PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT & ELISA

WESTERN BLOT & ELISA I.Giới thiệu 1. Western blot  Dùng để phát hiện 1 protein chuyên biệt trong một hỗn hợp phức tạp nhiều protein(mô,dịch chiết mô)  Western blot được phát triển bởi George Stark. Công nghệ này dùng kháng thể để xác định vị trí của Protein . NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP Chuẩn bị mẫu (Sample preparation) Điện di (Electrophoresis) Gel SDS–Polyacryamide (SDS-PAGE) Qúa trình phân tách protein Chuyển protein lên màng (Transfer of protein ) Mục đích PVDF, nitrocellulose. Các phương pháp Khoá màng (Blocking membrane) Nhuộm màng kiểm tra protein Mục đích Phương pháp Phát hiện (detected) Phương pháp Phân tích Sample preparation ( Chuẩn bị mẫu) grind the tissue with liquid nitrogen Centrifuge tube VOATEX RIPA Lysis Buffer Protease & phosphatase 4 0 C ultra speed centraifuge tube collect the supernatant LY TÂM Mẫu chứa protein 4 0 C RIPA Lysis Buffer: Lysates tế bào  Tris-HCl pH 7.4 50mM  NaCl 150mM  EDTA 1mM  Triton X-100 1%  SDS(sodium dodecyl sunfate) 0.1%  Sodium deoxycholate 1%  PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride hoặc phenylmethylsulfonyl fluoride) : chất ức chế serine protease 1mM  SDS có điện tích âm rất lớn ,liên kết với mạch polypeptide, SDS bao lấy protein có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm(-) sang cực dương(+).  protease và phosphatase :chất ức chế, ngăn chặn sự tiêu hóa của mẫu bởi các enzyme của chính mẫu.  Chuẩn bị mô thường được thực hiện ở nhiệt độ lạnh để tránh biến tính protein và suy thoái,bảo vệ mẫu.  Kết hợp voatex,ly tâm Nhanh chóng giúp ly giải tế bào và hòa tan protein. Video về bước chuẩn bị mẫu và SDS-Tác nhân làm biến tính protein Electrophoresis ( Điện di )  Điện di để phân tách protein trong mẫu. Sự phân tách này dựa trên điểm đẳng điện (isoelectric point - pI), khối lượng phân tử, điện tích, hoặc phối hợp các yếu tố trên. Đặc điểm của quá trình phân tách phụ thuộc vào cách xử lý mẫu và đặc điểm của bản gel.  Cho tới nay, phương pháp điện di sử dụng phổ biến nhất là gel polyacrylamide và đệm tải là sodium dodecyl sulfate (SDS ) Electrophoresis ( Điện di )  SDS –PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) giữ polypeptide ở trạng thái biến tính sau khi chúng đã bị xử lý với chất khử mạnh và mất đi cấu trúc bậc 2 bậc 3 (thí dụ, cầu disulfide) và phân tách protein dựa trên khối lượng phân tử.  Protein trong mẫu mang điện tích âm SDS và dịch chuyển tới cực dương qua mạng acrylamide bản gel  Electrophoresis(điện di) Cực âm (-) Cực dương (+) Protein - Protein nhỏ di chuyển nhanh hơn và do đó chúng được phân tách theo khối lượng (thường sử dụng đơn vị kilo, kDa). - Nồng độ acrylamide xác định khả năng phân tách (độ phân giải) của bản gel nồng độ càng cao thì phân tách càng tốt protein có khối lượng phân tử nhỏ. Protein chỉ di chuyển theo một hướng dọc theo bản gel. Các giếng [...]... *Có 2 phương pháp để thực hiện: +Phương pháp thấm (Blotting): dùng phương pháp mao dẫn để dẫn protein lên màn +Phương pháp electroblot: dùng dòng điện để kéo các protein lên màng PVDF hoặc nitrocellulose    Phương pháp thấm:Đặt màng lên mặt bản gel rồi đặt một tấm giấy lọc tiếp lên trên Đặt cả bộ trong dịch đệm, dịch đệm có thể thấm lên giấy lọc bằng lực mao dẫn, và mang theo cả protein phương pháp. .. phương pháp nhạy nhất để phân tích màng lai Ứng dụng western blot Western Blot cho phép các nhà điều tra xác định trọng lượng phân tử của protein và để đo lường số lượng tương đối của các protein hiện diện trong các mẫu khác nhau Hai xét nghiệm