Phương pháp lai Southern blot là phương pháp lai giữa DNA của tế bào với mẫu dò DNA. Phương pháp này cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào.Southern blot một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu trúc của gene, được phát triển vào giữa thập niên 1970 do Edwin Southern ở MRC một bộ phân của genome động vật hữu nhũ ở Edinburgh (Southern, 1975).Phương pháp Southern Blot được triển khai nhờ một số kỹ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như:Tách chiết genPCRThẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng laiLai phân tử (lai với mẫu dò đặc hiệu)…Đến nay, kỹ thuật lai Southern đã được cải tiến đi rất nhiều, chủ yếu bao gồm: Tăng độ nhạy Giảm một số bước trong quá trình laiGiảm thời gian thực hiện Vẽ kĩ thuật ngày nay đơn giản hơn rất nhiều.
GVHD: Trần Thị Dung SVTH: Nguyễn Thị Hoàng Yến 61103239 Nguyễn Văn Cư 61103020 Huỳnh Thị Mai Thy 61103315 MÔN KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT Mục lục: I. Giới thiệu về phương pháp Southern blot. II. Nguyên lý và nguyên tắc. • 1.Nguyên lý. • 2.Nguyên tắc. III. Tạo mẫu dò. • 1.Tạo mẫu dò nhờ Plasmid • 2.Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR • 3.Đánh dấu Probe IV. Quy trình của phương pháp Southern Blot. • 1.Giai đoạn 1. • 2.Giai đoạn 2. • 3.Giai đoạn 3. V. Ứng dụng. I. Giới thiệu về phương pháp Southern blot Phương pháp lai Southern blot là phương pháp lai giữa DNA của tế bào với mẫu dò DNA. Phương pháp này cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào. Southern blot - một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu trúc của gene, được phát triển vào giữa thập niên 1970 do Edwin Southern ở MRC một bộ phân của genome động vật hữu nhũ ở Edinburgh (Southern, 1975). Edwin Southern Phương pháp Southern Blot được triển khai nhờ một số kỹ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như: Tách chiết gen PCR Thẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng lai Lai phân tử (lai với mẫu dò đặc hiệu) … Đến nay, kỹ thuật lai Southern đã được cải tiến đi rất nhiều, chủ yếu bao gồm: Tăng độ nhạy Giảm một số bước trong quá trình lai Giảm thời gian thực hiện Vẽ kĩ thuật ngày nay đơn giản hơn rất nhiều. Nguyên lý Dựa trên nguyên tắc biến tính và hồi tính của phân tử DNA. Dựa vào nguyên tắc bổ sung giữa các cặp nucleotide: A-T, G-C ( các đoạn polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung). Màng lai nitrocellulose hay nylon có khả năng tiếp nhận DNA II. Nguyên lý và Nguyên tắc Nguyên tắc Phản ứng lai cần nhiệt độ cao hoặc hóa chất gây biến tính DNA ( NaOH, Formandehyt) Đòi hỏi một đọan DNA (RNA) đã biết trình tự để làm mồi “Probe”, Probe được đánh dấu. Các vật liệu, trang thiết bị máy móc chính xác: màng lai, máy Blotting, buồng lai, máy PCR III. Tạo mẫu dò (probe) Tạo mẫu dò nhờ Plasmid Cắt plasmid và DNA đã tách chiết từ tế bào bởi cùng một loại enzyme. Gắn DNA vào plasmid trong điều kiện môi trường phù hợp. Thực hiện biến nạp vào trong tề bào vi khuẩn. Nhân các tế bào vi kuẩn và chọn lọc. Tách plasmid từ các tế bào chọn lọc. Tách mẫu dò (đoạn DNA). Đánh dấu mẫu dò. Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR Thiết lập mồi và đánh dấu phóng xạ vào các mồi. Biến tính mẫu DNA thành các sợi đơn. Gắn mồi vào các sợi đơn. Tổng hợp các sợi DNA mới. Biến tính để tách các chuỗi mới vừa tổng hợp thành các sợi đơn. tiếp tục quay về gắn mồi vào các sợi đơn. Đánh dấu mẫu dò Gồm có 4 phương pháp: 1. Phương pháp Nick-translation 2. Phương pháp random priming 3. Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide 4. Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe) 1. Phương pháp Nick-translation . DNAse I tạo các khía trên DNA ở nhiều vị trí ngẫu nhiên khác nhau. . DNA polymerase với hoạt tính exonuclease 5’-3’, cắt mạch DNA theo chiều 5’-3’ theo các khía đã tạo sẵn, đồng thời, tổng hợp bù đoạn thiếu với sự tham gia của nucleotide đánh dấu (thường là dATP) . Kết quả là DNA được đánh dấu. 2. Phương pháp random priming . DNA kép được biến tính bằng nhiệt thành 2 mạch đơn. . Hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp được thêm vào, trở thành mồi (primer) cho DNA polymerase tổng hợp mạch bổ sung. . Một trong 4 loại nucleotide bổ sung vào được đánh dấu, nên 2 mạch mới tổng hợp cũng được đánh dấu. 3. Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide Các oligonucleotide được tổng hợp dưới dạng mạch đơn rồi được đánh dấu ở đầu 5’ nhờ enzyme T4 polynucleotide kinase với sự hiện diện của một nucleotide đánh dấu. Sau phản ứng các nuclotide tự do cũng được loại bỏ bằng sắc kí lọc gel, sắc kí lỏng cao áp (HPLC),… [...]... RNA đánh dấu Sau phản ứng, vector có mang trình tự DNA gốc bị DNase I phân hủy, các enzyme được loại bỏ qua tách chiết bằng phenol và RNA được tinh sạch trên sắc kí lọc gel IV Quy trình của phương pháp Southern blot Giai đoạn 1 • Tách chiết và làm biến tính các DNA thành sợi đơn Giai đoạn 2 • Chuyển DNA từ gel agarose lên màn lai (nylon hoặc nitrocellulose) Giai đoạn 3 • Lai với mẫu dò và kiểm tra... Cuối cùng, nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi (đối với probe đánh dấu phóng xạ), phương pháp so màu (với probe đánh dấu bằng biotin) hay dựa vào sự phát quang (với các probe phát quang sinh học) để định vị DNA-probe Sau quá trình lai, màng lai được rửa để loại các probe không bắt cặp chuyên biệt với DNA trên màng IV Ứng dụng Southern blot được sử dụng để đánh giá bản copy của gen trong genome, xác định các...4 Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe) Trước hết, trình tự DNA dùng để sản xuất mẫu dò RNA phải được đưa vào một vector có mang các promoter Vector này được cắt ra thành dạng mạch thẳng; sau đó, RNA polymerase... copy của gen trong genome, xác định các intron, exon, các đoạn bị đột biến thêm hoặc mất đoạn… Khi sử dụng các DNA marker khác nhau làm mẫu dò, có thể phân biệt được các loài, các loài đồng hình Southern blot – RFLP : giúp phát hiện sự đa dạng chiều dài các đoạn cắt bởi RE, qua đó, nhận biết sai biệt di truyền ở vị trí nhận biết của các RE dẫ đến sai biệt trong chiều dài của các đoạn DNA tạo ra từ... chuyển, vị trí các DNA không thay đổi Màng lai sau quá trình trên, được xử lý nhiệt (800 trong 2 giờ) hoặc chiếu tia UV (vài phút) để cố định DNA trên màng Cách tiến hành: Đặt gel lên giá chuyển máy Bloting để chuyển nguyên vẹn các sợi DNA biến tính Dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0.4M Màng lai sẽ giữ cố dịnh các đoạn DNA được chuyển lên từ gel điện li Giai đoạn 3 Lai các DNA cố định trên màng lai . Nguyễn Thị Hoàng Yến 611 03239 Nguyễn Văn Cư 611 03020 Huỳnh Thị Mai Thy 611 03 315 MÔN KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT Mục lục: I. Giới thiệu về phương pháp Southern blot. II. Nguyên. tắc. • 1. Nguyên lý. • 2.Nguyên tắc. III. Tạo mẫu dò. • 1. Tạo mẫu dò nhờ Plasmid • 2.Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR • 3.Đánh dấu Probe IV. Quy trình của phương pháp Southern Blot. • 1. Giai đoạn 1. • 2.Giai. Southern ở MRC một bộ phân của genome động vật hữu nhũ ở Edinburgh (Southern, 19 75). Edwin Southern Phương pháp Southern Blot được triển khai nhờ một số kỹ thuật nền tảng của công nghệ sinh