nhân gây bệnh héo rũ) trên cây cam quýt.

 Giám định sự hiện diện của BBTV(Banana

Bunchy Top Virus) gây bệnh chùn đọt chuối.

 Phát hiện kháng thể chống Mycoplasma

hyopnewmonia(MH) ở heo.

 Dư lượng kháng sinh

 Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật

 Độc tố tảo

 Độc tố Động vật giáp sát( Shellfish toxin)

Bộ KITs ELISA

 Cảm ơn các bạn đã chú ý lắng

nghe!