máu được sử dụng trong chẩn đoán mắc bệnh mãn tính với vi rút suy giảm miễn dịch ở người (HIV) bao gồm Western Blot và phương pháp Elisa Sử dụng Western Blot. .. Western Blot và phương pháp Elisa Sử dụng Western Blot để phát hiện kháng thể chống HIV trong một mẫu huyết thanh của con người  Western Blot cũng được sử dụng như là các thử nghiệm cho bệnh “bò điên” (BSE)  Một số hình thức kiểm tra bệnh Lymple thường dùng Western Blot  Western Blot cũng có thể được sử dụng như một thử nghiêm để xác nhận nhiễm viêm gan B ... băng nhuộm với thang đo khi điện di Tiếp theo là protein được định danh bằng cách cho cơ chất vào để xác định màu,huỳnh quang, hay xac định đồng vị phóng xạ Xác định màu: - Phương pháp xác định màu phụ thuộc vào quá trình ủ của western blot với cơ chất phản ứng với enzyme để chỉ thị (như peroxidase) có liên kết với kháng thể thứ cấp - Nó sẽ chuyển chất nhuộm tan thành dạng không tan hiện màu kết tủa ngay... chất nhuộm tan Đánh giá biểu hiện protein bằng mật độ kế (densitometry) (nhuộm đậm tới mức nào) hay quang phổ kế (spectrophotometry) Xác định phát quang hoá học Phương pháp xác định bằng phát quang hóa học phụ thuộc và quá trình ủ trong western blot với cơ chất phát quang khi phơi chất chỉ thị gắn trên kháng thể thứ cấp Ánh sáng phát ra thu được bằng film ảnh, hoặc máy chụp CCD mà có thể bắt được ảnh... với chất huỳnh quang hóa học, và sản phẩm phản ứng phát ra huỳnh quang tỉ lệ với lượng protein Có thể thu được hình ảnh này trên film ảnh Như với quy trình ELISA, cơ chất phản ứng với enzyme tạo màu nhìn trên màng(sẽ giới thiệu ở phần sau) Phương pháp phát hiện bằng 1 bước:sử dụng kháng thể thăm dò có khả năng nhận ra các protein quan tâm và chứa một nhãn phát hiện Phân tích?    Sau khi rửa loại... protein đích chưa bám vào Do đó, khi bổ sung kháng thể, sẽ không còn chỗ trên màng để nó bám vào ngoại trừ các vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích Điều này giảm “nhiễu” trong sản phẩm cuối của Western blot, cho kết quả rõ ràng và loại trừ dương tính giả Video bước khoá màng Detected (phát hiện)  Kháng thể sơ cấp:ủ dịch loãng kháng thể sơ cấp (thường sử dụng nồng độ 0.5 and 5 micrograms/ml) với... máy chụp CCD mà có thể bắt được ảnh kĩ thuật số của màng lai Hình ảnh này phân tích bằng mật độ kế, máy đo lượng tương đối protein nhuộm và định lượng kết quả theo mật độ quang Xác định phóng xạ: Phương pháp đánh dấu phóng xạ không cần cơ chất enzyme, nhưng phải đặt film X quang trực tiếp trước màng lai như phơi nó lên dấu phóng xạ và tạo vùng tối mà tương ứng với băng protein quan tâm Chi phí cao,... Phương pháp thấm:Đặt màng lên mặt bản gel rồi đặt một tấm giấy lọc tiếp lên trên Đặt cả bộ trong dịch đệm, dịch đệm có thể thấm lên giấy lọc bằng lực mao dẫn, và mang theo cả protein phương pháp electroblot : sử dụng dòng điện để kéo protein từ gel lên màng PVDF hay nitrocellulose Protein di chuyển từ gel lên màng và vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel Kết quả của quá trình lai thấm này là protein . polyvinylidene difluoride (PVDF). *Có 2 phương pháp để thực hiện: +Phương pháp thấm (Blotting): dùng phương pháp mao dẫn để dẫn protein lên màn. +Phương pháp electroblot: dùng dòng điện để kéo các. WESTERN BLOT & ELISA I.Giới thiệu 1. Western blot  Dùng để phát hiện 1 protein chuyên biệt trong một hỗn hợp phức tạp nhiều protein(mô,dịch chiết mô)  Western blot được phát. ) Mục đích PVDF, nitrocellulose. Các phương pháp Khoá màng (Blocking membrane) Nhuộm màng kiểm tra protein Mục đích Phương pháp Phát hiện (detected) Phương pháp Phân tích Sample preparation